Introduction
De fleste væv i kroppen er bløde viskoelastiske materialer med en Youngs modul i området fra 0,1 kPa for hjernen til 100 kPa for blød brusk, endnu, de fleste in vitro celle forskning foregår på vævskultur polystyren (TCP), som har et modul på ~ 1 GPa . 1 Dette stivhed mismatch i høj grad påvirker den måde celler reagerer på deres omgivelser. En voksende mængde forskning er således dedikeret til at belyse effekten af substrat stivhed om skæbne forskellige celletyper, 2,3 herunder stamceller. 4 Som følge heraf har flere hydrogeler blevet udviklet til at hjælpe med forståelsen af stivhed-afhængig celle biologi herunder polyacrylamid (PA), 5-7 polyethylenglycol (PEG), 8,9 polydimethylsiloxan (PDMS), 10 og alginat. 11 Mens bevis for, at underlaget stivhed har en væsentlig indvirkning på celle skæbne er stigende, er de fleste undersøgelser på en lille skala med et lille antal ssempler. Systematiske, multidimensionale undersøgelser af virkningen af substrat stivhed for en række celletyper eller miljømæssige forhold er sjældne. 12
Der er udviklet flere lovende high-throughput hydrogel teknologier, herunder PEG-baserede microarrays, 13 mikrofluidenheder til produktion af agarose hydrogel mikroperler, 14 eller mikro- og nano-stænger hvor stivhed moduleres af diameter og højde mikrostavene. 15. Dog , de teknologier til fremstilling af sådanne substrater er sofistikeret og tilgængelig for begrænset antal laboratorier. Megen forskning involverer stivhed moduleret cellereaktioner udnytter polyacrylamid (PA) geler, som ikke kun er billig og enkel at gennemføre, men også udviser en fysiologisk relevant række Youngs modul, nemlig 0,3 -. 300 kPa 16-22 Men de eksisterende metoder til at fremstille PA geler til cellekultur er arbejdskrævende og dermed prepARED i små partier. Nogle af de vanskeligheder, der er forbundet med udarbejdelsen af PA geler som cellesubstrater skyldes kravet om, at gelerne skal være forberedt: 1) i fravær af ilt for at tillade fuldstændig polymerisering, 2) med en flad og jævn overflade for at muliggøre en ensartet celle fastgørelse og spredning, og 3) permanent fastgjort til bunden af cellekultur skålen for at forhindre flydende.
Adskillige grupper har forsøgt at producere PA geler til cellekultur i store partier. Semler et al. Forberedte tykke plader af PA geler, der var så "cut" med en hulning og anbringes i 96-brønds plader. 23. Men denne metode er begrænset til stivere geler, dvs.> 1 kPa i Youngs modul, fordi blødere geler "sticky", svært at skære og beskadiges let. MIH et al. Udviklet en mere sofistikeret teknik, som gør det muligt geler direkte polymeriseret i en glasbund multibrøndsplade.
Dette papir beskriver en enkel og billig måde at samle PA geler i en flerbrøndsplade, der let kunne vedtages af alle laboratorier. Her er en fleksibel plastik støtte anvendes, der har to sider - en hydrofob en, som er afvisende PA geler og et hydrofilt, som kovalent binder PA gel ved deposition. Når PA gel ark aflejres og permanent fastgjort til den fleksible plastik støtte, gør det muligt at håndtere geler af enhver tykkelse eller stivhed og skære dem i enhver ønsket form. Denne ca.oach ikke kun producerer tilpassede plast «dækglas« i størrelser ellers ikke kommercielt tilgængelige, men også overflødiggør behovet for at forbehandle glasoverflader, enten dækglas eller brøndene i dyre glasbund flerbrøndsplader med en PA bindende løsning, som er en kedelig og tidskrævende trin. Endelig kan ensartede PA gels plader fremstilles på store partier og opbevares de-hydreret i flere måneder.
Sammenfattende assay præsenteres her, er en forbedring i forhold til eksisterende metoder i flere aspekter. Først processen flerbrøndspladen samling er effektiv, og de samlede omkostninger ved de nødvendige materialer er lav. For det andet er de hydrogeler som produceres i store partier i en enkelt homogen gel film. Endelig er kun materialer, der er kommercielt tilgængelige påkrævet. Anvendeligheden af assayet er vist ved at undersøge virkningen af substrat stivhed på cellemorfologi og spredning område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Hydrogel-associerede løsninger og alikvoter
- Fremstilling af polyacrylamidgel precursor-opløsning.
- Forbered polyacrylamidgel forstadium ved at blande acrylamid (A) (40% w / v, M r 71,08 g / mol), tværbinderen bisacrylamid (B) (2% w / v, M r 154,17 g / mol), og ud- ioniseret vand i volumen procentsatser i tabel 1.
BEMÆRK: Disse opløsninger kan fremstilles i store partier og opbevaret ved 4 ° C i op til flere måneder.- ADVARSEL: Akrylamid er giftig ved indånding eller indtagelse, især når de er i pulverform: således, brug fortrinsvis 40% w / v opløsning for at mindske risikoen for toksicitet. Håndtag kun mens iført beskyttelsesbeklædning, såsom handsker, beskyttelsesbriller og en kittel. Opbevares i lysægte, tæt lukket beholder i køleskabet (<23 ° C, godt ventileret område).
- ADVARSEL: Bis-acrylamid er giftigt ved indånding eller indtagelse, især,når i pulverform: således, helst bruge 2% w / v opløsning for at mindske risikoen for toksicitet. Håndtag kun mens iført beskyttelsesbeklædning, såsom handsker, beskyttelsesbriller og en kittel. Opbevares i lysægte, tæt lukket beholder i køleskabet (<4 ° C, godt ventileret område).
- Forbered polyacrylamidgel forstadium ved at blande acrylamid (A) (40% w / v, M r 71,08 g / mol), tværbinderen bisacrylamid (B) (2% w / v, M r 154,17 g / mol), og ud- ioniseret vand i volumen procentsatser i tabel 1.
- Fremstilling og anvendelse af N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat (sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) portioner. ADVARSEL: sulfo-SANPAH forårsager alvorlig øjenirritation; håndtag med handsker og ordentlig øjne og ansigt. Opbevares ved -20 ° C ved modtagelsen og før udportionering.
- Hvis du vil gemme sulfo-SANPAH: opløse sulfo-SANPAH i dimethylsulfoxane (DMSO) ved 50 mg / ml. Alikvot stamopløsningen i 50 mikro centrifugeglas på 20 pi pr rør. Flash fastfrysning af tøris eller flydende nitrogen (en valgfri men foretrak skridt for at bevare maksimal tværbinder effektivitet) og opbevares ved -80 ° C.
BEMÆRK: portioner can opbevares i flere måneder. - For at bruge sulfo-SANPAH: tø portionen kort og fortyndes i 480 ul deioniseret vand. Brug det samme. Sulfo-SANPAH hydrolyserer hurtigt i vand; derfor tage forsigtighed at udføre alle ovenstående trin hurtigt.
- Hvis du vil gemme sulfo-SANPAH: opløse sulfo-SANPAH i dimethylsulfoxane (DMSO) ved 50 mg / ml. Alikvot stamopløsningen i 50 mikro centrifugeglas på 20 pi pr rør. Flash fastfrysning af tøris eller flydende nitrogen (en valgfri men foretrak skridt for at bevare maksimal tværbinder effektivitet) og opbevares ved -80 ° C.
- Fremstilling af ammoniumpersulfat (Mr 228,18 g / mol) portioner.
BEMÆRK: Ammonium persulfat forårsager øjne, hud og irritation af luftvejene. Bær egnede personlige værnemidler ved håndtering. Håndtag ammoniumpersulfat pulver i et stinkskab. Opbevar pulver på et tørt, godt ventileret sted. Når alikvoteret, kunne den fortyndede opløsning anvendes på arbejdsbordet.- Ammoniumpersulfat opløses i deioniseret vand for at opnå en endelig ammoniumpersulfat koncentration på 10% w / v. Alikvot og opbevares ved -20 ° C. Optøs umiddelbart før brug.
- Fremstilling af kollagen type I-opløsning.
- Forbered 0,2 mg / ml collagen løsning ved at fortynde lager, sålution i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) med pH 7,4. Opbevar på is kort eller brug umiddelbart efter fortynding.
2. Hydrogel Forberedelse (Se figur 1)
- Fremstilling af hydrofobe objektglas.
- Placer et par dråber af en hydrofob opløsning på en glasplade og bruge silkepapir at sprede sig over hele overfladen. Lad lufttørre og tørres af med en silkepapir igen for at udjævne den hydrofobe belægning.
BEMÆRK: Opbevar hydrofobe opløsning i en brandfarlig skab ved stuetemperatur. Brug personligt beskyttelsesudstyr ved håndtering. Arbejde i et godt ventileret område.
- Placer et par dråber af en hydrofob opløsning på en glasplade og bruge silkepapir at sprede sig over hele overfladen. Lad lufttørre og tørres af med en silkepapir igen for at udjævne den hydrofobe belægning.
- Fremstilling af fleksibel plast support.
- Skær fleksibel plastik støtte svarer til størrelsen af den hydrofobe overtrukne glasplade.
- Mærk den hydrofobe side af den fleksible plastunderlag ved let at skrabe overfladen med et skarpt værktøj, såsom en skalpel.
BEMÆRK: Når gelen - som er helt gennemsigtig - tørrerVil ridser hjælpe med at skelne hvilke fleksibel plastik support side indeholder gelen.
BEMÆRK: fleksibel plastik støtte har en hydrofob og en hydrofil side. Når deponeret, polyacrylamid permanent klæber til den hydrofile side af plastik støtte, som gør det let efterfølgende hydrogel håndtering.
- Gel Forberedelse (f.eks mængderne er angivet i 5 ml gel precursor-løsninger).
BEMÆRK: 5 ml ville være tilstrækkelig til at frembringe ~ 40 geler, når gelen oprindelige tykkelse er 0,5 mm. Flere geler kan fremstilles, hvis gel tykkelsen er reduceret.- Placer 4972,5 pi polyacrylamid precursor opløsning af den ønskede slutkoncentration (tabel 1) i en 50 ml konisk rør. Sted i en afgasningskammer i 30 minutter med hætten åbnes.
BEMÆRK: Oxygen fungerer som en fri radikal-fælde, og når til stede, er det inhiberer polymerisation. - 25 pi af 10% w / v ammoniumpersulfat (se punkt 1.3) for at opnå en endeligammoniumpersulfat koncentration på 0,05%.
- Tilføj 2,5 pi N, N, N ', N'-tetramethylethylendiamin (TEMED, M r 116,24 g / mol) til den afgassede gelopløsning at opnå en endelig TEMED koncentration på 0,5%.
BEMÆRK: Opbevar TEMED i en brandfarlig skab ved stuetemperatur. Håndtag i stinkskab, når iført egnede personlige værnemidler. Hold tæt lukket under inert gas, da det er meget luft og fugtfølsomme. - Bland opløsningen forsigtigt ved pipettering op og ned 3-5 gange. Ikke vortex at undgå oxygen diffusion ind gelforstadiet opløsning.
- Pipette gel opløsningen på den hydrofile side af den fleksible plast støtte og sandwich med hydrofob-coatede objektglas. Adskil de to glidere med silikone afstandsstykker med ønsket tykkelse (fx 0,5 mm). Efterlad en lille mængde (~ 100 pi) af polymerpræcursor opløsning i 50 ml konisk rør til brug som en indikator for gelering.
BEMÆRK:Enhver spacer kan anvendes. For eksempel giver en enkelt strimmel parafilm en endelig kvældet gel tykkelse på 100-120 um. - Placer en anden glasplade på toppen af fleksible plast support / gel sandwich at fastslå en endnu hydrogel overflade ved polymerisation.
- Lad gelen polymerisere i 45 minutter, selv om mindre tid kan bruges til geler med højere vægt%, hvis det ønskes. For at sikre, at gelen er polymeriseret, observere den resterende opløsning i 50 ml konisk rør; hvis den resterende opløsning har geleret, så er det sandsynligt, at gelering på glaspladen er blevet indledt samt. Bemærk dog, at for tidlig åbning af formen vil forhindre fuldstændig polymerisation.
- Når gelen er dannet, skrælle fleksibel plastik støtte med kovalent bundet polyacrylamidgel på toppen, og sæt gel-side-up lufttørre.
BEMÆRK: Konvektion eller varme tørring kan også anvendes til at accelerere dette trin. Når tørret på fleksibel plastik støtte, kan gelen være butikd ubestemt tid.- Markér eventuelle bare pletter i fleksibel plastik støtte, hvor polyacrylamidgeler ikke udgjorde pga bobler. Mark mens gelen stadig hydreret, da dette vil falde i med den fleksible plastik støtte, når gelen er tør.
- Placer 4972,5 pi polyacrylamid precursor opløsning af den ønskede slutkoncentration (tabel 1) i en 50 ml konisk rør. Sted i en afgasningskammer i 30 minutter med hætten åbnes.
3. multibrøndsplade Assembly, Collagen Coating, og Sterilisation
- Flerbrøndsplade samling.
- Når tørret, skåret PA geler til ønskede former.
- For en 96-brønds plade, brug en kraftig huller med en diameter på ~ 6 mm. Brug en kraftig papir cutter til at skære geler i kvadratiske eller rektangulære former. Alternativt kan du bruge en saks.
- Forbered ca. 500 pi PDMS per plade med 96 brønde ifølge producentens anvisninger. At lime gelerne til bunden af en flerbrøndsplade, placere en lille dråbe (~ 5 pi) polydimethylsiloxan (PDMS) i midten af hver brønd. Ved hjælp af en pincet, placeres en polyacrylamide gel i hver brønd, fleksibel plast support nedad. For at give PDMS at helbrede, skal du lade den samlede plade ved 37 ° C i mindst 4 timer.
- Når tørret, skåret PA geler til ønskede former.
- Collagen belægning af polyacrylamidgeler.
- Med en overførsel pipette, placere en lille mængde (7. - 8. pi) af sulfo-SANPAH (se punkt 1.2.2) i hver brønd og hvirvel fra side til side for at belægge geloverfladen jævnt. Arbejde hurtigt da sulfo-SANPAH ikke er stabilt i vand.
- Placer godt pladen under en høj intensitet UV-lampe (intensitet = 37 mW, λ = 302-365 nm) i 5 minutter. Skyl gelerne med PBS for at fjerne overskydende sulfo-SANPAH.
- Pipette 50 pi på 0,2 mg / ml collagen type I-opløsning (se punkt 1.4) i hver brønd. Lad pladen dækket ved stuetemperatur i mindst 2 timer eller O / N ved 4 ° C.
BEMÆRK: For at fremskynde processen af kollagen belægning, kan en overførsel pipette bruges til at tilføje kollagenopløsningen. Typisk 1 - bør 2 dråber af opløsning være nok til at fuldførely dække geloverfladen. - Lad brøndplade ved stuetemperatur i mindst 2 timer for at tillade collagen binding.
- Skyl med PBS for at fjerne overskydende collagen opløsning, og der steriliseres under UV (λ = 200 nm) i en vævskultur hætte i 2 timer.
- Soak gelerne i komplet medium (se afsnit 4.1 for medium sammensætning) O / N til at fugte og ligevægt. Brug for celle såning straks eller opbevares i køleskabet i op til 2 dage.
4. cellepodning på PA Stivhed Assay
BEMÆRK: Selvom typiske for fælles mammale cellelinier protokollen beskrevet i dette afsnit er specifikt anvendes med breast cancer MDA-MB-231-cellelinie (se figur 4 og 5).
- Saml celler fra vævskultur kolbe ved udsættelse for 5% trypsin / EDTA i 5 minutter ved 37 ° C. Brug ~ 80 pi trypsin / EDTA per hver cm2 af dyrkningskolbe område; for eksempel bruge 2 ml trypsin / EDTA FOra T25 cellekultur kolbe. Resuspender opsamlede celler i komplet medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin ved en ønsket endelig cellekoncentration. Under hensyntagen celle fordoblingstid samt varigheden af cellerne vil blive podet på analysen, vælge en passende sub-sammenflydende cellekoncentration. Sørg for, at tilsat medium er nok til helt dykke hydrogelerne.
BEMÆRK: Da hydrogelerne er præækvilibreret i medierne (se trin 3.2.6) 100 pi volumen skulle være tilstrækkeligt. Typiske medium, der anvendes til flerbrøndsplader mængder bør være tilstrækkelig, da gelerne er præækvilibreret i medierne i det forrige trin.
BEMÆRK: Analysen ville være passende for en vedhæftet fil-afhængig celletype.- Tæl celleantal under et omvendt mikroskop ved anvendelse af et hæmacytometer. Load 10 pi cellesuspension i hver hæmacytometer port og gennemsnittet i celletallet fra mindst 8 kvadranter. For at få denkoncentration endelig celle, multipliceres celletallet med 10 4.
BEMÆRK: Bedste celletal resultater opnås, når celle nummer i hver hemacytometer kvadrant er 20-50.
- Tæl celleantal under et omvendt mikroskop ved anvendelse af et hæmacytometer. Load 10 pi cellesuspension i hver hæmacytometer port og gennemsnittet i celletallet fra mindst 8 kvadranter. For at få denkoncentration endelig celle, multipliceres celletallet med 10 4.
- Kultur af celler på PA stivhed assay i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Skift medier hver 2 - 3 dage. Saml celler når det er nødvendigt ved udsættelse for 5% trypsin / EDTA ved 37 ° C i 5 minutter. Brug ~ 80 pi trypsin / EDTA pr cm2 vævskulturkolbe. Under alle cellemodificering skridt, tage ekstra forsigtig ikke at forstyrre hydrogel overflade: aspirat eller pipette medium med lidt vippe flerbrøndspladen sidelæns og røre pipettespidsen på sidevæggen af hver brønd, i modsætning til at røre ved hydrogel.
BEMÆRK: Bortset under særlig omhu for ikke at beskadige hydrogel overfladen under standard vævskultur håndtering, podet på stivheden assay kan manipuleres på samme måde, som hvis de blev podet på cellernetil en almindelig flerbrøndsplade.
5. Imaging Celler podes på PA Stivhed Assay
- Billede celler direkte på PA stivhed analysen.
BEMÆRK: Enhver mikroskop - omvendt, fluorescerende eller konfokal, kan bruges til cell imaging.
BEMÆRK: fleksibel plastik støtte anvendes til at konstruere stivheden analysen er helt gennemsigtige og ikke autofluoresce eller forstyrre cell imaging. Men selv om den fleksible plastik støtte i sig selv er gennemsigtig, billeddannelse kapaciteter vil blive begrænset af arbejdsafstand af målet. Den fleksible plastik støtte har en tykkelse på 0,23 mm og en typisk arbejdsdag afstand af en 10X mål ~ 4 mm, stærkt faldende højere forstørrelser.- For levende cell imaging, position PA stivhed assay i mikroskop plade holder og image. Hold imaging sessioner under 2 timer, eller bruge et mikroskop udstyret med en miljømæssig kammer til længere billedoptagning.
- Når levende celler imaldring er ikke målet, fix celler i 4% formaldehyd-opløsning suppleret med 0,1% rengøringsmiddel. Soak celler i fiksativ ved stuetemperatur i mindst 2 timer. Skyl med PBS to gange. Kassér fiksativ affald i en udpeget affaldsbeholder.
BEMÆRK: Celler kan afbildes straks eller opbevares nedsænket i PBS ved 4 ° C i op til 2 uger. ADVARSEL: Formaldehyd er giftigt ved indånding og ved kontakt. Håndtag med handsker i stinkskab.
BEMÆRK: Cell fiksering protokol skal vælges på grundlag af de efterfølgende celle farvning og håndtering protokoller, fordi visse fiksativer skade nogle celle proteiner. - For fluorescerende billeddannelse, bejdse fikserede celler med ønskede cellefarvende direkte i flerbrøndspladen. Billede straks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polyacrylamid (PA) hydrogeler er almindeligt anvendt til at teste stivhed afhængig celle responser. 17,24 Ved at blande forskellige koncentrationer af acrylamid (A) og bis-acrylamid (B) kan man gøre PA geler, der spænder stivheden række fleste bløde væv i kroppen - 0,3 -.. 300 kPa Youngs modul 1 imidlertid fremstilling af polyacrylamidgeler er besværligt og tidskrævende, ofte begrænser deres anvendelighed i "high-throughput" applikationer såsom for eksempel lægemiddelscreening 12 Her en enkel og hurtig metode til samling PA geler i multi-brønds plader eller enhver anden ønskelig vævskultur fartøj præsenteres (figur 1). Figur 2A viser Youngs modul som funktion af flere A- og B-koncentrationer (også opsummeret i tabel 1). Den moduli af yderligere A- og B-kombinationer er rapporteret i litteraturen. 17,25,26 Gelen stivhed af fuldt swollen geler blev målt ved rheologi (AR 2000ex rheometer, TA Instruments) med en 20 mm øvre parallel geometri, oscillerende frekvens sweep test 1 - 10 Hz, og 2% konstant belastning. Som forventet blev det vist, at både opbevaringsmodul, G 'og tabsmodul, G ", er uafhængige af frekvensen (figur 2B). Det blev også bekræftet, at tørring og derefter igen Hydrating gelerne, påvirkede ikke deres Youngs modul (figur 2C). Youngs modul var relateret til opbevaringsmodul ved følgende ligning: 
hvor E er Youngs modul og v er Poissons forhold, som blev tilnærmet til 0,5 for PA geler. 27 Bemærk, at de rapporterede værdier er for hydrogeler fremstillet med TEMED. PA hydrogeler kan også fremstilles ved UV krydsbinding når eksponeringstid og UV-intensitet er optimeret (
Endvidere blev det påvist, at celler podet på hydrogeler af forskellig stiffness udviste forskellig morfologi. Til dette eksperiment blev brystkræft MDA-MB-231-celler podet på toppen af PA geler for 24-72 timer. Celler blev dyrket i RPMI medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Celler blev podet ved 1 x 10 5 celler / ml eller 1 x 10 4 celler / brønd i en 96-brønds plade. Dette er en typisk celle podningsdensitet - 4-fold lavere end konfluens celledensitet, hvor konfluens for en mammal cellelinie er nået på ~ 1 x 10 5 celler / cm2. Billeder blev taget på inverteret fluorescerende mikroskop og analyseret på ImageJ via formdeskriptor og området software plug-ins. Det blev observeret, at når podet på PA geler i 24 timer, forblev brystkræft MDA-MB-231-celler rundt på de bløde 0,5 og 1 kPa geler, men var i stand til at sprede og aflange på den stive 100 kPa gel (figur 4). Figur 4 også showcases, at hydrogeler fremstillet oven på fleksibel plastik støtte er transparente og giver mulighed for nem visualisering og mikroskopi. Desuden indeholder fleksibel plastik støtte ikke autofluoresce og derfor ikke forstyrrer den billeddannelse af fluorescens-mærkede celler. Cell morfologi blev yderligere kvantificeret i forhold til den samlede celle spredning område og cell formfaktor - cirkularitet (figur 5). Cellespredning område blev målt ved at skabe en maske for at spore omkredsen af hver celle. Cell form (cirkularitet) blev derefter beregnet ved følgende sammenhæng: 
Cirkularitet måles på en skala fra 0 - 1, hvor 0,6-1 blev taget til at udpege afrundede celler og 0-0,5 blev taget til at udpege aflange celler. Ca. tre hundrede celler fra mindst tre uafhængige forsøg blev analyseret for hver data poin t. Statistiske forskelle blev beregnet baseret på enkelt faktor variansanalyse (ANOVA) hvor datasæt blev betragtet signifikant forskellige, når p <0,05.
Figur 1. Skematisk fremstilling af forberedelse polyacrylamid gel på fleksibel plastik støtte. Tallet repræsenterer de forskellige trin i forberedelsen af PA geler på fleksibel plastik støtte. Efter gelen tørrer helt, kan det skæres eller stanses i enhver ønskelig form. En hel dorn (~ diameter 6 mm) er mest praktisk, når fremstilling af geler til en 96-brønds plade, mens en tunge papirskærer kan anvendes til kvadratiske eller rektangulære former. Figuren viser også kanterne af brøndene, både med og uden en gel, for at påvise, at fuldstændig brøndbund dækning kan opnås med denne fremgangsmåde. OAD / 52643 / 52643fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Stivhed af PA hydrogeler som målt ved rheologi. (A) repræsentant Youngs modul for fem forskellige A & B koncentrationer (se tabel 1 for akronymer) (B) oplagring og tabsmodul som en funktion af frekvensen som målt ved rheologi; (C) geler udviser den samme Youngs modul oprindeligt (Initial) og efter at de er tørret og re-hydreret (Re-hydreret) uafhængig af koncentrationen polymerpræcursor. Alle geler til rheologi målingerne blev fremstillet som plader af 20 mm diameter og 1-1,5 mm højde (ved fuldstændig hævelse).
/52643fig3.jpg "/>
Figur 3. Kollagen belægning på PA geler. Kollagenet belægning (grøn) effektivt distribueres og fastholdes på PA-gel (rød) overflade uafhængig af hydrogel stivhed Youngs modul). Collagen mærket med Cy5 blev anvendt til disse data. Rød-fluorescerende kugler blev indlejret i PA hydrogel til støtte visualisering. Tværsnitsbilleder blev taget på et konfokalt mikroskop (skala bar = 100 um). Billede tilpasset fra Zustiak et. al. 5 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Fase kontrakt (øverste række) og fluorescerende (nederste række) billeder af MDA-MB-231-celler podet på PA geler i 24 timer. MDA-MB-231 celler forbliver runde på bløde geler (Young 7; s modul på 0,5 og 1 kPa), men langstrakt på stive PA geler (Youngs modul på 100 kPa). Cellerne blev podet på gelerne i 24 timer, fikseret i ethanol og farvet med acridinorange (AO - grøn) til at visualisere cellecytoplasmaet og DAPI (blå) til at visualisere cellekernen; skala bar = 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. cellespredning område og cirkulariteten er påvirket af stivheden af det underliggende substrat. (A) MDA-MB-231 cellespredning område er signifikant forøget på 100 kPa i modsætning til de 0,5 kPa geler. (B) Cell cirkularitet aftager med stigningen i PA gel stivhed. Stjerner udpege væsentlige forskelle; p <0,05.
Figur 6. Skematisk fremstilling af en alternativ fremstilling polyacrylamid gel på fleksibel plastik støtte. Tallet repræsenterer de forskellige trin i forberedelsen af PA geler på fleksibel plastik støtte. Her fleksibel plastik støtte indledningsvis forskåret i plast "dækglas" af en ønsket form og størrelse. Denne teknik virker bedst for bløde hydrogeler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Forkortelse | Akrylamid% | Bis-acrylamid% | Akrylamid fra 40% stamopløsning (ml) | Bis-acrylamid fra 2% stamopløsning (ml) | Vand (ml) | G '± SD (kPa) | E ± SD (kPa) |
| PA1 | 5 | 0,025 | 625 | 62,5 | 4.312,5 | 0,62 ± 0,19 | 1,85 ± 0,57 |
| PA2 | 5 | 0.1 | 625 | 250 | 4125 | 3,55 ± 0,12 | 10,64 ± 0,36 |
| PA3 | 8 | 0.1 | 1.000 | 250 | 3750 | 9,71 ± 0,64 | 29.14 ± 1,93 |
| PA4 | 8 | 0.25 | 1.000 | 625 | 3375 | 22.00 ± 2.10 | 66.01 ± 6,31 |
| PA5 | 12 | 0.25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37.42 ± 2,68 | 112,25 ± 8,03 |
Tabel 1. Koncentrationer af acrylamid (A) og tværbinder bis-acrylamid (B), og den resulterende PA gel stivhed. Stivhed, her repræsenteret ved G 'og E blev målt ved rheologi. G 'er opbevaringsmodul på 1 Hz frekvens. Youngs modulus, E, blev beregnet ud fra Eq. 1. Standard afvigelse (SD) blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg med 3-5 prøver målt per eksperiment. De akronymer i tabellen svarer til de forkortelser, der anvendes i figur 2A.
| UV-intensitet = 15 mW / cm2 | Eksponering tid = 300 sek | ||
| Tid (s) | E (kPa) ± SD | Itensitet (mW / cm2) | E (kPa) ± SD |
| 75 | 0,14 ± 0,03 | 15 | 28.05 ± 2,62 |
| 100 | 6,98 ± 2,34 | 26 | 21.13 ± 3.01 |
| 125 | 19.11 ± 2,29 | 37 | 20.01 ± 2,38 |
| 300 | 28.05 ± 2,62 | 66 | 19,35 ± 2,86 |
Tabel 2. UV polymerisation er en alternativ og en hurtigere metode til PA gelfremstillingen når geleringsegenskaber betingelser optimeres; PA3 (se tabel 1) gel er afbildet. Tabel opsummerer den resulterende Youngs modul, når enten eksponeringstid (venstre to kolonner) eller UV intensitet (højre to kolonner) er varierede i samme løsning. Baseret på resultaterne fra tabellen fremgår det, at 300 sek eksponeringstid og 15mW / cm2 UV-intensitet give højeste PA gel stivhed, der er sammenlignelig med stivheden af traditionelt polymeriserede gel som rapporteret i tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyacrylamidgeler oprindelig er udviklet til elektroforese 28 nu rutinemæssigt anvendes som celledyrkningssubstrater at undersøge virkningerne af substrat stivhed på cellemorfologi, motilitet og kommunikation 3,24,29 blandt andre celletyper egenskaber. Polyacrylamid tillader manipulation af substrat stivhed til at omfatte stivheden af alle bløde væv i kroppen (0,3-300 kPa) 1 med en simpel ændring i koncentration polymerpræcursor (figur 2, tabel 1, se også referencerne 17,25,26). Koblet til den omstændighed, at PA geler er forholdsvis billig og enkel at fremstille, er de blevet uundværlige platforme i studiet af stivhed afhængig celle-materiale interaktioner. Men selv om enkle, er den nuværende teknik til fremstilling PA geler begrænset til små partier. This begrænsninger skyldes karakteren af den hydrogel gelering, som er en fri radikal-polymerisation katalyseret af ammoniumpersulfatog TEMED. 30 Da reaktionen er en fri-radikal kædepolymerisation det kan inhiberes af ethvert element, der tjener som en fri radikal-fælde, såsom oxygen. Da ilt diffusion i polymeropløsningen skal undgås under polymeriseringen - hvilket kan tage op til 45 min for de blødeste gels - blot pipettering PA geler i en åben flerbrøndsplade ikke er mulig. Også til anvendelse som en todimensional (2D) celle-substrat, skal overfladen af PA gel være flad. Begge de ovennævnte krav dikterer, at for at producere PA geler som 2D cellesubstrater bør PA gel precursor opløsning klemt inde mellem to flade overflader under polymerisationen - at inhibere oxygendiffusion og flade geloverfladen. Derudover den øvre overflade skal være sådan, at det let kunne skrælle fra gelen udsætte overfladen for cellevedhæftning. Dette opnås typisk ved hydrofob coating af en glasoverflade. Endelig, når placeret i the brønde på en plade med flere brønde, bør PA geler dække hele godt overflade og forhindres i at flyde. Komplet godt bundflade dækning er især vigtigt i applikationer, hvor de assays, der anvendes til at vurdere de celler er den type, der tager hensyn til hele cellepopulationen i brønden (f.eks MTT). Hvis PA gel ikke i tilstrækkelig grad dækker hele godt overflade, skal der drages omsorg for at blokere celleadhæsion til den eksponerede såvel overflade som celler let kunne rulle af gelen på glas eller plastik. Hvis det er nødvendigt, BSA blokering efter standardprotokoller eller ved anvendelse af off-hylden BSA-baserede celleadhæsion blokerende kits bør være tilstrækkelig til at blokere cellebinding til bunden af pladen godt. For eksempel for at fremstille en BSA-dækket overflade, 0,5 mg / opløsning af BSA ml i PBS, pH 7,4, bør adsorberes på vævsdyrkningsskål i 20 minutter ved stuetemperatur, skyllet med PBS og anvendes straks eller opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger. BSA har vist sig at blokere celleadhæsion of mammale cellekulturer på både hydrofile og hydrofobe polystyrenoverflader ved kraftigt at reducere celleadhæsion kræfter som målt ved atomic force mikroskopi. 31 BSA har været anvendt rutinemæssigt til at blokere pattedyr celleadhæsion samt skabe celle mønstrede overflader. 32,33
Afbildet i denne artikel teknik, opfylder alle de ovennævnte krav, der tillader masseproduktion af ensartede PA geler af brugerdefineret størrelse og form. Teknikken er enklere og mere effektiv end den nuværende standard for sandwiching PA gel precursor opløsning mellem to dækglas. Desuden kræver det ikke nogen avanceret udstyr, og dermed er let anvendelig ved enhver forskningslaboratorium. Det er også mere omkostningseffektivt, da det ikke nødvendiggør brug af glasplader eller dækglas, som ikke kun er dyre, men også komme i begrænsede størrelser. Teknikken er også hurtigere af flere grunde. For det første betyder det ikke indebærer nogen forbehandlingstrintypisk for glasoverflader siden fleksibel plastik støtte er udformet med to forskellige overflader - en hydrofil side, der permanent tillægger polyacrylamid og en hydrofob side, der let kunne skrælles efter geldannelse. For det andet, fordi plast støtte er fleksibel, er det lettere og hurtigere at skrælle den dannede gel: når der dannes tynde geler mellem to glasplader, skrælning toppen hydrofobe slide er vanskelig og ofte resulterer i brud, der også bringer gelen. Endelig, på grund af den fleksible plastunderlag gennemsigtighed, hurtigere UV polymerisation kan anvendes i modsætning til standard TEMED-baserede polymerisation, som kan tage så meget som 45 minutter (tabel 2). Dataene i tabel 2 viser, at når polymerisation tid og UV-lys intensitet er optimeret lignende stivhed kan opnås ved både TEMED og UV polymerisationsmetoder.
Hydrogelerne udarbejdes på fleksibel plASTIC støtte som afbildet på figur 1. Det anbefales at udføre geleringen i et afgasningskammer at undgå ufuldstændig polymerisation af gelen kanter (dvs. randeffekter) på grund af oxygen diffusion mellem de to overflader, der sandwich polymeropløsningen. Målet er at skabe et stort hydrogel film på toppen af den fleksible plastunderlag således glasplade af enhver størrelse ville være passende, men det vil diktere størrelsen af polyacrylamid film, der kan opnås. Glasset kan være belagt med et hydrofobt overtræk eller alternativt kan den hydrofobe side af den fleksible plast støtte anvendes i stedet. Når en PA gel film dannes, tørres det, skæres i ønskede former, og derefter re-hydreret før brug. Når tør, kan gelerne opbevares på ubestemt tid. Det blev bekræftet af rheologi, at PA gel stivhed er uændret efter rehydrering, selv når gelerne er lagret i tør tilstand i flere måneder (figur 2C). Men for meget soft geler (≤ 1 kPa i Youngs modul) tørring og re-hydrering forværre overflade krøl og revnedannelse. Denne adfærd er almindeligt for bløde geler, der gennemgår de-hydrering og efterfølgende re-hydrering samtidig være geometrisk begrænset. 34,35 Ikke alle geler krølle eller crack, således er det muligt visuelt at undersøge hydrogelerne inden brug og kun bruge prøverne at vise en glat overflade. Helt at undgå folder dannelse og revner, en alternativ fremgangsmåde til fremstilling af bløde hydrogeler er afbildet på figur 6. Her fleksibel plastik støtte forskårne i den ønskede form og PA gel er dannet på toppen, således gelerne ikke skal de-hydreret, men kan anvendes som fremstillet. En ekstra fordel ved denne alternative strategi er, at ~ 2,5 flere geler kan fremstilles af den samme mængde hydrogel forstadie opløsning (skønnet er baseret på at forberede geler til en standard 96-brønds plade, som beskrevet i protokollen afsnit). En forsigtig nårfremstilling hydrogeler på denne måde er at sørge for at undgå oxygen infiltration, især geler af mindre størrelse (fx til geler anvendes i en plade med 96 brønde). Selv når gelforstadiet opløsning er fuldstændig afgasset, dvs. oxygenfrit, oxygen vil diffundere mellem de to overflader, der sandwich PA opløsningen. For således at undgå kanteffekter eller ufuldstændig geldannelse langs kanterne, er det bedst at lade polymerisationen ske i fravær af oxygen. Det er vores erfaring, et vakuumkammer fungerer godt, selvom en inaktiv gas miljø kan anvendes med lige stor succes.
Et sidste forsigtighed ved udarbejdelsen PA hydrogeler som cellesubstrater at teste stivhed afhængig celle-responser, er, at tykkelsen af den resulterende hydrogel er vigtig: for meget tynde geler er cellerne i stand til at fornemme det underliggende substrat 36 Brug teori og eksperiment. Lin et al. viste, at den dybde, hvor celler kan feel det underliggende substrat er afhængig af den laterale dimension af cellen. 29 Da aktuelle forskning er modstridende, identificerer det krævede minimum tykkelse for at forhindre cellerne i at afføle "skjulte" substrat at være fra flere mikrometer 36 til så meget som 60 mikron, 37 en gel tykkelse på 100 um minimum bør tilstræbes.
Ved montering af PA geler i en flerbrøndsplade, er en lille dråbe af PDMS anvendes til at sikre gelen til bunden af brønden. PDMS blev valgt, fordi det fungerer som permanent lim ved hærdning, det er helt gennemsigtig og ikke interfererer med efterfølgende mikroskopi eksperimenter, er det fuldt ikke-cytotoksisk, og det hærder i ca. 4-8 timer efterlader tilstrækkelig tid til pladesamling. Sikker fastgørelse hydrogelerne til bunden af brønden hjælpemidler i celle håndtering: for eksempel kunne kraftig vask fjerne hydrogeler hvis ikke godt fast. Hvis hyppige ændringer i celle medier ikke er et problem, så gelerne kunne midlertidigt fastgjort til brøndens overflade af en lille dråbe af en ikke-cytotoksiske og højviskos væske, såsom glycerin.
De sidste trin før cellepodning involverer ECM belægning af gelen og derefter sterilisering. Her Collagen Type I coating er afbildet (Figur 3), selv om den samme teknik kan anvendes til andre ECM protein. Det bi-funktionelle tværbindingsmiddel sulfo-SANPAH anvendes til at opnå en endnu monolag pels. Tidligere forskning har vist, at en sådan kovalent binding giver en mere ensartet coating end simpel protein adsorption og giver også mulighed for en 12-fold tuning af mængden af protein bundet ved blot anvendelse af et protein opløsning af varierende koncentration. 6 Endelig samles flerbrøndspladens gelpladen steriliseres under UV i vævskultur hætte op til 2 timer. UV sterilisering tillader assayet at samles på et laboratorium bænk uden hætten, somgør processen logistisk enklere og samlet hurtigere.
Figur 4 og 5 illustrerer nogle repræsentative resultater fra brystkræft MDA-MB-231 celler dyrket på fleksible plastunderlag-bundet PA geler af forskellig stivhed. MDA-MB-231-celler blev udvalgt til at demonstrere metoden nytte, fordi de har vist sig at reagere på det underliggende substrat stivhed ved målelige ændringer i deres morfologi. 5,12 Som forventet, blev cellerne mere aflang og havde en større spredning område på de stive 100 kPa PA geler sammenlignet med de bløde 0,5 og 1 kPa PA geler (figur 4 og 5). Den nederste række på figur 4 viser også anvendelsen af to fluorescerende farvestoffer pletten cellekernen og cellecytoplasma, fremvisning, at fleksibel plastik støtte ikke interfererer med fluorescensmikroskop billeddannelse.
Sammenfattende en simpel metode forberede polyacrylamid hydrogeler i enflerbrøndsplade format præsenteres. Teknikken er hurtigere, mere effektiv og mindre kostbar end de nuværende metoder til fremstilling af PA geler skal anvendes som cellesubstrater såvel som muliggør fremstilling af geler af brugerdefinerede størrelser ellers ikke tilgængelig. Da det ikke kræver nogen specialudstyr, kan metoden let vedtaget af enhver forskningslaboratorium og vil være særligt nyttig i forskning fokuseret på at forstå stivhed-afhængige celle responser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
- Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
