Introduction
Estudo da Drosophila melanogaster tem proporcionado grandes insights sobre a regulação genética de uma ampla gama de fenômenos. Em particular, tem havido uma extensa pesquisa sobre o desenvolvimento do ovo, porque oogenesis fornece uma maneira dócil para investigar vários processos de desenvolvimento diferentes, incluindo padrões de tecidos, alterações de polaridade celular, comutação do ciclo celular, e regulação de translação 1,2,3,4. Um evento morphogenic importante durante oogenesis é a especificação, aquisição de motilidade, e migração de um conjunto de células, chamadas de células de fronteira (revisto em 5). Uma vez que a migração celular é uma característica fundamental da morfogénese dos animais, e porque a regulação genética do presente processo é bem conservada, determinados mecanismos de moscas são susceptíveis de ser importante em outros contextos. Assim, estamos investigando o controle molecular da migração celular fronteira. Para os nossos estudos, desenvolvemos um novo método para observar os pólos anterior de desenvolvimento de ovos,onde surgem as células de fronteira, para examinar como elas se desenvolvem em detalhe.
Dentro do ovário, câmaras de ovo em várias fases de desenvolvimento existir ao longo das cadeias chamadas ovarioles, que são envolvidas por uma bainha fina (Figura 1A). Cada câmara ovo vai continuar a formar um ovo. Durante oogenesis, vários tipos de células diferentes deve desenvolver-se de forma coordenada. O D. câmara melanogaster ovo é composto por 16 células germinativas, incluindo um oócito, cercado por uma única camada de epitélio folicular 6. Um pequeno número de células especializadas, chamadas células polares, surgem as anteriores e posteriores pólos do epitélio. As células de fronteira 6-8 originam no epitélio anterior da câmara de ovo, induzida pelas células polares 5,7. Em meados de oogénese (etapa 9), as células de fronteira desanexar das suas vizinhas e migram entre as células de enfermagem para atingir o oócito na parte posterior da câmara do ovo 5,7. Este movimento deve ser realizadoenquanto que as células permanecem na fronteira um cluster circundante duas células polares não-móveis, tornando este um tipo de migração celular colectiva. Migração bem-sucedida do grupo de células de fronteira garante o bom desenvolvimento da micrópila da casca do ovo, que é necessário para a fertilização.
As células polares anteriores instruir destino celular fronteira ativando uma cascata de transdução de sinal. Células polares secretar uma citocina, Unpaired (UPD), que se liga a um receptor de membrana, Domeless (DOME), na vizinha células foliculares durante a fase de desenvolvimento do oócito 8 8,9. A ligação da UPD provoca Janus tirosina quinase (JAK) para fosforilar o transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) 8,10,11. STAT, em seguida, move-se para o núcleo para activar a transcrição. Células de Fronteira lenta (SLBO) é um fator de transcrição que é um alvo direto da transcrição do STAT e também é necessário para a migração celular fronteira 12. Vistas laterais de câmaras de ovos indicam tatividade STAT chapéu é regulada em um gradiente através do epitélio anterior 8,11,13. Células do folículo mais próximos às células polares têm os mais altos níveis de STAT ativado, assim, tornam-se células de fronteira e invadir o tecido germinal adjacente.
Para entender como as células de fronteira são especificados dentro e destacar do epitélio, precisamos observar como o tecido é organizado. Se virmos câmaras de ovos de uma perspectiva anterior-on, esperaríamos simetria radial da atividade STAT nas células foliculares que cercam as células polares. Um fim-em vista também mostram mais precisamente as diferenças de proteínas de membrana e interfaces célula-célula antes e durante o descolamento do que comparando células em diferentes planos focais. Porque câmaras de ovo são oblongas e ligados uns aos outros por células pedunculares, estabelecem-se em lâminas lateralmente, tornando-o difícil de observar a arquitectura anterior. Assim, muita informação sobre as células nos pólos da câmara de ovo temsido inferida a partir de vistas laterais. Embora algumas informações podem ser obtidas através de algoritmos reconstruções 3-D de secções ópticas, espalhamento de luz, fotodegradativas e limites mais pobres da resolução no eixo Z tornar essa informação menos detalhada e confiável na ausência de técnicas caras, como microscopia de super-resolução 14 . Outros tipos de imagem baseado em seção (por exemplo, microscopia eletrônica ou microtome seccionamento) exigem extensa manipulação de tecidos, incluindo a desidratação, aumentando a probabilidade de artefatos. Assim, foi desenvolvido um novo método para a imagem D. câmaras melanogaster ovos, enquanto na posição vertical. Este método já provou útil para elucidar como células móveis estão fadados (ver resultados representativos e Manning et al, em revisão), e é provável que seja mais amplamente útil em estudos de outros aspectos da oogenesis.
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Protocol
1. Dissecção da ovaríolos
- Transferir cerca de quinze 2-4 dias de idade moscas fêmeas e alguns machos a uma mosca frasco fresco alimentos com adição de levedura seca activa. Use algodão como um plug para os frascos, e adicione algumas gotas de água para o algodão para manter a umidade alta.
- Coloque o frasco numa incubadora a 25 ° C durante 14-16 h, para maximizar o número de câmaras de 8-10 fase de ovo.
NOTA: O tempo de incubação varia dependendo da temperatura e estágio desejado. - Prepare a mídia de dissecação, 0,1 M KPO 4 e NP40 soluções conforme necessário para o dia seguinte (ver Materiais).
- Anestesiar as moscas usando CO 2, e colocar sob um microscópio de dissecção. Pipet várias gotas de mídia dissecção em cada cavidade no slide depressão vidro.
- Segure fórceps em cada mão em um ângulo de aproximadamente 30 ° para o topo da tabela e orientar uma mosca fêmea com as asas para baixo. Com a mão não-dominante, pegar a fêmea com a pinça, agarrando-a no anterior do abdômen, perto do tórax, e mergulhe-a para a mídia dissecção na depressão de slides (Figura 1A inserção).
- Com o outro par de fórceps, segure o exoesqueleto no ventral posterior do abdômen e perfurar. Agarre os ovários na extremidade posterior, em seguida, puxe-os para fora do abdômen e coloque no meio fresco, do outro lado do slide depressão. (Figura 1A inserção). Evite puxar para além do intestino. Descarte a carcaça.
- Repita o procedimento com as outras moscas fêmeas até que todos os ovários são dissecados. Descartar os machos.
- Com um par de fórceps, segure um ovário na extremidade posterior (perto das maiores câmaras de ovos), e com a outra mão use uma pinça para beliscar uma das câmaras de ovos mais anteriores (germário). (Figura 1A).
- Lenta e progressivamente, puxe uma cadeia ovaríolo fora da bainha de ovário. Continue a dissecar ovarioles individualmente até que todas as câmaras de ovos desejados são removed.
- Repita os passos de 1,7-1,8 para todos os ovários dissecados.
- Uma vez completo, transferir ovarioles a um tubo de 0,6 ml usando uma pipeta de plástico.
- Vamos ovarioles se depositam no fundo do tubo, em seguida, proceder à fixação e coloração etapas.
2. Immunofluorescent (IF) Coloração de ovaríolos
- Remova cuidadosamente media dissecção de ovarioles com uma pipeta. Cuidado para não remover quaisquer ovarioles ou câmaras de ovo. Deixe aproximadamente 50 l de ovarioles e meios de comunicação de dissecação.
- Adicionar 50 mL de 16% de paraformaldeído para 150 mL de 0,1 M KPO 4 tampão em um tubo, e adicionar solução para câmaras de ovos para corrigi-los. Incubar, enquanto balançando para 10 min. CUIDADO: paraformaldeído é tóxico.
- Remover fixador e lavar duas vezes com 0,5 ml de tampão de lavagem NP40.
- Lavar duas vezes durante 15 minutos cada à temperatura ambiente.
- Consulte o padrão se o protocolo 15 para as etapas subseqüentes.
- Resumidamente, após a fixação, adicionarOs anticorpos primários nas diluições apropriadas e incubar O / N a 4 ° C. Lavar em várias vezes NP40, em seguida, adicionar anticorpos secundários (1: 200) diluições.
- Lavar várias vezes em NP40, em seguida, adicionar DAPI (1: 1000) durante 10 min, em seguida, repetir lavagens. Uma vez SE protocolo é completa, adicionar 200 ul de glicerol a 50% em PBS para as câmaras de ovos e deixar repousar à temperatura ambiente durante 2 horas.
- Remova a solução, substitua-o por 70% de glicerol em PBS, e cubra com papel alumínio. Coloque amostra em 4 ᵒC até que esteja pronto para a montagem. Enquanto isso, continue com a etapa 3.
3. Preparação Prévia de glicerina geléia Slides
- Medida pelo menos 4 ml de glicerina geléia com uma espátula e encher um tubo de cultura de células de vidro para a marca de meio caminho. Derreter glicerina geleia num banho de água a 55 ° C durante 30 min.
- Verter uma pequena gota de glicerol, cerca de 300 ul, a partir da solução estoque em duas lâminas de microscópio. Utilizando um tecido, de glicerol em espalhar um la finayer através de cada um dos slides. Isto proporciona uma base e permite a fácil remoção de glicerina geleia no passo 5.6.
- Corte a ponta fora de uma pipeta de ponta 1.000 ul filtrada. Use cut ponteira para transferir 1000-1500 ul de warm geléia glicerina lentamente para cada lâmina de microscópio. Tome cuidado para evitar bolhas.
- Vamos lâminas glicerina geléia sentar por 5 min a RT para definir.
- Coloque cada slide glicerina geléia em 60 mm x 15 milímetros placa de petri e cubra com filme plástico. Coloque a 4 ° CO / N. Opcionalmente, loja glicerina lâminas de geléia para até 5 dias a 4 ° C.
4. Montagem ovo Chambers
- Usando amostras do passo 2.5, pipeta várias gotas 3 ul de câmaras de ovos em 70% de glicerol através de uma glicerina geléia slide. Continue pipetagem 3 gotas ul até que todas as câmaras de ovos estão neste slide. Certifique-se de cada gota contém, pelo menos, dez câmaras de ovo. Enquanto isso, aqueça um tubo de cultura de glicerina geléia em um banho de água a 55 ° C.
- Coloque o slide glicerina geléia com câmaras de ovo sob um microscópio de dissecção. Ajustar ampliação de modo a que apenas uma gota de câmaras de ovo está no campo de visão (figura 1B).
- Usando uma agulha de calibre 30 como uma colher, pegar a câmara fase de ovo desejado. Quando necessárias, as câmaras de ovo desejados separados de uma cadeia ovaríolo utilizando a agulha, como uma faca.
- Para evitar detritos que podem interferir com a imagem, a câmara de transferência de ovo para a segunda lâmina de glicerina geleia, com o anterior virada para a esquerda (Figura 1E -1). Repetir até que não haja, pelo menos, sete câmaras de ovo alinhados em uma coluna (Figura 1C).
- Formar novas colunas de sete até que todas as câmaras de ovos desejados são transferidos para o segundo slide glicerina geléia.
- Rasgue um pequeno pedaço de tecido e torção. Use-o para absorver o excesso de PBS-glicerol das câmaras de ovo levemente tocando cada um. Tome cuidado para não remover câmaras de ovo.
- Corte oponta de uma pipeta de ponta de 200 ul filtrada. Utilize este para transferir 150 mL de glicerina geléia para cobrir todas as colunas de câmaras de ovo.
NOTA: A quantidade de geléia glicerina necessário para cobrir as colunas é baseado em etapas da câmara de ovos e número de colunas. Este valor pode ser ajustado. - Deixe câmaras de ovos montados sentar-se durante 5 min à temperatura ambiente até que a camada superior de glicerina geleia é completamente solidificado (Figura 1D).
- Colocar a lâmina de câmaras de ovos montados em 60 mm × 15 milímetros placa de petri e cubra com filme plástico. Armazenar a 4 ° CO / N para permitir que as camadas glicerina geléia para solidificar juntos (lugar no escuro, se há uma preocupação com a fotodegradação).
5. Preparação de ovo Chambers for Imaging
- Coloque slides das câmaras de ovos montados sob um microscópio de dissecção. Ajustar ampliação de modo a que apenas uma coluna de câmaras de ovo está no campo de visão.
- Usando um ângulo de 45 ° bisturi miniatura, corte um straight linha ao longo do lado direito da primeira coluna de câmaras de ovo (próxima da face posterior das câmaras de ovo). (Figura 1D-E)
- Em seguida, cortado por cima da primeira câmara de ovo no topo e por baixo da última câmara de ovo na coluna. Neste ponto, a coluna de câmaras de ovo deve ser cortada em três lados.
- Usando um microlanceta, corte ao longo do lado esquerdo da coluna, tão perto quanto possível do lado anterior das câmaras de ovo (Figura 1E) -3.
- Pipetar 100 mL de frio 1X PBT sobre a coluna corte.
- Use uma espátula rodada gumes para remover o excesso de geléia glicerina em torno de três lados da coluna corte de câmaras de ovo e descartar, deixando o resto no slide.
- Insira a espátula no corte feito na face anterior das câmaras de ovos e separar a coluna do bloco de glicerina geléia primária.
- Preparar amostras em posição invertida (5.8.1) ou vertical (5.8.2) de microscopia para qualquer um.
- Para microscópio invertido: t Transferênciaele coluna de câmaras de ovos para uma lamela com face anterior das câmaras de ovo virado para baixo. Repita os passos 5,2-5,8 até que todas as colunas de glicerina geleia foram removidos e montados. Adicione um par de gotas de 50% PBS-glicerol para cada bloco de câmaras de ovos para evitar que sequem. Câmaras de ovos imagem diretamente sobre lamela.
- Para microscópio vertical: Transferir a coluna de câmaras de ovo para uma lâmina de microscópio com o lado anterior para cima. Repita os passos 5,2-5,9 até que todas as colunas de glicerina geleia foram removidas e montadas em lâminas de microscópio. Adicione um par de gotas de 50% PBS-glicerol para cada bloco de câmaras de ovo e blocos de cobertura com uma lamela ½ # 1.
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Representative Results
O método de imagem na vertical nos permitiu ver diretamente a organização das células do epitélio folicular anterior na fase 8. Um marcador geral para o destino células do folículo, o Absent Eyes (EJA) de proteínas, bem como o marcador de DNA nuclear DAPI, mostrou ainda expressão através deste campo de células, e demonstrou que todas as células podem ser vistos com intensidades de coloração semelhante (Figura 2B "). As proteínas reguladas, em resposta à UPD citoquina, no entanto, mostraram padrões variáveis e os níveis de expressão. Células polares liberar UPD apical antes deste estágio de desenvolvimento do ovo 16,17, portanto, espera STAT para ser ativado radialmente sobre as células polares, que às vezes era o caso. Muitas vezes, porém, observou-se que os alvos a jusante de STAT, incluindo SLBO, tinha padrões de expressão mais complexas. Por exemplo, para a expressão de GFP repórter SLBO apareceu na maioria, mas não todas, as células que rodeavam as células polares (Figura 2B, e ver Mannal sob revisão ing et). Percebemos pequenas diferenças na expressão da caderina-E / localização (Figura 2B '), o que pode refletir alterações na adesão, mas mais trabalho será necessário para quantificar e interpretar este resultado. Essas sutilezas não eram detectáveis através da reconstrução tridimensional lateral câmaras de ovos encenadas (Figura 2C-D). As diferenças no eixo apical-basal das células foliculares também podem ser distinguidos utilizando o método vertical. Utilizou-se uma linha de repórter para a proteína do canal anel Visgun (VSG), que está presente na região apical das membranas plasmáticas 18 (Figura 3A). Vertical de imagem confirmada expressão VSG foi detectado na porção apical das células do folículo, perto da parte mais estreita das células polares (Figura 3B).
Também se verificou que o método de imagem vertical funciona bem para ler o epitélio anterior em fase de ovo 9 câmaras. Neste desentões de fase, as células de fronteira coalescer em torno das células polares (Figura 4A). Pudemos observar esses aglomerados compactados usando o fim-on de imagem (Figura 4B-C). Como na etapa 8, verificou-se níveis semelhantes de expressão EYA em todas as células epiteliais (não mostrado), enquanto slbo -GFP bem como activado, STAT nuclear marcado com motilidade das células de fronteira (Figura 4B e 4C). A localização de proteínas FAS3 indicado a interface célula-célula polar polar (Figura 4B). Além disso, em ambas as fases 8 e 9, pode ver as grandes células enfermeira, como indicado por DAPI ou faloidina-coloração de actina cortical (não mostrado), o que sugere que este método também será útil no estudo de células da linha germinal ou células germinativas interacções celulares -follicle.
Figura 1. A montagem vertical da Drosophila câmara ovos. (A) Drosophila ovário indicando câmara de ovo, bainha, e ovaríolo. A representação ilustra a posição de uma pinça para puxar o ovaríolo lentamente a partir da bainha ovário. Inset mostra o posicionamento de fly para dissecção. Lado ventral de mosca fêmea fique voltada para cima. A-anterior, P-posterior. (BD) Procedimento de montagem câmaras de ovos. (B) Uma pequena gota de câmaras de ovos em 70% de glicerol-PBS, visto sob um microscópio estereoscópico dissecção. A seta amarela indica uma cadeia ovaríolo; seta amarela indica uma câmara de ovo individual. A seta vermelha indica a borda da gota de glicerol-PBS. (C) As colunas de câmaras de ovos dispostos em camada fina solidificada de gelatina glicerina. Seta amarela indica uma câmara de ovo individual. (D) A segunda camada fina de geléia derretida glicerina cobre as colunas câmara de ovo para incorporá-los. Linha pontilhada amarela indica onde os cortes devem ser feitos depois de O / N incubação a 4ᵒC. A seta vermelha indica obordo da segunda camada de glicerina geleia. Os números vermelhos indicam a ordem de cortar as colunas de câmara de ovos (top horizontal e cortes inferiores não são apresentados). Anterior é para a esquerda. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagem do epitélio anterior de um estágio 8 câmara de ovo cedo. (A) Vista lateral de um estágio de oito células de fronteira lentas (slbo) repórter gene câmara de ovo (genótipo: slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19,20, corado com DAPI e anticorpos primárias como indicado ou para slbo> GFP. tatu (ARM) é o homólogo da mosca β-catenina. Anterior (A) é para a esquerda, posterior (P) para a direita. (BB ") End-on vistas de um cha ovomber. Reconstrução tridimensional de imagens Z-stack de um estágio de 8 slbo- repórter gene câmara de ovo montado na posição vertical, corado com anticorpos primários, como indicado. Magenta asteriscos indicam células polares. DAPI marca os núcleos. (B ') slbo> GFP é expressa apenas nas células de fronteira presuntivos (SLBO). E-caderina (E-CAD) é uma molécula de adesão localizada na membrana e enriquecida em células de fronteira. (B? ') Olhos Ausente (EYA) é encontrado uniformemente expresso nos núcleos de todas as células do folículo excepto células polares. (C) Vista padrão de lateral de um slbo -reporter estágio 8 câmara de ovo coradas com DAPI (azul) e anticorpos contra GFP (SLBO, verde), ARM (vermelho), e FAS3 (branco). Inserção mostra os eixos: o eixo dos X é para baixo (seta verde), do eixo Y é para a esquerda (seta vermelha), e o eixo Z é para o visor (azul) (D) Por comparação com a nova técnica. , este painel mostra um crea final on-viewted por uma reconstrução tridimensional, processados com software Volocity, utilizando uma pilha de Z de imagens laterais da câmara de ovo mostrado em C. encarte mostra os eixos torneadas: o eixo dos X é para baixo (seta verde), eixo-Z é agora para a esquerda (seta azul), e o eixo dos Y é para o visor (vermelho). As células individuais são borradas devido à baixa resolução no eixo Z; Assim, a nova abordagem mostrado na B representa uma melhoria significativa de imagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparando a expressão de proteínas em domínios lateral e anterior do epitélio folicular de uma câmara de ovo etapa 8. (A) Reconstrução de uma vista lateral de uma câmara de ovo etapa 8 de visgun (VSG) -GFP repórter <sup> 21-23, manchado por anticorpos dirigidos contra GFP ou ARM (branco). DAPI marca os núcleos em azul, e os grandes núcleos de células enfermeira são aparentes. VSG se localiza canais circulares de células foliculares (verde). (BB ') End-on vistas de um chamber.Three-dimensional reconstrução ovo de uma Z-stack de imagens de um estágio de 8 VSG-GFP câmara repórter ovo, corado com como indicado anticorpos primários. Proteína SLBO (vermelho) é detectado em ambos os núcleos de células polares e de fronteira. ARM marca membranas das células do folículo e é enriquecida em células de fronteira; DAPI etiquetas núcleos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Imagem de fase 9 câmaras de ovos precoces. (A) Vista lateral de um início de fase 9 slbo -reporter câmara de ovo. As células de fronteira (verde) foram agrupadas dentro do epitélio anterior (seta branca). BC) End-on vista para as câmaras de ovo. Reconstrução tridimensional de um Z-stack de imagens a partir de uma fase inicial 9 gene slbo- câmara repórter ovo, coradas utilizando anticorpos primários dirigidos contra as proteínas como indicado ou GFP. (B) slbo> GFP é expresso nas células de fronteira (verde) , enquanto fasciclina 3 (FAS3, branco) localiza altamente para a membrana entre as duas células polares; DAPI marca o núcleo (azul). Asteriscos Magenta indicam células polares. (C) Ambos nuclear (ativada) STAT e slbo> expressão GFP são encontrados apenas nas células de fronteira, enquanto caderina-E (E-CAD) marca as membranas das células do folículo, e DAPI indica os núcleos. Magenta asteriscos indicam células polares. Resultados de coloração são apresentados individualmente para slbo> GFP (C ') e STAT (C' ') Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós descrevemos um método para montar e pequena imagem, o desenvolvimento de câmaras de ovos de uma perspectiva end-on. Técnicas comuns para câmaras de ovos de imagem são otimizados para vistas laterais e permitir principalmente a visualização precisa das células do folículo medio-lateral quando coradas com anticorpos fluorescentes. O uso de Z-stacks ou 3-D reconstruções auxilia na visualização de vários planos focais, mas ainda é insuficiente para a resolução de sub-celular dos pólos de câmaras de ovos elípticos (Figura 2D). Enquanto isso pode ser superado parcialmente com as mais recentes técnicas de microscopia, como super-resolução de imagem, estes métodos são caros e nem sempre estão disponíveis. Temos de protocolos de imagem vertical adaptado para embriões de Drosophila 24,25 para ser utilizado para as câmaras de ovo muito menores. Existem várias modificações importantes no método para contabilizar o tamanho muito menor de câmaras de ovos, comparado com embriões. Um componente-chave da técnica descrita é a separ físicação de câmaras individuais, que não são exigidas de embriões. Outra variação é a utilização de uma segunda corrediça de glicerina geleia durante a montagem (4.4). O tamanho das câmaras de ovo e à sua fixação através de células de caule para outras câmaras de ovos requer manipulação com a agulha e conduz à destruição da glicerina geleia. Portanto, câmaras de ovos devem ser transferidos com uma agulha para um novo geléia de slides glicerina para montagem (4.5). Imaging Vertical permite a visualização das áreas borrados pelo vistas laterais ou horizontais, revelando novas informações sobre a organização do tecido durante o desenvolvimento dos ovos. Isso levou a novos insights sobre os eventos de padronização, e propomos que esse método poderia ser usado para explorar aspectos adicionais de oogenesis.
Nós determinamos várias etapas críticas na montagem vertical bem sucedido. Nós descobrimos que é necessária para remover as cadeias ovaríolos completamente a partir da bainha durante a dissecação, e câmaras de ovo desejadas devem ser cortadas a partir do ovariole cadeia. A falta de câmaras de ovos livres do ovaríolo torna difícil para pegar a câmara fase de ovo correto (passo 4.3). É recomendável trabalhar com pequenas quantidades de glicerina geleia de cada vez que por alíquotas em tubos. Não aqueça glicerina geléia mais do que duas vezes por causa aquecimento repetido muda sua consistência e impede-o de solidificar adequadamente (3.1). Utilize pontas com filtro para evitar aspiração de geléia em pipetas. Permitir glicerina geléia para solidificar em lâmina de microscópio por pelo menos 8 horas, a 4 ° C. Encurtando esta etapa torna a montagem das câmaras de ovos difíceis (3.6). É importante certificar-se de absorver toda PBS-glicerol a partir de câmaras de ovos montados (4.6). Se demasiado líquido estiver presente, ele impede que a camada superior de glicerina geleia de aderir ao fundo. Neste caso, as câmaras de ovos podem flutuar e mudar de posição. Para obter os melhores resultados de imagiologia, glicerina blocos de gelatina deve ser cortado o mais próximo do lado anterior das câmaras de ovo como fisicamente possível (5.4). Demasiada gelatina glicerina nestalado diminui a qualidade da imagem devido ao aumento da distância entre a amostra e a lamela.
Há algumas advertências de montagem amostras em glicerina geléia. Por um lado, aumenta a distância entre a amostra e o objectivo. Esta distância em alta ampliação, especialmente ao usar um objetivo de petróleo, pode criar dificuldade em focar a amostra, o que pode resultar em má qualidade de imagem. Diante disso, é muito importante para esculpir os blocos de geléia de glicerina muito próximos para as câmaras de ovo. Embora a geléia glicerina é opticamente clara, ele faz defract alguma luz. Outra limitação é que o sinal de anticorpo pode ser reduzida devido a uma combinação de distância de funcionamento do objectivo e a espessura de glicerina geleia. Um aumento na concentração de anticorpos tanto primária e / ou secundária podem, por vezes, ajudar a reduzir este problema. Embora varie por anticorpos, que normalmente adquiridos melhores imagens usando o dobro da concentração de formiga secundárioibody vertical em imagem em comparação com a quantidade utilizada na imagiologia lateral do padrão. Sabemos da falta de alternativas para glicerina geléia para a montagem de câmaras de ovo em pé. Outros materiais, como agarose e poliacrilamida foram julgados, mas todos fraccionado luz mais severamente, causando uma perda de clareza enquanto imagem. Assim, esta técnica de montagem é o melhor que está atualmente disponível para uso com microscopia padrão.
Enquanto nós nos concentramos nas fases de especificação celular fronteira e início de motilidade, câmaras de ovos de diferentes estágios poderia ser usado neste protocolo, com apenas alguns pequenos ajustes. Mais importante ainda, o calibre da agulha pode ser alterado para manipular câmaras de ovos de diferentes tamanhos e estádios de desenvolvimento. Para etapas 7-10, uma agulha 30 G funciona bem porque as câmaras de ovos caber facilmente no bisel. Para câmaras fase de ovo anteriores uma agulha de calibre maiores (menores de bisel) deve ser usado de forma semelhante e um calibre menor (bisel maiores) deve ser usado para mais tarde stcâmaras de ovos idoso. Qualquer coisa em um estágio de desenvolvimento mais velho seria grande demais para esse calibre (4.3). Também qualquer lado da câmara de ovo pode ser fotografada usando esta técnica, organizando o bloco glicerina geléia de câmaras de ovo com a área de interesse para o objectivo.
Montagem pequenas amostras suportadas em glicerina geléia tem o potencial para ser útil em vários contextos. Esta estratégia pode ser usada para visualizar os diferentes tipos de tecidos, pequenas fixos de outros organismos, especialmente quando seria insuficiente para examinar as amostras de apenas uma perspectiva. Uma vez que esta técnica é dominada, ele pode ser usado para visualizar as câmaras de ovos em qualquer ângulo desejado, dependendo da forma como as câmaras de ovo são posicionados na geleia. Este método permite a criação de uma vista única compreensão tridimensional muito melhor de organização celular. Imagiologia na posição vertical de câmaras de ovo em conjunção com a coloração de imunofluorescência permite a detecção precisa de proteínas e célula-célula contatos que não seria possível em condições de montagem padrão. Pretendemos utilizar este método no mapeamento das interações célula-célula que permitam a coalescência e desapego do grupo de células de fronteira a partir do epitélio. Neste momento, a técnica de imagem vertical não pode ser usada com amostras vivas, mas que também estão a trabalhar para superar este obstáculo. Prevemos que este método também será aplicável ao estudo de outros aspectos de Drosophila oog�ese, ou pode ser adaptado para outros tecidos da imagem pequena em novos ângulos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
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