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Medicine

Demonstração da Wound modelo de pele de rato Isquêmico

doi: 10.3791/52637 Published: April 1, 2015
* These authors contributed equally

Summary

O rato, devido ao seu tamanho, disponibilidade e de comportamento e dócil, tem sido utilizada como um modelo de pesquisa durante muitos anos. O objetivo deste protocolo é para utilizar o rato como modelo isquêmico cura de feridas cutâneas de fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia das feridas crônicas.

Abstract

A propensão para feridas crônicas em humanos aumenta com a idade, condições de doenças como diabetes e função cardiovascular prejudicada e pressão unrelieved devido à imobilidade. Os modelos animais têm sido desenvolvidos que a tentativa para imitar estas condições para o propósito de promover a compreensão da complexidade de feridas crónicas. O modelo aqui descrito é um modelo de rato de isquemia aba de pele que permite uma redução prolongada do fluxo sanguíneo resultando em feridas que se tornam isquémica e se assemelham a um fenótipo ferida crónica (vascularização reduzida, aumento de inflamação e de encerramento de feridas retardada). Ele consiste de um retalho dorsal bipediculado com 2 feridas isquêmicas colocados centralmente e 2 feridas não-isquêmicas lateral à aba como controles. Uma nova adição a este modelo isquémico aba de pele é a colocação de uma folha de silicone sob a aba que funciona como uma barreira e uma tala para prevenir e reduzir a contração revascularização como as feridas cicatrizam. Apesar dodebate de usar ratos para estudos de cicatrização de feridas devido a suas diferenças anatômicas e fisiológicas bastante distintas em comparação com os seres humanos (ou seja, a presença de um músculo panniculus carnosus, curto tempo de vida, aumento do número de folículos pilosos, e sua capacidade de curar as feridas infectadas) as modificações empregadas neste modelo o tornam uma alternativa valiosa para modelos retalhos cutâneos isquêmicos anteriormente desenvolvidos.

Introduction

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Desenvolvimento de medicamentos eficazes e outras terapêuticas de cura de feridas requerem adequada em modelos in vivo, apesar dos problemas conhecidos em traduzir achados em modelos animais para terapias humanas 1. O que se segue é uma descrição de um protocolo detalhado para a utilização de um modelo de rato da cicatrização de feridas isquémico para investigar os mecanismos que ainda mais a compreensão da cicatrização de feridas patológico. As espécies de rato, muitas vezes empregadas devido à sua ampla disponibilidade, tamanho e natureza dócil é usado para estudos de cicatrização de feridas, pois é grande o suficiente para fornecer uma área de pele adequada para ferir incisional e excisional, imagem e coleta de tecido 2. No entanto, deve ser tido em consideração que o cuidado da pele de um rato e um ser humano são anatomicamente diferente, com ratos a ser referido como animais de pele soltas. Esta característica distinta permite a contração da ferida, ao invés de epithelialization de contribuir significativamente para o encerramento da pele do rato wounds 2. Além disso, a presença de um músculo panículo carnoso subcutânea em ratos, contribui para a cura por ambos contracção e formação de colagénio 3,4. Estas distinções anatómicas muito importantes que foram considerados no desenvolvimento do modelo de ferida cutânea do rato isquémica e modificações específicas foram implementadas para diminuir contracção da ferida e reduzir a influência do panículo carnoso muscular 5.

Em úlceras de pé diabético, úlceras venosas e úlceras de pressão, a cura é atrasada e essas feridas são consideradas crônicas. As feridas são caracterizadas pela inflamação excessiva, o que impede a ferida de progredir para as próximas fases do reparo de feridas 6. Um dos principais factores no desenvolvimento de uma ferida crónica é localizada isquemia tecidual (fluxo sanguíneo reduzido) 5 contribui para a incapacidade para limpar a inflamação. No momento em que este modelo foi sendo desenvolvida e validada (em 2003-4), Não havia modelos animais padronizados que poderiam fornecer tecido suficiente para testar a indução de angiogênese no leito da ferida, um processo importante durante a cicatrização normal e a motivação para o desenvolvimento deste modelo 5. Dito isto, o modelo aqui apresentado é uma modificação do modelo de ferimento isquémico originalmente descrito por Schwartz et ai. 7 e posteriormente utilizado na forma modificada por Chen et al. 8

No modelo de ferida isquêmica modificado, as alterações foram feitas para contornar as características anatômicas mencionadas acima do rato que levam à cura pela contração ao invés de epithelialization: (1) duas feridas por excisão de espessura total são criadas dentro de uma aba e da pele dorsal bipediculado músculo panículo carnoso é removido do leito da ferida por meio de dissecção logo acima da fáscia muscular. (2) A aba em si tem dimensões mais estreitas, garantindo que o fornecimento de sangue é aleatório e as feridas localizadas no ponto central de tele aba são isquêmicos. (3) A folha de silicone é inserida abaixo da aba, impedindo readherence e reperfusão do retalho de tecido subjacente. Contração da ferida é limitada (não eliminados), ancorando ou suturar o retalho para a folha de silicone 5.

O modelo foi recentemente utilizada em estudos que vão desde efeitos oxigênio hiperbárico sobre ferida isquêmica cura 9,10 para a cicatrização de feridas isquêmica em jovem contra ratos com idade entre 11 e provou ser um modelo confiável de isquemia tecidual prolongada. As dimensões da aba bipediculado também foram adaptados para diferentes estirpes de ratos, incluindo Sprague Dawley (11 cm de comprimento por 2 cm de largura) e ratos F344 (10.5 cm por 3,0-3,5 cm de largura) e outras espécies, incluindo ratos e porcos 12 13,14. Este vídeo utiliza o F344 estirpe, ratos na manifestação do modelo de pele ferida isquêmica.

Aprovação para todos os procedimentos com animais apresentados a seguir foi obtered da Universidade do Comitê Animal Care do sul da Flórida (IACUC) e cumprir todas as exigências da Lei do Bem-Estar Animal e do Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório.

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Protocol

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NOTA: A aprovação para todos os procedimentos com animais apresentados a seguir foram obtidos a partir da Universidade do Comitê Animal Care do sul da Flórida (IACUC) e cumprir todas as exigências da Lei do Bem-Estar Animal e do Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação de folhas de silicone e instrumentos cirúrgicos

  1. Tiras pré-cortadas (10,5 cm x 3,0 cm), de não reforçado 0,01 espessura, folhas de silicone de grau médico e esterilizar utilizando uma autoclave.
  2. Limpar e esterilizar instrumentos cirúrgicos adequados (tesouras, pinças e cortinas ou toalhas para criar um campo estéril durante a cirurgia).

2. Animais Experimentais

  1. Use adulto masculino ou ratas com peso na faixa de 250-350 g obtido a partir de um criador comercial. Se ratos idosos são utilizados, eles devem ser ≥350 g, a fim de garantir uma melhor sobrevivência pós-cirurgia. Antes do início de todas as experiências os animais aclimatizar durante, pelo menos7 dias em condições normais de um ciclo de luz-escuro de 12 horas com comida e água ad libitum.

3. A anestesia, analgesia pós-operatória e Preparação operativo

  1. Induzir a anestesia geral usando isoflurano a 3% -4% através de uma câmara de indução e manutenção (através da utilização de um cone de nariz) a 1% -2% com O2 durante a preparação da pele e cirurgia. Monitore a profundidade da anestesia pela observação do ritmo e profundidade da respiração, pitada interdigital ou palpebral reflexo de piscar.
    NOTA: neste momento, uma pomada veterinário pode ser colocado sobre os olhos para evitar a secura, enquanto o animal está sob anestesia.
  2. Em uma remota localização da área cirúrgica esterilizada, coloque o rato em decúbito ventral e raspar o dorso com clippers a partir da base do pescoço para baixo cerca de 11 cm. Stencil com marcador permanente, o esboço para o 3,0 centímetros x 10,5 centímetros aba (ver Figura 1A).
  3. Mova o rato para, um surgica designado limpol área equipada com uma almofada de aquecimento aprovado e campos cirúrgicos estéreis ou toalhas. Injetar 5 mg / kg por via subcutânea cetoprofeno antes das primeiras incisões cirúrgicas para tratamento da dor. Os fluidos adicionais (solução salina) pode ser determinado (máximo de 5 cc) por via subcutânea, conforme necessário.
  4. Prepare a pele ainda mais limpando primeiro com 70% de álcool isopropílico e em segundo lugar com 0,2% de clorexidina, em seguida, aplicar campos estéreis para criar um campo estéril. 10% de povidona-iodo (Betadine) também pode ser usado.
    NOTA: Um antibiótico (ampicilina a 15 mg / kg) pode ser administrado por via subcutânea, mas, se forem utilizadas técnicas assépticas boas, não é necessário.

4. Criação de Feridas excisional e bipediculado Flap

  1. Usando um, descartável 6 milímetros ferramenta biópsia estéril, crie duas circulares feridas "isquêmicos" no centro da área do retalho designado (Figura 1B). A profundidade da ferida deve ser até (e não através) a fáscia do panículo Carnosus músculo (Figura 1B inserção).
  2. Usando fórceps levantar a pele no meio do contorno da ferida criada pelo perfurador de biópsia e, em seguida, utilizar tesouras íris (com pontas curvas) para excisar a peça circular de tecidos (incluindo o músculo panniculus carnosus). O resultado será um de espessura total da ferida com a fáscia como a base da ferida.
    NOTA: O tecido excisado (tampões de feridas) pode ser congelado rapidamente em azoto liquido ou fixadas em 10% de formalina tamponada com O / N para processamento posterior, como controlo, a pele normal.
  3. Criar uma aba bipediculado fazendo incisões com um bisturi estéril em cada lado das feridas isquémicas ao longo das linhas de pré-retiradas (Figura 1C) que são 10,5 centímetros de comprimento e 3,0 cm de distância. A profundidade das incisões deve ser baixo para os músculos paraspinous. Usando uma tesoura de íris, separar o fascia panniculus carnosus dos músculos paraspinous, tomando cuidado para manter a fáscia intacto como a "base" dos mm socos 6 (Figura 1D).
  4. Tome uma folha de silicone pré-corte estéril e colocá-lo no meio da fáscia panniculus carnosus e os músculos paraspinous (Figura 1E), assegurando que a folha não está torto ou desistir. Usando preto, suturas não absorvíveis (tamanho 4.0) fechar as duas incisões, ancorando a folha de silicone para a pele, com pelo menos 8 interrompidos pontos de cada lado, ao longo do comprimento da aba (Figura 1F e 1G).
  5. Utilizando uma ferramenta de punção de biópsia descartável estéril, criar duas feridas de controlo "não-isquémicos" internos (para baixo para a face anterior do músculo panículo carnoso) lateralmente a 1 cm dos ferimentos isquémicos em cada lado da aba (Figura 1G).
  6. Coloque uma régua abaixo as feridas e tirar fotos digitais para fins de avaliação da ferida (ver Figura 3A). Nesta altura, o fluxo sanguíneo (perfusão) pode ser monitorizada por utilização de Doppler a laser ou outras manipulações (colocação tópica do fármaco) realizadas.
  7. Aplique um adesivo líquido aprovado tanto cranial e caudal para as feridas e uma película transparente vestir para manter o ambiente húmido e limpo (estéril). Um curativo adicional pode ser colocado na extremidade caudal da aba para impedir que o animal de remover as suturas mais caudal.

Procedimentos 5. pós-operatórias

  1. Colocar os animais em gaiolas (alojados individualmente) equipados com alimentadores rasas, de modo a impedir que o local cirúrgico de fricção contra o alimentador. Os animais não devem ser deixados sozinhos ou devolvido à companhia de outros animais, até que recupere a consciência suficiente para manter decúbito esternal e apresentam movimento proposital. Esteiras de aquecimento deve ser colocado sob a metade da gaiola para até 2 dias durante a recuperação.
  2. Para controlar a dor no pós-operatório, administrar cetoprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea aos animais pela manhã e 1x por dia seguinte para até 48 horas pós-cirurgia. Animais também devem ser monitorados diariamente porsinais prolongados de dor, perda de peso ou infecções de sítio cirúrgico.

6. Medidas feridas subsequentes e troca de curativos

  1. Medir feridas isquémicas e não isquémicos frequentemente sob anestesia geral usando isoflurano a 3% -4% através de uma câmara de indução e mantido (através de um cone de nariz) a 1% -2% com O 2 como no passo 3.1.
  2. Remover o penso suavemente a não puxar o adesivo da pele. Neste momento fotos digitais adicionais sejam tomadas para medições ferida, tratamentos tópicos reaplicado, o Doppler laser (LDI) ou outras manipulações realizadas para atender às necessidades do investigador.
  3. Aplique o adesivo e um curativo limpo e permitir que o animal possa recuperar como no passo 5.1.

7. Wound Recolha e eutanásia

  1. Isquêmica Colheita e feridas não-isquêmicas (em dias o investigador considerar apropriada), enquanto o animal está sob anestesia geral com isoflurano em 3% -4% através de uma indução câmara e mantido (através de um cone de nariz) a 1% -2% com O 2 como no passo 3.1.
  2. Utilizando um bisturi, fazer uma excisão em forma quadrada em torno da ferida para incluir algum tecido saudável em redor da ferida. Coloque a excisão em 1,5 ml de um tubo com tampa de encaixe e encaixe de congelação em azoto líquido (armazenar a -80 ° C) para análise molecular futuro ou incubar em 10% de formalina tamponada O / N à temperatura ambiente durante o processamento histológico.
    NOTA: As excisões ferida também pode ser cortado pela metade para fornecer mais amostras para análise.
  3. Após a remoção do tecido da ferida, a eutanásia do animal usando o método aprovado de inalação de CO 2.

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Representative Results

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O protocolo de rato modelo cura isquêmico ferida deve demorar cerca de 20 min por animal se realizada de forma eficiente. Antes da aplicação de um penso, o modelo deve aparecer como representado na Figura 1G. Será importante verificar que a aba e as feridas bipediculado aí são isquémicos. Tensão de oxigénio subcutânea (PSCO 2) ao nível das feridas foi medido durante a validação deste modelo 5, colocando um eléctrodo polarográfico no tecido subcutâneo entre os dois ferimentos isquémicos. PSCO dois valores estavam na gama crítica isquémica (20-40 mmHg). Uma vez que o desenvolvimento deste modelo a utilização de LDI cada vez mais tem sido utilizada para medir a perfusão sanguínea e esta técnica vai dar informações adequadas sobre o estado isquêmica do retalho bipediculado.

Resumidamente, a técnica de IDL é baseada na emissão de um feixe de luz laser realizado por uma sonda de fibra óptica. O measuring profundidade depende das propriedades do tecido e o comprimento de onda da luz laser. Na pele normal, um instrumento com uma sonda com separação padrão de fibras (0,25 mm) e um comprimento de onda do laser 780 nm, a medida da profundidade irá ser da ordem de 0,5-1 mm. Uma imagem Doppler representante (à esquerda) para uma aba dorsal bipediculado mostrando tanto uma área perfundido (à esquerda da linha de sutura) e a área não perfundido (à direita da linha de sutura) é mostrado na Figura 2.

Além de medir a tensão de oxigênio subcutânea, pode-se usar sondas ou marcadores bioquímicos comuns para estabelecer que as feridas no retalho são isquêmicos. PECAM-1 ou CD31 normalmente encontrado em células endoteliais vasculares é um marcador para a formação de novos vasos em feridas. Vários marcadores de espécies reativas de oxigênio, que são consideradas elevadas em feridas isquêmicas, estão disponíveis no mercado, muitas vezes como anticorpos ou indicadores superóxido fluorescente-etiquetados como dihydroethidium (DHE).

Wound medições de área para controlar o fechamento da ferida pode ser representado de uma variedade de maneiras. Geralmente, a área da ferida é quantificada a partir de imagens digitais das feridas ao longo do tempo de cura 11, utilizando uma fórmula tal como (6 mm Área biópsia = (π) r 2 = 3,14 x 9 = 28,26 milímetros 2 no dia 0) com dados apresentada como percentagem de área ferida inicial ou com a superfície da ferida em um dia em particular pode ser quantificado como em Gould et al. 5 Para os efeitos da presente demonstração, progressão de fecho de feridas é representada como percentagem de área ferida inicial ao longo de um curso de tempo de 28 dias . Usando o ImageJ software livre, uma foto digital é aberta e a escala é definida usando 10 milímetros na régua na imagem (Figura 3A). Uma linha traçada a 10 mm de comprimento iguala a uma contagem de pixels (inserida na Figura 3A), que pode ser convertido num aparelho de escolha, neste caso (mm). Em seguida, a circunferência da ferida é traçada na imagem (Figura 3B) e uma vez que o comando medida é dada, a área é apresentada em mm (inserida na Figura 3B). Os dados podem então ser apresentados como percentagem de área ferida inicial no eixo y e os dias no eixo-x (Figura 3C).

Figura 1
Figura 1. fotografias retratando passos durante a cirurgia para criar feridas isquêmicas, o retalho bipediculado e feridas não-isquêmicas. (A) a remoção do cabelo pré-cirúrgica e preparação da pele de um rato anestesiado receber uma dose pré-cirúrgica de analgésico (cetoprofeno) por via subcutânea para tratamento da dor. (B e inserção) feridas isquêmicas são criados dentro dos 2 marcadores de incisão através da utilização de um soco estéril ferramenta de biópsia. (C) As incisões são feitas ao longo das linhas marcadas para baixo para o músculo paraspinous e (D) a aba é levantada bipediculadopara mostrar a separação da aba (com o panículo carnoso fáscia intacta) a partir da camada muscular abaixo. (E) uma folha de silicone estéril (seta preta) é colocada entre o painel frontal do panículo carnoso e o músculo paraspinous. (F) preto, suturas não absorvíveis (tamanho 4.0) fechar ambas as incisões, ancorando a folha de silicone para a pele com múltiplos pontos interrompidos ao longo do comprimento da aba (L). Duas feridas não-isquêmicas (setas pretas) são criadas usando uma ferramenta de biópsia de lateral estéril para o retalho bipediculado em ambos os lados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. imagem Doppler a laser Representante da perfusão sanguínea pós-cirurgia. O pan direitael mostra uma imagem em preto e branco de duas feridas isquêmicas (setas pretas) no meio do retalho bipediculado e uma ferida não-isquêmica (single seta preta) laterais para o retalho. A linha de sutura foi destacada em branco. O painel da esquerda mostra a imagem Doppler da mesma área representada no painel direito. As áreas com cores mais brilhantes são mais perfusão do que áreas com azul escuro. Esta diferença de perfusão entre a área não isquémica (à esquerda) e a área isquémica (à direita) é clara e pode ser seguido ao longo de todo o comprimento da linha de sutura. Note-se que as feridas de ambos os lados parecem brilhantes, como as células do sangue ainda estão presentes em algum grau. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. medição Wound e representação de dados. (A) As fotografias digitais retratando medição da área da ferida utilizando software (ImageJ), conversão de pixels de (mm) (setas pretas) e o método para capturar uma circunferência exata (single seta preta) da ferida (B). Os dados estatísticos (média ± SEM de áreas das feridas num dado dia) pode então ser apresentada como percentagem de área ferida inicial (dia 0), sobre o eixo y e os dias no eixo-x (C). Os dados do gráfico apresenta linha analisados ​​usando um 2-way ANOVA com o teste de comparações múltiplas de Sidak, *** representa significativamente maior (P = 0,0004) do que os não-isquêmica no mesmo ponto de atendimento (dia 10), n = 8 feridas por grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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A cicatrização de feridas em ratos tem sido muitas vezes objecto de debate, devido à sua capacidade de curar feridas infectadas e alta taxa de variabilidade interanimal 5. Um dos objetivos originais do modelo durante o seu desenvolvimento foi para diminuir essa variação. Modificações na largura do retalho, reduzindo o número de feridas com posicionamento específico (centrada na aba com localização crânio-caudal consistente) e introdução de uma folha de silicone tem conseguido esse objetivo. Cicatrização de feridas pela contração também foi reduzida e cura por epithelialization, como nos seres humanos, é o resultado medido. Adaptação do modelo a uma estirpe diferente de rato, ou seja, o F344, também tem sido bem sucedida e reproduz o grau de isquemia observada utilizando ratos Sprague Dawley. No geral, as técnicas cirúrgicas (biópsia, excisão e sutura de feridas) necessários para este modelo são facilmente adquiridos pela maioria dos estudantes e técnicos com experiência cirúrgica limitada.

_content "> Para obter consistência com este modelo durante a execução de múltiplas cirurgias, verificou-se que é importante para criar as feridas isquêmicas prévias para a elevação do retalho para a colocação de folha de silicone 5. Além disso, não perfurando através da fáscia panniculus carnosus é fundamental para proporcionar um leito de ferida viáveis ​​para permanecer sobre o silicone. O silicone actua não só para evitar novo crescimento vascular, mas também como um "tampão", que encoraja re-epitelização da ferida. A aplicação do adesivo e pensos para prevenir a infecção e manter um ambiente húmido durante cicatrização de feridas também é importante. escolha do produto pode ser o que é o preferido ou usados ​​em instalações para animais do pesquisador. No entanto, não é incomum para alguns dos animais para ser capaz de remover os seus curativos, não importa o tipo de adesivo / combinação de vestir é utilizado.

O retalho bipediculado deve permanecer viável ao longo de um curso de tempo de cura, que é aproximada ly de 28 dias, dependendo da cepa de ratos e outras co-morbidades presentes. Raramente, podem formar abscessos no retalho (especialmente perto suturas) e seromas podem formar sob a aba. O líquido pode ser drenado e antibióticos administrados, se necessário. No entanto, se a aba perde viabilidade e torna-se necrótico recomenda-se que o animal já não ser utilizado. Excisão de Feridas para análise bioquímica não introduzir variabilidade devido a (1) um pouco de tecido normal deve ser mantido para apoio (2) a escolha de homogeneização preparação de tecidos e para isolamento de RNA, DNA ou proteína e (3) inerente 5,10 variabilidade interanimal, 11. Pode-se considerar este último ponto, uma limitação para o modelo e verificou-se que a redução do tamanho da aba (<2,0 cm) ou trauma aba pode causar necrose, indicando que pequenas variações de factores tais como os níveis de temperatura ou de stress, também pode levar a variação bioquimicamente detectável entre as amostras de feridas de um rato para o outro 5.

ve_content "> Em resumo, este modelo, com uma aba longitudinal, bipediculado variando 2,0-3,0 cm de largura e uma folha de silicone colocados estrategicamente, é um modelo confiável de isquemia tecidual prolongada. Uma vez que o usuário é adepto a usar as técnicas para criar um ferimento isquémico consistente, eles devem ser capazes de se adaptar a ela idades adicionais e espécies de roedores (ratos incluídos). As feridas excisionais podem ser tratados por via tópica, ou tratamentos sistémicos utilizados para explorar ainda mais o mecanismo (s) envolvido na formação de ferida crónica, exacerbadas respostas inflamatórias, a angiogénese aberrante e o fechamento da ferida atrasada.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sil-Tec medical grade sheeting Technical Products Inc. 500-3 nonreinforced, 0.01 inches in thickness
Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS World Precision Instruments #503671
Ethilon Nylon Sutures Ethicon 1964G black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle)
Laser Doppler Imager Moor Instruments moorLDI2-IR Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
ImageJ NIH free download http://rsb.info.nih.gov/ij/
Mastisol Henry Schein Cat # 7289210 Fisher Scientific NC9774929
Tegaderm Medical Specialties  3M1624W Fisher Scientific NC9922128

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References

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Trujillo, A. N., Kesl, S. L., Sherwood, J., Wu, M., Gould, L. J. Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model. J. Vis. Exp. (98), e52637, doi:10.3791/52637 (2015).More

Trujillo, A. N., Kesl, S. L., Sherwood, J., Wu, M., Gould, L. J. Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model. J. Vis. Exp. (98), e52637, doi:10.3791/52637 (2015).

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