Summary
Dit protocol geeft een methode waarbij een grote unilaterale craniotomie via temporale en pariëtale gebieden van het muizen cerebrale cortex. Dit is vooral handig voor real-time beeldvorming over een uitgestrekt gebied van een corticale halfrond.
Abstract
De craniotomie is een vaak uitgevoerde procedure naar de hersenen bloot te leggen voor in vivo-experimenten. In muis onderzoek, de meeste laboratoria gebruik van een kleine craniotomie, typisch 3 mm x 3 mm. Dit protocol introduceert een werkwijze voor het creëren van een aanzienlijk grotere 7 mm x 6 mm craniale venster blootstellen meeste een hersenhelft via muis temporale en pariëtale cortex (bv bregma 2,5-4,5 mm, lateraal 0-6 mm). Om deze operatie uit te voeren, moet de kop worden gekanteld ongeveer 30 ° en een groot deel van de temporale spier moet worden teruggetrokken. Door de grote hoeveelheid bot verwijderd, wordt deze procedure alleen bedoeld voor acute experimenten met de dieren onder narcose in de hele operatie en experiment.
Het belangrijkste voordeel van deze innovatieve grote laterale craniale raam is om gelijktijdige toegang tot zowel de mediale en laterale gebieden van de cortex te verschaffen. Deze grote eenzijdige craniale venster kan worden gebruikt om de neurale dynamiek tussen cellen te bestuderen,alsmede verschillende corticale gebieden door het combineren van meerdere elektroden elektrofysiologische opnames, beeldvorming van neuronale activiteit (bijvoorbeeld intrinsiek of extrinsiek beeldvorming) en optogenetic stimulatie. Bovendien is deze grote craniotomie onthult ook een groot gebied van corticale bloedvaten, waardoor directe manipulatie van de laterale corticale vaatstelsel.
Introduction
De craniotomie is een standaardprocedure die door neurologen om een gedeelte van de hersenen te onthullen. Sinds het begin van de elektrofysiologie, heeft de craniotomie ongekende doorbraken op het gebied van de neurowetenschappen toegestaan. Dichte kaart brengen van de cerebrale cortex van elektroden leidde tot experimenten testen hypothesen en theorieën op basis van deze kaarten. We hebben onlangs een nieuw tijdperk waarin de craniotomie wordt gebruikt voor in vivo beeldvorming van corticale bloedstroming 1, 2, 3 en 4 neurovasculaire architectuur, waardoor real time visualisatie van de corticale activiteit in de belichte gebieden 5, 6, 7. Hoewel veel studies gebruikt craniotomies gecombineerd met in vivo optische beeldvormende technieken om de structuur en functie van corticale neuronen, glia en cor studiesche vaatstelsel 8, 9, verder onderzoek beperkt tot kleine gebieden van de blootgestelde cortex (maar zie 10).
Het doel van dit protocol is een werkwijze voor het maken van een grote laterale craniotomie, waardoor de cerebrale cortex van de middellijn naar het OS SQUAMOSUM en zich uitstrekt voorbij bregma en lambda. Deze grote craniotomy maakt gelijktijdig bekijken van de vereniging cortex (retrospleniale, cingulate en pariëtale), primaire en secundaire motor, somatosensorische, visuele en de auditieve cortex. Deze werkwijze is eerder gekoppeld spanningsgevoelige kleurstof imaging (VSDI) te onderzoeken hoe meerdere corticale gebieden met elkaar tijdens spontane en stimulus-geïnduceerde corticale activiteit 5, 11, 12. De meest uitdagende aspecten van deze procedure omvatten het positioneren van de kopvan het dier, de vaststelling van de kopplaat en het vermijden bloeding onder afscheiding van de temporale spier van de pariëtale botten. Ook moet worden genomen tijdens het boren en schedel verwijderingsprocessen de schedel bochten onder een schuine hoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol volgt de richtlijnen van de Animal Care Committee (ACC) van de Universiteit van Lethbridge en wordt uitgevoerd in overeenstemming met de normen van de Canadese Raad voor Dierenverzorging (CCAC).
1. Bereiding
- Autoclaaf voor geopereerde chirurgische benodigdheden en zorg ervoor dat de steriliteit gedurende de operatie wordt gehandhaafd. Als meerdere operaties nodig zijn, autoclaaf tussen operaties.
- Zorg ervoor dat er voldoende hersenbuffer bij de hand is (tenminste 50 ml). De oplossing bestaat uit 134 mM natriumchloride, 5,4 mM kalium, 1 mM magnesiumchloride hexahydraat, 1,8 mM calciumchloride dihydraat en 5 mM HEPES natrium, pH gebalanceerd tot 7,4 met 5 M waterstofchloride.
- Plaats de muis in een inductiekamer en verdov met 3-4% isofluraan. Volg met 1,0 - 2,0% isofluraan voor onderhoud tijdens de operatie. Verdere reductie tot zo laag als 0,4 - 0,8% tijdens beeldvormings = "xref"> 5, 13, 14, 15, mits de juiste anesthesie wordt gehandhaafd. Deze lage niveaus van verdoving waakzaam en frequente controle van de muis (ongeveer elke 5 min) om ervoor te zorgen het blijft areflexic op pijnprikkels.
OPMERKING: Uitdroging kan problematisch worden als gevolg van de hoge oppervlakte tot volume verhouding van de muis en verergerd door langdurig gebruik van isofluraan.- Gebruik subcutane injecties van fysiologische zoutoplossing, 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht, iedere 1-2 uur. Bij voldoende gehydrateerd, zal eenmaal met de muis urineren per 1 - 2 uur.
- Nauwlettend toezien op de muis om te zorgen voor een consistente anesthesie hele operatie en beeldvorming. Laat de muis niet onbeheerd achter te laten en zorg ervoor dat het nooit terug bij bewustzijn.
- Breng de verdoofde muis op het hoofd-houder set-up en plaats op een thermo-regulering verwarmingskussen ingesteld op 37 ° C. Bevestig de bovenste TeetH in een tandenhouder.
- Draai de kop van de muis naar links ongeveer 30 ° om de rechter zijdelingse zijde van het hoofd te openen en beveilig het hoofd van de muis met het stompe uiteinde van de oorbouten ( Figuur 1A ).
- Toepassing van oftalmische zalf om te voorkomen dat het drogen van de hoornvlies.
- Om cerebrale oedeem te verminderen, injecteer dexamethason (4 mg / kg) intramusculair.
- Veeg de huid over het chirurgische gebied met katoenen zwabbers gedompeld in 4% chlorhexidine (3 keer) en 70% ethanol (3 keer). Gebruik elke katoenwip slechts één keer.
- Don chirurgische handschoenen en bedek het dier met lijm plastic wrap. Geef lokale verdoving door injectie van lidocaïne (8 - 10 mg / kg, 2% epinefrine) subcutaan over de craniotomie plaats. Wacht 3 tot 5 minuten voor het medicijn in het weefsel geabsorbeerd worden.
2. Verwijderen van de huid en terugtrekken van de spier uit de schedel
- Doe bijna alle deze procedures terwijl u de schedel onder adissectiemicroscoop (bijvoorbeeld 0,7 - 4,5X vermogen, afhankelijk van de situatie).
- Hef de huid 1 mm links van de middellijn (net achter het oor) met een tang en een kleine horizontale incisie met chirurgische schaar.
- Voeg een 5-6 mm lateraal cut naar het rechteroor, en snijd de rostrale richting van de kop.
- Bij de initiële incisie punt plaatst de schaar en knip 10 mm rostraal.
- Snijd de huid rond de rechter oor en in de buurt van het rechter oog naar de rechterkant van de schedel en de temporale spier bloot te leggen. Zorgen dat het breedste deel van het blootgestelde gebied ten minste 7 mm. Snijd de huid verder als de chirurgische gebied worden uitgebreid moet worden.
- Maak de huid rond de incisie door een paar druppels butyl cyanoacrylaat lijm tussen de schedel en de huid. Verzekeren het weefsel is eerder gedroogd wattenstaafje applicators of opgerold weefsel om de werkzaamheid van het hechtmiddel te vergroten.
- Met een wattenstaafje, wrijf het oppervlakvan de schedel in een cirkelvormige beweging om het periost van de schedel verwijderd. Zorg ervoor dat niemand blijft door het volledig drogen van de schedel.
- Met behulp van de lente een schaar en pincet, scheiden de temporalis van de schedel; snijden en trekken de spieren zijdelings tot aan de OS SQUAMOSUM (figuur 1C). Wees uiterst voorzichtig niet om de oppervlakkige temporale ader die loopt langs het niveau van de OS SQUAMOSUM dichtbij het oog beschadigen, anders bloedingen kunnen optreden.
- Control bloeden met gelschuim voorgeweekt in buffer hersenen. Voor ernstige bloedingen gebruik maken van een warmte cauterizer. Daling butyl cyanoacrylaat lijm op het bloeden plaatsen na behandeling met warmte cauterizer. Zorgen de omgeving wordt vooraf gedroogd met behulp wattenstaafje applicators of opgerold weefsel om de werkzaamheid van het hechtmiddel te vergroten.
3. Craniotomy
OPMERKING: De chirurg moet tijdens het verwijderen van de schedel ijverige blijven enDura om onnodige complicaties te voorkomen. Problemen oplossen stappen zijn opgenomen als er complicaties optreden.
- Merk de locatie van bregma ofwel met een fijne puntmarkering of snijd een kleine driehoekige stukband en wijs een hoek aan bij bregma ( Figuur 2A ) om de onderliggende hersenregio's te oriënteren.
- Voordat u de kopplaat bevestigt, zorg ervoor dat de schedel helemaal droog is. De schedel zal snel luchtdrogen na het aanbrengen van het gel-schuim dat in de hersenbuffer is geweekt. Als er meer droging nodig is, gebruik dan katoenen speldjes. Deze stap is cruciaal voor de kopplaatfixatie ( Figuur 1B ).
OPMERKING: Als er periosteum op de schedel is, of als de schedel niet droog is voordat u op de kopplaat lijmt, zal het waarschijnlijk loslaten. Als dit gebeurt, verwijder de kopplaat voorzichtig en begin opnieuw. Bloed kan zich voordoen tijdens dit proces; Laat een paar minuten duren om het te stolpen en verwijder het dan voorzichtig. Dit proces wordt niet aanbevolen om meer dan twee keer te herhalen. <li> Breng ethyl cyanoacrylaat lijm rond de onderkant van de kopplaat 16 en lijm de kopplaat via craniotomie gebied (figuur 1D en figuur 2A). - Vul de opening ruimte tussen de schedel en het hoofd plaat met tandheelkundige cement waardoor alleen de craniotomie blootgestelde gebied. Wacht tot het tandcement drogen en uitharden, gewoonlijk 5-10 min (figuur 2B).
- Zodra het cement is ingesteld kort de put te vullen met hersen buffer en laten inwerken gedurende 3-5 min. Met een opgerolde weefsel hersenen buffer te verwijderen vóór het boren (figuur 2C).
- Schets de chirurgische gebied door licht scoren het oppervlak van de schedel met een tandheelkundige boor. Gebruik een drilboor (ingesteld op maximaal 20 PSI), met een FG ¼ braam en gecontroleerd met een variabele snelheid voetpedaal.
- Voorzichtig traceren de boor langs de oorspronkelijke doelpunt te verdiepen, eij let de boor dringt niet door de schedel naar de hersenen (Figuur 2D). Om de beurt om de paar minuten tussen boren en deppen de schedel oppervlak met bevochtigd gerold weefsels. Dit verwarmen en drogen van de schedel van mechanische wrijving en langdurige blootstelling.
OPMERKING: De schedel zal snel lucht drogen na het aanbrengen van de natte gel foam. Als er meer drogen nodig is, gebruik wattenstaafje swabs.
Let op: De schedel is ongelijk in dikte. Bijvoorbeeld de pariëtale-temporale kam is de dikste gebied, terwijl schedel gebieden nabij de middellijn en squamosal monumenten zijn relatief dun. - Tijdens het boren, periodiek op knikken van de schedel door zachtjes te drukken met een tang of de niet-bewegende boor. Wanneer het been begint te knikken, stop boren en dompel het gehele venster in de hersenen buffer.
LET OP: Als er bloed rent uit van een gebied, kan het vermoeden dat de dura is beschadigd. Als dit het geval is, plaatst u een semi-natte gel foam via stippellijn proberen te genieten van de bloed onder voorzichtig druk uitoefenend op de gel schuim met een wattenstaafje wattenstaafje. - Wacht minstens 5 minuten voor schedel verwijderd tot op het bot te verzachten en om de kans op de dura vast te houden aan het bot te verminderen, waardoor de schedel verwijdering proces gemakkelijker.
- Voer de schedel verwijderingsproces terwijl de schedel wordt bedekt hersenen buffer.
LET OP: Als een deel van de schedel hardnekkig blijft vastzitten, kan een # 11 scalpel worden gebruikt om voorzichtig de score van de schedel. Wees uiterst voorzichtig om niet te doorboren het mes door de schedel en in de hersenen. - Beginnend vanaf de voorrand voorzichtig wrikken de losse schedel van de dura behulp van een tang.
OPMERKING: Indien een kleine hoeveelheid bloeden optreedt tijdens de schedel verwijderingsproces, verwijder de buffer met een transfer pipet of spuitje, en vervolgens vervangen door nieuwe buffer. - Zodra het bot los en "zwevende" op de dura, stevig grip op het bot met een tang en til het been vande dura. Zorg ervoor dat het bot nooit in de hersenen doordringt.
- Om bloeden te beheersen, rollen de hoek van een weefsel in een punt en de meeste buffer uit de craniale ook. Snel toepassing gelschuim, voorgeweekt in buffer aan het aflopend vlak onder toevoeging van zeer lichte druk met een wattenstaafje wattenstaafje.
Opmerking: Het bloeden is meestal afkomstig van de rand van het bot en het oppervlak van de dura; beide gevallen zijn normaal en bloeden zal snel stoppen als er geen grote bloedvaten beschadigd zijn. Als bloeden blijft, kan bloed het gehele venster vullen, vormen een stolsel laken over het afbeeldingsgebied.- Om het stolsel vel te verwijderen, zorgvuldig pick-up stukken van geronnen bloed uit de beeldvorming gebied, terwijl het verlaten van de bloedprop intact rond de bron van de gescheurde bloedvat. Zorg ervoor dat de bloedprop niet verwijderen van de snit bron, omdat dit nog meer bloedverlies kan veroorzaken. Irrigeren het oppervlak van de hersenen hersenen buffer wegwassen geen bloed.
- Wees voorzichtig om te voorkomen dat het aanraken van dedelicate hersenweefsel of het toevoegen van vreemd materiaal naar de hersenen; herhaal tot bloeden is gestopt, gedurende ongeveer 2-5 minuten (Figuur 2E).
LET OP: Op dit punt, de craniotomie klaar is voor de voorbereiding van de craniale venster (zie stap 5). Indien nodig, verwijder de dura voordat het implanteren van de craniale venster (zie stap 4).
4. Dura Removal
OPMERKING: Dura verwijdering is uiterste voorzichtigheid vereist en kunnen meer dan 15 minuten duren.
- Wegtrekken overtollige buffer van de craniotomie. Terwijl een vochtig oppervlak, pak een stukje dura met een tang en voorzichtig scheur de dura.
- Tang en veer schaar voorzichtig scheuren en knip de dura.
- Drop meer hersenen buffer op de hersenen oppervlak om de dura drijven en hulp te scheiden van de hersenen. Ga door totdat alle dura van de craniale venster site is verwijderd. Wanneer correct wordt uitgevoerd zal de hersenen blijken zeer schoon met verschillende bl te zijnood schepen en geen vlekken (vergelijk figuur 2E met 2F).
Waarschuwing: Sommige gebieden van de dura worden op het oppervlak van de hersenen (bijvoorbeeld bij de middellijn proximaal van de pariëtale associatie gebied) verbonden kleine arteriolen en verwijdering van dergelijke kan de arteriole scheuren. In dergelijke gevallen kan het beter zijn om een klein stukje intacte dura over de top van de arteriole verlaat. De FO kan niet door dat kleine gebied, maar dit heeft de voorkeur dat dit belangrijke bloeden. - Bevestig de hersenen oppervlak agarose zo snel mogelijk te minimaliseren beweging van pulsatie en verdere zwelling te voorkomen (zie stap 5).
5. Voorbereiden Cranial Window
- Spuit de dekglas met 70% ethanol en een luchtverfrisser bus zachtjes droog. Verzekeren het glas volledig schoon zonder vlekken of stof aanwezig.
- Bereid 1,3% agarose door verhitting van 200 mg agarose poeder opgelost in 15 ml buffer hersenen. Stel de Microwave hoog en verwarm gedurende 10-15 s tegelijk voorzichtig roeren tussendoor, totdat alle agar is opgelost.
Opmerking: Controleer of er geen luchtbellen of deeltjes aanwezig zijn, aangezien deze zal interfereren met beeldvorming. - Plaats een thermometer in de hete agarose en koel de agarose omlaag tot net boven het stollen van temperatuur (~ 40 ° C).
OPMERKING: Lopend koud water over de buitenkant van de agarose houder kan het koelproces te versnellen. Roer voortdurend geen bellen zorgen of deeltjes aanwezig zijn. - Onmiddellijk voordat de agar, verwijder de hersenen buffer van de craniale ook. Het opstellen van de agarose met een transfer pipet en laat de agarose rechtstreeks op de hersenen. Plaats snel het deksel slip over het oppervlak en bevestig de deksel slip met agarose druppels op de hoeken.
6. Euthanasie
LET OP: In onze ervaring, neemt deze procedure ervaren chirurgen minstens 3-4 praktijk operaties te bereiken meer dan 90%slaagkans. Minder ervaren chirurgen kunnen zelfs meer oefening nodig hebben. Tijdens de craniotomie of durotomie kan de hersenbeschadiging, bijvoorbeeld als de boor stoten door het bot in de hersenen ondersteunen. Enkele kleine beschadigingen aan de rand van craniotomie kan toelaatbaar zijn. Echter, als de hersenen niet "schone" met heldere rode onbeschadigde bloedvaten en witte cortex uitziet, moet het experiment worden beëindigd. Voorbeelden van slechte preparaten omvatten die met dode bloedvaten, of wanneer de cortex wordt aangeduid met gescheurde of beschadigde bloedvaten. Als een van deze symptomen aanwezig zijn, wordt het experiment onwaarschijnlijke leveren van hoge kwaliteit van de gegevens. Of de operatie / experiment geslaagd is of niet, humaan euthanaseren de muis bij de voltooiing van het experiment.
- Diep verdoven met ten minste 3,5% isofluraan. Vervolgens geeft een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital bij 300 mg / kg. Idealiter, als de naald in de lever wordt ingebracht, de dood zal zeer snel (<1 min) zijn.
- Als perfusie nodig is, controleert u of het dier diep onder narcose alvorens verder te gaan (zie stap 1.3).
- Als alternatief, als perfusie niet vereist is, wacht minimaal 5 minuten en controleer of de muis dood. Bevestigt de afwezigheid van ademhaling, hartslag, en een gebrek aan pijn terugtrekking en corneareflexen. Ook acht voor lichtblauw / wit en kleur van extremiteiten en donker worden van de bloedvaten in de cortex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De interacties tussen corticale gebieden binnen een halve bol bestuderen, gebruikten we een grote craniotomie zich over het sagittale sinus en 5-6 mm lateraal. Dit craniale venster opgenomen primaire (motor somatosensorische, visueel, auditief), secundaire (motor, visueel) en vereniging (retrospleniale, cingulate, pariëtale associatie) cortices van rechter hersenhelft (Figuur 3A). Voor dit werk gebruikten we spanningsgevoelige kleurstof (VSD) beeldvorming, die veranderingen in de membraanpotentiaal 3 weerspiegelt. Dit protocol zou ook nuttig zijn voor andere extrinsieke (bijvoorbeeld calcium- 17 en 18 glutamaat imaging) of intrinsiek imaging experimenten. Bij het stimuleren van het achterbeen, voorpoot, bakkebaarden, visueel of auditief systeem van muizen licht verdoofd onder toepassing van 0,5% isofluraan zagen we consensus patronen van corticale depolarisatie (> Figuur 3B). Consistent met eerdere studies 5, 19, 20, 21, 22, vonden we dat korte tactiele stimulatie C2 barrel cortex leidde tot activatie van primaire somatosensorische gebieden, evenals "eilandjes" van de reacties op functioneel verwante gebieden. Bijvoorbeeld, het primaire motorische cortex (M1) of secundaire representatie van somatosensorische cortex (S2, figuur 3BI). Eén 1 ms toon pip (25 kHz) stimulatie leidde tot de activatie van primaire auditieve cortex (A1) ongeveer 20 ms na auditieve stimulatie (Figuur 3Bii). In de komende paar milliseconden, de depolarisatie verspreid over de auditieve cortex en doorgegeven aan naburige secundaire somatosensorische cortex. Ongeveer 25 ms na de toon begin, zou een secundaire corticale depolarisatie ontstaan, gelegen 1.07; 0,2 mm mediaal en 1,9 ± 0,1 mm posterior ten opzichte van bregma (n = 9 muizen). Dit is ongeveer de locatie van het parietale verenigingsgebied (ptA). Het VSD-signaal wordt vervolgens gepropageerd naar het middenlijngebied waar andere corticale associatiegebieden zich bevinden, waaronder retrospleniale (RS) en cingulale cortex (CG). Daarom leidde de auditieve stimulatie tot de activatie van twee afzonderlijke brandpunten, van waaruit de reizende golven van VSD-depolarisatie zich verspreiden naar een groter gebied binnen de middenlijncortex. Focal stimulatie van het contralaterale oog met een 1 ms groene LED-puls, leidde tot activatie van de primaire visuele cortex binnen 40 ms ( Figuur 3Bv ). Deze primaire activering van de visuele cortex werd gevolgd door: (1) Ruimtelijke expansie van VSD-depolarisatie in naburige gebieden die mediaal, zijdelings en voorkant van het initieel geactiveerde gebied bevinden; (2) Depolarisatie van een tweede mediale corticale regio ongeveer 50 ms na stimulatie (n = 8 experimenten) gelegen langs sa gittal hechtdraad. Dit kwam overeen met sensorische prikkels van de voorpoot (figuur 3Biii) achterpoot (figuur 3Biv), C2 whisker of gehoor. VSDI uitgelokte reacties van sensorische stimulatie van de voorpoot, achterpoot of gehoor eerst activeerde de respectieve primaire sensorische cortex, gevolgd door een anisotrope spreiding activiteiten, alsmede midline cortex activatie van ongeveer 20-40 ms na de stimulatie. Dit resultaat was vergelijkbaar met reacties van visuele en snorhaar stimulatie. De voortplanting van sensorische opgewekte activiteit langs deze middellijn routes en frequente activering daarvan regios op spontane activiteit 6 kan erop wijzen dat deze gebieden het centrale knooppunt van de verbinding kern van de muis cortex, waarin sensorische informatie kan integreren spontane corticale activiteit.
2fig1.jpg"/>
Figuur 1. Chirurgische Setup en voorbereiding. (A) Muis kop geschoren, gereinigd, ongeveer 30 ° voor het zijdelings blootstelling gedraaid en bevestigd met stompe uiteinde van het oor bars. Isofluraan anesthesie wordt via een neusstuk en tanden houder. De muis is bedekt met zelfklevende plasticfolie voor verhoogde steriliteit en warmte. (B) Close-up toont huid en beenvlies uit de pariëtale schedel plaat, de temporalis onaangeroerd. (C) De temporale spier wordt verwijderd blootstellen van de tijdelijke plaat en OS SQUAMOSUM Noteer de oppervlakkige ader niet beschadigd. (D) voorafgaand aan fixatie, wordt de kopplaat zich in de juiste locatie met was. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Stap-voor-stap chirurgische ingreep. (A) De kopplaat is de schedel met ethyl cyanoacrylaat lijm aan het voorste en achterste locaties verbonden. Onthoud de bregma (zwarte driehoekige stukje plakband). (B) de craniale venster wordt vervaardigd door het aanbrengen verdikte tandheelkundig cement tussen de kopplaat en schedel. Merk op dat bregma en de squamosal oriëntatiepunten zichtbaar blijven. (C) Na drogen van cement wordt hersenen buffer toegevoegd aan de schedel te verzachten en om de hechting van de dura te voorkomen. Een opgerolde weefsel te verwijderen hersenen buffer voorafgaand aan het boren. (D) De randen van de craniotomie zijn gescoord. Let op de vasculatuur gemakkelijker gezien door het dun bot nabij het tandheelkundig cement randen. (E) De pariëtale en temporale schedel platen zijn afneemed en de dura zichtbaar. Opmerking vlekken van bloed op de dura van kleine bloeden, wat normaal is. Zorgvuldig onderzoek onder de 2 - 4x vergroting zal twee lagen van de bloedvaten, een in de dura en de andere in de pia onthullen. (F) De dura wordt verwijderd onthullen een ongerept cortex. Pial vaatstelsel is helder rood zonder vlekken aanwezig. Let op de losse stukjes wit gekleurde dura aan de randen van de craniale venster. In dit voorbeeld was er een kleine bloeding durale aan het achterste gedeelte van de craniale venster, die snel gestold. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Unieke en Consensus activatiepatronen tijdens meerdere vormen van zintuiglijke prikkeling. < / strong> (A) Schematische weergave van de unilaterale craniotomie met de afgebeelde corticale gebieden. (B) microfoto van het brede unilaterale craniotomie met bregma aangegeven met een witte cirkel in de opname. Patronen van corticale activatie wordt in een muis verdoofd met isofluraan (0,5%) na (i) stimulatie (Stim) van de contralaterale C2 snorhaar, (ii) auditieve stimulatie, (iii) contralaterale voorpoot stimulatie, (iv) contralaterale achterpoot stimulatie en (v) visuele stimulatie van de contralaterale oog met een lichtemitterende diode (LED). Er was middellijn activatie tenslotte vormen van sensorische stimulatie (witte pijlen) bij 10-25 ms na primaire sensorische cortex activatie. De reacties zijn het gemiddelde van 20 tests. Het tweede beeld van links in de tweede rij (ii) geeft de anterieure (A), posterieur (P), middel (M) en laterale (L) richtingen. Gewijzigd met toestemming van Mohajerani, et al., 2013.p_upload / 52642 / 52642fig3large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze innovatieve protocol voor een groot craniale raam maakt gelijktijdige beeldvorming via temporale en pariëtale gebieden van de cerebrale cortex. Gecombineerd met optische beeldvorming, kan het helpen om de neurale dynamiek binnen corticale gebieden onthullen tijdens spontane en stimulus-geïnduceerde activiteit. Deze uitgebreide craniotomie onthult ook een grote uitbreiding van de corticale vaatstelsel netwerk, inclusief het proximale uiteinde van de middelste hersenslagader (MCA), waardoor in vivo beeldvorming van bloedstroming en directe manipulatie van laterale vaten ischemische model. Deze techniek is zeer nuttig voor recent ontwikkelde lijnen van muizen die spanning en calciumindicator 23 eiwitten. Deze muizen bieden praktisch voordeel van het omzeilen van de noodzaak voor de incubatie voltage gevoelige kleurstoffen op de cortex. Deze extrinsieke kleurstoffen tijd nemen om adequaat te dringen het hersenweefsel (~ 60-90 min) en worden beperkt door hun milde toxiciteit. Grote craniotomies hebben ookeerder gebruikt om de ontwikkeling van rattenhersenen studie met VSDI 11. Pasgeboren ratten veel grotere kop en is vergelijkbaar in grootte met volwassen muizen. Dit biedt onderzoekers met een unieke kans om ontwikkelingsproblemen in de neurowetenschappen te bestuderen, zij het niet met transgene muizen.
De belangrijkste beperkingen van deze werkwijze zijn de onmogelijkheid voor chronische experimenten. De kromming van de schedel maakt het boorproces uitdagender en tijdrovend dan kleinere craniotomies. Deze grote craniotomie, is het essentieel om de koppositie met de centrale hechtdraad en squamosal bezienswaardigheden evenwijdig aan het concentreren van lens zijn. Hoewel enige vervorming van de hersenen wordt verwacht van de kromming van de hersenen, worden deze overwonnen door zich in de oppervlakkige lagen van de cortex. Dit probleem wordt verder verminderd door het verkrijgen van veel overlappende stimulatie en middeling. Kortom, onze grote craniotomy techniek is op grote schaal applicable voor de studie van de huidige problemen in de neurobiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC) Discovery Grant # 40352, Campus Alberta for Innovation Program Chair, Alberta Alzheimer Research Program aan MHM en NSERC CREATE in BIF doctorale beurs en AIHS postdoctoraal fellowship aan MK. Wij danken Pu Min Wang voor de ontwikkeling van dit protocol en voor chirurgische opleiding en Behroo Mirza Agha en Di Shao voor veeteelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating Pad | FHC | 40-90-2 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2 or more pairs are recommended |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00, 15000-10 | 1 pair should be designated for dura removal |
| Jet tooth shade powder | LANG Dental | Jet Tooth Shade Powder | to be mixed with the Jet Liquid |
| Jet tooth shade liquid | LANG Dental | Jet Tooth Shade Liquid | to be mixed wihth the Jet Powder |
| Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 | Midwest Dental | 385201 | |
| Agarose Powder | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Gelfoam | Sinclair Dental Canada | Pfizer Gelfoam | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Centre Ltd | 124125 | |
| Lidocaine 2% Epinephrine | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125299 | |
| Dexamethazone 5 mg/mL | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125231 | |
| Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) | Western Drug Distribution Centre Ltd | 12612 |
References
- Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).
- Mohajerani, M. H., et al. Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections. Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).
- Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice. J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).
- Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio. J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat. J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).
- Sweetnam, D., et al. Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke. J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).
- Yin, Y. Q., et al. In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia. Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).
- Sharp, P. S., et al. Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime. Scientific Reports. 5, 12621 (2015).
- Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Vanni, M. P., Murphy, T. H. Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex. J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs. Nat Commun. 6, 7738 (2015).
- Lim, D. H., et al. In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas. Front Neural Circuits. 6, (2012).
- Ferezou, I., et al. Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice. Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).
- Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
