Summary
Il ratto, grazie alle sue dimensioni, disponibilità e comportamento piuttosto docile, è stato utilizzato come modello di ricerca per molti anni. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare il ratto come una pelle ferita modello ischemico guarigione per fornire informazioni preziose sulla fisiopatologia delle lesioni croniche.
Abstract
La propensione per le ferite croniche negli esseri umani aumenta con l'invecchiamento, condizioni di malattia come il diabete e la funzione cardiovascolare compromessa, e la pressione non alleviata a causa di immobilità. I modelli animali sono stati sviluppati che tentativo di imitare queste condizioni al fine di promuovere la nostra comprensione della complessità delle ferite croniche. Il modello qui descritto è un modello lembo cutaneo ischemica topo che permette una riduzione prolungata del flusso sanguigno con conseguente ferite che diventano ischemica e assomigliano un fenotipo cronica ferita (ridotta vascolarizzazione, una maggiore infiammazione e la chiusura della ferita in ritardo). È costituito da un lembo dorsale bipedicled con 2 ferite ischemiche posizionati centralmente e 2 ferite non ischemiche laterale al lembo come controlli. Un romanzo Oltre a questo modello ischemico lembo cutaneo è il posizionamento di un foglio di silicone sotto il lembo che funziona come una barriera e una stecca per prevenire rivascolarizzazione e ridurre la contrazione come le ferite guariscono. Nonostante ladibattito di utilizzare ratti per la guarigione delle ferite studi a causa delle loro differenze anatomiche e fisiologiche ben distinte rispetto per l'uomo (cioè, la presenza di un muscolo pannicolo carnosus, breve durata, aumento del numero dei follicoli piliferi, e la loro capacità di guarire le ferite infette) le modifiche impiegati in questo modello lo rendono una valida alternativa ai modelli lembo cutaneo ischemici precedentemente sviluppate.
Introduction
Lo sviluppo di farmaci efficaci e di altre terapie cicatrizzanti richiedono appropriati modelli in vivo, nonostante i problemi noti a tradurre i risultati in modelli animali per le terapie umane 1. Quella che segue è una descrizione di un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un modello di ratto di ischemico pelle guarigione delle ferite per indagare meccanismi che ulteriormente la comprensione della cicatrizzazione patologica. Le specie di ratto, spesso impiegato per la sua ampia disponibilità, le dimensioni e la natura docile viene utilizzato per gli studi la guarigione di ferite come è grande abbastanza per fornire una zona di pelle adatta per incisionale ed escissionali ferimento, l'imaging e la raccolta dei tessuti 2. Tuttavia dovrebbe essere preso in attenta considerazione che la pelle di un topo e un essere umano sono diversi anatomicamente, con i ratti è stata sottoposta agli animali come sciolto dalla pelle. Questa caratteristica permette distinto per ferita contrazione, piuttosto che epithelialization contribuire in modo significativo alla chiusura di pelle di ratto wounds 2. Inoltre, la presenza di un pannicolo sottocutaneo carnosus muscolare nei ratti, contribuisce alla guarigione sia contrazione e formazione di collagene 3,4. Queste distinzioni molto importanti anatomici sono stati considerati nello sviluppo del modello ischemico ferita della pelle di ratto e specifiche modifiche sono state attuate per diminuire ferita contrazione e ridurre l'influenza del pannicolo carnosus muscolare 5.
In ulcere diabetiche del piede, ulcere venose e ulcere da pressione, la guarigione è ritardata e queste ferite sono considerate croniche. Le ferite sono caratterizzati da infiammazione eccessiva, che impedisce la ferita di progredire alle successive fasi di riparazione della ferita 6. Uno dei principali fattori di sviluppo di una ferita cronica è localizzato ischemia tissutale (ridotto flusso di sangue) 5 contribuire alla incapacità di eliminare l'infiammazione. Al momento in cui questo modello è stato sviluppato e validato (nel 2003-4), Non c'erano modelli animali standardizzati che potrebbero fornire abbastanza tessuto per testare l'induzione dell'angiogenesi nel letto della ferita, una tappa fondamentale nel normale guarigione delle ferite e la motivazione per lo sviluppo di questo modello 5. Detto questo, il modello qui presentato è una modifica del modello ischemico ferita originariamente descritto da Schwartz et al. 7 e successivamente utilizzato in forma modificata da Chen et al. 8
Nel modello ferita ischemica modificata, sono state apportate modifiche di eludere le caratteristiche anatomiche di cui sopra del topo che conducono alla guarigione dalla contrazione piuttosto che epithelialization: (1) Due ferite escissionali tutto spessore vengono create all'interno di un lembo cutaneo dorsale bipedicled e la panniculus muscolare carnosus viene rimosso dal letto della ferita sezionando appena sopra la fascia muscolare. (2) Il lembo stesso ha dimensioni più strette, assicurando che apporto di sangue è casuale e le ferite poste nel punto medio di tegli lembo sono ischemica. (3) Un foglio di silicone è inserito sotto il lembo, impedendo readherence e riperfusione del lembo di tessuto sottostante. La contrazione della ferita è limitata (non eliminato) per l'ancoraggio o la sutura del lembo al foglio di silicone 5.
Il modello è stato utilizzato di recente negli studi che vanno dagli effetti di ossigeno iperbarico sulla ferita ischemica guarigione 9,10 per ischemico guarigione della ferita in giovane contro ratti anziani di 11 e ha dimostrato di essere un modello affidabile di ischemia del tessuto prolungata. Le dimensioni del lembo bipedicled sono state adattate a differenti ceppi di ratto, compresi Sprague Dawley (lunga 11 cm e larga 2 cm) e ratti F344 (lunghezza 10,5 centimetri da 3,0-3,5 cm di larghezza) e altre specie, tra 12 e suina topi 13,14. Questo video utilizza la F344 ceppo di ratti inbred nella dimostrazione del modello ischemico ferita pelle.
L'approvazione per tutte le procedure, presentato sotto era ottenereed all'Università del comitato Animal Care del South Florida (IACUC) e rispettare tutti i requisiti della legge sulla protezione degli animali e la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
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Protocol
NOTA: approvazione per tutte le procedure, presentato di seguito è stato ottenuto presso l'Università del comitato Animal Care del South Florida (IACUC) e rispettare tutti i requisiti della legge sulla protezione degli animali e la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Preparazione di fogli di silicone e strumenti chirurgici
- Strisce pretagliate (10,5 centimetri x 3,0 cm) di non rinforzati 0,01 di spessore, di grado medico teli di silicone e sterilizzare in autoclave.
- Pulire e sterilizzare idonei strumenti chirurgici (forbici, pinze e tende o asciugamani per creare un campo sterile durante l'intervento chirurgico).
2. Gli animali sperimentali
- Utilizzare maschio adulto o ratti femmina di peso nella gamma 250-350 g ottenuti da un allevatore commerciale. Se vengono utilizzati ratti anziani, dovrebbero essere ≥350 g per garantire post-chirurgia migliore sopravvivenza. Prima dell'inizio di qualsiasi esperimenti acclimatarvi tutti gli animali per almeno7 giorni in condizioni standard di un ciclo luce-buio 12 ore con cibo e acqua ad libitum.
3. Anestesia, Analgesia pre-operatoria e di preparazione operativa
- Indurre anestesia generale utilizzando isoflurano al 3% -4% tramite una camera di induzione e mantenere (mediante uso di un cono) a 1% -2% di O 2 durante la preparazione della pelle e chirurgia. Monitorare la profondità dell'anestesia dall'osservazione del tasso e la profondità della respirazione, pinch interdigitale o palpebrale riflesso corneale.
NOTA: In questo momento, un unguento veterinario può essere posizionato sugli occhi per prevenire la secchezza mentre l'animale è sotto anestesia. - In una remota località della zona chirurgica sterile, collocare il topo in posizione prona e radersi il dorso con Clippers dalla base del collo in giù circa 11 centimetri. Stencil con pennarello indelebile, la traccia per il 3,0 centimetri x 10,5 centimetri falda (vedi Figura 1A).
- Spostare il ratto di un ambiente pulito, surgica designatozona l dotato di un rilievo di riscaldamento approvato e teli o asciugamani chirurgici sterili. Iniettare 5 mg / kg per via sottocutanea ketoprofene prima delle prime incisioni chirurgiche per la gestione del dolore. Altri fluidi (saline) possono essere dati (fino a 5 cc) per via sottocutanea come necessario.
- Preparare la pelle ulteriormente tampone prima con 70% di alcool isopropilico e secondo con clorexidina 0,2%, quindi applicare teli sterili per creare un campo sterile. 10% iodopovidone (Betadine) può essere utilizzato anche.
NOTA: Un antibiotico (ampicillina a 15 mg / kg) può essere somministrato per via sottocutanea, ma se sono usate buone tecniche asettiche non è necessaria.
4. Creazione di Ferite escissionali e Bipedicled Flap
- Utilizzando un sterili monouso 6 millimetri strumento biopsia, creare due ferite circolari "ischemici" nel centro dell'area lembo designata (Figura 1B). La profondità della ferita dovrebbe essere giù a (non attraverso) la fascia sottostante del Carno pannicolosus muscolare (Figura 1B nel riquadro).
- Uso pinze sollevare la pelle al centro del contorno ferita creata dalla biopsia e quindi utilizzare le forbici iris (con punte curve) per asportare il pezzo circolare di tessuto (compreso il carnosus muscolo pannicolo). Il risultato sarà un tutto spessore avvolto con la fascia come base della ferita.
NOTA: Il tessuto asportato (tappi ferita) può essere a scatto congelati in azoto liquido o fissati in 10% tamponata-formalina O / N per l'elaborazione successiva come il controllo, la pelle normale. - Creare un lembo bipedicled facendo incisioni con un bisturi sterile su ogni lato delle ferite ischemiche lungo le linee pre-elaborato (Figura 1C) che sono 10,5 centimetri di lunghezza e 3,0 centimetri di distanza. La profondità delle incisioni dovrebbe essere giù ai muscoli paraspinali. Utilizzando forbici iris, separare la fascia pannicolo carnosus dai muscoli paraspinali, facendo attenzione a mantenere intatta la "base" dei punzoni 6 millimetri la fascia (FIGURA 1D).
- Prendere 1 sterile foglio di silicone pre-tagliati e posizionarlo tra la fascia pannicolo carnosus e muscoli paraspinali (Figura 1E) assicurando che il foglio non fibbia o piegare. Usando nero, suture non assorbibili (formato 4.0) chiude entrambi incisioni ancorando il foglio di silicone per la pelle con almeno 8 interrotte punti su ciascun lato, lungo la lunghezza del lembo (Figura 1F ed 1G).
- Utilizzando un sterili monouso punzone biopsia, creare due controllo ferite "non-ischemici" interni (fino alla fascia anteriore del muscolo carnosus panniculus) 1 cm lateralmente alle ferite ischemici su entrambi i lati del lembo (Figura 1G).
- Posizionare un righello sotto le ferite e scattare foto digitali per scopi di misurazione della ferita (vedi Figura 3A). In questo momento, il flusso di sangue (perfusione) può essere monitorato utilizzando Doppler laser o altre manipolazioni (collocamento farmaco topico) eseguite.
- Applicare un adesivo liquido approvato sia craniale e caudale per le ferite e una pellicola trasparente spogliatoio per mantenere l'ambiente umido e pulito (sterile). Una medicazione supplementare può essere posizionato all'estremità caudale del lembo per impedire all'animale di rimuovere le suture più caudale.
Procedure 5. post-operatorie
- Inserire animali in gabbia (singolarmente alloggiati) dotati di alimentatori superficiale in modo da prevenire il sito chirurgico da sfregamento contro l'alimentatore. Gli animali non devono essere lasciati incustoditi o restituiti alla compagnia di altri animali fino a che riprendano conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale ed esibire movimento deciso. Tappeti di riscaldamento devono essere posti sotto la metà della gabbia per un massimo di due giorni durante il recupero.
- Per gestire il dolore post-operatorio, amministrare Ketoprofene (5 mg / kg) per via sottocutanea per gli animali al mattino e 1 volta al giorno successivo per la post-intervento chirurgico fino a 48 ore. Gli animali devono essere monitorati ogni giorno persegni prolungati di dolore, perdita di peso o infezioni del sito chirurgico.
6. Misure Ferita successive e cambi di medicazione
- Misurare ferite ischemiche e non ischemiche spesso in anestesia generale con isoflurano al 3% -4% tramite una camera di induzione e mantenuto (tramite un cono) al 1% -2% di O 2 come al punto 3.1.
- Rimuovere delicatamente la medicazione per non tirare l'adesivo dalla pelle. In questo momento altre foto digitali sono prese per le misure della ferita, i trattamenti topici ri-applicati, laser Doppler Imaging (LDI) o altre manipolazioni effettuate in base alle esigenze del ricercatore.
- Applicare l'adesivo e una medicazione pulita e permettere all'animale di recuperare come al punto 5.1.
7. Ferita Collection e l'eutanasia
- Harvest ischemica e le ferite non ischemiche (nei giorni sperimentatore ritenga necessari), mentre l'animale è in anestesia generale con isoflurano al 3% -4% tramite un indCamera uzione e mantenuto (tramite un cono) al 1% -2% di O 2 come al punto 3.1.
- Usando un bisturi, fare una escissione di forma quadrata attorno alla ferita per includere qualche tessuto sano intorno alla ferita. Posizionare il escissione in un 1,5 ml scatto tubo cap e scatto congelamento in azoto liquido (conservare a -80 ° C) per l'analisi molecolare futuro o incubare nel 10% formalina tamponata O / N a RT per l'elaborazione istologica.
NOTA: Le escissioni ferita possono essere tagliati a metà per fornire più campioni per l'analisi. - Dopo la rimozione del tessuto della ferita, eutanasia l'animale con il metodo approvato CO 2 inalazione.
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Representative Results
Il protocollo di ratto ischemico modello guarigione dovrebbe durare circa 20 minuti per ogni animale se eseguita in modo efficiente. Prima dell'applicazione di una medicazione modello dovrebbe apparire come rappresentato nella figura 1G. Sarà importante verificare che il lembo e ferite bipedicled ivi sono ischemico. Tensione di ossigeno sottocutaneo (PSCO 2) a livello delle ferite è stata misurata durante la convalida del modello 5 posizionando un elettrodo polarografico nel tessuto sottocutaneo tra le due ferite ischemiche. PSCO 2 valori erano nel range critico ischemico (20-40 mmHg). Dal momento che lo sviluppo di questo modello l'uso di LDI è sempre stato utilizzato per misurare la perfusione di sangue e questa tecnica vi darà informazioni adeguate sullo stato ischemico del lembo bipedicled.
Brevemente, la tecnica LDI si basa sulla emissione di un fascio di luce laser portato da una sonda a fibre ottiche. La misprofondità ng dipende dalle proprietà dei tessuti e la lunghezza d'onda della luce laser. In pelle normale, uno strumento con una sonda con separazione standard di fibra (0,25 mm) e un laser di lunghezza d'onda 780 nm, profondità di misura sarà dell'ordine di 0,5-1 mm. Una immagine rappresentativa Doppler (sinistro) per un lembo dorsale bipedicled mostrando sia un'area perfuso (a sinistra della linea di sutura) e la zona non perfuso (a destra della linea di sutura) è mostrato in Figura 2.
Oltre a misurare tensione di ossigeno per via sottocutanea, si può utilizzare anche una sonda o marcatori biochimici comuni per stabilire che le ferite della falda sono ischemico. PECAM-1 o CD31 che normalmente si trovano sulle cellule endoteliali vascolari è un marker per formazione di nuovi vasi nelle ferite. Vari indicatori per le specie reattive dell'ossigeno, trovati a essere elevato nelle ferite ischemici, sono disponibili in commercio spesso anticorpi o indicatori superossido come fluorescenti-tag come dihydroethidium (DHE).
Wound misurazioni dell'area per monitorare la chiusura della ferita possono essere rappresentati in una varietà di modi. Comunemente, zona ferita è quantificata da immagini digitali delle ferite nel corso tempo di guarigione 11 utilizzando una formula quali (6 mm Area biopsia = (π) r 2 = 3.14 x 9 = 28,26 millimetri 2 al giorno 0) con i dati presentato come percentuale di area iniziale della ferita o superficie della ferita in un particolare giorno può essere quantificata come Gould et al. 5 Ai fini di questa dimostrazione, la progressione chiusura della ferita è rappresentata come percentuale della superficie iniziale ferita nel corso di un corso di tempo di 28 giorni . Utilizzando il software ImageJ gratuito, una foto digitale è aperto e la scala è impostata con 10 millimetri sul righello nell'immagine (Figura 3A). Una linea tracciata 10 mm di lunghezza corrisponde a un numero di pixel (inserto nella Figura 3A) che può essere convertito in una unità di scelta, in questo caso (mm). Successivamente, la circonferenza della ferita è tracciata sull'immagine (Figura 3B) e una volta che viene dato il comando di misura, l'area è presentato in mm (inserto nella Figura 3B). I dati possono poi essere presentato come percentuale di area iniziale avvolto sul y e giorni l'asse x (Figura 3C).
Figura 1. Le fotografie ritraggono passi durante l'intervento chirurgico per creare ferite ischemici, il lembo bipedicled, e le ferite non ischemiche. (A) depilazione pre-chirurgica e la preparazione della pelle di un topo anestetizzato ricevuto una dose pre-chirurgica di analgesico (ketoprofene) per via sottocutanea per la gestione del dolore. (B e riquadro) ferite ischemici sono create all'interno dei 2 marcatori incisione utilizzando un pugno sterile utensile biopsia. (C) incisioni sono fatte lungo le linee tracciate fino al muscolo paraspinali e (D) il lembo bipedicled viene sollevatala separazione è del lembo (con pannicolo carnosus fascia intatto) dallo strato muscolare sottostante. (E) Un foglio di silicone sterile (freccia nera) è posta tra la fascia del carnosus pannicolo e il muscolo paraspinali. (F) Nero, suture non assorbibili (dimensioni 4,0) chiudono entrambe incisioni ancorando il foglio di silicone per la pelle con più interrotto punti lungo la lunghezza del lembo (G). Due ferite non ischemici (frecce nere) sono creati utilizzando una sterile biopsia strumento laterale al lembo bipedicled su entrambi i lati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. laser Rappresentante immagine Doppler di post-chirurgia perfusione di sangue. Il piatto destroel mostra un'immagine in bianco e nero di 2 ferite ischemici (frecce nere) al centro del lembo bipedicled e 1 ferita non-ischemica (singola freccia nera) laterali al lembo. La linea di sutura è stato evidenziato in bianco. Il pannello di sinistra mostra l'immagine Doppler della stessa area raffigurato nel pannello di destra. Le aree con colori più brillanti sono più perfusi di aree con blu scuro. Questa differenza di perfusione tra la zona non-ischemica (sinistra) e l'area ischemica (destra) è chiaro e può essere seguito per tutta la lunghezza della linea di sutura. Si noti che le ferite di entrambe le parti appaiono brillanti, come le cellule del sangue sono ancora presenti in una certa misura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Misurazione delle ferite e la rappresentazione dei dati. (A) Le fotografie digitali raffiguranti misura zona ferita utilizzando il software (ImageJ), la conversione di pixel (mm) (frecce nere) e il metodo per catturare una circonferenza precisa (singola freccia nera) della ferita (B). Dati statistici (media ± SEM delle zone avvolti su un dato giorno) possono poi essere presentato come percentuale della ferita iniziale (giorno 0) sul y e giorni sul asse x (C). I dati grafico lineare presenta analizzati utilizzando un 2-way ANOVA con test di confronto multiplo di Sidak, *** rappresenta significativamente superiore (p = 0,0004) rispetto ai non-ischemica allo stesso punto di tempo (giorno 10), N = 8 ferite per gruppo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La guarigione delle ferite nei ratti è stata spesso oggetto di dibattito a causa della loro capacità di guarire le ferite infette e alto tasso di variabilità interanimal 5. Uno degli obiettivi originali del modello durante il suo sviluppo è stato quello di ridurre questa variazione. Modifiche alla larghezza del lembo, riducendo il numero di ferite con posizionamento specifico (centrate sul lembo con coerente posizione cranio-caudale) e l'introduzione di una carta siliconata ha compiuto questo obiettivo. La guarigione delle ferite per contrazione è stata ridotta e guarigione epitelizzazione, come negli esseri umani, è il risultato misurato. Adattamento del modello di un diverso ceppo di ratti, cioè, la F344, ha anche dimostrato di successo e riproduce il grado di ischemia osservata utilizzando ratti Sprague Dawley. Nel complesso le tecniche chirurgiche (biopsia, sutura e escissione ferita) necessari per questo modello sono facilmente acquisiti dalla maggior parte degli studenti e tecnici con esperienza chirurgica limitata.
_content "> Per ottenere la coerenza con questo modello durante l'esecuzione di interventi chirurgici multipli, si è scoperto che è importante creare le ferite ischemiche prima di elevazione del lembo di foglio di silicone posizionamento 5. Inoltre, non punzonatura attraverso la fascia pannicolo carnosus è fondamentale per fornire una ferita valida letto di rimanere sul silicone. Il silicone non solo agisce per impedire la ricrescita vascolare ma anche come "splint" che incoraggia ferita riepitelizzazione. L'applicazione dell'adesivo e medicazioni per prevenire l'infezione e mantenere un ambiente umido per la guarigione della ferita è anche importante. scelta del prodotto può essere ciò che si preferisce o utilizzato in stabulario del ricercatore. Tuttavia, non è raro che alcuni degli animali per poter rimuovere i loro condimenti, non importa quale tipo di adesivo / combinazione di medicazione è utilizzato.Il lembo bipedicled dovrebbe rimanere vitali durante un corso a tempo di guarigione che è approssimativo ly 28 giorni, a seconda del ceppo di ratti e altre comorbidità presenti. Raramente, ascessi possono formarsi nel lembo (in particolare vicino a punti di sutura) e sieromi possono formare sotto la patta. Fluid può essere scaricato e antibiotici somministrati se necessario. Tuttavia, se il lembo perde vitalità e diventa necrotico si raccomanda che tale animale non è più utilizzabile. Escissione ferita per analisi biochimica fa introdurre variabilità dovuta a (1) un certo tessuto normale deve essere mantenuta per il supporto (2) la scelta di omogeneizzazione preparazione di tessuti e per l'isolamento di RNA, DNA o proteine e (3) la variabilità intrinseca interanimal 5,10, 11. Si potrebbe considerare questo ultimo punto una limitazione al modello e si è riscontrato che la riduzione delle dimensioni del lembo (<2,0 cm) o lembo trauma può causare necrosi, indicando che le variazioni minori in fattori quali temperatura o di stress livelli, possono anche portare a variazioni biochimicamente rilevabile tra i campioni della ferita da un topo ad un altro 5.
ve_content "> In sintesi, questo modello, con una longitudinale lembo bipedicled vanno 2,0-3,0 cm di larghezza e un foglio di silicone in posizione strategica, è un modello affidabile di ischemia del tessuto prolungata. Una volta che l'utente è abile a utilizzare le tecniche per creare una ferita ischemica coerente, dovrebbero essere in grado di adattarsi a età aggiuntivi e specie di roditori (topi incluso). Le ferite escissionale possono essere trattati per via topica, o trattamenti sistemici utilizzati per esplorare ulteriormente il meccanismo (s) coinvolti nella formazione ferita cronica, esacerbato risposte infiammatorie, angiogenesi aberranti e la chiusura della ferita in ritardo.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sil-Tec medical grade sheeting | Technical Products Inc. | 500-3 | nonreinforced, 0.01 inches in thickness |
| Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS | World Precision Instruments | #503671 | |
| Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | 1964G | black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle) |
| Laser Doppler Imager | Moor Instruments | moorLDI2-IR | Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8 |
| ImageJ | NIH | free download | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
| Mastisol | Henry Schein | Cat # 7289210 | Fisher Scientific NC9774929 |
| Tegaderm | Medical Specialties | 3M1624W | Fisher Scientific NC9922128 |
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