Summary
La rata, debido a su tamaño, la disponibilidad, y el comportamiento más bien dócil, se ha utilizado como un modelo de investigación durante muchos años. El objetivo de este protocolo es el de utilizar la rata como modelo de curación de la piel de la herida isquémica proporcionar información valiosa sobre la fisiopatología de las heridas crónicas.
Abstract
La propensión de las heridas crónicas en humanos aumenta con la edad, condiciones de la enfermedad como la diabetes y la función cardiovascular deteriorada, y la presión, debido a la inmovilidad. Los modelos animales han sido desarrollados que intento de imitar estas condiciones con el propósito de fomentar la comprensión de la complejidad de las heridas crónicas. El modelo descrito en este documento es un modelo de colgajo de piel de rata isquémico que permite una reducción prolongada del flujo de sangre que resulta en heridas que se convierten en isquémica y se asemejan a un fenotipo crónica de la herida (vascularización reducida, aumento de la inflamación y de cierre de heridas retardada). Se compone de una aleta dorsal bipediculado con 2 heridas isquémicas colocados centralmente y 2 heridas no isquémicas lateral a la solapa como controles. Una novela Además de este modelo de colgajo de piel isquémica es la colocación de una lámina de silicona debajo de la solapa que funciona como una barrera y una férula para evitar la revascularización y reducir la contracción como las heridas se curan. A pesar de ladebate de la utilización de las ratas para estudios de curación de la herida debido a sus diferencias anatómicas y fisiológicas muy diferentes en comparación con los seres humanos (es decir, la presencia de un músculo panículo carnoso, corta vida, aumento del número de folículos pilosos, y su capacidad de curar heridas infectadas) las modificaciones empleadas en este modelo convierten en una alternativa valiosa a los modelos de colgajo de piel isquémicos desarrollados anteriormente.
Introduction
El desarrollo de medicamentos eficaces y otras terapias de curación de heridas requieren apropiado en modelos in vivo, a pesar de los problemas conocidos en traducir los resultados en modelos animales para terapias humanas 1. Lo que sigue es una descripción de un protocolo detallado para el uso de un modelo de rata de la cicatrización de heridas isquémicas para investigar los mecanismos que promuevan la comprensión de la curación de heridas patológico. Las especies de ratas, a menudo empleado debido a su amplia disponibilidad, tamaño y naturaleza dócil se utiliza para estudios de curación de heridas, ya que es lo suficientemente grande como para proporcionar un área de la piel adecuado para heridas por incisión y escisión, de imágenes y de recogida de tejido 2. Sin embargo debe tenerse muy en cuenta que la piel de una rata y un ser humano son diferentes anatómicamente, con las ratas que se refiere a los animales como de piel suelta. Esta característica distintiva permite la contracción de la herida, en lugar de la epitelización de contribuir de manera significativa al cierre de piel de rata wounds 2. Además, la presencia de un músculo panículo carnoso subcutánea en ratas, contribuye a la curación por tanto la contracción de colágeno y la formación de 3,4. Estas distinciones anatómicas muy importantes fueron considerados en el desarrollo del modelo de herida en la piel isquémica rata y modificaciones específicas se llevaron a cabo para disminuir la contracción de la herida y reducir la influencia del panículo carnoso muscular 5.
En las úlceras del pie diabético, úlceras venosas de las piernas y las úlceras por presión, la curación se retrasa y estas heridas se considera crónica. Las heridas se caracterizan por la inflamación excesiva, lo que impide la herida progrese a las siguientes fases de la reparación de heridas 6. Uno de los principales factores en el desarrollo de una herida crónica es la isquemia localizada de tejido (reducción del flujo sanguíneo) 5 contribuir a la incapacidad para eliminar la inflamación. En el momento en que se está desarrollando este modelo y validada (en 2003-4), No había modelos animales estandarizados que podrían proporcionar suficiente tejido para probar la inducción de la angiogénesis en el lecho de la herida, una etapa clave durante la cicatrización normal de las heridas y la motivación para el desarrollo de este modelo 5. Dicho esto, el modelo presentado aquí es una modificación del modelo de herida isquémica originalmente descrito por Schwartz et al. 7 y, posteriormente, se utiliza en forma modificada por Chen et al. 8
En el modelo de herida isquémica modificado, se han hecho cambios para eludir las características anatómicas antes mencionadas de la rata que conducen a la curación por la contracción en lugar de epitelización: (1) Dos heridas por escisión de espesor completo se crean dentro de una aleta y la piel dorsal bipediculado muscular panículo carnoso se elimina de lecho de la herida mediante la disección justo encima de la fascia muscular. (2) El colgajo en sí tiene dimensiones más estrechas, lo que garantiza que el suministro de sangre es al azar y las heridas localizadas en el punto medio de tque solapa son isquémicos. (3) Una lámina de silicona se inserta debajo de la solapa, evitando readherence y reperfusión de la solapa de tejido subyacente. Contracción de la herida es limitada (no eliminado) mediante el anclaje de sutura o la solapa a la hoja de silicona 5.
El modelo ha sido utilizado recientemente en estudios que van desde efectos de oxígeno hiperbárico en la herida isquémica curación 9,10 para la cicatrización de heridas isquémicas en jóvenes frente a ratas de edad 11 y ha demostrado ser un modelo fiable de prolongada isquemia tisular. Las dimensiones de la aleta bipediculado también se han adaptado a diferentes cepas de ratas Sprague Dawley, incluyendo (11 cm de largo por 2 cm de ancho) y ratas F344 (10,5 cm de largo por 3.0-3.5 cm de ancho) y otras especies, incluyendo porcina 12 y los ratones 13,14. Este video utiliza el F344 cepa de rata endogámica en la manifestación del modelo de herida en la piel isquémica.
La aprobación para todos los procedimientos con animales se presentan a continuación era obtenered de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales del Sur de la Florida (IACUC) y cumplir con todos los requisitos de la Ley de Protección de los Animales y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
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Protocol
NOTA: La aprobación para todos los procedimientos con animales se presentan a continuación se obtuvo de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales del Sur de la Florida (IACUC) y cumplir con todos los requisitos de la Ley de Protección de los Animales y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de hojas de silicona y los instrumentos quirúrgicos
- Tiras precortadas (10,5 cm x 3,0 cm) de no reforzarse 0.01 grosor, láminas de silicona de grado médico y esterilizar en autoclave.
- Limpiar y esterilizar instrumentos quirúrgicos adecuados (tijeras, pinzas y cortinas o toallas para crear un campo estéril durante la cirugía).
2. Los animales de experimentación
- Utilice macho adulto o ratas hembra con un peso en el rango de 250 a 350 g obtenido de un criador comercial. Si se utilizan ratas de edad, deben ser ≥350 g con el fin de garantizar una mejor supervivencia después de la cirugía. Antes del inicio de cualquier experimento todos los animales aclimatarse durante al menos7 días en condiciones estándar de un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con alimento y agua ad libitum.
3. Anestesia, Analgesia preoperatoria y preparación Operativo
- Inducir la anestesia general mediante el uso de isoflurano al 3% -4% a través de una cámara de inducción y mantener (a través de uso de un cono de la nariz) al 1% -2% con O 2 durante la preparación de la piel y la cirugía. Monitorear la profundidad de la anestesia mediante la observación de la frecuencia y profundidad de la respiración, la pizca interdigital o reflejo de parpadeo palpebral.
NOTA: En este momento, un ungüento veterinario puede ser colocado en los ojos para evitar la sequedad mientras el animal está bajo anestesia. - En un remoto lugar de la zona quirúrgica estéril, coloque la rata en la posición prona y afeitarse el dorso con una maquinilla de la base del cuello hasta aproximadamente 11 cm. Stencil con marcador permanente, el esbozo de la 3.0 cm x 10.5 cm solapa (ver Figura 1).
- Mueva la rata a un lugar limpio, Surgica designadol zona equipada con una almohadilla térmica aprobado y cortinas o toallas quirúrgicos estériles. Inyectar 5 mg / kg por vía subcutánea ketoprofeno antes de las primera incisiones quirúrgicas para el tratamiento del dolor. Fluidos adicionales (solución salina) se pueden dar (hasta 5 cc) por vía subcutánea según sea necesario.
- Preparar la piel aún más en muestras de secreciones en primer lugar con 70% de alcohol isopropílico y el segundo con clorhexidina al 0,2%, a continuación, aplicar paños estériles para crear un campo estéril. 10% de povidona-yodo (Betadine) también se puede utilizar.
NOTA: Un antibiótico (ampicilina a 15 mg / kg) se puede administrar por vía subcutánea, pero si se utilizan buenas técnicas asépticas no se requiere.
4. Creación de Heridas escisionales y bipediculado Flap
- El uso de un desechable 6 mm herramienta de punzón de biopsia estéril, crear dos heridas circulares "isquémicos" en el centro de la zona de la aleta designada (Figura 1B). La profundidad de la herida debe estar hacia abajo para (no a través de) la fascia subyacente de la carno panículomuscular SUS (Figura 1B recuadro).
- Utilizando unas pinzas levantar la piel en el centro del contorno de la herida creada por la biopsia en sacabocados y luego usar tijeras iris (con puntas curvadas) para escindir la pieza circular de tejido (incluyendo el músculo panículo carnoso). El resultado será un espesor total de la herida con la fascia como la base de la herida.
NOTA: El tejido extirpado (tapones de heridas) se pueden congelaron rápidamente en nitrógeno líquido o se fijaron en 10% de formalina tamponada con O / N para su posterior procesamiento como control, la piel normal. - Crear un colgajo bipediculado haciendo incisiones con un bisturí estéril a cada lado de las heridas isquémicas a lo largo de las líneas de pre-dibujadas (Figura 1C) que son 10,5 cm de longitud y 3,0 cm de distancia. La profundidad de las incisiones debe estar abajo a los músculos paravertebrales. Usando tijeras iris, separar la fascia panículo carnoso de los músculos paravertebrales, teniendo cuidado de mantener intacta como la "base" de los punzones 6 mm de la fascia (Figura 1D).
- Tome 1 hoja de silicona pre-corte estéril y colóquelo en entre la fascia panículo carnoso y los músculos paravertebrales (Figura 1E) asegurando que la hoja no se tuerce o retirarse. El uso de negros suturas, no absorbibles (tamaño 4,0) cerrar ambas incisiones mediante el anclaje de la hoja de silicona a la piel con por lo menos 8 puntos interrumpidos en cada lado, a lo largo de la longitud de la aleta (Figura 1F y 1G).
- Usando una herramienta de punzón de biopsia desechable estéril, crear dos heridas de control "no isquémicas" internos (hasta la fascia anterior del músculo panículo carnoso) 1 cm lateral a las heridas isquémicas en cada lado de la solapa (Figura 1G).
- Coloque una regla debajo de las heridas y tomar fotos digitales a efectos de valoración de la herida (ver Figura 3A). En este momento, el flujo sanguíneo (perfusión) se puede controlar mediante el uso de láser Doppler u otras manipulaciones (colocación fármaco tópico) realizadas.
- Aplicar un adhesivo líquido aprobado tanto craneal y caudal a las heridas y una película de apósito transparente para mantener el entorno de la herida húmeda y limpia (estéril). Un apósito adicional se puede colocar en el extremo caudal de la solapa para evitar que el animal de la eliminación de las suturas más caudal.
Procedimientos 5. postoperatorias
- Coloque los animales en jaulas (alojados individualmente) equipados con alimentadores de poca profundidad a fin de evitar que el sitio quirúrgico roce contra el alimentador. Los animales no deben ser desatendidos o devueltos a la compañía de otros animales hasta recuperar la conciencia suficiente para mantener decúbito esternal y exhibir movimientos intencionales. Esteras de calefacción deben ser colocados debajo de la mitad de la jaula para un máximo de 2 días durante la recuperación.
- Para controlar el dolor después de la operación, administrar ketoprofeno (5 mg / kg) por vía subcutánea a los animales por la mañana y 1 vez al día siguiente para un máximo de 48 horas después de la cirugía. Los animales también deben ser controlados diariamente porsignos prolongados de dolor, pérdida de peso o infecciones del sitio quirúrgico.
6. Medidas de heridas posteriores y los cambios de apósito
- Mida heridas isquémicas y no isquémicas frecuencia bajo anestesia general usando isoflurano al 3% -4% a través de una cámara de inducción y mantenido (a través de un cono de la nariz) al 1% -2% con O 2 como en el paso 3.1.
- Retire el apósito con cuidado para no tirar el adhesivo de la piel. En este momento las fotos digitales adicionales se toman para las mediciones de la herida, los tratamientos tópicos reaplicarán, Doppler láser (LDI) u otras manipulaciones realizadas para satisfacer las necesidades del investigador.
- Aplique el adhesivo y un apósito limpio y que el animal pueda recuperarse como en el paso 5.1.
7. Herida Collection y la eutanasia
- Isquémica Cosecha y heridas no isquémicas (en día que el investigador considere apropiado) mientras el animal está bajo anestesia general usando isoflurano al 3% -4% a través de un indcámara de ucción y mantenido (a través de un cono de la nariz) al 1% -2% con O 2 como en el paso 3.1.
- El uso de un bisturí, hacer una escisión de forma cuadrada alrededor de la herida para incluir algo de tejido sano alrededor de la herida. Coloque la escisión en un 1,5 ml complemento tubo con tapa y broche de congelación en nitrógeno líquido (conservar a -80 ° C) para futuros análisis molecular o incubar en formalina al 10% O / N a temperatura ambiente durante el procesamiento histológico.
NOTA: Las escisiones herida también se pueden cortar por la mitad para dar más muestras para su análisis. - Después de la eliminación tejido de la herida, la eutanasia a los animales usando el método de inhalación de CO2 aprobado.
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Representative Results
El protocolo de la rata modelo de curación de la herida isquémica debe tomar aproximadamente 20 minutos por animal si se realiza de manera eficiente. Antes de la aplicación de un apósito el modelo debe aparecer como se representa en la Figura 1G. Será importante verificar que la solapa y heridas bipediculado el mismo son isquémica. La tensión de oxígeno subcutánea (funcionario de supervisión 2) a nivel de las heridas se ha medido durante la validación de este modelo 5 mediante la colocación de un electrodo polarográfico en el tejido subcutáneo entre las dos heridas isquémicas. Funcionario de supervisión 2 valores estaban en el rango crítico isquémica (20-40 mmHg). Desde el desarrollo de este modelo, el uso de LDI cada vez más se ha utilizado para medir la perfusión sanguínea y esta técnica le dará información adecuada sobre el estado de isquemia del colgajo bipediculado.
Brevemente, la técnica de LDI se basa en la emisión de un haz de luz láser realizado por una sonda de fibra óptica. El measuriprofundidad ng depende de las propiedades del tejido y la longitud de onda de la luz láser. En la piel normal, un instrumento con una sonda con la separación estándar de fibra (0,25 mm) y un láser de longitud de onda de 780 nm, la medición de la profundidad será del orden de 0,5-1 mm. Una imagen Doppler representante (izquierda) de una aleta dorsal bipediculado que muestra tanto un área perfundida (a la izquierda de la línea de sutura) y el área de no perfundido (a la derecha de la línea de sutura) se muestra en la Figura 2.
Además de medir la tensión de oxígeno subcutánea, también se puede utilizar sondas o marcadores bioquímicos comunes para establecer que las heridas en la solapa son isquémica. PECAM-1 o CD31 que normalmente se encuentran en las células endoteliales vasculares es un marcador para la formación de nuevos vasos en las heridas. Varios marcadores de especies reactivas de oxígeno, que se encuentran elevados en heridas isquémicas, están disponibles comercialmente a menudo anticuerpos o indicadores superóxido como fluorescentes etiquetadas como dihydroethidium (DHE).
Wound mediciones de área para el seguimiento de cierre de la herida pueden ser representados en una variedad de maneras. Comúnmente, área de la herida se cuantifica a partir de imágenes digitales de las heridas durante el curso del tiempo de curación 11 utilizando una fórmula como (6 mm área de la biopsia punch = (π) r 2 = 3,14 x 9 = 28,26 mm 2 en el día 0) con los datos presentados como porcentaje de área inicial de la herida o área de superficie de la herida en un día en particular pueden ser cuantificados como en Gould et al. 5 A los efectos de esta demostración, la progresión de cierre de la herida se representa como por ciento del área de la herida inicial durante un transcurso de tiempo de 28 días . Utilizando el ImageJ software libre, una imagen digital se abrió y la escala se ajusta con 10 mm en la regla en la imagen (Figura 3A). Una línea trazada a 10 mm de longitud equivale a un número de píxeles (inserción en la Figura 3A) que se puede convertir en una unidad de elección, en este caso (mm). A continuación, la circunferencia de la herida se trazó en la imagen (Figura 3B) y una vez que se da la orden de medida, el área se presenta en mm (inserción en la Figura 3B). Los datos a continuación, se puede presentar como porcentaje de área de la herida inicial en el eje Y y día en el eje x (Figura 3C).
Figura 1. Las fotografías que representan pasos durante la cirugía para crear heridas isquémicas, la solapa bipediculado, y heridas no isquémicas. (A) la eliminación del vello antes de la cirugía y la preparación de la piel de una rata anestesiada recibir una dosis pre-quirúrgica de analgésico (ketoprofeno) por vía subcutánea para el tratamiento del dolor. (B y recuadro) heridas isquémicas se crean dentro de los 2 marcadores de incisión utilizando un punzón estéril herramienta de biopsia. (C) Las incisiones se realizan a lo largo de las líneas marcadas hasta el músculo paravertebral y (D) la solapa bipediculado se elevapara mostrar la separación de la aleta (con el panículo carnoso fascia intacta) de la capa muscular de abajo. (E) Una lámina de silicona estéril (flecha negro) se coloca entre la fascia del panículo carnoso y el músculo paravertebral. (F) Negro, suturas no absorbibles (tamaño 4,0) cerca de ambas incisiones mediante el anclaje de la hoja de silicona a la piel con múltiples puntos de sutura interrumpida a lo largo de la longitud de la solapa (G). Dos heridas no isquémicas (flechas negras) se crean usando una herramienta de biopsia por punción lateral estéril a la aleta bipediculado en ambos lados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imagen Doppler láser Representante de la perfusión sanguínea después de la cirugía. El plato de la derechael muestra una imagen en blanco y negro de 2 heridas isquémicas (flechas negras) en el medio de la aleta bipediculado y 1 herida no isquémica (sola flecha negro) laterales de la solapa. La línea de sutura se ha destacado en blanco. El panel izquierdo muestra la imagen de Doppler de la misma zona se muestra en el panel derecho. Las áreas con colores más brillantes son más perfundidos de áreas con azul oscuro. Esta diferencia en la perfusión entre el área no isquémica (izquierda) y el área isquémica (a la derecha) es clara y puede ser seguido a lo largo de toda la longitud de la línea de sutura. Tenga en cuenta que las heridas de ambos lados aparecen brillantes, como los glóbulos están todavía presentes en algún grado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Medición de la herida y representación de datos. (A) Las fotografías digitales que representan medida del área de la herida utilizando el software (ImageJ), la conversión de píxeles de (mm) (flechas negras) y el método para capturar una circunferencia exacta (sola flecha negro) de la herida (B). Los datos estadísticos (media ± SEM de las áreas de la herida en un día determinado), entonces se pueden presentar como porcentaje de área de la herida inicial (día 0) en el eje Y y día en el eje x (C). Los datos del gráfico línea presenta analizaron mediante un ANOVA de 2 vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak, *** representa significativamente mayor (P = 0,0004) que los no-isquémica en el mismo punto (día 10) el tiempo, N = 8 heridas por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La cicatrización de heridas en ratas ha sido a menudo objeto de debate debido a su capacidad de curar las heridas infectadas y alto índice de variabilidad interanimal 5. Uno de los objetivos originales de la modelo durante su desarrollo fue la de disminuir esta variación. Las modificaciones de la anchura de la solapa, reduciendo el número de heridas con colocación específica (centrado en la solapa con la ubicación cráneo-caudal consistente) y la introducción de una hoja de silicona ha logrado este objetivo. La cicatrización de heridas por la contracción también se ha reducido y la curación por la epitelización, como en los seres humanos, es el resultado medido. Adaptación del modelo a una cepa diferente de la rata, es decir, el F344, también ha demostrado su eficacia y se reproduce el grado de isquemia se observa utilizando ratas Sprague Dawley. En general, las técnicas quirúrgicas (biopsia, sutura y escisión de la herida) que se requieren para este modelo son fácilmente adquiridos por la mayoría de los estudiantes y técnicos con experiencia quirúrgica limitada.
_content "> Para lograr coherencia con este modelo, mientras que la realización de múltiples cirugías, se encontró que es importante para crear las heridas isquémica previa a la elevación de la solapa para la colocación de lámina de silicona 5. Además, no perforar a través de la fascia panículo carnoso es crítico para proporcionar una herida viable cama para permanecer sobre la silicona. La silicona actúa no sólo para evitar el recrecimiento vascular sino también como un "férula" que fomenta la re-epitelización de la herida. La aplicación del adhesivo y apósitos para prevenir la infección y mantener un ambiente húmedo para cicatrización de heridas también es importante. Elección del producto puede ser lo que se prefiere o se utiliza en instalaciones de animales del investigador. Sin embargo, no es raro que algunos de los animales para poder eliminar sus aderezos, no importa qué tipo de adhesivo / combinación vestidor es utilizado.El colgajo bipediculado debe permanecer viables durante todo un curso de tiempo de curación que es aproximada ly de 28 días, dependiendo de la cepa de ratas y otras comorbilidades presentes. En raras ocasiones, los abscesos pueden formarse en la solapa (sobre todo cerca de las suturas) y seromas pueden formar debajo de la solapa. El líquido puede ser drenado y la administración de antibióticos si es necesario. Sin embargo, si el colgajo pierde viabilidad y se vuelve necrótico se recomienda que ese animal ya no puede utilizarse. La escisión de la herida para el análisis bioquímico hace introducir variabilidad debido a (1) parte del tejido normal debe ser retenida para el apoyo (2) la elección de la homogeneización del tejido y la preparación para el aislamiento de ARN, ADN o proteína y (3) 5,10 inherente variabilidad interanimal, 11. Se podría considerar este último punto una limitación al modelo y se encontró que la reducción del tamaño de la aleta (<2,0 cm) o trauma aleta puede causar necrosis, lo que indica que pequeñas variaciones en factores tales como los niveles de temperatura o de tensión, también pueden conducir a la variación bioquímicamente detectable entre las muestras de la herida de una rata a otra 5.
ve_content "> En resumen, este modelo, con una aleta longitudinal bipediculado que van desde 2,0 hasta 3,0 cm de ancho y una hoja de silicona colocado estratégicamente, es un modelo fiable de prolongada isquemia tisular. Una vez que el usuario es experto en el uso de las técnicas para crear una herida isquémica coherente, que debe ser capaz de adaptarse a las edades y especies adicionales de roedores (ratones incluido). Las heridas por escisión pueden ser tratados por vía tópica, o tratamientos sistémicos utilizados para explorar más a fondo el mecanismo (s) involucrado en la formación de heridas crónicas, exacerbado respuestas inflamatorias, la angiogénesis aberrante y cierre de la herida retrasada.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sil-Tec medical grade sheeting | Technical Products Inc. | 500-3 | nonreinforced, 0.01 inches in thickness |
| Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS | World Precision Instruments | #503671 | |
| Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | 1964G | black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle) |
| Laser Doppler Imager | Moor Instruments | moorLDI2-IR | Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8 |
| ImageJ | NIH | free download | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
| Mastisol | Henry Schein | Cat # 7289210 | Fisher Scientific NC9774929 |
| Tegaderm | Medical Specialties | 3M1624W | Fisher Scientific NC9922128 |
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