Introduction
O objetivo geral deste método é a aplicação de contraste dinâmico aprimorado ressonância magnética (DCE-MRI) para ortotópicos xenografts tumor pancreático em camundongos. DCE-MRI é um método não-invasivo de avaliação da microvasculatura num tecido alvo por monitorização da alteração de contraste MR ao longo de um certo período de tempo após a injecção. DCE-MRI tem sido utilizada para diagnóstico de tumores malignos e para avaliar a resposta do tumor a várias terapias 1-4. Quantitative DCE-MRI apresentou alta reprodutibilidade 5. Para quantificar os parâmetros farmacocinéticos de um agente de contraste MR em um tecido alvo, todas as imagens DCE-MR adquiridas em diferentes momentos e mapa T1 obtidos antes da injeção de contraste devem ser georeferenciados 6. No entanto, devido aos movimentos respiratórios e peristálticas na área abdominal, quantitativa DCE-MRI teve aplicação limitada para tumores gastrointestinais.
Modelos ortotópicos de tumor pancreático foram utilizados para avaliarresposta de pâncreas-tumor seguinte terapias biológicas e quimioterapias 7,8. Modelos ortotópicos de tumor são considerados superiores aos modelos subcutâneos convencionais, uma vez que o microambiente no local do tumor original é reflectida e, assim, a resposta do tumor à terapia humana podem ser previstos com mais precisão. No entanto, o pâncreas do mouse está localizado no quadrante superior esquerdo do abdome, de modo quantitativo DCE-MRI de ortotópicos xenotransplantes de tumor do pâncreas em ratos não foi prontamente implementadas.
Nós estabelecemos um protocolo de DCE-MRI de tumores abdominais em camundongos, fixando os tumores usando uma placa de plástico orthogonally dobrado para evitar a transferência de movimento da região do tórax 9. A pressão aplicada por este fórum foi localizada na área abdominal, e não resultou em dificuldade respiratória. Uma técnica automatizada imagem coregistration foi validado para DCE-MRI de órgãos abdominais em um modo livre de respiração, mas ele executa effectively apenas quando as regiões alvo mover-se lentamente e regularmente 10. A freqüência respiratória dos animais é variável durante o exame, moderação, de modo físico na área abdominal será necessário para recuperar os parâmetros farmacocinéticos de confiança em modelos de ratos tumor pancreático ortotópicos. Temos quantificada com sucesso os parâmetros farmacocinéticos de um agente de contraste MR em ortotópicos xenografts tumor pancreático usando a placa de plástico orthogonally dobrado em DCE-MRI 11-13. Aqui apresentamos o procedimento detalhado de modelagem tumor pancreático orthotopic, DCE-MRI dos xenotransplantes de tumor em ratos, e quantificação dos parâmetros farmacocinéticos.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade do Alabama, em Birmingham.
1. Orthotopic pâncreas Tumor Rato Modeling
- Linhas de padrão de cultura de células humanas do pâncreas-cancro em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino. Mantenha todas as culturas a 37 ° C em atmosfera humidificada com 5% de CO 2.
- Use 8-10 semanas de idade, do sexo feminino graves ratos imunodeficientes combinados. Coloque as gaiolas dos animais em 12 horas de luz e escuridão ciclo de 12 horas à temperatura ambiente (21 ± 2 ° C) e 60% de humidade.
- Anestesiar todos os animais utilizando ventilação com 2% de isoflurano misturado com oxigénio (2 L / min) durante toda a cirurgia. Confirme a profundidade da anestesia por toe pitada reflexo. Colocar os animais de uma almofada de aquecimento (37 ° C) para manter a temperatura corporal. Aplicar pomada oftálmica veterinária nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. &# 160;
- Remover o cabelo no quadrante superior esquerdo do abdómen de cada rato, e dar um medicamento analgésico (carpofen, 5 mg / kg de peso corporal por via subcutânea) na área. Aplique uma solução de betadine para a pele exposta. Prepare instrumentos cirúrgicos autoclavada.
- Faça uma incisão de 1 cm na pele e peritônio usando iris tesoura reta. Remova cuidadosamente o pâncreas do abdome utilizando pinças cirúrgicas.
- Insira 28 L agulha de uma seringa de 0,5 mL de insulina na cauda do pâncreas e, em seguida, lentamente, uma solução de infusão de 2,5 milhões de células de cancro pancreático humano em 30 ul de DMEM. Confirme se uma pequena bolha é criado na cabeça do pâncreas pela solução.
- Delicadamente, coloque o pâncreas volta para o abdômen utilizando pinças cirúrgicas. Feche o peritônio e da pele em uma camada com 2 interrompido 5-0 Prolene, e, em seguida, terminar a anestesia. Não devolva um animal que passou por uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.60; Remover suturas em 7 ~ 10 dias após a cirurgia.
- Dê outra dose do medicamento analgésico (carpofen, 5 mg / kg de peso corporal por via subcutânea) a 24 h após a cirurgia.
- Verifique o tamanho do tumor através da palpação da área de cirurgia usando dois dedos. Os tumores normalmente se sentir mais denso e mais instável do que os tecidos e órgãos adjacentes. Normalmente demora ~ 1-2 semanas para começar a sentir um tumor.
- Monitorar os animais diariamente para sinais de doença. Quando os animais aparecem doentes (comportamentos de higiene e de prevenção de falta normais), encerramos-los usando deslocamento cervical sob anestesia.
2. Imagem por Ressonância Magnética
- Aplicar ressonância magnética quando o tamanho do tumor é de cerca de 5-7 mm de diâmetro a normalmente 2 a 4 semanas após a implantação da célula. Use um scanner de ressonância magnética dedicada a pequena imagem de animal ou um scanner MR clínica equipado com uma bobina especializado para pequena imagem animal.
NOTA: Foi utilizado um animal pequeno scanner de ressonância magnética 9.4T com uma combinação de um volume de ressonância 1 H/ Transmissor e um receptor de superfície da bobina (30 mm de diâmetro) (Bruker BioSpin Corporation, Billerica, MA). A bobina de superfície proporciona melhor relação sinal-ruído (SNR) 14. - Prepara-se uma agente de contraste à base de gadolínio para MRI injectar ~ 0,1-0,2 mmol / kg a cada animal em ~ 0,1-0,2 ml de PBS (tampão fosfato salino).
NOTA: Foi utilizado gadoteridol, e injectado 0,2 mmol / kg em 0,15 ml de PBS durante um período de 15 segundos (0,1 ml / seg). - Prepara-se uma micro-tubo de polietileno (comprimento: 7,62 milímetros, o diâmetro interno forma: 0,28 mm, diâmetro externo = 0,64 mm). Inserir uma agulha G 30 (comprimento de 12,7 mm) em uma das extremidades do tubo, e uma agulha 30 G romba ponta (9,5 mm de comprimento) na outra extremidade. Conectar uma seringa de 1 ml, contendo agente de contraste MR à agulha de ponta romba, e empurrar lentamente a seringa para encher todo o tubo com o agente de contraste de MR.
- Anestesiar os animais utilizando ventilação com ~ 1 - 2% de isoflurano misturado com oxigénio (2 L / min) durante toda a preparação e imagiologia. Confirme a profundidade de Anesthesia por toe pitada reflexo. Aplicar pomada oftálmica veterinária nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. Dilatar a veia da cauda usando uma lâmpada de calor antes da inserção da agulha. Pegue o meio da agulha de 30 G com a pinça Kelly, e inseri-lo na veia da cauda. Fita ambos a cauda e o tubo sobre uma folha de plástico ou de papel de cartão (10 mm de largura x 100 mm de comprimento) para manter a linha reta cauda.
- Colocar o animal em decúbito dorsal em uma cama de animais equipado com circulação de água quente (ou ar quente) para regular a temperatura corporal durante o exame. Ajuste da temperatura no leito de 37 ° C. Insira uma sonda de temperatura rectal para monitorizar a temperatura do corpo durante o exame.
- Aplicar uma placa de plástico orthogonally dobrada na área abdominal. Verifique se o tumor está localizado atrás da extremidade superior do tabuleiro, e, em seguida, puxe para baixo a placa ligeiramente (~ 2 mm) para garantir o tumor é capturado pela diretoria. Tape o tabuleiro para a cama dos animais com firmeza.
- Tape um transduce pad respiraçãor (SA Instrument, Inc., Stony Brook, NY) na região do peito para monitorar a respiração animal durante o exame. Inserir uma bobina de superfície no topo da região do tumor, e fita-lo para a cama de animais com firmeza. Empurrar a cama dos animais no scanner MR para colocar a região do tumor no centro da bobina de volume (diâmetro interno: 72 milímetros).
- Executar a correspondência e afinação tanto para o receptor e transmissor, seguido por calços.
- Comece com uma sequência MR anatômica para localizar o tumor. Use uma sequência spin-echo (T2W) turbo T2 para obter imagens axiais com os seguintes parâmetros de aquisição. Tempo de repetição (TR) / tempo de eco (TE) = 3.000 / 34 ms, 128 x matriz de 128, 30 x 30 mm campo de visão, número de médias = 1, comprimento do comboio echo = 4 e 20 contíguas de 1 mm de espessura em um modo entrelaçado para cobrir toda a região do tumor (tempo total de digitalização: 1,6 min).
Observação: Uma vez que os tumores pancreáticos ortotópicos são mais difíceis de ser localizado do que as subcutâneas, locali convencionalzer imagens com resolução mais baixa pode não ser útil. - Adquirir imagens ponderadas em T1 (T1W) com vários ângulos de aleta para recuperar T1 mapa. Para esta finalidade, utilizar um gradiente de eco abordagem ângulo multiflip com os seguintes parâmetros: tempo de repetição (TR) / tempo de eco (TE) = 115/3 mseg, de 128 x 128 de matriz, um campo de 30 x 30 mm de vista, o número de médias = 4, ~ 5-7 contíguas de 1 mm de espessura em um modo entrelaçado para cobrir a região do tumor, e sete ângulos de aleta de 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70 (tempo total de digitalização por flip angle: 1 min).
NOTA: No entanto, a abordagem ângulo multiflip é eficiente somente quando o campo B1 homogeneidade é alta. Se não, mapas T1 pode ser obtido com a abordagem TR múltipla, em vez de 15. - Adquira imagens T1W antes e após a injeção de contraste gadolínio baseado MR. Use os mesmos parâmetros de aquisição e da geometria para o mapeamento T1 mas com o ângulo da aleta fixa de 30. Use codificação linear para garantir estado estacionário quando o centro de k-espaço é obtido, especially quando um curto TR e um ângulo de baixo grau de aleta são usados. Adquirir 5 imagens de base antes de injeção de contraste. Em seguida, adquirir 40 imagens após a injeção de contraste (tempo total de digitalização: 45 min). Usar uma bomba de seringa para injectar agente de contraste a uma taxa constante (0,01 ml / seg).
- Controlar a respiração dos animais de forma contínua, e ajustar concentração de isoflurano para manter a freqüência respiratória para 50 - 100 respirações por minuto. Monitore a temperatura do corpo do animal durante exames de imagem.
- Depois de completar DCE-MRI, retirar a agulha e outras sondas, e colocar o animal em uma gaiola vazia camas com toalhas de papel. Massageie suavemente a área abdominal inferior. A gaiola deve ser colocado metade sob uma lâmpada de calor para que os animais possam entrar e sair do gradiente de calor como ele se recupera. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
3. Processamento de Imagem e Análise
- Regi tumorais Segmento em em imagens em T2. Em imagens em T2, a intensidade do sinal na região do tumor é mais brilhante do que a dos tecidos circundantes, de modo que o limite do tumor pode ser delineada manualmente.
NOTA: técnicas semi-automáticas de segmentação, como limiar global ou contorno ativo pode ser usado 16,17, mas a intensidade de fundo irregular deve ser corrigido especialmente quando uma bobina de superfície é usado. - Criar mapas T1 e densidade de prótons. Em imagens T1W adquiridos com uma sequcia de eco de gradiente, assumindo que o tempo de eco (TE) é muito menor do que em T2 * valor, o valor de pixel é determinada pela
onde S 0 é a densidade de prótons, T 1 T 1 é tempo de relaxamento constante, TR é tempo de repetição, e θ é um ângulo de flip. A equação (1) pode ser reescrito para
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quando S (θ) / sinθ é substituído com Y, e S (θ) / tanθ é substituído com X. A equação (2) é uma equação linear, e a sua inclinação e intersecção pode ser utilizado para recuperar e T1 S valores 0, respectivamente. - Calcule concentração contraste MR em imagens DCE-MR. Quando agente de contraste MR base de gadolínio é injetado, T 1 relaxamento constante de tempo é alterada ao longo do tempo. Então, a equação (1) pode ser reescrito para
T 1 (t) está relacionada com a concentração de contraste MR, C (t), como se segue,
em que r é 1 a relaxação longitudinal do agente de contraste de MR. Assim, combinando as equações (3) e (4), a concentração de contraste MR é determinada pela - Quantificar os parâmetros farmacocinéticos do MR contraste agente. C p (t) apresenta concentração contraste MR no plasma sanguíneo no tempo t após o início da injeção de contraste. C p (t) é chamada função de entrada arterial (AIF). Se FIA está disponível, os parâmetros farmacocinéticos do agente de contraste MR pode ser calculado
em que C t (t) é a concentração de contraste na RM de um tecido alvo, p v é o volume do plasma sanguíneo fraccionada, e v é o volume extracelular extravascular fraccionada, e K é uma constante trans transferência de volume. Taxa de fluxo constante, k ep é igual a K trans divididos por v e. Se FIA não está disponível, então o modelo da região de referência pode ser utilizado em vez 18,19. O modelo da região de referência é baseado no modelo de fluxo Kety-20 e limitada usa concentração de contraste em uma região de referência para eliminar a necessidade de AIF como se segue,
em que C t, ROI (t), K trans, ROI, e v e, ROI são concentração contraste, a transferência de volume constante, e volume extracelular extravascular-fraccionada, respectivamente, na região de interesse (ROI), enquanto a C t, RR (t), K trans, RR, e v e, RR são os da região de referência. Músculo paravertebral é frequentemente seleccionada como a região de referência e v e, em pa murino RRravertebral músculo é assumido ser constante a 0,08 21. Usamos o modelo região de referência.
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Representative Results
As células tumorais pancreáticas humanas crescer com sucesso em pâncreas de rato criando um tumor sólido. A Figura 1 apresenta fotografias de (A) um pâncreas normal onde a solução da célula de tumor é injectada, e (B) um ratinho representativo tendo um xenoenxerto de tumor pancreático ortotópico (MIA PaCa-2 ). Tumor está localizado no quadrante superior esquerdo do abdómen, ao lado do baço. Ele normalmente leva 2-4 semanas para que os tumores a crescer até 5-7 mm de diâmetro após o implante de células.
Moção de ortotópicos xenografts tumor pancreático foi substancialmente suprimida, embora movimento artefato estava presente em imagens de RM para uma determinada magnitude. Em imagens T2W MR, o desvio padrão do sinal MR no ar sobre a região do tumor foi de cerca de 2,5 vezes maior quando as células do tumor pancreático foram ortotopicamente implantado de que, quando um modelo de tumor subcutâneo foi empregado. Figura 2A mostra o esquema de uma configuração para o DCE -MRI de um pancreati ortotópicoc xenoenxerto de tumor. O círculo laranja representa o tumor, apanhado pela extremidade superior de uma placa de plástico orthogonally dobrados. Figura 2B mostra o esquema da placa de plástico com dimensões. A largura da placa (30 mm) foi concebida para ser a mesma com a largura da cama de animais em ratinhos. O comprimento placa foi projetada para ser o tempo suficiente para aplicar fita com firmeza. A profundidade da ponta da placa (4 mm) foi projetado para 20 g de ratos. Figura 2C mostra as imagens T2W MR (corte sagital) de um rato representante, munidos de um xenotransplante tumor pancreático orthotopic (MIA PaCa-2). Tumor é indicada em um círculo vermelho com pontos, e o recuo induzida pela placa de plástico é indicado com uma seta branca.
DCE-MRI quantitativa é aplicada com sucesso para ortotópicos de xenoenxertos do tumor pancreático utilizando região de referência (RR) do modelo, tal como descrito na equação (7). A Figura 3A mostra mapas de contraste na região do tumor (escala de cores) de 1 minuto antes c MR Ontrast (gadoteridol) injecção e aos 5 e 40 minutos após a injecção, respectivamente, sobreposto com imagens T2W MR (escala de cinza). O rato foi tendo um PaCa-2 xenoenxerto de tumor MIA ortotopicamente. A Figura 3B mostra as curvas de realce de contraste médios na região do tumor (janela 3 x 3) e da região da musculatura paravertebral (9 x 9 janela) indicado com dois quadrados brancos, respectivamente, na figura 3A. As Figuras 3C e 3D mostram mapas K ep trans e k, respectivamente.
Figura 1. fotografias de (A) um pâncreas normais tratados com solução de células de tumor e (B) um xenoenxerto de tumor pancreático ortotópico em um murganho imunodeficiente. Tumor está localizado no quadrante superior esquerdo do abdómen, indicado com um círculo a tracejado branco.es / ftp_upload / 52641 / "target =" _ 52641fig1highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Esquema de DCE-MRI de um xenotransplante tumor pancreático orthotopic. (A) Esquema de uma configuração para o DCE-MRI de um xenotransplante tumor pancreático orthotopic (laranja região circular). Um cateter é inserido na veia da cauda para infundir agente de contraste de MR. (B) Esquema de uma placa de plástico com dimensões dobradas ortogonalmente. (C) T2W imagens de RM (vista sagital) de um rato, munidos de um xenoenxerto de tumor pancreático orthothopic indicado com um ponteado círculo vermelho, quando uma placa de plástico orthogonally dobrada foi aplicado (indicado com uma seta branca). Por favor, clique aqui para ver uma versi maioresem dessa figura.
Figura 3. Imagens DCE-MR e mapas paramétricas de um xenotransplante tumor pancreático orthotopic. (A) mapas de contraste em 1 min antes ou no 5 e 40 min após MR contraste (gadoteridol) injecção. (B) curvas de realce de contraste em média, na região do tumor (3 x 3 janela) e região da musculatura paravertebral (9 x 9 janela) indicadas com dois quadrados brancos, respectivamente, na Figura 3A. (C) K mapa trans. (D) mapa k ep. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós introduzimos os métodos detalhados de modelagem de tumor pancreático orthotopic usando ratos imunodeficientes, DCE-MRI de tumores abdominais em ratos, e quantificação de seus parâmetros cinéticos. Na modelagem de tumor pancreático orthotopic, é preciso ter cuidado ao inserir uma agulha na cauda do pâncreas. Se for bem sucedido, as células serão transferidos para a cabeça do pâncreas criando uma pequena bolha. Ao aplicar-se uma placa de plástico orthogonally dobrado, é fundamental para confirmar que o tumor está localizado abaixo da extremidade superior da placa. Uma vez que o tumor de pâncreas é perto do diafragma, o conselho pode não ser capaz de segurá-lo com firmeza, especialmente quando o tamanho do tumor é inferior a 5 mm de diâmetro. Depois de imagem, a área abdominal deve ser massageado suavemente até que o animal está consciente. Recomenda-se que não exceda o tempo total de preparação e de imagem para cada animal mais longo do que 90 minutos, a fim de prevenir a dor abdominal.
A dimensão do plásticoplaca pode ter de ser reajustada de acordo com o tamanho dos tumores ou animais. Se o tamanho do tumor é menor que 5 mm, os tumores podem não ser firmemente apanhado pelo tabuleiro ortogonalmente dobrada tendo uma profundidade 4 mm e assim artefactos podem ocorrer em imagens por ressonância magnética. Além disso, se o tamanho do animal é maior do que 20 g, a profundidade de 4 milímetros pode não ser suficiente para manter o tumor. No entanto, uma pressão demasiado elevada no abdómen pode danificar o sistema nervoso abdominal paralisar a parte inferior do corpo do animal.
Modelagem tumor pancreático ortotópico em murganhos utilizando linhas de células de cancro pancreático humano padrão foi utilizado para estudar a resposta terapêutica dos tumores pancreáticos. No entanto, tumor tomar taxa (percentual do que um animal vai ter um tumor palpável após o implante) e taxa de crescimento foram altamente dependente das características de células tumorais, por isso, recomenda-se começar com duas vezes mais animais e selecione a metade deles portadores de tamanho semelhante tumores. Os tumores com formato irregular devem ser excluídos,uma vez que eles podem responder a uma terapia de forma diferente; a forma irregularidade pode ser detectado por palpação rotina, mas a imagem de ultra-sons irá proporcionar uma melhor apreciação 9. Algumas linhas de células podem desenvolver metástases geralmente no fígado. As metástases hepáticas (MET) podem ser detectados comumente usando a imagem de bioluminescência quando as células luciferase-positivos foram implantados ou por dissecção hepática após animais morreram. METs fígado encurtar o tempo de vida dos animais, de modo que o plano de estudo deve ser estabelecido em conformidade.
Quantitative DCE-MRI foi implementado com sucesso para um modelo de rato tumor pancreático orthotopic. Para quantificar parâmetros farmacocinéticos do agente de contraste MR baseado no modelo de fluxo limitado Kety 20, a função de entrada arterial (AIF) deve estar disponível. Nesta aplicação, a aorta abdominal está dentro do campo de visão, de modo FIA pode ser obtida directamente medindo a alteração da concentração de contraste MR na aorta abdominal. No entanto, tele diâmetro interior da aorta abdominal do rato é inferior a 1 mm (0,5-0,7 mm), 22, e empiricamente o tamanho do pixel deve ser, pelo menos, quatro vezes menor do que o diâmetro (0,125 mm), para evitar o efeito do volume parcial grave. Além disso, a taxa de amostragem ideal da FIA é 1-2 sec 23. Na ressonância magnética, resoluções espaciais e temporais comprometer com SNR. Por isso, é um desafio para obter um FIA de confiança no DCE-MRI de camundongos. Alternativamente, o modelo de (RR) região de referência pode ser utilizado. Modelo RR emprega os dados de aumento de contraste em uma região de referência (tipicamente o tecido do músculo), para remover a necessidade de AIF na farmacocinética de parâmetro de quantificação. No entanto, o volume extracelular extravascular fraccionada na região de referência deve ser assumida, o que causou cerca de 35% de erro em um estudo (n = 9) 21. No entanto, a alteração da microcirculação do tumor depois da terapia pode ser medido com precisão, se a mesma região referência é seleccionado em cada momento.
24,25.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | Harlan Laboratories | BT-9501 | |
| Betadine | Purdue products | 67618-153-01 | |
| 5-0 Prolene sutures | Ethicon | 8720H | |
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin Corporation | BioSpec 94/20 USR | |
| Gadoteridol | Bracco Diagnostics Inc | NDC 0270-1111-03 | |
| Micro-polyethelene tube | Strategic Applications, Inc | #PE-10-25 | |
| 30 G blunt tip needle | Strategic Applications, Inc | 89134-194 | |
| Monitoring and gating system | SA instruments, Inc | Model 1030 | This is an MR compatiable system to measure resiratory rating and body temperature of small animals at the same time. |
| Syringe pump | New Era Pump Systems, Inc. | NE-1600 |
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