Summary
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Schaffung einer großen einseitigen Kraniotomie über die zeitlichen und parietalen Regionen der Maus Hirnrinde. Dies ist besonders nützlich für die Echtzeit-Bildgebung über einen expansiven Bereich einer kortikalen Hemisphäre.
Abstract
Die Kraniotomie ist ein häufig durchgeführtes Verfahren , das Gehirn für in - vivo - Experimente zu belichten. In Maus-Forschung verwenden die meisten Labors eine kleine Kraniotomie, typischerweise 3 mm x 3 mm. Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Herstellung eines wesentlich größeren 7 mm x 6 mm kranialen Fenster zu schaffen meist eine zerebralen Hemisphäre über die Maus temporale und parietale Kortex aussetzt (zB Bregma 2,5 bis 4,5 mm, lateral 0-6 mm). Um diese Operation auszuführen, muss der Kopf gekippt werden etwa 30 ° und ein großer Teil der Schläfenmuskel muss zurückgezogen werden. Aufgrund der großen Menge an Knochenentfernung wird dieses Verfahren für die akute Experimente mit dem Tier während der Operation und Experiment betäubt nur gedacht.
Der Hauptvorteil dieses innovativen großen seitlichen Schädelfenster gleichzeitigen Zugang zu den beiden medialen und lateralen Bereichen der Hirnrinde zu liefern. Dieses große einseitige Schädelfenster kann verwendet werden, um die neuronale Dynamik zwischen Zellen zu untersuchen,sowie zwischen verschiedenen kortikalen Bereichen von Multi-Elektroden - elektrophysiologische Aufzeichnungen, Bildgebung neuronaler Aktivität (zB intrinsische oder extrinsische imaging) und optogenetische Stimulation kombiniert. Zusätzlich bietet diese große Craniotomie macht auch einen großen Bereich der kortikalen Blutgefäße, für die direkte Manipulation der lateralen kortikalen Gefäße ermöglicht.
Introduction
Die Kraniotomie ist ein Standardverfahren von Neurowissenschaftlern verwendet, um einen Teil des Gehirns zu zeigen. Seit Anbeginn der Elektrophysiologie hat die Kraniotomie beispiellos Durchbrüche auf dem Gebiet der Neurowissenschaften erlaubt. Dichte Abbildung der Hirnrinde mit Elektroden führte zu Experimenten Überprüfung von Hypothesen und Theorien auf der Grundlage dieser Karten. Wir haben vor kurzem in eine neue Ära , in der die Kraniotomie für in vivo Bildgebung von kortikalem Blutfluß 1, 2, 4, 3 und Gefäß - Nerven - Architektur ermöglichte die Visualisierung der kortikalen Aktivität in Echtzeit in den belichteten Bereichen 5, 6, 7 verwendet wird. Obwohl viele Studien verwenden Kraniotomien mit in vivo optischen Bildgebungstechniken kombiniert , um die Struktur und Funktion von kortikalen Neuronen zu untersuchen, Glia und cortische Vaskulatur 8, 9, werden weitere Untersuchungen von kleinen Bereichen des exponierten cortex begrenzt (siehe aber 10).
Der Zweck dieses Protokolls ist es, ein Verfahren zum Erzeugen einer große seitliche Kraniotomie zu schaffen, die Hirnrinde von der Mittellinie auf das Schuppenbein aussetzt und darüber hinaus Bregma und Lambda erstreckt. Diese große Kraniotomie ermöglicht die gleichzeitige Betrachtung der Assoziationskortizes (retrosplenialen, cingulären und parietale), primären und sekundären Motor, somatosensorischen, visuelle und auditorischen Cortex. Dieses Verfahren wurde mit spannungsempfindliche Farbstoff imaging (VSDI) zu untersuchen , die zuvor gekoppelt , wie mehrere kortikalen Bereichen miteinander während der spontanen und Stimulus-induzierten kortikaler Aktivität 5, 11, 12 in Wechselwirkung treten. Die schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens umfassen Positionierung des Kopfesdes Tieres, Fixieren der Kopfplatte, und die Vermeidung von Blutung während des Schläfenmuskel von dem parietalen Knochen trennt. Es muss auch während der Bohr- und Schädel-Entfernungsverfahren, wie die Schädel Kurven in einem schrägen Winkel aufgenommen werden.
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Protocol
Das folgende Protokoll folgt der University of Lethbridge Animal Care Committee (ACC) Richtlinien und wird in Übereinstimmung mit den Standards des Canadian Council on Animal Care (CCAC) durchgeführt.
1. Vorbereitung
- Für eine längere Studienzeiten, Autoklaven alle chirurgische Versorgung geöffnet und dafür sorgen, dass die Sterilität während der Operation aufrechterhalten wird. Wenn mehrere Operationen erforderlich sind, Autoklaven zwischen Operationen.
- Stellen Sie sicher, es gibt viele Gehirnpuffer auf der Hand (mindestens 50 ml) ist. Die Lösung wird aus 134 mM Natriumchlorid besteht, 5,4 mM Kalium, 1 mM Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 1,8 mM Calciumchlorid-dihydrat und 5 mM HEPES-Natrium, pH-neutral auf 7,4 mit 5 M Chlorwasserstoff.
- Platzieren Sie die Maus in eine Ansaugkammer und anästhesieren mit 3 bis 4% Isofluran. Folgen Sie mit 1,0-2,0% Isofluran für die Wartung während der Operation. weiter reduzieren zu so niedrig wie 0,4 bis 0,8% während des AbbildensS = "xref"> 5 , 13 , 14 , 15 , sofern eine ordnungsgemäße Anästhesie aufrechterhalten wird. Diese niedrigen Anästhesieanforderungen erfordern eine wachsame und häufige Überwachung der Maus (etwa alle 5 min), um sicherzustellen, dass sie für schmerzhafte Reize unflexibel bleibt.
HINWEIS: Die Dehydratation kann aufgrund des hohen Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnisses der Maus problematisch werden und durch eine verlängerte Verwendung von Isofluran verschärft werden.- Verwenden Sie subkutane Injektionen von Kochsalzlösung, 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht, alle 1 - 2 h. Wenn adäquat hydratisiert wird, wird die Maus einmal alle 1 - 2 h urinieren.
- Die Maus sorgfältig überwachen, um eine konsistente Anästhesie während der Operation und Imaging zu gewährleisten. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt und achten Sie darauf, dass sie niemals das Bewusstsein wiedererlangt.
- Übertragen Sie die anästhesierte Maus auf die Kopfhalterung und legen Sie sie auf einen thermo-regulierenden Heizkissen auf 37 ° C. Sichern Sie den oberen Teeth in einem Zahnhalter.
- Drehen , um die Kopf der Maus nach links in etwa 30 ° die rechte seitliche Seite des Kopfes zu , und die Maus des Kopf mit dem stumpfen Ende der Ohrstäbe (1A) zu sichern.
- Bewerben Augensalbe Hornhaut Austrocknen zu verhindern.
- Zu reduzieren, Hirnödem, intramuskulär Dexamethason (4 mg / kg) injizieren.
- Wischen, die Haut über das Operationsgebiet mit Baumwolle in 4% Chlorhexidin getaucht Tupfer (3-mal) und 70% Ethanol (3 mal). Verwenden Sie nur einmal pro Wattestäbchen.
- Don chirurgische Handschuhe und deckt das Tier mit klebender Kunststofffolie. Für örtliche Betäubung durch Einspritzen von Lidocain (8 - 10 mg / kg; 2% Epinephrin) subkutan über die Kraniotomiestelle. Warte 3 bis 5 min für das Medikament in das Gewebe absorbiert werden.
2. Entfernen der Haut und einfahren Muskel aus dem Schädel
- Führen Sie fast alle diese Verfahren während der Schädel unter einem BetrachtungsBinokular (zB 0,7 - 4,5 - fachen Leistung, abhängig von der Situation).
- Heben Sie die Haut 1 mm von der Mittellinie nach links (direkt hinter dem Ohr) mit einer Pinzette und macht einen kleinen horizontalen Schnitt mit chirurgischen Scheren.
- Machen Sie einen 5 - 6 mm Seitenschnitt auf dem rechten Ohr, und dann in Richtung des rostralen Ende des Kopfes geschnitten.
- Bei dem Anfangspunkt Inzision, die Scheren einzusetzen und zu 10 mm rostral schneiden.
- Schneiden Sie die Haut um das rechte Ohr und in der Nähe des rechten Auges auf die rechte Seite des Schädels und der Schläfenmuskel zu belichten. Sicherstellen, dass der breiteste Teil der belichteten Fläche mindestens 7 mm beträgt. Schneiden Sie die Haut weiter, wenn der OP-Bereich erweitert werden muss.
- Befestigen Sie die Haut um den Schnitt durch ein paar Tropfen Butylcyanoacrylat Klebstoff zwischen dem Schädel und der Haut. Sicherstellen, dass das Gewebe wurde mit Baumwollspitze Applikatoren oder gerollte Gewebe zu erhöhen, um die Wirksamkeit des Klebstoffes zuvor getrocknet.
- Mit einem Wattestäbchen, reiben Sie die Oberflächedes Schädels in einer kreisförmigen Bewegung des Periosts aus dem Schädel zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass keiner bleibt durch den Schädel vollständig trocknet.
- Mit Feder Schere und Pinzette, trennt den Schläfenmuskel aus dem Schädel; geschnitten und einfahren , bis der Muskel seitlich Schuppenbein (1C) erreicht. Größte Vorsicht walten lassen nicht die oberflächliche zeitliche Vene zu beschädigen, die in der Nähe des Auges entlang der Ebene des Squamosum Knochen läuft, sonst Blutungen auftreten können.
- Kontrolle Blutungen mit Gel-Schaum in Gehirn Puffer vorgetränkt. Für ernsthaften hemorrhaging einen Wärme Ausbrenner verwenden. Drop Butylcyanoacrylat Leim auf die Blutungsstellen nach der Behandlung mit dem Wärme Ausbrenner. Sicherstellen, dass der Bereich getrocknet wird zuvor durch Baumwollspitze Applikatoren oder gerollte Gewebe mit der Wirksamkeit des Klebers zu erhöhen.
3. Craniotomy
HINWEIS: Der Chirurg muss während der Entfernung des Schädels fleißig bleiben unddura, um unnötige Komplikationen zu vermeiden. Schritte zur Fehlerbehebung sind enthalten sollten Komplikationen auftreten.
- Mark der Ort des Bregma entweder mit einem feinen Spitze Marker oder geschnitten , um eine kleine dreieckiges Stück Band und zeigt eine Ecke am Bregma (2A) , um die darunterliegenden Hirnregionen zu orientieren.
- Vor der Kopfplatte Befestigung gewährleistet der Schädel vollständig trocken ist. Der Schädel wird schnell Luft trocknen nach dem Auftragen des Gels Schaum in brain Puffer getränkt, wenn mehr Trocknen benötigt wird, Baumwollspitze Tupfer verwenden. Dieser Schritt ist entscheidend für die Kopfplatte Fixation (1B).
HINWEIS: Wenn es Periost links auf dem Schädel, oder wenn der Schädel vor dem Verkleben auf der Kopfplatte nicht trocken ist, wird es wahrscheinlich abnehmen. Wenn dies der Fall ist, entfernen Sie die Kopfplatte und von vorn beginnen. Blutungen während dieses Prozesses auftreten können; erlaubt ein paar Minuten, es gerinnen zu lassen, und dann sanft entfernen. Dieser Prozess wird empfohlen, nicht mehr als zweimal wiederholt werden. <li> Ethylcyanoacrylat Kleber um den unteren Rand der Kopfplatte 16, Übernehmen und die Kopfplatte über den Kraniotomie Bereich (1D & 2A) kleben. - Füllen Sie den Öffnungsraum zwischen dem Schädel und Kopfplatte mit Zahnzement ausgesetzt nur der Kraniotomie Bereich zu verlassen. Warten , bis der Zahnzement zu trocknen und zu härten, typischerweise von 5 bis 10 min (2B).
- Sobald der Zement gesetzt ist, kurz die gut mit Gehirn-Puffer füllen und ermöglichen 3 einweichen - 5 min. Verwenden eines aufgerollten Gewebe Gehirn Puffer zu entfernen , bevor das Bohren (2C).
- Skizzieren Sie den OP-Bereich durch leicht auf die Oberfläche des Schädels mit einem Zahnbohrer Scoring. Verwenden eines pneumatischen Bohrers (auf maximal 20 psi), mit einem FG ¼ Grates und mit einer variablen Geschwindigkeit Fußpedal gesteuert.
- Sanft die Bohrer verfolgen entlang des ursprünglichen Scoring es zu vertiefen, eHat der Bohrer nsuring nicht durch den Schädel in das Gehirn (2D) durchdringen. Wechseln sich alle paar Minuten zwischen Bohr- und Abtupfen der Schädeloberfläche mit angefeuchteten gewalzten Geweben. Dies wird Erhitzen und Trocknen des Schädels von mechanischer Reibung und längerer Exposition reduzieren.
HINWEIS: Der Schädel wird schnell Luft trocknen nach dem Auftragen des nassen Gels Schaum. Wenn mehr Trocknung erforderlich ist, verwenden Wattestäbchen Abstriche.
Achtung: Der Schädel ist ungleichmäßig dick. Zum Beispiel ist der parietale zeitliche Grat der dickste Bereich, während Schädel Regionen in der Nähe der Mittellinie und Squamosum Sehenswürdigkeiten relativ dünn sind. - Während des Bohrens periodisch überprüfen, um mit einer Pinzette durch leichten Druck auf sich den Schädels Knick oder den nicht bewegenden Bohrer. Wenn der Knochen sich zu wölben beginnt, zu stoppen Bohren und das gesamte Fenster in brain Puffer eintauchen.
HINWEIS: Wenn Blut aus einer Gegend rast, kann es lassen vermuten, dass die Dura beschädigt wurde. Wenn dies der Fall ist, setzen Sie ein semi-Nass-Gel-Schaum über den Bereich und versuchen, das Blut aufzusaugen, während sanft Druck auf das Gel-Schaum mit einem Wattestäbchen Tupfer Anwendung. - Warten für mindestens 5 min vor dem Schädel Entfernen die Knochen zu erweichen und die Möglichkeit der Dura zu reduzieren, um die Knochen haftet, so dass der Schädelentfernungsprozess einfacher.
- Führen Sie den Schädelentfernungsprozess, während der Schädel im Gehirn Puffer eingetaucht ist.
HINWEIS: Wenn ein Teil des Schädels hartnäckig haften bleibt, kann ein # 11 Skalpell verwendet wird sanft den Schädel punkten. Größte Vorsicht walten lassen die Klinge durch den Schädel nicht durchstoßen und in das Gehirn. - Ausgehend von der vorderen Kante, hebel sanft den losen Schädel von der Dura mit einer Pinzette.
HINWEIS: Wenn eine geringe Menge der Blutung während des Schädels Entfernungsprozesses auftritt, entfernen Sie den Puffer mit einer Transferpipette oder einer Spritze und dann mit neuen Puffer ersetzen. - Sobald die Knochen lose sind und „schwimmend“ auf der Dura, fest greift mit einer Pinzette die Knochen und heben Sie die Knochen ausdie Dura. Sicherstellen, dass die Knochen nicht in das Gehirn eindringt.
- Um zu steuern, Blutungen, rollen die Ecke eines Gewebes in einem Punkt und entfernen die meisten der Puffer aus der kranialen gut. Schnell Gelschaum, vorgetränkt in Puffern, auf die blutende Fläche aufzubringen, während sehr leichten Druck mit einer Baumwolltupfer Spitze hinzugefügt wird.
HINWEIS: Die Blutung kommt in der Regel von dem Rand des Knochens oder der Oberfläche der Dura; In beiden Fällen sind normal und Blutungen schnell stoppen, wenn keine größeren Blutgefäße beschädigt werden. Wenn die Blutung fortsetzt, kann Blut in das gesamte Fenster füllen, ein Gerinnsel Blatt über den Abbildungsbereich zu bilden.- Um das Gerinnsel Blatt zu entfernen, Pick up sorgfältig Stücke geronnenes Blut aus dem Bereich Bildgebung, während die intakte Blut gerinnen lassen um die Quelle des geplatzten Blutgefäßes. Achten Sie darauf, nicht das Blutgerinnsel aus der Entlüftungs Quelle zu entfernen, da dies noch mehr Blutverlust verursachen kann. Bewässern die Oberfläche des Hirns mit Hirnpuffer kein Blut abzuwaschen.
- Achten Sie darauf, zu vermeiden, die zu berührenempfindliche Gehirngewebe oder das Hinzufügen von Fremdmaterial an das Gehirn; wiederholen , bis die Blutung zum Stillstand gekommen ist, für etwa 2 bis 5 min (Figur 2E).
HINWEIS: An diesem Punkt die Kraniotomie bereit sind, die Schädel Fenster zur Herstellung von (siehe Schritt 5). Falls erforderlich, Entfernen des Dura vor dem kraniale Fenster Implantieren (siehe Schritt 4).
4. Dura Removal
HINWEIS: Dura Entfernung erfordert äußerste Sorgfalt und kann mehr als 15 Minuten dauern.
- Zeichnen Sie überschüssige Puffer aus der Kraniotomie entfernt. Während eine feuchte Oberfläche gehalten wird, ein kleines Stück mit einer Pinzette dura greifen und sanft die Dura reißen.
- Verwenden einer Pinzette und Schere Feder sanft reißen und die Dura wegschneiden.
- Drop mehr Gehirn-Puffer auf der Hirnoberfläche die Dura zu schweben und helfen, sie aus dem Gehirn zu trennen. Fortfahren, bis alle Dura aus dem Schädel Fenstern Website entfernt wird. Wann wird korrekt das Gehirn durchgeführt erscheint sehr sauber zu sein mit unterschiedlichen blOOD Gefäße und keine Flecken (vergleiche Abbildung 2E mit 2F).
Achtung: Einige Bereiche der Dura sind an kleinen Arteriolen auf der Oberfläche des Gehirns (zB in der Nähe der Mittellinie proximal des parietalen Assoziationsbereich) und Entfernung solcher kann den Arteriolen Bruch. In solchen Fällen kann es besser sein, ein kleines Stück dura über Oberseite des arteriole intakt zu lassen. Die FU kann nicht diesen kleinen Bereich eindringen, aber dies mit schweren Blutungen bevorzugt. - Befestigen Sie die Hirnoberfläche in Agarose so schnell wie möglich Bewegung von Pulsieren zu minimieren und zu verhindern, dass weitere Quellen (siehe Schritt 5).
5. Vorbereitung Cranial Fenster
- Spray das Deckglas mit 70% Ethanol und verwenden einen Luftbehälter vorsichtig trocken. Achten Sie darauf, das Glas ohne Flecken oder Staub vorhanden ist absolut sauber.
- Bereiten 1,3% Agarose durch Erhitzen von 200 mg Agarose-Pulver, gelöst in 15 ml Hirn-Puffer. Stellen Sie den microwave hoch und Wärme für 10 bis 15 s in einer Zeit unter Rühren sanft dazwischen, bis alle Agar gelöst sind.
Hinweis: Sicherstellen, keine Blasen oder Partikel vorhanden sind, da diese mit einer Abbildungs stören. - Platzieren ein Thermometer in der heißen Agarose und kühlt die Agarose nach unten bis kurz über Erstarrungstemperatur (~ 40 ° C).
ANMERKUNG: Die Ausführung kühles Wasser über die Außenseite des Agarose-Behälters kann der Kühlprozess beschleunigen. Rühren Sie leicht kontinuierlich keine Blasen oder Partikel vorhanden sind, zu gewährleisten. - Unmittelbar vor der Agar-Anwendung, die das Gehirn Puffer aus dem Schädel gut entfernen. Zeichnen Sie die Agarose mit einer Transferpipette und bringt die Agarose direkt auf das Gehirn. Schnell den Deckel Schlupf über die Oberfläche und befestigen der Abdecküberzug mit Agarose an den Ecken abfällt.
6. Euthanasie
HINWEIS: Nach unserer Erfahrung dieses Verfahren erfahrene Chirurgen dauert mindestens 3 bis 4 Praxis Operationen zu erreichen mehr als 90%Erfolgsrate. Weniger erfahrene Chirurgen können noch mehr Praxis erfordern. Während der Kraniotomie oder durotomy kann die Hirnschäden, wie zum Beispiel, wenn der Bohrer Schläge durch den Knochen in das Gehirn aufrecht zu erhalten. Einige kleinere Schäden am Rande des Craniotomie zulässig sein. Wenn jedoch das Gehirn „sauber“ mit leuchtend roten unbeschädigten Blutgefäßen und weißer Rinde sieht nicht, kann das Experiment muß beendet werden. Beispiele für schlechte Präparate schließen diejenigen mit toten Blutgefäßen, oder wenn die Rinde mit zerrissenen oder beschädigten Blutgefäßen gekennzeichnet ist. Wenn eines dieser Anzeichen vorhanden sind, wird das Experiment unwahrscheinlich hohe Qualitätsdaten liefern. Ob die Operation / Experiment erfolgreich war oder nicht, artgerecht mit der Maus auf der Beendigung des Experiments einschläfern.
- Tief mit mindestens 3,5% Isofluran betäubt. Dann gibt eine intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital bei 300 mg / kg. Im Idealfall, wenn die Nadel in die Leber eingeführt wird, wird der Tod sehr schnell sein (<1 min).
- Wenn Perfusion erforderlich ist, stellen Sie sicher, dass das Tier tief narkotisierten ist, bevor Sie fortfahren (siehe Schritt 1.3).
- Alternativ kann, wenn die Perfusion nicht erforderlich ist, für mindestens 5 Minuten warten und dann überprüfen, ob die Maus tot ist. Bestätigen Sie die Abwesenheit von Atmung, Herzschlag, sowie einen Mangel an Schmerz Rückzug und Corneareflexe. Auch für hellblaue / weiße Färbung von Extremitäten und Verdunkelung der Blutgefäße über die Kortex beobachten.
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Representative Results
Um die Wechselwirkungen zwischen kortikalen Bereichen innerhalb einer einzigen Hemisphäre zu untersuchen, benutzten wir eine große Kraniotomie, die sich über den Sagittal Sinus und 5 - 6 mm lateral erstreckt. Dieses kraniale Fenster umfasste primäre (motorische, somatosensorische, visuelle, auditive), sekundäre (motorische, visuelle) und Assoziation (retrosplenial, cingulate, parietal association) Cortices der rechten Gehirnhemisphären (Abbildung 3A ). Für diese Arbeit wurde eine spannungsempfindliche Farbstoff (VSD) -Bildgebung verwendet, die Änderungen des Membranpotentials widerspiegelt 3 . Dieses Protokoll wäre auch für andere extrinsische ( z. B. Calcium 17 und Glutamat 18 Imaging) oder intrinsische Imaging Experimente nützlich. Bei der Stimulierung des Hindlimb-, Forcleimb-, Whiskers-, visuellen oder auditiven Systems von leicht anästhesierten Mäusen mit 0,5% Isofluran beobachteten wir Konsensusmuster der kortikalen Depolarisation (> 3B). In Übereinstimmung mit früheren Studien , 5, 19, 20, 21, 22, haben wir festgestellt , dass kurze taktile Stimulation von C2 barrels cortex auf der Aktivierung der primären somatosensorischen Bereiche geführt sowie „Inseln“ von Antworten innerhalb von funktionell verwandten Gebieten. Zum Beispiel kann die primäre Motorkortex (M1) oder sekundäre Darstellung somatosensorischen Kortex (S2; Abbildung 3Bi). Ein einzelner 1 ms Ton pip (25 kHz) führte die Stimulation auf die Aktivierung des primären auditorischen Cortex (A1) ca. 20 ms nach Hörstimulation (Abbildung 3Bii). In den nächsten paar Millisekunden verteilt die Depolarisation über den auditorischen Kortex und zu den benachbarten sekundären somatosensorischen Kortex weitergeleitet. Etwa 25 ms nach dem Ton Beginn, eine sekundäre Rinde Depolarisation würde entstehen, lag 1,07; 0,2 mm medial und 1,9 ± 0,1 mm posterior zum Bregma Relativ (n = 9 Mäuse). Dies ist etwa der Ort des parietalen Assoziationsbereich (PTA). Das VSD-Signal dann an die Mittellinie Bereich ausbreitet, wo andere kortikale Assoziations Gebiete befinden, einschließlich retrosplenialen (RS) und cingulären Cortex (CG). Daher führte Hörstimulation zur Aktivierung von zwei separaten Schwerpunkte, aus denen sich ausbreitenden Wellen von VSD Depolarisation Ausbreitung auf einen größeren Bereich innerhalb Mittellinie cortex. Focal Stimulation des kontralateralen Auges mit einem 1 ms grünen LED - Puls, führte zur Aktivierung der primären visuellen Kortex innerhalb von 40 ms (Figur 3 BV). Diese primäre Aktivierung des visuellen Kortex wurde, gefolgt von: (1) räumlichen Ausdehnung der VSD Depolarisation in benachbarte Bereiche median befanden, lateral und ventral den anfänglichen aktivierten Bereich; (2) Die Depolarisation eines zweiten medialen kortikalen Bereich ungefähr 50 ms nach der Stimulation (n = 8 Versuche) entlang angeordnet sa gittal Naht. Dies war ähnlich zu sensorischen Stimulationen von forelimb (Abbildung 3Biii), hindlimb (Abbildung 3Biv), C2 - Whisker oder abzuhören. Evozierten VSDI Antworten von sensorischer Stimulation der forelimb, hindlimb oder Vorspielen aktiviert zunächst die jeweiligen primären sensorischen Kortex, durch ein anisotropes Ausbreitung der Aktivität gefolgt, sowie Mittellinie Aktivierung der Hirnrinde rund 20 bis 40 ms nach der Stimulation. Dieses Ergebnis war ähnlich Antworten von visueller und Whisker Stimulation. Die Ausbreitung von sensorisch-evozierte Aktivität entlang dieser Mittellinie Routen und häufige Aktivierung gleicher Regionen durch spontane Aktivität 6 könnte darauf hindeuten , dass diese Bereiche die zentrale Nabe des Verbindungskernes der Maus cortex sind, bei der sensorischen Informationen mit spontaner kortikaler Aktivität integrieren können.
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Abbildung 1. Chirurgische Einrichtung und Vorbereitung. (A) Maus - Kopf wird rasiert, gereinigt, etwa 30 ° gedreht zur seitlichen Belichtung und mit dem stumpfen Ende der Ohrstäbe befestigt. Isofluran Narkose wird über ein Mundstück und Zahnhalter geliefert. Die Maus ist mit selbstklebender Frischhaltefolie für erhöhte Sterilität und Wärme behandelt. (B) Nahaufnahme zeigt Haut und Periost von der parietalen Schädelplatte entfernt, der Schläfenmuskel unberührt. (C) Der Schläfenmuskel entfernt, um die zeitliche Platte und Knochen Squamosum Belichten durch Beachtung der oberflächliche Vene beschädigt ist. (D) vor der Fixierung, wird die Kopfplatte in die richtige Lage mit Wachs positioniert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schritt- für -Schritt - chirurgischer Eingriff. (A) Die Kopfplatte wird an den vorderen und hinteren Stellen an den Schädel mit Essig Cyanacrylatkleber befestigt. Man beachte die Lage des Bregma (schwarzes dreieckiger Stück Band). (B) Der kraniale Fenster wird durch Anwenden verdickter Zahnzement zwischen der Kopfplatte und dem Schädel hergestellt. Beachten Sie, dass Bregma und die Squamosum Sehenswürdigkeiten bleiben sichtbar. (C) Nach dem Trocknen des Zements wird brain Puffer hinzugefügt , um den Schädel zu erweichen und der Adhäsion der Dura zu verhindern. Ein gerolltes Gewebe hilft brain Puffer vor dem Bohren entfernt werden. (D) Die Ränder des Kraniotomie haben erzielt worden. Bemerkenswert ist die Vaskulatur leichter durch den ausgedünnten Knochen in der Nähe der Zahnzement Kanten gesehen. (E) parietale und temporale Schädelplatten remov gewesenEd und die Dura sichtbar ist. Hinweis Flecke von Blut auf der Dura aus kleineren Blutungen, was normal ist. Eine sorgfältige Prüfung unter 2 - 4-fache Vergrößerung werden zwei Schichten von Blutgefäßen zeigen, eine in der Dura und der andere in der pia. (F) Die Dura eine unberührte Hirnrinde ist aufschlussreich. Pial Gefäß ist leuchtend rot ohne Flecken vorhanden. Beachten Sie die Streu Stücke von weißer Farbe dura an den Rändern des Schädel Fenster. In diesem Beispiel gab es eine kleinere dural blutet am hinteren Teil des Schädelfensters, das schnell verklumpt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Einzigartiges und Konsensaktivierungsmuster bei mehreren Formen von sensorischer Stimulation. < / strong> (A) Schematische Darstellung der einseitigen die bebilderten kortikalen Regionen zeigen Kraniotomie. (B) Mikroskopische Aufnahme der breiten unilateral Kraniotomie mit Bregma durch einen weißen Kreis in jedem Bild angezeigt. Mustern der kortikalen Aktivierung sind in einer Maus mit Isofluran (0,5%) nach (i) Stimulation (Stim) des kontralateralen C2 Whisker, (ii) Hörstimulation, (iii) kontralateralen forelimb Stimulation, (iv) kontralateralen hindlimb Stimulation anästhesiert gezeigt und (v) visuelle Stimulation des kontralateralen Auges mit einer Leuchtdiode (LED). Es gab Mittellinie Aktivierung nach allen Formen der sensorischen Stimulation (weiße Pfeile) bei 10 bis 25 ms nach der primären sensorischen Kortex Aktivierung. Die Antworten sind der Mittelwert von 20 Versuchen. Die Bild zweite von links in der zweiten Reihe (II) gibt den anterioren (A), hintere (P), mediale (M) und lateralen (L) Richtung. Mit Genehmigung von Mohajerani, et al., 2013.p_upload / 52642 / 52642fig3large.jpg“target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses innovative Protokoll für ein großes Schädelfenster ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung über die zeitlichen und parietalen Bereiche der Hirnrinde. Kombiniert mit der optischen Bildgebung kann es helfen, die neuronale Dynamik innerhalb kortikaler Bereiche während der spontanen und stimulusinduzierten Aktivität aufzudecken. Diese expansive Craniotomie macht auch eine große Ausdehnung des kortikalen Gefäßnetzes aus, einschließlich des proximalen Endes der mittleren zerebralen Arterie (MCA), was eine in vivo Bildgebung des Blutflusses und eine direkte Manipulation von Seitengefäßen für ischämische Modelle ermöglicht. Diese Technik wird für kürzlich entwickelte Linien von Mäusen, die Spannungs- und Kalziumindikatorproteine ausdrücken, von großem Nutzen sein 23 Diese Mäuse bieten den praktischen Vorteil, dass sie die Notwendigkeit der Inkubation von spannungsempfindlichen Farbstoffen auf der Kortikalis umgehen müssen. Diese extrinsischen Farbstoffe nehmen sich Zeit, um das Hirngewebe (~ 60 - 90 min) adäquat zu durchdringen und sind durch ihre milde Toxizität begrenzt. Große Kraniotomien haben auchzuvor verwendet worden , 11 , um die Entwicklung von Rattenhirn mit VSDI zu studieren. Neugeborene Ratten haben einen viel größeren Kopf und sind in der Größe vergleichbar mit erwachsenen Mäusen. Dies bietet den Forschern eine einzigartige Gelegenheit, Entwicklungsprobleme in den Neurowissenschaften zu studieren, wenn auch nicht mit transgenen Mäusen.
Die wichtigsten Grenzen dieser Methode sind die Unfähigkeit, für chronische Experimente. Die Krümmung des Schädels macht den Bohrprozess schwieriger und zeitaufwändiger als kleine Kraniotomien. Für diese großen Kraniotomie, ist es wichtig, den Kopf mit dem zentralen Naht und Squamosum der Sehenswürdigkeiten Position in der Fokussierungsebene der Linse parallel zu sein. Während eine gewisse Verzerrung des Gehirns aus der Krümmung des Gehirns zu erwarten ist, werden diese durch die Konzentration in den oberflächlichen Schichten der Hirnrinde überwinden. Dieses Problem wird weiter durch den Erhalt zahlreiche Wiederholungen von Stimulation und Mitteln gelindert. Zusammengefasst ist unsere große Craniotomie Technik weit Applicable für das Studium der aktuellen Probleme in der Neurobiologie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von einer Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) Discovery-Grant-# 40352, Campus Alberta für Innovation Program Chair, Alberta Alzheimer-Forschungsprogramm zu MHM und NSERC CREATE in BIF Promotionsstipendium und Abchasisches Forschungsinstitut postgraduale Gemeinschaft zu MK unterstützt wurde. Wir danken Pu Min Wang für die Entwicklung dieses Protokolls und für die chirurgische Ausbildung und Behroo Mirza Agha und Di Shao für Haltung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating Pad | FHC | 40-90-2 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2 or more pairs are recommended |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00, 15000-10 | 1 pair should be designated for dura removal |
| Jet tooth shade powder | LANG Dental | Jet Tooth Shade Powder | to be mixed with the Jet Liquid |
| Jet tooth shade liquid | LANG Dental | Jet Tooth Shade Liquid | to be mixed wihth the Jet Powder |
| Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 | Midwest Dental | 385201 | |
| Agarose Powder | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Gelfoam | Sinclair Dental Canada | Pfizer Gelfoam | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Centre Ltd | 124125 | |
| Lidocaine 2% Epinephrine | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125299 | |
| Dexamethazone 5 mg/mL | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125231 | |
| Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) | Western Drug Distribution Centre Ltd | 12612 |
References
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