Introduction
قياس الاستجابة الباردة في القوارض المهم لتحسين فهم الآليات المحتملة للحساسية الباردة في البشر في إطار كل من الظروف العادية والمرضية. والباردة أخمصي الفحص (CPA)، وضعت أصلا منذ عدة سنوات 1، يهدف إلى توليد استنساخه، لا لبس فيها الاستجابات السلوكية الفئران لحافز البارد ألقاها في RT. وقد أتاحت المزيد من التحسينات الأخيرة من هذا الاختبار قياس استنساخه من حساسية الباردة في مجموعة واسعة من درجات الحرارة 2. تم تصميم كلا الإصدارين أيضا أن يكون نسبيا عالية الإنتاجية، وغير مكلفة للاستخدام.
أحرز قدر كبير من التقدم في فهم آليات حساسية الباردة باستخدام أساليب سلوكية أخرى. أسلوب واحد هو اختبار التبخر الأسيتون، والتي تنطوي على اللمس أو الرش الأسيتون على مخلب الماوس وقياس مقدار الوقت الذي تنفق الماوس عبها 3،4 مخلب. للأسف،خزينا الردود على الأسيتون التبخر التي كتبها الإحساس الرطب ورائحة الأسيتون. أيضا، والتحفيز الباردة التي يتم تطبيقها في اختبار الأسيتون التبخر يمكن أن تختلف على أساس كمية من الاسيتون التطبيقية، ويصعب قياسها كميا. وأخيرا، لم يصب الفئران لها ردود الحد الأدنى لالأسيتون في الأساس، مما يجعل من المستحيل قياس التسكين في غياب فرط الحساسية مع هذا الأسلوب.
فحص الكلاسيكي آخر لردود الباردة هو فحص الذيل نفض الغبار، حيث يتم قياس زمن الوصول إلى الانسحاب بعد مغمورة الذيل في 5،6 الماء البارد. في حين أن الاستجابات السلوكية في هذا الاختبار هي لا لبس فيها ويقيس الفحص الردود على درجة حرارة معينة، لا بد من ضبط النفس الحيوانات أثناء الاختبار، والتي يمكن أن تغير الاستجابة الباردة من خلال موصوفة وصفا جيدا التوتر الناجم عن آليات مسكن 7.
آخر أداة تستخدم عادة هي اختبار لوحة البارد، الذي يقيس السلوكيةردود الفئران بعد يتم وضعها على طبق من ذهب المبردة بلتيير 8-10. بينما توفر هذه الأداة المعلومات حول استجابات الحيوان في درجات حرارة معينة، فإنه كما استخدمت بشكل غير متسق. وتقاس مجموعات مختلفة أنواع مختلفة من الاستجابات بما في ذلك عدد من القفزات 8،11، الكمون لأول رد 8،11- 13، وعدد من مخلب يرفع 11،13،14 مع نتائج مختلفة جدا. لوحة فحص البارد هو أيضا منخفضة نسبيا الإنتاجية كما حيوان واحد فقط يمكن اختبارها في كل مرة، وأنه يتطلب وجود جهاز بلتيير مكلفة وهشة.
2-لوحة اختبار تفضيل درجة الحرارة هو مشتق تستخدم عادة للاختبار لوحة الباردة يقيس كمية النسبي من الوقت الذي تنفق الحيوانات في 2 وحات متصلة من درجات حرارة مختلفة 9،15- 17. آخر مماثل فحص شيوعا هو فحص التدرج الحراري، حيث مقدار الوقت الذي تنفق الفئران في مناطق مختلفة في درجة الحرارةتتراوح بين 5 ° C و 45 ° C على لوحة معدنية طويلة تقاس 16. في حين أن هذه المقايسات تسمح المقارنة بين درجات الحرارة، وأنه من غير الواضح ما إذا كان يمثل سلوك النفور درجة الحرارة أو لتفضيل درجة الحرارة.
وأخيرا، تم استخدام لوحة الباردة الديناميكي فحص لقياس مدى الفئران تستجيب لتغير درجات الحرارة المحيطة 18. يتضمن هذا الأسلوب وضع الفئران على جهاز بلتيير RT والتعلية ذلك وصولا الى 1 درجة مئوية في حين قياس مدى تقفز الفئران أو لعق الكفوف في درجات حرارة لوحة مختلفة. في حين أن هذا اختبارات كيف الفئران على التكيف مع بيئة التبريد، وأنها لا توفر وسيلة لاختبار مدى الفئران تستجيب لحافز البارد في الإعداد لدرجة الحرارة المحيطة برودة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يتطلب معدات باهظة الثمن لأداء ولا توفر وسيلة لتأقلم الفئران لاختبار المعدات قبل قياس حساسيتها الباردة.
واستكمالا لهذه المقايسات، وCPA يختبر acclimaردود تيد لحافز البارد واضحة المعالم في مجموعة متنوعة من تتراوح درجة الحرارة، أو أثناء عملية التكيف مع درجات الحرارة المحيطة الباردة. فإنه يمكن اختبار ما يصل الى 14 الفئران في وقت واحد مع الجهاز الحالي لدينا، مع إمكانية زيادتها غير مكلفة تصل لاختبار الإنتاجية العالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وكانت جميع البروتوكولات الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة من قبل لجنة الدراسات الحيوانية من كلية الطب بجامعة واشنطن (سانت لويس، MO).
1. إعداد لوحة اختبار واسوار
- تنظيف قبالة سطح الزجاج.
- تأمين T-نوع خيوط التحقيق الحرارية إلى السطح في منتصف لوحة من الزجاج مع الشريط المختبر.
- وضع مرفقات الحيوان على لوحة الزجاج في خط واحد على طول منتصف اللوحة.
- كاتب التحقيق الحرارية من خلال مركز الضميمة الحيوانية والاندماج في مسجل البيانات. تحويل مسجل بيانات على حين تفعيل هذا ميزة لصناعة السيارات في الاغلاق، وإرفاق مسجل بيانات إلى جهاز الكمبيوتر باستخدام كابل المقدمة.
- إذا تسجيل درجة الحرارة لوحة أثناء التجربة، افتح البرنامج مسجل بيانات لبدء تسجيل درجات الحرارة لوحة.
- إذا لزم الأمر، وضبط البرنامج لإعادةالحبل درجة الحرارة لوحة مرة واحدة كل ثانية.
- بدء تسجيل درجات الحرارة باستخدام برنامج حزم مع مسجل بيانات الحراري.
- فصل العلبة السوداء مع تدرج لمنع التفاعل البصري بين الفئران.
- موقف يعكس تحت الزجاج بحيث الجانب السفلي من العبوات مرئيا من وضع الجلوس المريح.
2. الاحتباس الحراري / تبريد لوحة زجاج
- ملء صناديق الألومنيوم مع المياه تحسنت، والجليد الرطب، أو الثلج الجاف والموقف منها بشكل مناسب على لوحة زجاجية (يمكن أيضا الحزم رقائق الألومنيوم مليئة الثلج الجاف أن تستخدم لتبريد الزجاج؛ الشكل 1) (2).
- للاختبار في 30 ° C، ضع صناديق الألومنيوم حوالي 0.25 '' بعيدا عن حظائر الحيوانات (الشكل 2B) 2.
- تحديد شكل دائري الماء الساخن على جانبي لوحة زجاجية. تعيين دائري إلى 45 - 60 درجة مئوية، ولناالبريد إلى ملء صناديق الألومنيوم مع وجود تدفق مستمر من الماء الساخن (الشكل 1C) 2.
- ضع المروجون مثل أن الماء الساخن من صناديق الألومنيوم يستنزف مباشرة مرة أخرى في خزان للدائري على كل جانب (الشكل 1C) 2.
- للاختبار في RT، وترك صناديق فارغة (الشكل 2) 2.
- للاختبار في 17 ° C، ضع صناديق حوالي 0.25 '' بعيدا عن حظائر الحيوانات على جانبي وملء مع الثلج الرطب (الشكل 2) 2.
- للاختبار في 12 ° C، ضع صناديق حوالي 1.25 '' بعيدا عن العبوات على جانبي وملء مع الثلج الجاف (الشكل 2) 2.
- للاختبار في 5 ° C، ضع صناديق حوالي 0.25 '' بعيدا عن العبوات على جانبي وملء مع الثلج الجاف (الشكل 2) 2.
- عندما التبريد الزجاج مع الثلج الجاف، تأكد من وجود تهوية كافية لمنع CO 2 تراكم في الغرفة.
- للاختبار في 30 ° C، ضع صناديق الألومنيوم حوالي 0.25 '' بعيدا عن حظائر الحيوانات (الشكل 2B) 2.
- الانتظار للزجاج للوصول إلى مجموعة ودرجة الحرارة المطلوبة.
- إضافة الفئران لالمرفقات على لوحة.
ملاحظة: يمكن استخدام مولد الضوضاء البيضاء لتقليل الاضطرابات الضوضاء. - انتظر الفئران ليتأقلم.
ملاحظة: في منشأتنا هذا يستغرق ما يقرب من 2.5 ساعة، ولكن هذا قد تتفاوت تفاوتا كبيرا على أساس السكن الحيوانية وشروط التعامل معها. - الحفاظ على الزجاج في نطاق درجات الحرارة المطلوبة عن طريق ضمان أن يتم الاحتفاظ صناديق كامل من الماء درجة حرارة والجليد الرطب، أو الثلج الجاف.
ملاحظة: مع جهازنا في حاجة إلى صناديق ليتم تعبئتها مع الثلج تقريبا كل 90 دقيقة.
ملاحظة: لC حالة 17 °، فإنه من المفيد لتفريغ معظم المياه من مربعات الألومنيوم من خلال فتحات التصريف قبل إعادة تعبئتها مع الثلج. وهذا الاستقرار في درجة الحرارة أفضل، والعلاقات العامةتجاوز الحدث
ملاحظة: إن المبلغ المحدد من الثلج الجاف تختلف موسميا، ولكن بصفة عامة حفظ مربعات أكثر من ¼ الكاملة على طول من مربع سوف تبقي درجة حرارة ثابتة.
3. اختبار الفئران في درجات الحرارة الثابتة
- خارج الغرفة السلوكية، وملء دلو الجليد حوالي نصف كامل من الثلج الجاف.
- باستخدام مطرقة أو مطرقة، سحق الثلج الجاف الى مسحوق ناعم.
ملاحظة: سوف الملئ دلو تجعل من الصعب سحق تماما الثلج الجاف الى مسحوق. - باستخدام شفرة حلاقة مستقيمة أو مقص، وقطع رأس قبالة حقنة 3 مل.
- باستخدام إبرة 21 G، كزة 3 الثقوب على طرفي نقيض من الحقنة (ما مجموعه 6 فتحات).
ملاحظة: هذه الثقوب يقلل من الضغط الناتجة عن التسامي في حين ضغط الثلج الجاف. يمكن إعادة استخدام المحاقن قطع للتجارب متعددة. - أخذ الحقنة، ومسحوق الثلج الجاف، وساعة توقيت باليد إلى غرفة السلوكية.
- ملء غرفة حقنة نصف كامل من مسحوق الثلج الجاف. عقد نهاية قطع من حقنة ضد كائن مسطح، وضغط بقوة مسحوق باستخدام المكبس. احذر؛ المكبس من البلاستيك قد ينحني أو كسر من الضغط. إذا حدث هذا، استبدال المكبس من حقنة جديدة.
- تمديد غيض من مضغوط بيليه الثلج الجاف الماضي حافة حقنة.
- الفئران الاختبار التي هي تماما في بقية.
- في 30 ° C، 23 ° C و 17 ° C، والفئران التي لديها اختبار كل الكفوف 4 على الزجاج وليس تتحرك، ولكن ليس نائما تماما (19).
- في 12 ° C و 5 ° C، الفئران الاختبار التي هي على الكفوف 2 أو 4 الكفوف وعدم التحرك أو القفز.
- باستخدام المرايا الاستهداف، بلطف ولكن بحزم اضغط بيليه دافق شقة ضد سطح الزجاج تحت hindpaw الماوس (الشكل 1A) 2. بدء الموقت اليد.
- إيقاف الموقت وإزالة بيليه عندما يتحرك الماوس بعيدا عن الزجاج يبرد.
ملاحظة: إن الحركة الانسحاب يمكن أن يكون الرأسي أو الأفقي.- إذا كان الماوس يتحرك لفترة وجيزة جدا مخلب ثم يعود إلى السطح التبريد، ومواصلة توقيت وتحفيز حتى يجعل الماوس تحرك دائم بعيدا.
ملاحظة: يستخدم مختبرنا وقت التحفيز الأقصى من 20 ثانية بالنسبة للفئران في معظم الحالات.
- إذا كان الماوس يتحرك لفترة وجيزة جدا مخلب ثم يعود إلى السطح التبريد، ومواصلة توقيت وتحفيز حتى يجعل الماوس تحرك دائم بعيدا.
- كرر هذا الإجراء الاختبار حتى يتم جمع لا يقل عن 3 القيم على كل مخلب من كل حيوان. محاكمات منفصلة اختبار الكفوف المعاكس على نفس الماوس بنسبة 7 دقيقة على الأقل، ومحاكمات منفصلة متتالية على أي مخلب واحد من قبل لا يقل عن 15 دقيقة.
- إذا لزم الأمر، استخدم سمك مختلفة من الزجاج لتوليد معدلات مختلفة من التبريد (الشكل 3) 1.
ملاحظة: ويرتبط معدل التبريد عكسيا مع سمك الزجاج.
4. اختبار الفئران خلال الباردة التكيف
ملاحظة: هذا هو بروتوكول بديل الذي يسمح الاختبار وبلات الزجاجالبريد يبرد، بدلا من مرة واحدة قد استقر لوحة والفئران تكيفت تماما مع البيئة الباردة.
- اتبع الإرشادات المذكورة في القسم 1 لإعداد الجهاز.
- اتبع الإرشادات الواردة في القسم 3 لأخذ القياسات الأساسية في RT (الشكل 7A) 2.
- قبل صناديق تبريد الألومنيوم مع الثلج الجاف.
- مرة واحدة وقد تم قياس الإختفاء انسحاب خط الأساس، وضع صناديق precooled على لوحة حوالي 1.25 '' بعيدا عن العبوات على جانبي (الشكل 7A، السهم المسمى "وأضاف الجليد الجاف") 2.
- اتبع الإرشادات الواردة في القسم 3 لأخذ القياسات كما يبرد لوحة من الزجاج، أخذ القياسات كلما كان ذلك ممكنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الاستجابات السلوكية انتزع من الفئران ابتداء من الساعة 30 ° C، 23 ° C، 17 ° C، و 12 ° C هي تكرار للغاية (الشكل 4A) 20. من أجل قياس التحفيز الباردة التي يتم توليدها تحت hindpaw، تم تخدير الفئران مع الكيتامين / زيلازين / آسيبرومازين الكوكتيل وتم تأمين الكفوف على الزجاج على رأس الحرارية نوع T-خيوط (الشكل 4B) 20. تم تبريد الزجاج أو تحسنت إلى مجموعة الاختبار المطلوب. على الرغم من أن لوحة يتم تبريده بشكل موحد على طول لوحة (الشكل 5A) 2، وتجدر الإشارة إلى أن التدرج البارد يتم إنشاء عبر مرفقات السلوك (الشكل 5B) 2. أجزاء من العلبة التي هي أقرب إلى الثلج الجاف على جانبي المرفقات أكثر برودة، في حين أن الأجزاء الوسطى هي أكثر دفئا قليلا (الشكل 5B) 2. في أبرد درجات الحرارة شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي، والفئران تنفق معظم وقتهم في الأجزاء الوسطى من العلبة. مرة واحدة في درجات الحرارة لوحة من الزجاج قد استقرت، وضعت على البؤري التحفيز الثلج الجاف على الزجاج تحت مخلب / thermode. استنادا إلى آثار درجة حرارة سجلت من هذا الإعداد، فمن الواضح أن المحفزات الباردة إنشاؤها باستخدام سلطة الائتلاف المؤقتة هي استنساخه للغاية في كل نطاق درجة حرارة (الشكل 4C) 20.
تم قياس التحفيز البارد ولدت في اتفاقية السلام الشامل أيضا باستخدام ثلاثة سمك مختلفة من الزجاج لتغيير شدة التبريد (الشكل 3). معدل التبريد يرتبط عكسيا مع سماكة الزجاج، وأي من هذه سمك يمكن استخدامها لقياس حساسية الباردة حسب الحاجة (الشكل 3).
وقد أظهرت الأعمال السابقة أن CPA يمكن الكشف عن تسكين وفرط الحساسية في الفئران. 30 دقيقة بعد الحقن تحت الجلد من 1.5 ملغم / كغم من المورفين، والفئران لها بشكل كبير لonger الكمون إلى الانسحاب من الفئران أعطيت حقنة تحت الجلد من المياه المالحة (الشكل 6A: 2-طريقة ANOVA الرئيسي تأثير * P <0.05 مع Bonferroni بعد مخصص الاختبار؛ 30 دقيقة ** P <0.01، ن = 12 لكل مجموعة) 1. قبل 60 دقيقة بعد المورفين / المالحة، ليس هناك فرق بين saline- والجماعات حقن المورفين، وهو ما يتسق مع معدل الأيض المورفين في الفئران.
وقد سبق يظهر مساند فرويند الكامل (CFA) أن تسبب الالتهاب والحساسية بعد hindpaw حقن 21. بعد الحقن CFA، والإختفاء انسحاب CPA انخفاض 2 و 3 ساعة بعد الحقن (الشكل 6B: 2-طريقة ANOVA تأثير ع الرئيسي <0.001 مع Bonferroni بعد مخصص الاختبار؛ 2 ساعة * P <0.05، 3 ساعة ** P <0.01 ن = 12 لكل مجموعة). 4 ساعات بعد الحقن CFA، أعطيت الفئران حقن تحت الجلد من 1.5 ملغم / كغم من المورفين. 30 دقيقة بعد حقن المورفين، وكان كل من CFA- والفئران المحقونة المالحة زادت withdrأوال الإختفاء نسبة إلى الإختفاء بهم في 3 ساعة (الشكل 6B: 1-طريقة ANOVA مع اختبار ما بعد خاص-Dunnett؛ وCFA 3 ساعة مقابل 4.5 ساعة CFA $$$ P <0.001، المالحة 3 ساعة مقابل المالحة 4.5 ساعة $$$ ف <0.001). بعد ساعة، مرة واحدة قد استقلاب المورفين، كانت الفئران CFA حقن مرة أخرى أقل الإختفاء انسحاب من السيطرة على الفئران المحقونة المالحة (الشكل 6B: 2-طريقة ANOVA مع اختبار Bonferroni ما بعد الوضع القائم؛ ** p <0.01) 1.
معظم أنواع الثدييات لديها القدرة على التكيف مع حساسية درجة حرارتها لمباراة بيئتهم. في المختبر، وقد اقترحت الدراسات أن هذه العملية تعتمد على التكيف PIP 2 التحلل 22- 24، ولكن لم يتمكنوا من التحقق من صحة هذه الفرضية في الجسم الحي الأدوات السلوكية السابقة. إن CPA قادرة على قياس هذا التكيف بطريقتين مختلفتين. عن طريق اختبار الكمون الانسحاب من الفئران كما يبرد الزجاج (
اتفاق السلام الشامل يمكن أيضا قياس ABility على التكيف مع درجات الحرارة المحيطة الباردة على مدى فترات طويلة من الزمن. عندما يتم اختبار البرية من نوع الفئران باستخدام CPA بعد أن تأقلم لمدة 3 ساعة على 30 ° C، 23 ° C، 17 ° C، أو 12 ° C الكمون الانسحاب هي نفس درجات الحرارة ابتداء من الساعة كل شيء، مما يدل على أن من النوع البري الفئران تكييفها وفقا لدرجة الحرارة المحيطة الباردة (الشكل 2A: WT 30 ° C = 13.23 ± 0.5 ثانية، 23 ° C = 12.8 ± 0.7 ثانية، 17 ° C = 12.3 ± 0.9 ثانية، 12 ° C = 12.8 ± 0.5 ثانية، 1- طريقة ANOVA مع Bonferroni اختبار ما بعد خاص، P> 0.05 ن = 6 لمدة 30 ° C، ن = 15 لمدة 23 ° C، 17 ° C، و 12 ° C) 20. على عكس الفئران من النوع البري، كما يقلل من درجة حرارة الانطلاق في الإختفاء الانسحاب من الفئران TRPM8-KO الانخفاض، مما يدل على أنهم غير قادرين على التكيف عتبة استجابتها لتناسب بيئتهم (الشكل 8: 1-طريقة التدابير ANOVA المتكررة مع Bonferroni ما بعد اختبار خاص، الذكور التأثير الرئيسي ص = 1.5 × 10-5، 12 ° C مباراة. 23 ° C ع = 6 × 10 -5، 17 ° C مقابل 23 ° C P = 0.004. الإناث الرئيسي تأثير ع = 3.6 × 10 -5، 12 ° C مقابل 23 ° C ع = 9.25 × 10 -5، 17 ° C مقابل 23 ° C ع = 0.0005. DF = 1، ن = 11 ذكور و 11 إناث) 20.
الشكل 1. الباردة أخمصي الفحص (CPA) جهاز 2. (A) تخطيطي لأداء اتفاق السلام الشامل. وتأقلم الفئران على طبق من الزجاج في حاويات بلاستيكية السلوكية حتى أنهم في راحة. يتم تطبيق بيليه الثلج الجاف على الجانب السفلي من الزجاج تحت hindpaw، والكمون للانسحاب من الزجاج التبريد يقاس. (ب) صورة لجهاز CPA، في التكوين لتبريد لوحة ل5 ° C. مسجل البيانات الحراري هو في وسط المرفقات، وصناديق الألومنيوم الجناح العلبة على أي من الجانبين. (C) صورة الجهاز CPA، في التكوين لتدفئة لوحة إلى 30 ° C. يتدفق الماء شكل دائري الماء الساخن في مربع الألومنيوم، الذي يتدفق ثم من نزيف على الجانب مرة أخرى إلى الخزان من شكل دائري. إعادة استخدامها بإذن من برينر وآخرون 2014 (2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. درجة الحرارة من لوحة زجاج خلال CPA 2. (A) متوسط اقتفاء أثر درجة الحرارة في لوحة من الزجاج خلال التجارب السلوكية في اتفاقية السلام الشامل. 30 ° C ن = 1، 23 ° C ن = 5، 17 ° C ن = 7، 12 ° C ن = 7، 4 ° C ن = 5. (B) الرسوم التخطيطية ماركاonstrating كيفية توليد ظروف درجات الحرارة المختلفة في اتفاق السلام الشامل. إعادة استخدامها بإذن من برينر وآخرون 2014 (2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. سمك الزجاج ويرتبط عكسيا مع معدل التبريد 1. (A) تخطيطي المخططات التصميم التجريبي (BD). تم قياس درجة حرارة خلال التحفيز أخمصي البارد تحت مخلب على كل سمك الزجاج ثلاثة في ظل ظروف طبيعية، والفواصل التي تتمتع بدعم الستايروفوم مخلب بعيدا عن سطح الزجاج. في جميع الحالات، الذين يدعمون مخلب بعيدا عن الزجاج تسبب في انخفاض هائل في التحفيز البارد قياسها مخلب (ن = 6 في سماكة الزجاج). (
الشكل 4. الإختفاء انسحاب CPA تتسق 20. (A) متوسط الكمون الانسحاب بالنسبة للفئران بدءا من 23 ° C، 17 ° C، أو 12 ° C. (ب) تكوين لقياس CPA التحفيز البارد. يتم تأمين مخلب من الماوس تخدير على لوحة زجاجية مع الشريط المختبر على رأسمن نوع T-خيوط الحرارية. يتم وضع الحوافز CPA على الجانب السفلي من الزجاج تحت كل من مخلب والحرارية. (C) درجات الحرارة المتولدة في اتفاقية السلام الشامل بدءا من 30 ° C، 23 ° C، 17 ° C، أو 12 ° C. وتمثل الأسهم السوداء متوسط الإختفاء الانسحاب بالنسبة للفئران مستيقظا في كل حالة. إعادة استخدامها بإذن من برينر وآخرون. 2014 (2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. درجات الحرارة لوحة زجاج تتفق في اتفاقية السلام الشامل (2). (A) الحرارية T1 (أسود) وضعت في وسط اللوحة. وضعت T2 الحرارية (الحمراء) في العلبة السلوكية الأقرب إلى الحافة اليمنى من لوحة. هيئة تنظيم الاتصالات في درجة الحرارةcings والرسم البياني في اليمين المتطرف (T1-T2) تظهر درجات الحرارة متطابقة تقريبا في T1 و T2 طوال فترة التجربة. وضعت (B) T1 الحرارية (أسود) في وسط اللوحة. وضعت T2 الحرارية (الحمراء) في العلبة السلوكية المركزية، في الجدار أقرب إلى صناديق الألومنيوم مليئة الثلج الجاف. وتظهر اقتفاء أثر درجة الحرارة والرسم البياني في اليمين المتطرف (T1-T2) أن هناك ما يقرب من 3 ° C الفرق بين T1 و T2 مرة واحدة وصلت الى لوحة درجة حرارة مستقرة. إعادة استخدامها بإذن من برينر وآخرون. 2014 (2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. CPA يمكن قياس تسكين وفرط الحساسية 1. (A) Sحقن ubcutaneous من 1.5 ملغم / كغم من المورفين يزيد من الكمون الانسحاب من الفئران 30 دقيقة بعد الحقن (2-طريقة ANOVA مع Bonferroni بعد مخصص الاختبار؛ 30 دقيقة حقن مشاركة ** P <0.01). 60 دقيقة بعد الحقن، وليس هناك فرق كبير بين حقن المورفين والفئران المحقونة المالحة. (B) Intraplantar حقن 10 ماي كاملة المصاحب فرويند (CFA) يقلل من الكمون الانسحاب من الفئران 2 و 3 ساعة بعد الحقن (2-طريقة ANOVA مع Bonferroni ما بعد اختبار خاص؛ * ف <0.05، ** p <0.01). أعطيت كل الفئران حقن تحت الجلد من المورفين في 4 ساعات، وكانت كل الإختفاء الانسحاب عند 4.5 ساعة أعلى بكثير مقارنة مع 3 ساعة (1-طريقة ANOVA مع اختبار Dunnet في مرحلة ما بعد الوضع القائم؛ $$$ P <0.001). 5.5 ساعة بعد الحقن من CFA (1.5 ساعة بعد الحقن المورفين)، لا يزال زيارتها الفئران CFA حقن أقل الإختفاء الانسحاب من الفئران حقن محلول ملحي (2-طريقة ANOVA مع Bonferroni بعد مخصص الاختبار؛ ** p <0.01). إعادة استخدامها بإذن منبرينر وآخرون 2012 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. قياس التكيف البارد لوحة الزجاج يبرد حيوي 20. (A) تخطيطي لأداء CPA مثل لوحة من الزجاج والتبريد. يتم قياس درجات الحرارة أساسية في RT، تضاف الحاويات الثلج الجاف إلى لوحة، ويتم قياس الكمون الانسحاب يبرد لوحة من الزجاج. (B) الفئران من النوع البري لها نفس انسحاب الكمون كما يبرد لوحة من الزجاج، مما يوحي بأنها التكيف مع درجات حرارة التبريد بشكل أسرع مما يمكن قياسها مع سلطة التحالف المؤقتة (خط الأساس = 12.8 ± 0.3 ثانية، 30 دقيقة = 13.67 ± 0.9 ثانية، 60 دقيقة = 11.03 ± 1.0 ثانية، و 90 دقيقة = 11.31 ± 0.6 ثانية، ن = 3 الفئران. 1-طريقة ANOVA مع Bonferroni اختبار ما بعد خاص، عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين أي مجموعة). (C) تخطيطي لأداء CPA مثل لوحة من الزجاج والتبريد، وبعد intraplantar الحقن من U73122 PLC المانع أو U73343 مجمع السيطرة. (D) الفئران أن يكون أقل من ذلك بكثير الإختفاء الانسحاب في حين ان لوحة والتبريد بعد الحقن U73122، مما يوحي بأن U73122 يتداخل مع القدرة على التكيف مع تبريد درجات الحرارة المحيطة. إعادة استخدامها بإذن من برينر وآخرون. 2014 20. وقد تم استنساخ هذا الشكل بإذن من الجمعية الدولية لدراسة الألم (IASP). قد لا تكون مستنسخة الرقم لأي غرض آخر دون الحصول على إذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفئران الرقم 8. TRPM8-KO لا تتكيف مع تبريد البيئية 20 الفئران TRPM8-KO لها الإختفاء انسحاب أعلى من النوع البري تتزاحم في جميع درجات الحرارة بدءا قياس (2-طريقة ANOVA مع Bonferroni بعد مخصص الاختبار؛ *** ف < 0.001). الكمون الانسحاب من الفئران TRPM8-KO ينخفض أيضا باسم انخفاض درجة حرارة البداية (1-طريقة ANOVA مع Bonferroni بعد مخصص الاختبار؛ ## ف <0.01، ### p <0.001)، في حين لا يوجد أي تغيير كبير في الانسحاب الكمون من النوع البري تتزاحم مثل انخفاض درجات الحرارة ابتداء. إعادة استخدامها بإذن من برينر وآخرون. 2014 20. وقد تم استنساخ هذا الشكل بإذن من الجمعية الدولية لدراسة الألم (IASP). قد لا تكون مستنسخة الرقم لأي غرض آخر دون الحصول على إذن. الرجاء أنقرك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T-type thermocouple probe | Physitemp | IT-24p | Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/) |
| Glass plate | Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) | We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful | |
| Thermal Data logger | Extech | EA15 | Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408) |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe |
| Computer | If using Extech logger, any Pcwill work | ||
| Aluminum boxes | Washington University in St. Louis machine shop | boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid. There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water. | |
| Heated water circulator | VWR | Any water circulator model with a pump will work | |
| 21 G needle | BD | 305165 | The exact needle size is not important |
| Hand timer | Any hand timer will work | ||
| Mirror | Any flat mirror will work |
References
- Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7 (6), 8 (2012).
- Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. , (2014).
- Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59 (3), 369-376 (1994).
- Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458 (2), 93-95 (2009).
- Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56 (2), 155-166 (1994).
- Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119 (1-2), 23-29 (1985).
- Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359 (1-2), 73-76 (2004).
- Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (4), 1273-1278 (2009).
- Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150 (2), 340-350 (2010).
- Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
- Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54 (3), 379-386 (2007).
- Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54 (3), 371-378 (2007).
- Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448 (7150), 204-208 (2007).
- Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115 (9), 2393-2401 (2005).
- Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
- Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (5), 1304-1310 (2005).
- Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (13), 5533-5541 (2013).
- Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10 (7), 767-773 (2009).
- Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9 (2), 174-184 (2008).
- Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. , (2014).
- Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18820-18824 (2009).
- Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33 (14), 6154-6159 (2013).
- Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8 (5), 626-634 (2005).
- Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284 (3), 1570-1582 (2009).
- Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (44), 12067-12077 (2007).
- Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (42), 13202-13209 (2009).
