Summary
Denne protokollen presenterer en metode for å lage en stor ensidig kraniotomi i løpet av de temporale og parietale regioner av muse cerebral cortex. Dette er spesielt nyttig for sanntids avbildning over et omfattende område av en kortikal halvkule.
Abstract
Den kraniotomi er en vanligvis utføres prosedyre for å eksponere hjernen for in vivo eksperimenter. I mus forskning, de fleste laboratorier benytter en liten kraniotomi, typisk 3 mm x 3 mm. Denne protokollen introduserer en fremgangsmåte for å danne et vesentlig større 7 mm x 6 mm kranial vindu utsette det meste av en hjernehalvdel over musetemporale og parietale cortex (f.eks bregma 2,5 til 4,5 mm, lateral 0 - 6 mm). For å utføre denne operasjonen, må hodet vippes omkring 30 °, og mye av den temporale muskel må trekkes tilbake. På grunn av den store mengden av fjerning av ben, er denne fremgangsmåten bare beregnet for akutte eksperimenter med dyr bedøvet under hele kirurgien og eksperiment.
Hovedfordelen med denne nye stor sideveis kraniale vindu er å tilveiebringe samtidig tilgang til både indre og ytre områder av hjernebarken. Denne store ensidig cranial vindu kan brukes til å studere nevrale dynamikken mellom celler,så vel som mellom forskjellige hjernebark ved å kombinere flerelektrodeelektrofysiologiske opptak, avbildning av neuronal aktivitet (f.eks indre eller ytre imaging), og optogenetic stimulering. I tillegg gir denne store kraniotomi eksponerer også et stort område av kortikale blodkar, noe som åpner for direkte manipulering av de laterale kortikale vaskulatur.
Introduction
Kraniotomi er en standard prosedyre som brukes av nevrologer for å avsløre en del av hjernen. Siden starten av elektrofysiologi har craniotomi gitt uovertruffen gjennombrudd innen nevrovitenskap. Tett kartlegging av hjernebarken med elektroder har ført til eksperimenter som testet hypoteser og teorier basert på disse kartene. Vi har nylig inntatt en ny epoke hvor craniotomi brukes til in vivo avbildning av kortikal blodstrøm 1 , 2 , 3 og nevrologisk arkitektur 4 , som muliggjør sanntids visualisering av kortikal aktivitet innenfor de eksponerte områdene 5 , 6 , 7 . Selv om mange studier bruker craniotomier kombinert med in vivo optiske bildeteknikker for å studere strukturen og funksjonen av kortikale nevroner, glia og cortical vaskulatur 8, 9, vil ytterligere undersøkelser begrenset av små områder av eksponert cortex (men se 10).
Hensikten med denne protokollen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for å danne en stor sideveis kraniotomi, utsette den cerebrale cortex fra midtlinjen til den squamosal ben, og som strekker seg utover bregma og lambda. Denne store kraniotomi muliggjør samtidig visning av Association kortekser (retrosplenial, cingulate, og parietale), primær og sekundær motor, somatosensorisk, visuell og auditiv cortex. Denne metode har tidligere blitt koplet til spenningsfølsomt fargestoff imaging (VSDI) for å undersøke hvordan flere hjernebark samvirke med hverandre under den spontane og stimulusfremkalte kortikal aktivitet 5, 11, 12. De største utfordringene ved denne fremgangsmåte omfatter å posisjonere hodetav dyret, festehodeplaten, og å unngå blødning, mens man separerte det temporale muskel fra den parietalbenet. Hensyn må også tas under bore og skalle fjerningsprosesser som skalle kurvene ved en skrå vinkel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll følger University of Lethbridge Animal Care Committee (ACC) retningslinjer, og er gjennomført i samsvar med kravene i den kanadiske Council on Animal Care (CCAC).
1. Fremstilling
- For lengre studieperioder, autoklav alle åpne kirurgiske forsyninger og sørge for at steriliteten opprettholdes gjennom hele operasjonen. Hvis flere operasjoner er nødvendig, autoklav mellom operasjoner.
- Sikre at det er nok av hjerne-buffer på hånden (i det minste 50 ml). Oppløsningen består av 134 mM natriumklorid, 5,4 mM kalium, 1 mM magnesiumklorid-heksahydrat, 1,8 mM kalsiumklorid-dihydrat, og 5 mM HEPES natrium, pH balansert til 7,4 med 5 M hydrogenklorid.
- Den plasseres i en induksjonskammeret og bedøve med i 3 - 4% isofluran. Følg med 1,0 til 2,0% isofluran for vedlikehold under operasjonen. Videre reduseres til så lavt som 0,4 til 0,8% under avbildnings = "ekstern referanse"> 5, 13, 14, 15, forutsatt riktig anestesi blir opprettholdt. Disse lave nivåer av anestesi krever påpasselig og hyppig overvåking av mus (omtrent hver 5 min) for å sikre at det forblir areflexic til smertefulle stimuli.
MERK: Dehydrering kan bli problematisk på grunn av den høye overflate til volumforholdet mellom mus og forverret ved langvarig bruk av isofluran.- Bruke subkutane injeksjoner av saltløsning, 0,1 ml per 10 g kroppsvekt, hver 1 - 2 timer. Når tilstrekkelig hydrert, vil musen urinere gang hver 1-2 time.
- Følge nøye med musen for å sikre konsistente anestesi hele kirurgi og bildebehandling. Ikke la musen uten tilsyn og pass på at det aldri gjenvinner bevissthet.
- Overfør bedøvede mus den spissholderen set-up og sted på en termoregulerende varmepute innstilt på 37 ° C. Sikre de øvre Teett på en tannholder.
- Roter musens hodet mot venstre omkring 30 ° for å eksponere den høyre laterale side av hodet og sikre musens hode med den butte enden av øret stenger (figur 1A).
- Påfør oftalmisk salve for å hindre hornhinnen tørking.
- For å redusere cerebralt ødem, injiserer deksametason (4 mg / kg) intra-muskulært.
- Tørk huden over kirurgiske området med bomullspinner dyppet i 4% klorhexidin (3 ganger) og 70% etanol (3 ganger). Bruk hver bomullsdott bare én gang.
- Don kirurgiske hansker og dekke dyret med selvklebende plastfolie. Tilveiebringe lokalbedøvelse ved injeksjon av lidokain (8 - 10 mg / kg 2% adrenalin) subkutant over kraniotomi området. Vent 3 - 5 min for medikamentet å bli absorbert inn i vevet.
2. Fjerne Hud og trekker tilbake Muscle fra Skull
- Utføre nesten alle disse prosedyrene mens du ser på skallen under enDissekere mikroskop ( f.eks. 0,7 - 4,5 x strøm, avhengig av situasjonen).
- Løft opp huden 1 mm til venstre for midtlinjen (rett bak øret) med tang og la et lite horisontalt snitt med kirurgisk saks.
- Gjør en 5 - 6 mm sideskjæring mot høyre øre, og kutt deretter mot rostralenden av hodet.
- Ved første snittpunkt setter du saksen og kutter 10 mm rostrally.
- Klipp huden rundt høyre øre og nær høyre øye for å avsløre høyre side av skallen og temporal muskel. Sørg for at den bredeste delen av det eksponerte området er minst 7 mm. Trim huden ytterligere hvis det kirurgiske området må forlenges.
- Fest huden rundt snittet ved å sette noen få dråper butylcyanoakrylatlim mellom skallen og huden. Sørg for at vevet tidligere har blitt tørket med bomullstippede applikatorer eller valsede vev for å øke limens effektivitet.
- Gni overflaten med en bomullspinneav hodeskallen i en sirkulær bevegelse for å fjerne periosteum fra skallen. Pass på at ingen forblir ved tørking skallen helt.
- Ved hjelp av fjær sakser og pinsetter, skiller den temporale muskel fra skallen; kutte og trekke tilbake den muskelen sideveis til n squamosal ben (figur 1C). Vær svært forsiktig for ikke å skade den overfladiske temp blodåre som går langs nivået på squamosal bein nær øyet, ellers hemorrhaging kan oppstå.
- Kontroll blødning med gel-skum er forhåndsneddykket i hjerne-buffer. For alvorlig blødning bruke en varme cauterizer. Slipp butyl cyanoakrylatlim på de blødnings etter behandling med varme cauterizer. Sikre at området blir tørket på forhånd ved anvendelse av bomull tippet applikatorer eller rullet vev for å øke effektiviteten av limet.
3. kraniotomi
MERK: Kirurgen må være flittig under fjerning av skallen ogdura for å unngå unødvendige komplikasjoner. Feilsøkingstrinn inngår burde komplikasjoner oppstår.
- Markere plasseringen av bregma enten med en fin spiss markør eller skjære en liten trekantet stykke tape og peker et hjørne ved bregma (figur 2A) for å orientere de underliggende områder av hjernen.
- Før festing av hodeplaten sikre skallen er helt tørr. Hodeskallen vil raskt tørr luft etter påføring av gelen skum dynket i hjernen buffer, hvis mer tørking er nødvendig, benytte bomullstuppen spinner. Dette trinnet er avgjørende for hodeplaten fiksering (figur 1B).
MERK: Hvis det er periosteum venstre på skallen, eller om skallen er ikke tørr før liming på hodet plate, vil det sannsynligvis løsne. Hvis dette skjer, forsiktig fjerne hodet plate og starte på nytt. Blødning kan forekomme i løpet av denne prosessen; Det tar noen minutter for den å koagulere, og deretter forsiktig fjerne. Denne prosessen er ikke anbefalt å bli gjentatt mer enn to ganger. <li> Bruk etyl cyanoakrylatlim rundt den nedre kanten av hodeplaten 16, og lim hodeplate over kraniotomi-området (figur 1D og figur 2A). - Fylle åpningen plass mellom kraniet og hodeplaten med dentalsement slik at bare den kraniotomi område som avdekkes. Vent til dentalsement for å tørke og stivne, typisk 5 - 10 min (figur 2B).
- Når sementen er satt, kort fylle brønnen med hjerne-buffer og bløt i 3 - 5 min. Bruke en rullet vev for å fjerne hjerne buffer før boring (figur 2C).
- Skissere det kirurgiske området ved lett å utføre overflate skallen med en dentalboremaskin. Bruke en pneumatisk drill (innstilt på maksimalt 20 PSI), med et FG ¼ graden, og styrt med en variabel hastighets fotpedal.
- Forsiktig spore boret langs den opprinnelige scoring å utdype den, ensuring bore ikke trenge gjennom skallen inn i hjernen (figur 2D). Bytter noen få minutter mellom boring og dabbing skallen overflaten med fuktet rullet vev. Dette vil redusere oppvarming og tørking av skallen fra mekanisk friksjon og langvarig eksponering.
MERK: Skallen vil raskt lufttørke etter påføring av den våte gel skum. Hvis mer tørking er nødvendig, bruke bomull tips spinner.
Forsiktig: Skallen er ujevn i tykkelse. For eksempel, er den parietale-temporale møne den tykkeste område, mens skull regioner i nærheten av midtlinjen og squamosal landemerker er forholdsvis tynn. - Under boring, med jevne mellomrom se for knekking av skallen med et lett trykk på den med pinsett eller den ikke-bevegelige borkronen. Når benet begynner å spenne, stoppe boring og dyppe det hele vinduet i hjernen buffer.
MERK: Hvis blodet styrter ut av et område, kan det tyde på at dura er skadet. Hvis dette er tilfelle, plasserer en semI-vått gelskum over området og forsøk å suge blodet mens du forsiktig legger trykket på gelskummet med en bomullspinnepinne. - Vent i minst 5 minutter før fjerning av skallen for å myke beinet og for å redusere sjansen for at dura holder seg til beinet, noe som gjør kranens fjerning enklere.
- Utfør skallefjerningsprosessen mens skallen er nedsenket i hjernebufferen.
MERK: Hvis en del av skallen forblir fastfestet, kan en # 11 skalpellblad brukes til å forsiktig skille skallen. Vær forsiktig så du ikke punkterer bladet gjennom skallen og inn i hjernen. - Begynn fra den fremre kanten, forsiktig løs den løse skallen fra duraen med tang.
MERK: Hvis det oppstår en liten blødning i løpet av fjerning av skallen, fjern bufferen med en overføringspipette eller sprøyte, og erstatt deretter med ny buffer. - Når beinet er løs og "flytende" på duraen, hold grepet på benet med tau og løft benet fradura. Sørg beinet aldri trenger inn i hjernen.
- For å kontrollere blødning, ruller hjørne av et vev til et punkt, og fjerne det meste av bufferen fra den kraniale brønn. Raskt bruke gel skum, pre-dynket i buffer, for å blødnings området, og tilfører meget lett trykk med en bomullsdott spiss.
MERK: blødning kommer vanligvis fra kanten av beinet eller overflaten av dura; begge tilfeller er normalt og blødning vil raskt stoppe hvis ingen store blodårer er skadet. Hvis blødningen fortsetter, vil blodet kunne fylle hele vinduet danner en blodpropp ark over det bildedannende område.- For å fjerne blodproppen ark, forsiktig plukke opp stykker av levret blod fra bildeområdet og samtidig la blodet koagulere intakt rundt kilden til den knuste blodkaret. Vær nøye med å ikke fjerne blodpropp fra lufte kilde da dette kan føre til enda mer blodtap. Vanne overflaten av hjernen med hjerne-buffer for å vaske vekk eventuelle blod.
- Pass på å unngå å berøredelikat hjernevev eller tilsetning av fremmedmateriale i hjernen; gjentas inntil blødningen er stoppet, for ca 2 - 5 min (figur 2E).
MERK: På dette punktet, er det kraniotomi klar for å forberede den kraniale vinduet (se trinn 5). Hvis nødvendig, fjern dura før implantere den kraniale vinduet (se trinn 4).
4. Dura Fjerning
MERK: Dura fjerning krever ekstrem forsiktighet og kan ta over 15 minutter.
- Fører bort overflødig buffer fra kraniotomi. Samtidig opprettholde en fuktig overflate, ta en liten del av dura med pinsett og forsiktig rive dura.
- Bruk pinsett og våren saks til å forsiktig rive og klippe bort dura.
- Falle mer hjerne buffer på hjernens overflate til å flyte dura og hjelpe den atskilt fra hjernen. Fortsett til alle dura er fjernet fra kraniale vinduet nettstedet. Når utført riktig hjernen vil synes å være veldig rent med tydelig blOOD fartøy og ingen blemmer (sammenligne figur 2E med 2F).
Forsiktig: Noen områder av dura er festet til små arterioler på overflaten av hjernen (f.eks nær midtlinjen proksimalt til parietal forening området), og fjernelse av slike kan sprenge arterioler. I slike tilfeller kan det være bedre å la en liten bit av dura intakt over toppen av arteriole. VSD kan ikke trenge inn i det lille området, men det er foretrukket å ha større blødninger. - Fiks hjernens overflate i agarose så snart som mulig for å minimalisere bevegelse fra pulsering og for å hindre videre svelling (se trinn 5).
5. Klar Kraniell Window
- Spray dekkglass med 70% etanol og bruke en luft beholderen for å forsiktig tørke. Sikre at glasset er fullstendig ren uten flekker eller støv til stede.
- Fremstill 1,3% agarose ved oppvarming av 200 mg agarose pulver oppløst i 15 ml hjerne-buffer. Sett microwave til høy og varme i 10 - 15 s ved et tidspunkt, forsiktig omrøring i mellom, inntil alt agar er oppløst.
Merk: Sikre at ingen bobler eller partikler som er tilstede, da disse vil interferere med avbildning. - Plasser et termometer i varm agarose og kjøle agarose ned til like over størkningstemperaturen (~ 40 ° C).
MERK: Rennende kaldt vann over utsiden av agarose beholderen kan fremskynde kjøleprosessen. Rør forsiktig kontinuerlig for å sikre at ingen bobler eller andre partikler er til stede. - Umiddelbart før påføring av agar, fjernes hjernen buffer fra den kraniale brønn. Trekk opp agarose med en overføring pipette og slippe agarose direkte på hjernen. Raskt sted dekkglasset over overflaten og feste dekkglasset med agarose dråper på hjørnene.
6. Eutanasi
MERK: I vår erfaring, tar denne prosedyren erfarne kirurger minst 3-4 praksis operasjoner for å oppnå mer enn 90%suksess rate. Mindre erfarne kirurger kan kreve enda mer praksis. Under kraniotomi eller durotomi kan hjernen opprettholde skade, for eksempel hvis boret slår gjennom benet inn i hjernen. Noen mindre skader på kanten av craniotomi kan være tillatt. Men hvis hjernen ikke ser "ren" ut med lyse røde ubeskadigede blodårer og hvite cortex, må eksperimentet bli avsluttet. Eksempler på dårlige preparater inkluderer de med døde blodkar, eller når cortex er merket med revet eller skadet blodårer. Hvis noen av disse tegnene er til stede, vil eksperimentet usannsynlig gi data av høy kvalitet. Hvorvidt operasjonen / eksperimentet var vellykket eller ikke, humaniserer menneskelig musen ved ferdigstillelse av forsøket.
- Dyp anesthetize med minst 3,5% isofluran. Deretter gir en intraperitoneal injeksjon av natriumpentobarbital ved 300 mg / kg. Ideelt sett dersom nålen settes inn i leveren, vil døden være veldig rask (<1 min).
- Hvis perfusjon kreves, kontroller at dyret er døvt bedøvet før du fortsetter (se trinn 1.3).
- Alternativt, hvis perfusjon ikke er nødvendig, vent i minst 5 minutter og bekreft deretter at musen er død. Bekreft fravær av respirasjon, hjerteslag, samt mangel på smerteuttak og hornhindereflekser. Vær også oppmerksom på lyseblå / hvit fargestoffer av ekstremiteter og mørkere blodårer over cortexen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å studere interaksjonene mellom hjernebark i et enkelt halvkule, ble det benyttet en stor kraniotomi som strekker seg på tvers av sagittal sinus og 5. - 6. mm lateralt. Dette kranial vindu inkludert primær (motor, somatosensorisk, visuell, auditiv), sekundær (motor, visuelle), og forening (retrosplenial, cingulate, parietal forening) cortexer fra høyre hjernehalvdelene (figur 3A). For dette arbeidet vi brukte spenningsfølsomt fargestoff (VSD) avbildning, noe som reflekterer forandringer i membranpotensialet 3. Denne protokollen vil også være nyttig for andre ekstrinsik (f.eks, kalsium 17 og glutamat 18 imaging) eller iboende bildebehandling eksperimenter. Når stimulerende bakbenområdet, forbena, whiskers, visuell eller auditiv system for lett bedøvet mus ved bruk 0,5% isofluran, observerte vi konsensus mønstre av kortikale depolarisering (> Figur 3B). I samsvar med tidligere undersøkelser 5, 19, 20, 21, 22, har vi funnet at korte taktil stimulering av C2 fat cortex førte til aktivering av primære somatosensoriske områder, så vel som "øyer" av svar innenfor funksjonelt beslektede områder. For eksempel kan den primære motor cortex (M1) eller sekundær representasjon av somatosensorisk cortex (S2, figur 3BI). En enkelt 1 ms tone pip (25 kHz) stimulering førte til aktivering av primær auditiv cortex (A1) omtrent 20 ms etter auditiv stimulering (figur 3Bii). I løpet av de neste par millisekunder, den depolarisering spredt over det auditive cortex og gått over til nabo sekundære somatosensoriske cortex. Ca. 25 ms etter starten tone, vil en sekundær cortical depolarisering dukke opp, plassert 1,07; 0,2 mm mediale og 1,9 ± 0,1 mm posteriort i forhold til bregma (n = 9 mus). Dette er omtrent på plasseringen av parietal foreningen området (PTA). VSD signal forplanter seg så til midtlinjen område hvor andre kortikale foreningsområdene ligger herunder retrosplenial (RS) og cingulate cortex (CG). Derfor, auditiv stimulering førte til aktivering av to separate fokale områder, fra hvilke vandrebølger av VSD depolarisering spredt til et større område i løpet av midtlinjen cortex. Fokal stimulering av den kontralaterale øyet med en 1 ms grønn LED-puls, førte til aktivering av den primære visuelle cortex i løpet av 40 ms (figur 3Bv). Denne primære aktivering av den visuelle cortex ble etterfulgt av: (1) romlig utvidelse av VSD depolarisering inn i tilgrensende områder som ligger medialt, lateralt, og anteriort for det opprinnelige aktiverte området; (2) depolarisering av en andre midtre kortikal regionen ca 50 ms etter stimulering (n = 8 eksperimenter) lokalisert langs sa Gittal sutur. Dette lignet sensoriske stimuleringer av forelimb ( Figur 3Biii ), hindlimb ( Figur 3Biv ), C2 whisker eller audition. Fremkallte VSDI-responser fra sensorisk stimulering av forelimb, hindlimb eller audition initierte i utgangspunktet de respektive primære sensoriske kortikene, etterfulgt av en anisotropisk aktivitetsspredning, samt midlineaktivering av cortex rundt 20 - 40 ms etter stimulering. Dette resultatet lignet responsene fra visuell og vispstimulering. Utbredelsen av sensorisk fremkalt aktivitet langs disse midlineruter og hyppig aktivering av samme regioner ved spontan aktivitet 6 kan tyde på at disse områdene er det sentrale navet i forbindelseskjernen til musekortexen, hvor sensorisk informasjon kan integreres med spontan kortikal aktivitet.
2fig1.jpg"/>
Figur 1. Kirurgisk oppsett og fremstilling. (A) Mus hode er barbert, renset, rotert omtrent 30 ° for sideveis eksponering, og sikret med den butte enden av øret barer. Isofluran bedøvelse er levert via en nesestykke og tennene holder. Musen er dekket med selvklebende plastfolie for økt sterilitet og varme. (B) nærbilde viser hud og periosteum fjernet fra den parietale skallen plate, er den temporale muskelen urørt. (C) Den temporale muskelen blir fjernet utsette den temporale platen og squamosal ben, merk overfladisk vene er uskadet. (D) før fiksering, blir den hodeplate plassert i det riktige sted med voks. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Trinn-for-trinn kirurgisk prosedyre. (A) Hodeplaten er festet til skallen med etylcyanoakrylatlim på fremre og bakre steder. Legg merke til plasseringen av bregma (svart stykke trekantet tape). (B) Kranialvinduet er fremstilt ved å påføre fortykket tannssement mellom hodeplaten og skallen. Merk at bregma og squamosal landemerker forblir synlige. (C) Etter tørking av sement blir hjernebuffer tilsatt for å myke skallen og for å forhindre adhesjon av dura. Et valset vev vil bidra til å fjerne hjernebufferen før boring. (D) Kanter av kraniotomi er blitt scoret. Legg merke til at vaskulaturen er lettere å se gjennom den tynne bein nær tannkantsandene. (E) Parietal- og temporalskalleplaten er fjerneted og dura er synlig. Merk kviser av blod på dura fra mindre blødning, noe som er normalt. Nøye undersøkelse under 2 - 4X forstørrelse vil avsløre to lag med blodårer, en i dura og den andre i pia. (F) Dura fjernes avsløre en uberørt cortex. Pial blodkar er knallrød uten blemmer stede. Merk Stray biter av hvit farget dura på kantene av kraniale vinduet. I dette eksempel, var det en mindre dural blø ved den bakre del av den kraniale vinduet, noe som raskt levret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Unike og Konsensus Activation Patterns under flere former for sansestimulering. < / strong> (A) Skjematisk fremstilling av den ensidige kraniotomi viser den avbildede kortikale regioner. (B) mikrofotografi av et stort ensidig kraniotomi med bregma angitt med en hvit sirkel i hvert bilde. Mønstre av kortikal aktivering er vist i en mus bedøvet med isofluran (0,5%) etter (i) stimulering (stim) av den kontralaterale C2 whisker, (ii) auditiv stimulering, (iii) kontralaterale forbena stimulering, (iv) kontralateral med bakbena stimulering og (v) visuell stimulering av den kontralaterale øyet med en lysemitterende diode (LED). Det ble midtlinjen aktivering etter at alle former av sensoriske stimuli (hvite piler) i 10 - 25 ms etter primær sensorisk cortex aktivering. Svarene er middel av 20 forsøk. Bildet andre fra venstre i den andre raden (ii) indikerer den fremre (A), bakre (P), medial (M) og sideveis (L) retning. Modifisert med tillatelse fra Mohajerani, et al., 2013.p_upload / 52642 / 52642fig3large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne innovative protokollen for et stort kranialvindu muliggjør simultan avbildning over de tidlige og parietale områdene i hjernebarken. Kombinert med optisk avbildning, kan det bidra til å avdekke nevral dynamikk innen kortikale områder under spontan og stimulus-indusert aktivitet. Denne ekspansive kraniotomi viser også en stor forlengelse av det kortikale vasculaturnettverket, inkludert den proximale enden av den midtre cerebrale arterien (MCA), som muliggjør in vivo avbildning av blodstrøm og direkte manipulering av laterale fartøy for iskemiske modeller. Denne teknikken vil være til stor nytte for nylig utviklede linjer av musekspresserende og kalsiumindikatorproteiner 23 . Disse musene gir den praktiske fordelen ved å omgå behovet for inkubering av spenningsfølsomme farger på cortexen. Disse ekstrinsiske fargestoffene tar tid til å trenge gjennom hjernevævet tilstrekkelig (~ 60 - 90 min) og er begrenset av deres milde toksisitet. Store craniotomier har ogsåtidligere blitt benyttet for å studere utviklingen av rottehjerne med VSDI 11. Nyfødte rotter har en mye større hode og kan sammenlignes i størrelse med voksne mus. Dette gir forskere en unik mulighet til å studere utviklingsproblemer i nevrovitenskap, om enn ikke med transgene mus.
De viktigste begrensningene ved denne metode er den manglende evne for kroniske eksperimenter. Krumningen av hodeskallen gjør boreprosessen mer krevende og tidkrevende enn mindre craniotomies. For denne store kraniotomi, er det viktig å posisjonere hodet med de sentrale sutur og squamosal landemerker å være parallell med fokus planet av objektivet. Mens noen forvrengning av hjernen er forventet fra krumningen av hjernen, blir disse overvunnet ved å fokusere på de øvrige lag av hjernebarken. Dette problemet blir ytterligere lettes ved oppnåelse av tallrike gjentakelser av stimulering og midling. Oppsummert er vår store craniotomy teknikk allment applicable for studiet av dagens problemer i nevrobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant # 40352, Campus Alberta for innovasjonsprogram Chair, Alberta Alzheimer Research Program til MHM, og NSERC CREATE i BIF doc og AIHS hovedfags fellesskap til MK. Vi takker Pu Min Wang for utviklingen av denne protokollen og for kirurgisk trening, og Behroo Mirza Agha og Di Shao for oppdrett.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating Pad | FHC | 40-90-2 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2 or more pairs are recommended |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00, 15000-10 | 1 pair should be designated for dura removal |
| Jet tooth shade powder | LANG Dental | Jet Tooth Shade Powder | to be mixed with the Jet Liquid |
| Jet tooth shade liquid | LANG Dental | Jet Tooth Shade Liquid | to be mixed wihth the Jet Powder |
| Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 | Midwest Dental | 385201 | |
| Agarose Powder | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Gelfoam | Sinclair Dental Canada | Pfizer Gelfoam | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Centre Ltd | 124125 | |
| Lidocaine 2% Epinephrine | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125299 | |
| Dexamethazone 5 mg/mL | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125231 | |
| Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) | Western Drug Distribution Centre Ltd | 12612 |
References
- Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).
- Mohajerani, M. H., et al. Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections. Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).
- Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice. J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).
- Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio. J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat. J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).
- Sweetnam, D., et al. Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke. J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).
- Yin, Y. Q., et al. In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia. Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).
- Sharp, P. S., et al. Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime. Scientific Reports. 5, 12621 (2015).
- Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Vanni, M. P., Murphy, T. H. Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex. J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs. Nat Commun. 6, 7738 (2015).
- Lim, D. H., et al. In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas. Front Neural Circuits. 6, (2012).
- Ferezou, I., et al. Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice. Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).
- Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
