Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

بسيط Multiwell تصلب الفحص لدراسة الردود خلية تصلب التي تعتمد على أساس بولي أكريلاميد

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52643
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

Introduction

معظم الأنسجة في الجسم هي المواد اللزجة لينة مع معامل يونج (أ) تتراوح من 0.1 كيلو باسكال لالدماغ إلى 100 ​​كيلو باسكال لالغضاريف لينة، وبعد، ويجري أكثر في أبحاث الخلايا المختبر على البوليسترين زراعة الأنسجة (TCP) التي لديها معامل ~ 1 جيغا 1 عدم التطابق هذا صلابة يؤثر بشكل كبير على طريقة الخلايا تستجيب لبيئتها. وهناك مجموعة متزايدة من البحوث بالتالي مخصص لتوضيح تأثير الركيزة صلابة على مصير مختلف أنواع الخلايا، بما في ذلك 2،3 الخلايا الجذعية. 4 ونتيجة لذلك، تم وضع الهلاميات المائية متعددة للمساعدة في فهم خلية تعتمد على صلابة علم الأحياء بما في ذلك بولي أكريلاميد (PA) و5-7 البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، 8،9 ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS)، و 10 والجينات. 11 في حين أن الأدلة التي الركيزة صلابة لديها تأثير كبير على مصير الخلايا ينمو، ويتم إجراء معظم الدراسات على نطاق ضيق مع عدد صغير من الصورةamples. منهجية، ودراسات متعددة الأبعاد على تأثير الركيزة صلابة لمجموعة من أنواع الخلايا أو الظروف البيئية نادرة. 12

وقد تم تطوير العديد من التقنيات هيدروجيل عالية الإنتاجية الواعدة، بما في ذلك ميكروأرس تستند PEG، 13 ميكروفلويديك الأجهزة لإنتاج ميكروبيدات الاغاروز هيدروجيل، 14 أو الجزئي والنانو قضبان حيث التضمين صلابة من قبل قطر والارتفاع من microrods. 15 ولكن وتكنولوجيات إعداد مثل هذه ركائز هي متطورة والمتاحة لعدد محدود من المختبرات. الكثير من البحوث التي تنطوي على صلابة التضمين استجابات الخلايا يستخدم بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية التي ليست فقط غير مكلفة وبسيطة لتنفيذ، ولكن أيضا يحمل مجموعة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من معامل يونج، وهي 0.3 - 300 كيلو باسكال 16-22 ومع ذلك، الأساليب القائمة لافتعال PA المواد الهلامية للثقافة الخلية هي كثيفة العمالة وبالتالي الإعداديةعرب كورب في دفعات صغيرة. بعض الصعوبات المرتبطة إعداد المواد الهلامية السلطة الفلسطينية بمثابة ركائز الخلايا الجذعية من شرط أن المواد الهلامية يجب أن يكون مستعدا: 1) في غياب الأكسجين للسماح البلمرة كاملة، 2) مع سطح مستو وناعم للسماح خلية موحدة المرفقات ونشر، و3) الملصقة بشكل دائم إلى أسفل الطبق الثقافة الخلية لمنع العائمة.

وقد حاولت عدة مجموعات لإنتاج المواد الهلامية السلطة الفلسطينية لزراعة الخلايا على دفعات كبيرة. زملر وآخرون أوراق سميكة مستعدة من المواد الهلامية السلطة الفلسطينية التي كانت ثم "قطع" مع لكمة ثقب وضعها في لوحات 96-جيدا. 23 ومع ذلك، هذا الأسلوب يقتصر على المواد الهلامية أشد، أي> 1 كيلو باسكال في معامل يونج، ليونة المواد الهلامية هي "لزجة"، من الصعب قطع، وتلف بسهولة. MIH وآخرون بتطوير تقنية أكثر تطورا والذي يسمح المواد الهلامية ليتم بلمرة مباشرة في لوحة من الزجاج السفلي multiwell. و6 على الرغم من واعدة جدا، والآثار تفوق طفيف لا يزال لوحظ مع هذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه التقنية مجموعة مصمم خصيصا لا يمكن الوصول إليها على الفور إلى العديد من المختبرات وكذلك من الزجاج السفلي مكلفة لوحات multiwell.

وتصف هذه الورقة طريقة بسيطة وغير مكلفة لتجميع المواد الهلامية للسلطة الفلسطينية في لوحة multiwell التي يمكن اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر. هنا، ويستخدم على الدعم من البلاستيك المرن الذي له وجهان - واحد مسعور، وهو طارد للالهلام السلطة الفلسطينية، واحد ماء، الذي يربط تساهميا هلام السلطة الفلسطينية على الترسيب. مرة واحدة يتم إيداع أوراق هلام السلطة الفلسطينية وبشكل دائم الملصقة على الدعم من البلاستيك المرن، فإنه يمكن التعامل مع المواد الهلامية من أي سمك أو تصلب وقطع لهم في أي شكل المطلوب. هذا approach تنتج ليس فقط مخصصة "coverslips" بلاستيكية بأحجام لا خلاف المتاحة تجاريا، ولكن أيضا يغني عن ضرورة إلى ما قبل علاج الواجهات الزجاجية، إما coverslips الزجاج أو الآبار من الزجاج السفلي مكلفة لوحات multiwell، مع حل السلطة الفلسطينية ملزم، وهو ومملة وخطوة تستغرق وقتا طويلا. وأخيرا، وصحائف والمواد الهلامية PA موحدة يمكن أن تكون على استعداد في دفعات كبيرة وتخزينها دي رطب لعدة أشهر.

وباختصار، فإن فحص المقدمة هنا هو تحسنا الطرق القائمة في عدة جوانب. أولا، عملية لوحة التجمع multiwell هي كفاءة، والتكلفة الإجمالية للمواد المطلوبة منخفضة. ثانيا، يتم إنتاج الهلاميات المائية في دفعات كبيرة في فيلم هلام متجانس واحد. وأخيرا، يطلب من المواد فقط التي هي متاحة تجاريا. وتتجلى فائدة الفحص من خلال استكشاف تأثير الركيزة صلابة على مورفولوجيا الخلايا ونشر المنطقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحلول ومأخوذة هيدروجيل المصاحب

  1. إعداد الحل بولي أكريلاميد هلام السلائف.
    1. إعداد بولي أكريلاميد حل هلام السلائف عن طريق خلط مادة الأكريلاميد (A) (40٪ ث / ت، M ص 71.08 جم / مول)، وbisacrylamide crosslinker (B) (2٪ ث / ت، ص M 154.17 جم / مول)، واجتثاث الماء المؤين في نسب حجم المحددة في الجدول 1.
      ملاحظة: هذه الحلول يمكن إعداد في دفعات كبيرة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.
      1. تنبيه: الأكريلاميد سامة عند استنشاق أو ابتلاع، ولا سيما عندما تكون في شكل مسحوق: وهكذا، ويفضل استخدام 40٪ ث / ت حل للحد من مخاطر سمية. التعامل فقط في حين يرتدي ملابس واقية، مثل القفازات، ونظارات واقية، ومعطف المختبر. متجر في، حاوية مغلقة بإحكام مقاومة للضوء في الثلاجة (<23 ° C، منطقة جيدة التهوية).
      2. تنبيه: مكرر الأكريلاميد السامة على استنشاق أو ابتلاع، بشكل خاص،عندما تكون في شكل مسحوق: وهكذا، ويفضل استخدام 2٪ ث / ت حل للحد من مخاطر سمية. التعامل فقط في حين يرتدي ملابس واقية، مثل القفازات، ونظارات واقية، ومعطف المختبر. متجر في، حاوية مغلقة بإحكام مقاومة للضوء في الثلاجة (<4 ° C، منطقة جيدة التهوية).
  2. إعداد واستخدام N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (سلفو-SANPAH، M ص 492.40 جم / مول) مأخوذة. تنبيه: سلفو-SANPAH يسبب تهيج العين الشديد؛ التعامل مع قفازات والعين السليمة أو حماية الوجه. تخزينها في -20 ° C عند استلام وقبل aliquoting.
    1. لتخزين سلفو-SANPAH: حل سلفو-SANPAH في dimethylsulfoxane (DMSO) في 50 ملغ / مل. قسامة الحل الأسهم إلى 50 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 20 ميكرولتر في الأنبوب. تجميد فلاش على الثلج الجاف أو في النيتروجين السائل (خطوة اختيارية لكنه فضل الحفاظ على أقصى قدر من الكفاءة crosslinker) وتخزينها في -80 ° C.
      ملاحظة: مأخوذة كاليفورنيان خزنها لعدة أشهر.
    2. لاستخدام سلفو-SANPAH: ذوبان الجليد في قسامة لفترة وجيزة وتمييع في 480 ميكرولتر من دي المتأينة المياه. استخدامها على الفور. سلفو-SANPAH hydrolyzes بسرعة في الماء: ولذا أخذ الحيطة والحذر على أداء جميع الخطوات المذكورة أعلاه بسرعة.
  3. إعداد فوق كبريتات الأمونيوم (M ص 228.18 جم / مول) مأخوذة.
    ملاحظة: فوق كبريتات الأمونيوم تسبب العين والجلد وتهيج في الجهاز التنفسي. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع. التعامل مع مسحوق فوق كبريتات الأمونيوم في غطاء الدخان الكيميائية. مسحوق تخزينها في مكان جاف وجيد التهوية. مرة واحدة aliquoted، يمكن استخدام محلول مخفف على مقاعد البدلاء العمل.
    1. حل بيرسلفات الأمونيوم في الماء منزوع الأيونات لتحقيق النهائي تركيز فوق كبريتات الأمونيوم 10٪ ث / ت. قسامة وتخزينها في -20 ° C. ذوبان الجليد مباشرة قبل الاستعمال.
  4. إعداد الكولاجين النوع الأول حل.
    1. إعداد 0.2 ملغ / مل حل الكولاجين عن طريق تمييع السهم حتىlution في الفوسفات 1X مخزنة المالحة (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.4. تخزين على الجليد لفترة وجيزة أو استخدام فور التخفيف.

2. هيدروجيل إعداد (راجع الشكل 1)

  1. إعداد الشرائح الزجاجية مسعور.
    1. ضع بضع قطرات من محلول مسعور على طبق من الزجاج واستخدام المناديل الورقية لنشر عبر السطح. السماح الهواء الجاف ويمسح بقطعة المناديل الورقية مرة أخرى على استقامة طلاء مسعور.
      ملاحظة: مخزن حل مسعور في خزانة قابلة للاشتعال في RT. ارتداء معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع. العمل في منطقة جيدة التهوية.
  2. إعداد دعم بلاستيكية مرنة.
    1. خفض الدعم بلاستيكية مرنة لتتناسب مع حجم لوحة من الزجاج مسعور المغلفة.
    2. بمناسبة الجانب مسعور من الدعم من البلاستيك المرن من الخدش طفيفة السطح مع أداة حادة مثل مشرط.
      ملاحظة: مرة واحدة في هلام - التي تكون شفافة تماما - يجف، فإن علامات خدش تساعد التمييز الذي يحتوي على مرونة الجانب دعم البلاستيك هلام.
      ملاحظة: الدعم من البلاستيك المرن لديه مسعور والجانب ماء. مرة واحدة المودعة، بولي أكريلاميد تلتزم بشكل دائم إلى الجانب ماء من الدعم من البلاستيك مما يسهل سهولة التعامل هيدروجيل لاحق.
  3. تحضير هلام (يتم إعطاء كميات سبيل المثال لمدة 5 مل حلول هلام السلائف).
    ملاحظة: سوف 5 مل تكون كافية لإنتاج المواد الهلامية ~ 40 عندما هلام سمك الأولي هو 0.5 ملم. يمكن أن تنتج عن المواد الهلامية إذا تم تخفيض سمك هلام.
    1. وضع 4972.5 ميكرولتر من حل السلائف بولكرلميد من المطلوب التركيز النهائي (الجدول 1) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. وضع في غرفة التفريغ لمدة 30 دقيقة مع غطاء فتحه.
      ملاحظة: أعمال الأكسجين كما فخ الجذور الحرة وعندما تكون موجودة، فإنه يمنع البلمرة.
    2. إضافة 25 ميكرولتر من 10٪ ث / ت فوق كبريتات الأمونيوم (يرجى الرجوع إلى نقطة 1.3) لتحقيق نهائيالأمونيوم تركيز بيرسلفات من 0.05٪.
    3. إضافة 2.5 ميكرولتر من N، N، N '، tetramethylethylenediamine N'- (TEMED، M ص 116.24 جم / مول) في حل هلام نزع الغاز لتحقيق تركيز TEMED النهائي من 0.5٪.
      ملاحظة: مخزن TEMED في خزانة قابلة للاشتعال في RT. التعامل في غطاء الدخان الكيميائية عند ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. تبقي مغلقة بإحكام تحت غاز خامل، كما هو درجة عالية من الهواء والرطوبة الحساسة.
    4. مزيج الحل بلطف بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات. لا دوامة لتجنب انتشار الأوكسجين في حل هلام السلائف.
    5. ماصة الحل الهلام على الجانب ماء من الدعم من البلاستيك المرن وساندويتش مع مسعور المغلفة شريحة زجاجية. فصل الشرائح مع اثنين من الفواصل السيليكون من سمك المطلوب (على سبيل المثال، 0.5 ملم). ترك كمية صغيرة (~ 100 ميكرولتر) من الحل البوليمر السلائف في 50 مل أنبوب مخروطي لاستخدام كمؤشر على دبق.
      ملاحظة:ويمكن استخدام أي فاصل. على سبيل المثال، وهو شريط واحد من بارافيلم يعطي سماكة هلام تورم النهائي من 100-120 ميكرون.
    6. وضع لوحة زجاجية أخرى فوق مرونة البلاستيك دعم / هلام شطيرة للتأكد من سطح حتى هيدروجيل على البلمرة.
    7. السماح للهلام تتبلمر لمدة 45 دقيقة، على الرغم من أن أقل وقت يمكن أن تستخدم في المواد الهلامية من أعلى٪ بالوزن اذا شئت. للتأكد من أن الجل وبلمرة، ومراقبة الحل المتبقية في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إذا كان قد تبلور الحل المتبقية، فمن المرجح أن دبق على لوحة من الزجاج وقد بدأت كذلك. ومع ذلك، لاحظ أن افتتاح سابق لأوانه من العفن سيمنع البلمرة كاملة.
    8. مرة واحدة يتم تشكيل هلام، تقشر دعم البلاستيك المرن مع هلام بولي أكريلاميد المرفقة تساهميا على القمة، ووضع جل جنبا إلى الهواء الجاف.
      ملاحظة: يمكن أيضا الحراري أو التجفيف بالحرارة استخدامها لتسريع هذه الخطوة. جفت مرة واحدة على الدعم من البلاستيك المرن، يمكن أن يكون جل متجرد إلى أجل غير مسمى.
      1. بمناسبة أي بقع عارية من الدعم بلاستيكية مرنة، حيث المواد الهلامية بولي أكريلاميد لم تشكل بسبب الفقاعات. علامة في حين أن جل ما زال رطب حيث سيؤدي ذلك إلى مزيج بدعم البلاستيك المرن مرة واحدة هلام جاف.

3. Multiwell الجمعية اللوحة، طلاء الكولاجين، والتعقيم

  1. التجمع لوحة Multiwell.
    1. جفت مرة واحدة، وقطع المواد الهلامية السلطة الفلسطينية إلى الأشكال المطلوبة.
      1. لوحة 96-جيدا، واستخدام الثقيلة لكمة ثقب بقطر ~ 6 ملم. استخدام ورقة القاطع الثقيلة لخفض المواد الهلامية إلى أشكال مربعة أو مستطيلة. بدلا من ذلك، استخدم المقص.
    2. إعداد ما يقرب من 500 ميكرولتر من PDMS في لوحة 96-جيدا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لالغراء المواد الهلامية إلى الجزء السفلي من لوحة multiwell، ضع قطرات صغيرة (~ 5 ميكرولتر) من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) في وسط كل بئر. باستخدام ملقط، ضع polyacrylamid واحدهلام الإلكترونية في كل البلاستيك جيدا ومرنة دعم الجانب السلبي. للسماح PDMS لعلاج، وترك لوحة تجميعها عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
  2. الكولاجين طلاء المواد الهلامية بولي أكريلاميد.
    1. مع ماصة نقل، ضع كمية صغيرة (7-8 ميكرولتر) من سلفو-SANPAH (يرجى الرجوع إلى نقطة 1.2.2) في كل بئر ودوامة من جانب إلى آخر لمعطف سطح هلام بالتساوي. العمل على وجه السرعة منذ سلفو-SANPAH ليست مستقرة في الماء.
    2. وضع لوحة بشكل جيد في ظل كثافة عالية مصباح الأشعة فوق البنفسجية (كثافة = 37 ميغاواط، λ = 302-365 نانومتر) لمدة 5 دقائق. شطف المواد الهلامية مع برنامج تلفزيوني لإزالة الزائد سلفو-SANPAH.
    3. ماصة 50 ميكرولتر من 0.2 ملغ / مل الكولاجين النوع الأول حل (يرجى الرجوع إلى نقطة 1.4) في كل بئر. ترك لوحة تغطيتها على RT لمدة 2 ساعة على الأقل أو O / N عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لتسريع عملية الكولاجين الطلاء، وماصة نقل يمكن استخدامها لإضافة محلول الكولاجين. عادة، 1 - 2 ينبغي قطرات من محلول تكون كافية لإكماللاي تغطية سطح هلام.
    4. ترك لوحة جيدا في RT لمدة 2 ساعة على الأقل للسماح الكولاجين الترابط.
    5. شطف مع برنامج تلفزيوني لإزالة حل الكولاجين الزائد وتعقيم تحت الأشعة فوق البنفسجية (λ = 200 نانومتر) في الثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة لمدة 2 ساعة.
    6. نقع المواد الهلامية في المتوسط ​​كاملة (راجع القسم 4.1 لتكوين المتوسط) O / N لترطيب وتتوازن. استخدام للخلية البذر مباشرة أو تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى 2 أيام.

4. البذر الخلية على السلطة الفلسطينية تصلب الفحص

ملاحظة: على الرغم نموذجية للخطوط الخلايا الثديية مشتركة، يتم استخدام بروتوكول المبينة في هذا القسم تحديدا مع سرطان الثدي خط الخلية MDA-MB-231 (انظر الأرقام 4 و 5).

  1. جمع الخلايا من نسيج الثقافة قارورة عن التعرض إلى 5٪ التربسين / EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. استخدام ~ 80 ميكرولتر من التربسين / EDTA لكل سم 2 من منطقة قارورة الثقافة. على سبيل المثال، استخدام 2 مل من التربسين / EDTA FOرا T25 زراعة الخلايا القارورة. اعادة تعليق الخلايا التي تم جمعها في المتوسطة كاملة تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في تركيز الخلية النهائي المطلوب. مع الأخذ بعين الاعتبار خلية مضاعفة الوقت وكذلك طول الفترة الزمنية سيتم المصنف الخلايا على الفحص، واختيار التركيز المناسب خلية فرعية متموجة. ضمان المتوسطة أضاف يكفي لغمر تماما الهلاميات المائية.
    ملاحظة: منذ الهلاميات المائية تم قبل معايرتها في وسائل الإعلام (راجع الخطوة 3.2.6) 100 حجم ميكرولتر يجب أن تكون كافية. يجب أن أحجام المتوسطة المعتادة المستخدمة في لوحات multiwell تكون كافية منذ المواد الهلامية تم قبل معايرتها في وسائل الإعلام في الخطوة السابقة.
    ملاحظة: إن الفحص تكون مناسبة لأي نوع من الخلايا التي تعتمد على المرفق.
    1. عد عدد الخلايا تحت مجهر مقلوب باستخدام عدادة الكريات. تحميل 10 ميكرولتر من تعليق خلية في كل ميناء عدادة الكريات ومتوسط ​​عدد خلايا من لا يقل عن 8 أجزاء. للحصول علىتركيز الخلية النهائي، مضاعفة عدد خلايا بنسبة 10 4.
      ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج عدد خلايا عند عدد الخلايا في كل رباعي عدادة الكريات هو 20-50.
  2. ثقافة الخلايا على صلابة فحص PA في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. تغيير وسائل الاعلام كل 2 - 3 أيام. جمع الخلايا عند الحاجة عن طريق التعرض إلى 5٪ التربسين / EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استخدام ~ 80 ميكرولتر من التربسين / EDTA لكل سم 2 من زراعة الأنسجة قارورة. خلال جميع الخطوات التلاعب خلية، ورعاية خاصة لا لتعطيل سطح هيدروجيل: نضح أو ماصة المتوسطة التي كتبها البقشيش قليلا لوحة multiwell جانبية ولمس طرف ماصة على الجدار الجانبي من كل بئر، خلافا للمس هيدروجيل.
    ملاحظة: باستثناء لرعاية خاصة لا تتلف سطح هيدروجيل خلال معيار التعامل زراعة الأنسجة، المصنفة الخلايا على فحص صلابة يمكن التلاعب بها بنفس الطريقة كما لو كانت المصنفة علىإلى لوحة multiwell العادية.

5. التصوير من خلايا المصنف على السلطة الفلسطينية تصلب الفحص

  1. خلايا صورة مباشرة على صلابة مقايسة السلطة الفلسطينية.
    ملاحظة: أي المجهر - مقلوب، الفلورسنت، أو متحد البؤر، ويمكن استخدامها لتصوير الخلية.
    ملاحظة: الدعم من البلاستيك المرن المستخدمة لبناء فحص صلابة شفافة تماما ولا autofluoresce أو تتداخل مع التصوير الخلية. ومع ذلك، على الرغم من أن الدعم من البلاستيك المرن في حد ذاته هو شفاف وقدرات التصوير سوف تكون محدودة بسبب المسافة عمل الهدف. الدعم البلاستيكية مرن يحتوي على سمك 0.23 مم والمسافة العمل نموذجية من هدف 10X هو ~ 4 مم، وخفض حاد لتكبير أعلى.
    1. لتصوير الخلايا الحية، موقف السلطة الفلسطينية تصلب فحص في حامل لوحة المجهر والصورة. إبقاء جلسات التصوير تحت 2 ساعة، أو استخدام المجهر مجهزة غرفة البيئية لأوقات التصوير أطول.
    2. عندما يعيش ايم خليةالشيخوخة ليست الهدف، وتحديد الخلايا في 4٪ محلول الفورمالديهايد تستكمل مع 0.1٪ المنظفات. نقع الخلايا في تثبيتي في RT مدة لا تقل عن 2 ساعة. شطف مع PBS مرتين. تجاهل تثبيتي النفايات في حاوية النفايات المعينة.
      ملاحظة: خلايا يمكن تصوير فورا أو تخزينها المغمورة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع. تنبيه: الفورمالديهايد سامة عند استنشاق والاتصال. التعامل مع القفازات في غطاء الدخان الكيميائية.
      ملاحظة: خلية بروتوكول تثبيت لابد من اختياره بناء على تلطيخ الخلايا والتعامل مع البروتوكولات اللاحقة، لأن بعض مثبتات تلف بعض البروتينات الخلية.
    3. للتصوير الفلورسنت، وصمة عار الخلايا مع المطلوب وصمة عار الخلايا مباشرة في لوحة multiwell الثابتة. الصورة فورا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتستخدم بولي أكريلاميد (PA) الهلاميات المائية على نطاق واسع لاختبار استجابات الخلايا التي تعتمد على صلابة. 17،24 بواسطة خلط تركيزات مختلفة من مادة الأكريلاميد (A) ومكرر الأكريلاميد (B) واحد يمكن أن تجعل المواد الهلامية السلطة الفلسطينية التي تغطي مجموعة وتصلب الأنسجة اللينة في معظم الجسم - 0.3 -.. 300 معامل كيلو باسكال يونغ 1 ومع ذلك، وإعداد المواد الهلامية بولي أكريلاميد هو مملة ومضيعة للوقت، وغالبا ما تحد من فائدتها في تطبيقات "عالية الإنتاجية" مثل لفحص سبيل المثال المخدرات 12 هنا، وهي طريقة بسيطة وسريعة ل تجميع المواد الهلامية PA في لوحات متعددة جيدا أو أي مرغوب فيه سفينة الثقافة الأنسجة الأخرى وتقدم (الشكل 1). ويبين الشكل 2A معامل ويونغ بوصفها وظيفة من عدة تركيزات ألف وباء (تلخيصها كما في الجدول رقم 1). يتم الإبلاغ عن معاملات الرجوعية من تركيبات إضافية A و B في الأدب. 17،25،26 وصلابة هلام من swolle بالكاملن وقد تم قياس المواد الهلامية التي كتبها الريولوجيا (AR 2000EX مقياس غلفاني، الآلات TA) مع هندسة موازية 20 ملم العليا، تردد متذبذبة اختبار الاجتياح 1 - 10 هرتز، و 2٪ الضغط المستمر. وكما كان متوقعا، وقد تبين أن كلا من معامل التخزين، G '، وفقدان معامل، G "، تكون مستقلة عن التردد (الشكل 2B). وأكد أيضا أن التجفيف ثم إعادة ترطيب المواد الهلامية، لم تؤثر على معامل يونغ الخاصة بهم (الشكل 2C). ويرتبط معامل يونج إلى معامل التخزين من خلال المعادلة التالية:
المعادلة 1

حيث E هو معامل يونج والخامس هو نسبة بواسون الذي يقترب إلى 0.5 لالهلام PA 27 لاحظ أن القيم المبلغ عنها هي لالهلاميات المائية أعدت مع TEMED. ويمكن أيضا أن يتم من قبل يشابك UV إعداد الهلاميات المائية السلطة الفلسطينية عندما يتم تحسين زمن التعرض وكثافة الأشعة فوق البنفسجية ( 27 وسائل أخرى مثل قوة المجهر الذري 5،7 هي أيضا مناسبة. الهلاميات المائية بولي أكريلاميد وحدها خامل. وبالتالي، يجب أن تضاف إلى انتزاع مرفق الخلية جزيئات المصفوفة خارج الخلية بشكل منفصل. الكولاجين النوع الأول تم اختياره لهيدروجيل طلاء، ولكن نفس الطريقة يمكن أن تستخدم لمعطف أي المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتين الآخر من اختيار الشكل 3 يوضح أنه باستخدام crosslinker سلفو-SANPAH، طلاء الكولاجين موحد على الهلاميات المائية من أي تصلب لا يمكن أن يتحقق. 5

وعلاوة على ذلك، وقد تبين أن الخلايا المصنفة على الهلاميات المائية من stiffne مختلفةSS عرضت التشكل مختلفة. لهذه التجربة، والمصنف سرطان الثدي MDA-MB-231 الخلايا على رأس المواد الهلامية السلطة الفلسطينية ل24-72 ساعة. كانت الخلايا المستزرعة في RPMI المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تم المصنفة الخلايا في 1 × 10 5 خلية / مل أو 1 × 10 4 خلايا / جيد لوحة 96-جيدا. هذا هو نموذجي كثافة البذر الخلية - 4 أضعاف أقل من كثافة الخلايا confluency، حيث يتم التوصل confluency للحصول على خط خلية الثدييات في ~ 1 × 10 5 خلية / سم 2. أخذت الصور على المجهر الفلورسنت المقلوب وتحليلها على يماغيج عبر اصف الشكل والبرمجيات المساحة المكونات الإضافية. ولوحظ أنه عندما المصنف على المواد الهلامية السلطة الفلسطينية لمدة 24 ساعة، وظلت سرطان الثدي MDA-MB-231 الخلايا جولة على لينة 0.5 و 1 كيلو باسكال المواد الهلامية، ولكن كانت قادرة على الانتشار واستطال على 100 ​​كيلو باسكال قاسية هلام (الشكل 4). showcas أيضا الرقم 4وفاق حقيقة أن الهلاميات المائية جعلت على رأس الدعم بلاستيكية مرنة شفافة وتسمح لسهولة التصور والمجهري. وعلاوة على ذلك، فإن الدعم بلاستيكية مرنة لا autofluoresce وبالتالي فهي لا تتدخل في التصوير من خلايا fluorescently المسمى. وكان كميا مورفولوجيا الخلايا مزيد من حيث خلية الشاملة نشر المنطقة وعامل شكل الخلية - دائرية (الشكل 5). وقد تم قياس خلية منطقة ينتشر عن طريق إنشاء قناع لتتبع محيط كل خلية. ثم تم احتساب شكل الخلية (دائرية) من العلاقة التالية:
المعادلة 1

يتم قياس دائرية على مقياس من 0 - 1، حيث 0.6 - اتخذت 1 إلى تسمية الخلايا تقريب و0 - اتخذت 0.5 لتسمية الخلايا ممدود. وقد تم تحليل ما يقرب من ثلاثمائة الخلايا من ثلاثة على الأقل تجارب مستقلة لكل بوين البيانات ر. تم حساب فروق ذات دلالة إحصائية على أساس تحليل واحد عامل التباين (ANOVA) حيث كانت تعتبر مجموعات البيانات تختلف كثيرا عندما ف <0.05.

الشكل (1)
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لإعداد هلام بولي أكريلاميد على الدعم من البلاستيك المرن. ويمثل هذا الرقم الخطوات المختلفة المشاركة في إعداد المواد الهلامية السلطة الفلسطينية على دعم بلاستيكية مرنة. بعد أن يجف الجل تماما، ويمكن خفض أو لكمات في أي شكل مرغوب فيه. لكمة كاملة (~ 6 مم) هي الأكثر ملاءمة عند إعداد المواد الهلامية لوحة 96-جيدا، في حين أن ورقة القاطع الثقيلة يمكن أن تستخدم لالأشكال المربعة أو المستطيلة. يسلط الضوء على شخصية أيضا حواف الآبار، مع وبدون جل كلا، لإثبات ويمكن تحقيق ذلك تغطية كاملة أسفل بشكل جيد مع هذا الأسلوب. OAD / 52643 / 52643fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تصلب السلطة الفلسطينية الهلاميات المائية مقاسا الريولوجيا. (A) معامل الممثل الشاب لمدة خمس A & B تركيزات مختلفة (راجع الجدول رقم 1 لالمختصرات)؛ (ب) تخزين وفقدان معامل بوصفها وظيفة من التردد مقاسا الريولوجيا، (C) المواد الهلامية يحمل نفس معامل يونج في البداية (الأولية) وبعد أن تم تجفيفها وإعادة رطب (إعادة رطب) مستقلة عن تركيز البوليمر السلائف. تم إعداد جميع المواد الهلامية للقياسات الريولوجيا كما ألواح من 20 مم و1-1،5 ملم الإرتفاع (عند تورم الكامل).

/52643fig3.jpg "/>
الشكل 3. الكولاجين الطلاء على المواد الهلامية السلطة الفلسطينية. طلاء الكولاجين (الأخضر) يتم توزيعها بكفاءة واحتفظت على هلام PA (الحمراء) مستقلة سطح معامل هيدروجيل صلابة يونغ). تم استخدام الكولاجين المسمى مع Cy5 لهذه البيانات. وجزءا لا يتجزأ من الخرز الأحمر الفلورية في هيدروجيل السلطة الفلسطينية إلى التصور المساعدات. واتخذت صورة مقطعية على المجهر متحد البؤر (مقياس بار = 100 ميكرون). صورة مقتبسة من Zustiak وآخرون. آل 5 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. عقد المرحلة (الصف العلوي) والفلورسنت (الصف السفلي) وصور من MDA-MB-231 خلايا المصنف على المواد الهلامية السلطة الفلسطينية لمدة 24 ساعة. MDA-MB-231 الخلايا تبقى جولة على المواد الهلامية اللينة (الشباب 7؛ ق معامل 0.5 و 1 كيلو باسكال) ولكن استطال على المواد الهلامية PA شديدة (معامل يونج من 100 كيلو باسكال). تم المصنف الخلايا على المواد الهلامية لمدة 24 ساعة، ثابتة في الإيثانول وملطخة أكريدين البرتقال (AO - الأخضر) لتصور السيتوبلازم الخلية ودابي (الأزرق) لتصور نواة الخلية؛ على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
تتأثر الشكل 5. خلية منطقة الانتشار ودائرية من صلابة الركيزة الأساسية. (أ) يتم زيادة MDA-MB-231 منطقة انتشار الخلايا بشكل ملحوظ على 100 ​​كيلو باسكال بدلا من 0.5 كيلو باسكال المواد الهلامية. (ب) يقلل دائرية الخليوي مع زيادة في السلطة الفلسطينية هلام صلابة. النجمة تعين اختلافات كبيرة؛ P <0.05.

ve_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل (6)
الشكل 6. تمثيل تخطيطي لإعداد بديل هلام بولي أكريلاميد على دعم بلاستيكية مرنة. ويمثل هذا الرقم الخطوات المختلفة المشاركة في إعداد المواد الهلامية السلطة الفلسطينية على دعم بلاستيكية مرنة. هنا يتم في البداية قبل قطع على الدعم البلاستيك المرن إلى "coverslips" البلاستيكية من الشكل المطلوب والحجم. هذه التقنية تعمل أفضل لالهلاميات المائية لينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

اختصار مادة الأكريلاميد٪ مكرر الأكريلاميد٪ مادة الأكريلاميد من 40٪ محلول المخزون (مل) مكرر الأكريلاميد من 2٪ محلول المخزون (مل) الماء (مل) G '± SD (كيلو باسكال) E ± SD (كيلو باسكال)
PA1 5 0.025 625 62.5 4312.5 0.62 ± 0.19 1.85 ± 0.57
PA2 5 0.1 625 250 4125 3.55 ± 0.12 10.64 ± 0.36
PA3 8 0.1 1،000 250 3750 9.71 ± 0.64 29.14 ± 1.93
PA4 8 0.25 1،000 625 3375 22.00 ± 2.10 66.01 ± 6.31
PA5 12 0.25 1،500 625 2875 37.42 ± 2.68 112.25 ± 8.03

الجدول 1. تركيزات مادة الأكريلاميد (A) وcrosslinker مكرر الأكريلاميد (B) والناتجة PA هلام صلابة. تصلب، ممثلة هنا من قبل G 'وE، وقد تم قياس بواسطة الريولوجيا. G 'هو معامل التخزين في 1 هرتز التردد. معامل يونج، E، تم حسابها من المعادلة. تم احتساب 1. معيار الانحراف (SD) على أساس ثلاث تجارب مستقلة مع 3-5 عينات تقاس في التجربة. المختصرات في الجدول تتوافق مع الاختصارات المستخدمة في الشكل 2A.

كثافة الأشعة فوق البنفسجية = 15 ميغاواط / سم 2 زمن التعرض = 300 ثانية
الوقت (ق) E (كيلو باسكال) ± SD فيتوتر (ميغاواط / سم 2) E (كيلو باسكال) ± SD
75 0.14 ± 0.03 15 28.05 ± 2.62
100 6.98 ± 2.34 26 21.13 ± 3.01
125 19.11 ± 2.29 37 20.01 ± 2.38
300 28.05 ± 2.62 66 19.35 ± 2.86

الجدول 2. البلمرة للأشعة فوق البنفسجية هو بديل وطريقة أسرع للسلطة الفلسطينية إعداد هلام عندما يتم تحسين الظروف دبق. PA3 (راجع الجدول رقم 1) وصفت هلام. يلخص الجدول معامل الناتجة عن يونغ عندما يكون أي وقت التعرض (من اليسار عمودين) أو كثافة الأشعة فوق البنفسجية (يمين عمودين) وتتنوع لنفس الحل. استنادا إلى نتائج من الجدول، يبدو أن 300 ثانية زمن التعرض و15ميغاواط / سم 2 كثافة الأشعة فوق البنفسجية تعطي أعلى صلابة هلام السلطة الفلسطينية، وهو مشابه لصلابة من هلام بلمرة تقليديا كما ورد في الجدول 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المواد الهلامية بولي أكريلاميد، وضعت أصلا لالكهربي، 28 تستخدم الآن بشكل روتيني بمثابة ركائز ثقافة الخلية لدراسة آثار الركيزة صلابة على مورفولوجيا الخلايا، حركية، والاتصالات 3،24،29 بين خصائص الخلايا الأخرى. بولي أكريلاميد يسمح التلاعب الركيزة صلابة ليشمل صلابة من جميع الأنسجة الرخوة في الجسم (0،3 حتي 300 كيلو باسكال) 1 مع تغيير بسيط في تركيز البوليمر السلائف (الشكل 2، الجدول رقم 1، وانظر أيضا المراجع 17،25،26). إلى جانب ذلك إلى حقيقة أن المواد الهلامية السلطة الفلسطينية غير مكلفة إلى حد ما وبسيطة لإعداد، لأنها أصبحت منصات لا غنى عنها في دراسة الخلايا المادية التفاعلات تعتمد على صلابة. ومع ذلك، على الرغم من البساطة، والتقنية الحالية لإعداد المواد الهلامية PA يقتصر على دفعات صغيرة. هذه القيود تنبع من طبيعة دبق هيدروجيل، وهو البلمرة الحرة الراديكالية يحفزه فوق كبريتات الأمونيوموTEMED 30 منذ رد الفعل هو حر جذرية سلسلة البلمرة، فإنه يمكن أن تحول دون أي عنصر التي هي بمثابة فخ الجذور الحرة، مثل الأكسجين. لذلك، منذ انتشار الأوكسجين في حل البوليمر لابد من تجنبها خلال البلمرة - وهو ما قد يستغرق ما يصل إلى 45 دقيقة لأنعم المواد الهلامية - ببساطة pipetting لوالمواد الهلامية السلطة الفلسطينية إلى لوحة multiwell مفتوحة ليس ممكنا. أيضا، لاستخدامها بمثابة ثنائي الأبعاد (2D) الركيزة الخلية، ويجب أن يكون السطح من هلام PA مسطح. كل من إملاء الشروط المذكورة أعلاه أن لإنتاج المواد الهلامية السلطة الفلسطينية بمثابة ركائز خلية 2D، يجب أن تكون محصورة PA حل هلام السلائف بين اثنين من الأسطح المسطحة خلال البلمرة - لمنع انتشار الأوكسجين وتتسطح سطح هلام. وبالإضافة إلى ذلك، والسطح العلوي يجب أن يكون من النوع الذي يمكن أن قشر بسهولة الخروج من هلام تعريض السطح لمرفق الخلية. وعادة ما يتم تحقيق ذلك من خلال طلاء مسعور من سطح الزجاج. وأخيرا، عند وضعه في الالآبار (ه) من لوحة multiwell، ينبغي أن المواد الهلامية PA تغطي السطح كله جيدا وتكون مقيدة من العائمة. تغطية كاملة السطح السفلي جيدا أهمية خاصة في التطبيقات حيث المقايسات المستخدمة لتقييم الخلايا هي من النوع الذي يأخذ بعين الاعتبار السكان الخلية كله في البئر (على سبيل المثال، MTT). إذا لم هلام السلطة الفلسطينية كافية لتغطية السطح جيدا كله، يجب توخي الحذر لمنع التصاق الخلية إلى السطح جيدا يتعرض كخلايا يمكن لفة بسهولة قبالة الهلام على الزجاج أو البلاستيك. إذا لزم الأمر، BSA حجب يلي البروتوكولات القياسية أو باستخدام الجاهزة التصاق الخلايا مجموعات حجب القائم على BSA ينبغي أن يكون كافيا لمنع مرفق الخلية إلى الجزء السفلي من لوحة جيدا. على سبيل المثال، لإعداد السطح BSA المغطاة، 0.5 ملغ / مل من حل BSA في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4 يجب أن كثف على طبق زراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة في RT، تشطف مع برنامج تلفزيوني واستخدامها على الفور أو تخزين عند 4 درجات مئوية ل لتصل إلى 2 أسابيع. وقد تبين BSA لمنع التصاق الخلايا سو مزارع الخلايا الثديية على كل الأسطح البوليسترين ماء والكارهة للماء عن طريق خفض كبير للقوات التصاق الخلايا مقاسا مجهر القوة الذرية. وقد استخدم 31 BSA بشكل روتيني لمنع التصاق الخلايا الثدييات فضلا عن خلق خلية الأسطح المزخرفة. 32،33

تقنية صورت في هذه المقالة، يرضي جميع الشروط المذكورة أعلاه مما يتيح للانتاج كميات كبيرة من المواد الهلامية PA موحدة من حجم مخصص والشكل. هذه التقنية هي أبسط وأكثر كفاءة من المعيار الحالي من يقحم PA حل هلام السلائف بين اثنين من coverslips الزجاج. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يتطلب أي معدات متطورة، وبالتالي بسهولة تبنيهم من قبل أي مختبر أبحاث. بل هو أيضا أكثر فعالية من حيث التكلفة لأنها لا تتطلب استخدام ألواح الزجاج أو coverslips الزجاج، والتي ليست مكلفة فقط، ولكن أيضا تأتي في أحجام محدودة. هذه التقنية هي أيضا أسرع لعدة أسباب. أولا، أنها لا تنطوي على أي خطوات المعالجةنموذجية للأسطح الزجاج منذ تم تصميم الدعم من البلاستيك المرن مع سطحين متميزة - الجانب ماء أن تعلق بشكل دائم إلى بولي أكريلاميد والجانب مسعور التي يمكن مقشر قبالة بسهولة بعد تشكيل هلام. ثانيا، لأن الدعم البلاستيكية مرن، فمن أسهل وأسرع لتقشر هلام شكل: عندما تتشكل المواد الهلامية رقيقة بين اثنين من الشرائح الزجاجية، تقشير قبالة أعلى الشريحة مسعور صعبة وغالبا ما يؤدي إلى الكسر الذي يعرض للخطر أيضا هلام. وأخيرا، بسبب مرنة الشفافية دعم البلاستيك، ويمكن استخدام أسرع البلمرة الأشعة فوق البنفسجية وليس لمعيار البلمرة مقرها TEMED-وهو ما قد يستغرق ما يصل إلى 45 دقيقة (الجدول 2). يوضح البيانات الواردة في الجدول 2 أنه عندما يتم تحسين الوقت البلمرة وكثافة الأشعة فوق البنفسجية صلابة مماثلة يمكن أن يتحقق من قبل كل من TEMED والأشعة فوق البنفسجية طرق البلمرة.

يتم إعداد الهلاميات المائية على رر مرندعم أستيك كما هو مبين في الشكل (1). ومن الموصى به لأداء دبق في غرفة التفريغ لتجنب البلمرة غير مكتملة من حواف هلام (أي آثار الحافة) وذلك بسبب انتشار الأوكسجين بين اثنين من الأسطح التي ساندويتش الحل البوليمر. والهدف هو خلق فيلم هيدروجيل كبير على رأس الدعم بلاستيكية مرنة، وبالتالي، لوحة من الزجاج من أي حجم سيكون مناسبا، لكنه لن تملي حجم فيلم بولي أكريلاميد التي يمكن تحقيقها. يمكن أن تكون مغلفة الزجاج مع أي طلاء مسعور أو بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم الجانب مسعور من الدعم من البلاستيك المرن بدلا من ذلك. مرة واحدة يتم تشكيل فيلم هلام السلطة الفلسطينية، وتجفيفها، مقطعة إلى الأشكال المطلوبة، ومن ثم إعادة رطب-قبل الاستخدام. عندما تجف، والمواد الهلامية ويمكن تخزين ما لا نهاية. وأكد من قبل الريولوجيا، أن الجل تصلب السلطة الفلسطينية لم تتغير على الإماهة حتى عندما يتم تخزين المواد الهلامية في الحالة الجافة لعدة أشهر (الشكل 2C). ومع ذلك، لقوات العمليات الخاصة جدار المواد الهلامية (≤ 1 كيلو باسكال في معامل يونج) التجفيف والإماهة التجعيد سطح تفاقم والكراك. هذا السلوك هو شائع عن المواد الهلامية اللينة التي تخضع لنزع الماء واللاحق الإماهة في حين يجري مقيدة هندسيا. 34،35 ليست كل المواد الهلامية تجعد أو الكراك، وبالتالي، فمن الممكن لدراسة بصريا الهلاميات المائية قبل استخدامها وفقط استخدام العينات يتم عرضها على سطح أملس. لتجنب تماما تشكيل تجعد وتكسير، طريقة بديلة لإعداد الهلاميات المائية لينة وصفت في الشكل (6). وهنا، فإن الدعم بلاستيكية مرنة قبل قطع في الشكل المطلوب ويتم تشكيل هلام السلطة الفلسطينية على القمة، وبالتالي، والمواد الهلامية لا تحتاج إلى إزالة رطب ولكن يمكن أن تستخدم مستعدا. ميزة إضافية لهذه الاستراتيجية البديلة هي أن ~ 2.5 المزيد من المواد الهلامية يمكن أن تنتج من نفس الحجم من حل هيدروجيل السلائف (ويستند التقدير على إعداد المواد الهلامية لوحة قياسية 96-جيدا كما هو موضح في قسم البروتوكول). واحد الحذر عندإعداد الهلاميات المائية في هذه الطريقة هو اتخاذ الحذر لتجنب تسرب الأوكسجين، وخاصة بالنسبة المواد الهلامية من حجم أصغر (على سبيل المثال، والمواد الهلامية لاستخدامها في لوحة 96-جيدا). حتى عندما يتم نزع الغاز الحل هلام السلائف تماما، أي الأكسجين الحر، والأكسجين سيتم نزع فتيله بين اثنين من الأسطح التي ساندويتش حل السلطة الفلسطينية. وهكذا، من أجل تجنب الآثار حافة أو تشكيل هلام غير مكتمل على طول الحواف، فمن الأفضل للسماح للبلمرة أن يحدث في غياب الأكسجين. في تجربتنا، فراغ الغرفة يعمل بشكل جيد، على الرغم من بيئة غاز خامل يمكن استخدامها بنفس القدر من النجاح.

واحد الحذر النهائي عند إعداد السلطة الفلسطينية الهلاميات المائية بمثابة ركائز خلية لاختبار استجابات الخلايا التي تعتمد على الصلابة، هو أن سمك هيدروجيل الناتجة مهم: لوالمواد الهلامية رقيقة جدا، والخلايا قادرة على الشعور الركيزة الأساسية 36 عن طريق النظرية والتجربة. لين وآخرون أثبتت أن العمق الذي يمكن خلايا الحديدشرم الركيزة الأساسية تعتمد على البعد الأفقي للخلية. 29 منذ البحوث الحالية هو متناقض، وتحديد الحد الأدنى المطلوب سمك لمنع الخلايا من الاستشعار عن بعد في "الخفية" الركيزة لتكون من عدة ميكرون 36 لتصل إلى 60 ميكرون، وينبغي أن تهدف 37 سماكة هلام الحد الأدنى من 100 ميكرومتر ل.

عند تجميع المواد الهلامية PA في لوحة multiwell، يتم استخدام قطرات صغيرة من PDMS لتأمين هلام إلى أسفل البئر. PDMS تم اختياره لأنه يعمل الغراء دائم كما على تصلب، فمن شفاف تماما و لا تتداخل مع التجارب المجهري لاحقة، هو تماما غير السامة للخلايا، وأنها تشفي في ما يقرب من 4 - 8 ساعة ترك الوقت الكافي لوحة التجمع. تأمين بأمان الهلاميات المائية إلى الجزء السفلي من المساعدات جيدا في التعامل مع الخلايا: على سبيل المثال، يمكن غسل قوي طرد الهلاميات المائية إذا لم تثبت بإحكام. إذا كان التغيير المتكرر في الخلية مالقانونين ليست مصدر قلق، ثم المواد الهلامية يمكن تأمينها بشكل مؤقت إلى السطح جيدا من قبل قطرات صغيرة من السائل غير السامة للخلايا وعالية اللزوجة مثل الجليسرين.

الخطوات النهائية قبل البذر خلية تنطوي ECM طلاء من هلام ومن ثم التعقيم. هنا وصفت الكولاجين النوع الأول طلاء (الشكل 3) على الرغم من أن نفس الأسلوب يمكن تطبيقها على أي بروتين ECM الآخرين. ويستخدم ثنائية وظيفية crosslinker سلفو-SANPAH لتحقيق معطف أحادي الطبقة حتى. وقد أظهرت الأبحاث السابقة أن هذا التعلق التساهمية ينتج طلاء أكثر اتساقا من مجرد امتصاص البروتين ويسمح لضبط 12 أضعاف من كمية البروتين التي توليها ببساطة باستخدام محلول البروتين من تركيز متفاوتة أيضا. 6 وأخيرا، فإن تجميعها لوحة هلام multiwell يتم تعقيم تحت الأشعة فوق البنفسجية في الثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة لمدة تصل إلى 2 ساعة. تعقيم الأشعة فوق البنفسجية يسمح للمقايسة ليتم تجميعها على مقاعد البدلاء المختبر خارج غطاء محرك السيارة، التييجعل عملية وجستيا أبسط وأسرع عموما.

أرقام 4 و 5 توضيح بعض نتائج ممثلة من الخلايا MDA-MB-231 سرطان الثدي مثقف على مرنة المرفقة دعم البلاستيك والمواد الهلامية السلطة الفلسطينية من صلابة متفاوتة. -231 MDA-MB خلايا تم اختيار لإثبات فائدة طريقة لأنهم وقد ثبت للرد على الركيزة الأساسية صلابة بسبب التغيرات قابلة للقياس في التشكل. 5،12 وكما كان متوقعا، كانت الخلايا أكثر ممدود، وكان مجال نشر أكبر على وتيبس 100 كيلو باسكال المواد الهلامية السلطة الفلسطينية مقارنة مع 0.5 الناعمة والمواد الهلامية 1 كيلو باسكال PA (الأرقام 4 و 5). الصف السفلي في الشكل (4) يوضح أيضا استخدام اثنين من الأصباغ الفلورية أن وصمة عار على نواة الخلية والسيتوبلازم الخلوي، وعرض حقيقة أن الدعم من البلاستيك المرن لا تتداخل مع التصوير المجهر الفلورسنت.

وباختصار، طريقة بسيطة لإعداد الهلاميات المائية بولي أكريلاميد فييتم تقديم شكل لوحة multiwell. هذه التقنية هي أسرع وأكثر كفاءة وأقل تكلفة من الطرق الحالية لإعداد المواد الهلامية السلطة الفلسطينية لاستخدامها بمثابة ركائز المحمولة، فضلا عن تمكن إعداد المواد الهلامية العرف الاحجام لا تتوفر على خلاف ذلك. كما أنها لا تتطلب أي معدات متخصصة، وطريقة يمكن اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر البحوث وستكون مفيدة بشكل خاص في مجال البحوث التي تركز على فهم استجابات الخلايا التي تعتمد على صلابة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
40% Acrylamide Bio-Rad 161-0140
2% Bis-acrylamide Bio-Rad 161-0142
Ammonium Persulfate Bio-Rad 161-07000
TEMED Sigma Aldrich T9281
Sulfo-SANPAH Thermo Scientific 22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml BD Biosciences 354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100
Hydrophobic solution — Repel Silane GE Healthcare Bio-Sciences 17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4 HyClone SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] Elsworth Adhesives 3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x) Sigma Aldrich 44174
RPMI-1640 Medium (1x) HyClone SH30027-02
Fetal Bovine Serum HyClone SH30073-03
Penicillin Streptomycin MP Biomedicals 1670046
Detergent: Triton-X Sigma Aldrich T8787
Formaldehyde 37% Solution Sigma Aldrich F1635
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit Chemicon International ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels GE Healthcare Bio-Sciences 309819
Glass Plates Slumpys GBS4100SFSL
50 ml conical tubes Fisher Scientific 3181345107
15 ml conicals tubes FALCON 352097
Micro centrifuge tubes Fisher Scientific 2 ml: 02681258
96-well plate (flat bottom) Fisher Scientific 12565501
Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) Fisher Scientific 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes Fisher Scientific 5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Fisher Scientific 2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9D
Parafilm PARAFILM  PM992
Powder Free Examination Gloves Quest 92897
Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm Grace Bio-Labs JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) Zeiss 3820005619
Microscope Software Zeiss AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven UVITRON UV1080
Vacuum chamber/degasser BelArt 999320237
Vacuum pump for degasser KNF Lab 5097482
Tissue Culture Hood NUAIRE NU-425-600
Chemical Fume Hood KEWAUNEE 99151
Inverted Microscope (Axiovert 25) Zeiss 663526
Incubator NUAIRE NU-8500
Pipette Aid Drummond Scientific Co. P-76864
Hemacytometer Bright-Line 383684

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
  2. Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  5. Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
  6. Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
  7. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
  8. Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
  9. Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
  10. Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
  11. Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
  13. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  14. Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
  15. Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
  16. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  17. Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
  18. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  19. Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  20. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  21. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  22. Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
  23. Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
  24. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  25. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  26. Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
  27. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  28. Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
  30. Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
  31. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
  32. Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
  33. Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
  34. Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
  35. Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
  36. Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  37. Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 97، Multiwell، الركيزة صلابة، وفحص المخدرات، بولي أكريلاميد، معامل يونج، عالية الإنتاجية
بسيط Multiwell تصلب الفحص لدراسة الردود خلية تصلب التي تعتمد على أساس بولي أكريلاميد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Syed, S., Karadaghy, A., Zustiak, S. … More

Syed, S., Karadaghy, A., Zustiak, S. Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses. J. Vis. Exp. (97), e52643, doi:10.3791/52643 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter