Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52643

Introduction

De meeste lichaamsweefsels zijn zacht visco-elastisch materiaal met een elasticiteitsmodulus van 0,1 kPa hersenen 100 kPa zachte kraakbeen, maar de meeste in vitro-onderzoek verricht naar weefselkweek polystyreen (TCP) dat een modulus van ~ 1 GPa heeft . 1 Deze stijfheid mismatch grote invloed op de manier waarop cellen reageren op hun omgeving. Een groeiende hoeveelheid onderzoek is dus gewijd aan het ophelderen van het effect van substraat stijfheid over het lot van verscheidene celtypen, waaronder 2,3 stamcellen. 4 Daardoor zijn verschillende hydrogels ontwikkeld om te helpen bij het ​​begrijpen van stijfheid-afhankelijke cellijn biologie waaronder polyacrylamide (PA), 5-7 polyethyleenglycol (PEG), 8,9 polydimethylsiloxaan (PDMS), 10 en alginaat. 11 Hoewel het bewijs dat substraat stijfheid heeft een aanzienlijke impact op de lot van de cel groeit, de meeste studies zijn uitgevoerd op kleine schaal met een klein aantal jarenamples. Systematische, multidimensionale studies naar het effect van substraat stijfheid voor een serie van celtypen of milieuomstandigheden zijn zeldzaam. 12

Verscheidene veelbelovende high-throughput hydrogel technieken ontwikkeld, zoals PEG-gebaseerde microarrays, 13 microfluïdische inrichtingen voor de productie van agarose hydrogel microbolletjes, 14 of micro- en nano-stangen waar stijfheid wordt gemoduleerd door de diameter en hoogte van de microrods. 15 Nochtans , de technologieën voor te bereiden dergelijke substraten zijn verfijnde en beschikbaar voor een beperkt aantal laboratoria. Veel onderzoek met stijfheid gemoduleerd celresponsen gebruik polyacrylamide (PA) gels die niet alleen goedkoop en eenvoudig te implementeren, maar vertonen ook een fysiologisch relevant bereik van Young's modulus, namelijk 0,3 -. 300 kPa 16-22 De bestaande werkwijzen te vervaardigen PA gels voor celcultuur zijn arbeidsintensief en dus prepared in kleine batches. Enkele moeilijkheden bij de bereiding van PA gels celsubstraten voort uit het vereiste dat de gels worden bereid: 1) in afwezigheid van zuurstof om volledige polymerisatie mogelijk, 2) met een vlakke oppervlakte uniforme cel toe hechting en verspreiding, en 3) vast aan de onderkant van de celkweekschaal te voorkomen drijven.

Verschillende groepen hebben geprobeerd om PA gels voor celcultuur te produceren in grote batches. Semler et al. Bereide dikke vellen PA gels waarvan vervolgens "cut" met een perforator en geplaatst in 96-well platen. 23 Deze methode is beperkt tot stijver gels, namelijk> 1 kPa in Young's modulus, want zachter gels zijn "sticky", moeilijk te snijden en gemakkelijk beschadigd. Mih et al. Ontwikkelden een meer geavanceerde techniek waardoor de gels rechtstreeks worden gepolymeriseerd glazen bodem multi- putjesplaat. 6 Hoewel veelbelovend, lichte voorsprong effecten werden nog waargenomen met deze techniek. Daarnaast is de techniek vereist een speciaal ontworpen matrix niet onmiddellijk door veel laboratoria en kostbare glazen bodem putjes.

Dit artikel beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om PA gels monteren in een plaat met meerdere putjes die door elk laboratorium gemakkelijk kunnen worden vastgesteld. Hier wordt een flexibele kunststof gebruikte drager, die twee kanten heeft - een hydrofoob is, dat afweermiddel voor PA gels, en een hydrofiele, die covalent bindt PA gel op afzetting. Zodra PA gel platen worden gedeponeerd en permanent aangebracht op de flexibele kunststof steun, maakt het hanteren van gels van elke dikte of stijfheid en snij ze in elke gewenste vorm. Dit ca.oach produceert niet alleen de aangepaste plastic 'coverslips' in de maten anders niet in de handel verkrijgbaar, maar voorkomt ook de noodzaak om glasoppervlakken-treat pre, ofwel dekglaasjes of de putten van dure glazen bodem putjes, met een PA binding oplossing, dat is een vervelende en tijdrovende stap. Tenslotte kan uniform PA gels platen worden bereid in grote series en opgeslagen de gehydrateerde enkele maanden.

Kortom, de assay hier gepresenteerde is een verbetering over bestaande werkwijzen in verschillende aspecten. Ten eerste, het proces van multi-putjesplaat samenstel efficiënt, en de totale kosten van de benodigde materialen is laag. Ten tweede worden de hydrogelen in grote batches in een homogene gel film. Tenslotte uitsluitend materialen die commercieel verkrijgbaar zijn vereist. De bruikbaarheid van de test wordt geïllustreerd door onderzoeken van het effect van substraat stijfheid op celmorfologie en verspreidingsgebied.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van Hydrogel-geassocieerde oplossingen en Aliquots

  1. Bereiding van polyacrylamide gel precursor oplossing.
    1. Bereid polyacrylamide gel precursor oplossing door mengen acrylamide (A) (40% w / v, M r 71,08 g / mol), de crosslinker bisacrylamide (B) (2% w / v, M r 154,17 g / mol), en de- geïoniseerd water in het volume percentages in tabel 1.
      Opmerking: Deze oplossingen kunnen worden bereid in grote hoeveelheden en bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
      1. WAARSCHUWING: Acrylamide toxisch bij inhalatie of inname, vooral wanneer in poedervorm dus gebruik bij voorkeur 40% w / v oplossing toxiciteit risico's. Behandelen alleen tijdens het dragen van beschermende kleding, zoals handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Bewaren in een licht-bestendig, goed gesloten verpakking in de koelkast (<23 ° C, goed geventileerde ruimte).
      2. LET OP: Bis-acrylamide is giftig bij inademing of inname, in het bijzonder,wanneer in poedervorm dus gebruik bij voorkeur 2% w / v oplossing toxiciteit risico's. Behandelen alleen tijdens het dragen van beschermende kleding, zoals handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Bewaren in een licht-bestendig, goed gesloten verpakking in de koelkast (<4 ° C, goed geventileerde ruimte).
  2. Voorbereiding en het gebruik van N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrofenylamino) hexanoaat (Sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) porties. LET OP: Sulfo-SANPAH veroorzaakt ernstige oogirritatie; handvat met handschoenen en een goede oog- of gelaatsbescherming. Bewaren bij -20 ° C na ontvangst en voor aliquoteren.
    1. Om sulfo-SANPAH opslaan: los sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) bij 50 mg / ml. Aliquot de stockoplossing in 50 micro centrifuge buizen van 20 ui per buis. Flash bevriezing op droog ijs of vloeibare stikstof (optioneel maar voorkeursstap maximale verknopingsmiddel efficiëntie behouden) en bewaar bij -80 ° C.
      OPMERKING: De porties can worden opgeslagen voor enkele maanden.
    2. Om sulfo-SANPAH gebruiken: ontdooien de hoeveelheid kort en verdund in 480 ul van gedeïoniseerd water. Onmiddellijk gebruiken. Sulfo-SANPAH hydrolyseert snel in water: dus voorzichtigheid te nemen om al het bovenstaande stappen snel uit te voeren.
  3. Bereiding van ammoniumpersulfaat (Mr 228,18 g / mol) hoeveelheden.
    OPMERKING: Ammoniumpersulfaat veroorzaakt ogen, huid en irritatie van de luchtwegen. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren. Handvat ammoniumpersulfaat poeder in een zuurkast. Bewaren poeder in een droge, goed geventileerde plaats. Eenmaal porties verdeeld, kan de verdunde oplossing worden gebruikt op de werkbank.
    1. Los ammoniumpersulfaat in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke ammoniumpersulfaat concentratie van 10% g / v te bereiken. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. Ontdooi onmiddellijk voor gebruik.
  4. Bereiding van collageen type I oplossing.
    1. Bereid 0,2 mg / ml collageen oplossing door verdunning van de voorraad, zodatlutie in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4. Slaan op ijs kort of onmiddellijk gebruik na verdunning.

2. Hydrogel Voorbereiding (zie Figuur 1)

  1. Bereiding van hydrofobe glasplaatjes.
    1. Plaats een paar druppels van een hydrofobe oplossing op een glasplaat en gebruik tissue verspreid over het oppervlak. Laat aan de lucht drogen en veeg met een papieren zakdoekje weer om zelfs uit de hydrofobe coating.
      OPMERKING: Bewaren hydrofobe oplossing in een brandbare kast bij RT. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren. Werk in een goed geventileerde ruimte.
  2. Voorbereiding van flexibele kunststof steun.
    1. Snij de flexibele plastic steun aan de grootte van de hydrofobe beklede glasplaat passen.
    2. Markeren de hydrofobe kant van de flexibele plastic steun door licht krassen op het oppervlak met een scherp voorwerp, zoals een scalpel.
      OPMERKING: Zodra de gel - en dat is volledig transparant - Dries, De krassen zal helpen onderscheiden welke flexibele kunststof steun kant bevat de gel.
      OPMERKING: De flexibele plastic drager een hydrofoob en een hydrofiel kant. Eenmaal afgezet, polyacrylamide permanent houdt zich aan de hydrofiele kant van de plastic steun die gemakkelijk daaropvolgende hydrogel hantering vergemakkelijkt.
  3. Gel Bereiding (bijvoorbeeld volumes gegeven 5 ml gel precursor toegevoegd).
    OPMERKING: 5 ml voldoende is om ~ 40 gels zou zijn wanneer de gel oorspronkelijke dikte is 0,5 mm. Meer gels kunnen ontstaan ​​indien de gel dikte wordt verminderd.
    1. Plaats 4972,5 ui polyacrylamide precursor oplossing gewenste eindconcentratie (tabel 1) in een 50 ml conische buis. Plaats in een ontgassingskamer gedurende 30 min met de dop geopend.
      OPMERKING: Zuurstof fungeert als een vrije radicalen vanger en, indien aanwezig, het remt polymerisatie.
    2. Voeg 25 ul van 10% w / v ammoniumpersulfaat (zie punt 1.3) tot een uiteindelijke bereikenammoniumpersulfaat concentratie van 0,05%.
    3. Voeg 2,5 gl N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED, M r 116,24 g / mol) aan de ontgaste gel oplossing tot een uiteindelijke TEMED concentratie van 0,5% te bereiken.
      OPMERKING: Bewaren TEMED in een brandbare kast bij RT. Hanteer in een zuurkast bij het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Goed gesloten houden onder inert gas, want het is zeer lucht en vocht gevoelig.
    4. Meng de oplossing voorzichtig door en neer te pipetteren 3-5 keer. Niet vortex diffusie van zuurstof in de gel precursor oplossing voorkomen.
    5. Pipetteer de gel oplossing op de hydrofiele kant van de flexibele plastic steun en sandwich met hydrofobe coating glasplaatje. Scheid de twee dia met siliconen afstandhouders van gewenste dikte (bijvoorbeeld 0,5 mm). Laat een kleine hoeveelheid (-100 pl) polymeer precursor oplossing in de 50 ml conische buis te gebruiken als een indicator van gelering.
      OPMERKING:Elke spacer worden gebruikt. Bijvoorbeeld, een enkele strook van Parafilm geeft een definitieve gezwollen gel dikte van 100-120 urn.
    6. Plaats een andere glasplaat boven op de flexibele plastic support / gel-sandwich tot een nog hydrogel oppervlak nagaan bij polymerisatie.
    7. Laat de gel polymeriseren gedurende 45 min, hoewel minder tijd kan worden gebruikt voor gels hoger% gew indien gewenst. Ervan te vergewissen dat de gel is gepolymeriseerd, observeert de resterende oplossing in de 50 ml conische buis; indien de resterende oplossing gegeleerd, dan is het waarschijnlijk dat gelering op de glasplaat is ook geïnitieerd. Merk echter op dat voortijdige opening van de mal wordt voorkomen dat volledige polymerisatie.
    8. Zodra de gel wordt gevormd, schil van de flexibele plastic ondersteuning met het covalent gebonden polyacrylamidegel- op de top, en stel gel-side-up aan de lucht drogen.
      OPMERKING: Convectie of warmte drogen kan ook worden gebruikt om deze stap te versnellen. Eenmaal gedroogd op de flexibele kunststof steun, kan de gel winkelonbepaalde tijd d.
      1. Markeert geen kale plekken van de flexibele plastic steun, waar polyacrylamidegelen vormden geen gevolg van bubbels. Mark, terwijl de gel wordt nog steeds gehydrateerd, omdat dit zal in combinatie met de flexibele kunststof voor ondersteuning zodra de gel droog is.

3. Multiwell Plate Assembly, Collageen Coating, en Sterilisatie

  1. Multiwell plaat montage.
    1. Eenmaal gedroogd, gesneden PA gels in de gewenste vorm.
      1. Voor een 96-well plaat, gebruik maken van een heavy-duty perforator met een diameter van ~ 6 mm. Gebruik een heavy-duty papiersnijder te gels gesneden in vierkante of rechthoekige vormen. U kunt ook gebruik maken van een schaar.
    2. Bereid ongeveer 500 pl PDMS per plaat met 96 putjes volgens de instructies van de fabrikant. Om de gels aan de bodem van een multi-putjesplaat lijm, plaats een kleine druppel (~ 5 pl) van polydimethylsiloxaan (PDMS) in het midden van elk putje. Met behulp van een tang, plaats een polyacrylamidee gel in elk putje, flexibele plastic steun naar beneden. Toestaan ​​PDMS uitharden, laat de gemonteerde plaat bij 37 ° C gedurende minimaal 4 uur.
  2. Collageen coating van polyacrylamide gels.
    1. Met een transfer pipet, plaats een kleine hoeveelheid (7-8 pl) van sulfo-SANPAH (zie punt 1.2.2) goed en werveling in elk van links naar rechts om de vacht van de gel oppervlak gelijkmatig. Werken prompt sinds sulfo-SANPAH is niet stabiel in het water.
    2. Plaats de wells plaat onder een UV-lamp met hoge intensiteit (intensiteit = 37 mW, λ = 302-365 nm) gedurende 5 min. Spoel de gels met PBS om overtollig sulfo-SANPAH verwijderen.
    3. Pipetteer 50 ul van 0,2 mg / ml collageen type I oplossing (zie punt 1.4) in elk putje. Laat de plaat afgedekt bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur of O / N bij 4 ° C.
      OPMERKING: Om het proces te versnellen van collageen coating, kan een transfer pipet worden gebruikt om de collageen-oplossing toe te voegen. Typisch, 1 - 2 druppels dient oplossing genoeg voltooienly bedekken de gel oppervlak.
    4. Laat de put plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur aan collageen binding staan.
    5. Spoelen met PBS om het teveel aan collageen oplossing te verwijderen en te steriliseren onder UV (λ = 200 nm) in een weefselkweek kap voor 2 uur.
    6. Week de gels in compleet medium (zie paragraaf 4.1 voor de samenstelling van het medium) O / N om te hydrateren en evenwicht. Gebruiken voor cell onmiddellijk of op te slaan zaaien in de koelkast tot 2 dagen.

4. Cell Zaaien op PA Stijfheid Assay

Opmerking Hoewel typisch voor zachte zoogdiercellijnen, het protocol beschreven in dit gedeelte wordt specifiek gebruikt met borstkanker MDA-MB-231 cellijn (zie figuren 4 en 5).

  1. Verzamel cellen van weefselkweek kolf blootstelling aan 5% trypsine / EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Gebruik ~ 80 ul van trypsine / EDTA per elke cm 2 van de kolf gebied; bijvoorbeeld, gebruik 2 ml trypsine / EDTA fora T25 celkweekkolf. Resuspendeer verzamelde cellen in compleet medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine bij een gewenste uiteindelijke celconcentratie. Gezien cel verdubbelingstijd en de tijd de cellen worden gezaaid op de assay Kies een geschikte sub-confluente celconcentratie. Ervoor zorgen dat de toegevoegde medium is genoeg om helemaal onder te dompelen de hydrogels.
    OPMERKING: Aangezien hydrogelen werden vooraf geëquilibreerd in media (zie 3.2.6 stap) 100 pl volume voldoende zijn. Typische medium volumes voor putjes moeten toereikend, omdat de gels werden vooraf geëquilibreerd in media in de vorige stap.
    OPMERKING: De test geschikt voor elke attachment-afhankelijke celtype zou zijn.
    1. Telling aantal cellen onder een omgekeerde microscoop met behulp van een hemacytometer. Load 10 ul van celsuspensie in elk hemacytometer poort en het gemiddelde van het aantal cellen van ten minste 8 kwadranten. Om het te krijgeneindcelconcentratie, vermenigvuldig het aantal cellen met 10 4.
      OPMERKING: Beste celgetal resultaten worden verkregen als het aantal cellen in elke hemacytometer kwadrant is 20-50.
  2. Kweek van de cellen op de PA stijfheid assay in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Veranderen media elke 2-3 dagen. Verzamel cellen indien nodig door blootstelling aan 5% trypsine / EDTA bij 37 ° C gedurende 5 min. Gebruik ~ 80 ul van trypsine / EDTA per cm2 van weefselkweek kolf. Tijdens alle cel manipulatie stappen te nemen speciale zorg van de hydrogel oppervlak niet te verstoren: aspireren of pipet medium door lichtjes kantelen van de multi- plaat zijwaarts en aanraken van de pipet op de zijwand van elk putje, in tegenstelling tot het aanraken van de hydrogel.
    OPMERKING: Behalve lettend de hydrogel oppervlak tijdens standaard weefselkweek behandeling niet te beschadigen, de cellen gezaaid op de stijfheid test kan worden gemanipuleerd op dezelfde wijze als wanneer zij werden geënt opnaar een reguliere meerdere putjes plaat.

5. Beeldvorming van cellen gezaaid op PA Stijfheid Assay

  1. Afbeelding cellen direct aan de PA stijfheid test.
    OPMERKING: microscoop - omgekeerd, fluorescent, of confocale kunnen worden gebruikt cell imaging.
    OPMERKING: De flexibele kunststof steun gebruikt om de stijfheid test te construeren is volledig transparant en niet autofluoresce of interfereren met cell imaging. Echter, hoewel de flexibele kunststof drager zelf transparant, grafische mogelijkheden beperkt door de werkafstand van de doelstelling. De flexibele kunststof drager heeft een dikte van 0,23 mm en een typische werkafstand van een 10X objectief is ~ 4 mm, sterk dalende hogere vergrotingen.
    1. Voor live cell imaging, positie PA stijfheid test in microscoop plaathouder en imago. Houd beeldvorming sessies onder de 2 uur, of gebruik een microscoop voorzien van een milieu-kamer voor langere belichtingstijden.
    2. Wanneer levende cellen imaging is niet het doel, te repareren cellen in 4% formaldehyde-oplossing aangevuld met 0,1% wasmiddel. Geniet cellen in fixeermiddel bij kamertemperatuur gedurende minimaal 2 uur. Spoelen met PBS twee keer. Gooi fixatief afval in een aangewezen afvalcontainer.
      OPMERKING: Cellen kunnen direct worden afgebeeld of opgeslagen ondergedompeld in PBS bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. LET OP: Formaldehyde is giftig bij inademing en contact. Handvat met handschoenen in een zuurkast.
      OPMERKING: Cel fixatie protocol worden gekozen op basis van de volgende cel kleuring en behandeling protocollen, omdat sommige fixeermiddelen beschadigen enkele cel eiwitten.
    3. Voor fluorescerende beeldvorming, vlek vaste cellen met gewenste cel vlek direct in de multi- plaat. Afbeelding onmiddellijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Polyacrylamide (PA) hydrogels worden wijd gebruikt om stijfheid afhankelijke cel responsen testen. 17,24 Door het mengen verschillende concentraties van acrylamide (A) en bis-acrylamide (B) kan PA gels die de stijfheidsgebied meeste zachte weefsels omvatten maken het lichaam - 0,3 -.. 300 kPa Young's modulus 1 evenwel bereiding van polyacrylamidegels is vervelend en tijdrovend, vaak beperkt hun bruikbaarheid in "high-throughput" toepassingen zoals bijvoorbeeld drug discovery 12 Hier een eenvoudige en snelle methode voor montage PA gels in multi-well platen of andere gewenste weefselkweekvat gepresenteerd (figuur 1). Figuur 2A toont de Young's modulus als functie van verschillende A en B concentraties (ook samengevat in Tabel 1). De moduli van meer A en B combinaties worden in de literatuur. 17,25,26 De gel stijfheid volledig swollen gelen werd gemeten door reologie (AR 2000EX reometer, TA Instruments) met een 20 mm bovenste parallelle geometrie oscillerende frequentie sweep proef 1 - 10 Hz en 2% constante spanning. Zoals verwacht, werd aangetoond dat zowel de opslagmodulus, G ', en verlies modulus, G', onafhankelijk van de frequentie (figuur 2B). Ook werd bevestigd dat drogen en opnieuw hydrateren de gels niet van invloed hun Young modulus (figuur 2C). Young's modulus was gerelateerd aan de opslagmodulus van de volgende vergelijking:
Vergelijking 1

waarin E is Young's modulus en v de Poisson-verhouding die werd benaderd 0,5 PA gels. 27 Merk op dat de gerapporteerde waarden voor hydrogelen bereid met TEMED. PA hydrogelen kunnen ook worden bereid door UV crosslinking wanneer belichtingstijd en UV intensiteit geoptimaliseerd ( 27 andere werkwijzen zoals atomic force microscopie 5,7 zijn ook geschikt. Polyacrylamide hydrogels alleen zijn inert; Zo mag ontlokken celhechting extracellulaire matrix moleculen afzonderlijk worden toegevoegd. Collageen type I gekozen voor hydrogel coating, maar de methode kan worden gebruikt voor het coaten andere extracellulaire matrix (ECM) eiwitten van keuze. Figuur 3 toont dat door de crosslinker sulfo-SANPAH een gelijkmatige collageen bekleding op hydrogels van stijfheid kan worden bereikt. 5

Verder werd aangetoond dat cellen gezaaid op hydrogels verschillende stiffness tentoongesteld verschillende morfologie. Voor dit experiment werden borstkanker MDA-MB-231 cellen uitgezaaid bovenop de PA gels 24-72 uur. Cellen werden gekweekt in RPMI medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Cellen werden gezaaid met 1 x 10 5 cellen / ml of 1 x 10 4 cellen / putje voor een 96-wells plaat. Dit is een typische cel zaaidichtheid - 4-voudig lager dan de confluentie celdichtheid, wanneer confluentie een zoogdiercellijn is bereikt ~ 1 x 10 5 cellen / cm2. Foto's werden genomen op omgekeerde fluorescentiemicroscoop en geanalyseerd op ImageJ via de Shape Descriptor en omgeving software plug-ins. Er werd waargenomen dat na enting PA gels 24 uur, borstkanker MDA-MB-231 cellen bleven rond de zachte 0,5 en 1 kPa gels, maar konden verspreiden en verlengen de stijve 100 kPa gel (figuur 4). Figuur 4 showcas ookes dat hydrogels die bovenop de flexibele drager van kunststof transparant en zorgen voor een gemakkelijke visualisatie en microscopie. Voorts is de flexibele drager van kunststof niet autofluoresce en dus niet interfereert met de beeldvorming van fluorescent gelabelde cellen. Celmorfologie werd verder gekwantificeerd in termen van algemene cel verspreiden gebied en mobiele vormfactor - circulariteit (Figuur 5). Cell verspreidingsgebied werd gemeten door een masker om de omtrek van elke cel traceren. Cel vorm (rondheid) werd vervolgens berekend uit de volgende relatie:
Vergelijking 1

Cirkelvormigheid wordt gemeten op een schaal van 0-1, waarbij 0,6-1 werden naar afgeronde cellen aan te wijzen en 0-0,5 werden genomen om de langgerekte cellen wijzen. Ongeveer driehonderd cellen uit ten minste drie onafhankelijke experimenten werden geanalyseerd voor elke data poin t. Statistische verschillen werden berekend op basis van factor variantieanalyse (ANOVA) wanneer gegevens werden als significant verschillend bij p <0,05.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van polyacrylamide gel preparaat flexibele kunststof drager. De figuur geeft de verschillende stappen van de bereiding van PA gels flexibele drager van kunststof. Nadat de gel droogt volledig kan worden gesneden of gestanst in elke gewenste vorm. Een hele pons (~ 6 mm diameter) is meest geschikt bij de voorbereiding gels een 96-well plaat, terwijl een zware papiersnijder kan worden gebruikt voor vierkante of rechthoekige vormen. De figuur wijst ook op de randen van de putten, zowel met als zonder een gel te tonen dat volledige wellbodem dekking kan worden bereikt met deze methode. OAD / 52643 / 52643fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Stijfheid van PA hydrogelen zoals gemeten door reologie. (A) Representatieve Young's modulus vijf verschillende A & B concentraties (zie tabel 1 voor de afkortingen), (B) opslag en verlies modulus als functie van de frequentie gemeten door reologie, (C) gels vertonen dezelfde elasticiteitsmodulus initieel (Initial) en nadat zij zijn gedroogd en opnieuw gehydrateerd (gerehydrateerd) onafhankelijk van polymeer precursor concentratie. Alle gels de reologie metingen werden bereid zoals platen van 20 mm diameter en 1-1,5 mm hoogte (na volledige zwelling).

/52643fig3.jpg "/>
Figuur 3. Collageen coating PA gels. Het collageen bekleding (groen) efficiënt verdeeld en bewaard op de PA gel (rood) oppervlak onafhankelijk van hydrogel stijfheid Young's modulus). Collageen gelabeld met Cy5 werd gebruikt voor deze gegevens. Rood-fluorescerende kralen werden ingebed in de PA hydrogel om hulp visualisatie. Dwarsdoorsnedebeelden werden genomen op een confocale microscoop (schaalbalk = 100 pm). Afbeelding aangepast van Zustiak et. al. 5 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Fase contract (bovenste rij) en TL (onderste rij) beelden van MDA-MB-231 cellen gezaaid op de PA gels gedurende 24 uur. MDA-MB-231 cellen blijven ronde op zachte gels (Young 7; s modulus van 0,5 en 1 kPa), maar langwerpig op stijve PA gels (Young's modulus van 100 kPa). De cellen werden op de gels gedurende 24 uur, in ethanol gefixeerd en gekleurd met acridine oranje (AO - groen) het cytoplasma en DAPI (blauw) naar celkern visualiseren visualiseren; schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. celspreiding stippellijn circulariteit worden beïnvloed door de stijfheid van het onderliggende substraat. (A) MDA-MB-231 cellen verspreidingsgebied aanzienlijk verhoogd op 100 kPa in tegenstelling tot de 0,5 kPa gels. (B) Cell circulariteit afneemt met toename PA gel stijfheid. Sterretjes duiden significante verschillen; p <0,05.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figuur 6
Figuur 6. Schematische weergave van een alternatieve polyacrylamidegel preparaat flexibele kunststof drager. De figuur geeft de verschillende stappen van de bereiding van PA gels flexibele drager van kunststof. Hier de flexibele kunststof drager eerst pre-cut in plastic "dekglaasjes" van een gewenste vorm en grootte. Deze techniek werkt het beste voor zachte hydrogels. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Acroniem Acrylamide% Bis-acrylamide% Acrylamide van 40% voorraad-oplossing (ml) Bis-acrylamide van 2% stockoplossing (ml) Water (ml) G '± SD (kPa) E ± SD (kPa)
PA1 5 0.025 625 62.5 4312,5 0,62 ± 0,19 1.85 ± 0.57
PA2 5 0.1 625 250 4125 3.55 ± 0.12 10.64 ± 0.36
PA3 8 0.1 1000 250 3750 9.71 ± 0.64 29.14 ± 1.93
PA4 8 0.25 1000 625 3375 22.00 ± 2.10 66.01 ± 6.31
PA5 12 0.25 1,500 625 2875 37.42 ± 2.68 112,25 ± 8,03

Tabel 1. Concentraties van acrylamide (A) en crosslinker bis-acrylamide (B) en de resulterende PA gel stijfheid. Stijfheid, hier door G en E vertegenwoordigde, werd gemeten door reologie. G 'is de opslagmodulus 1 Hz frequentie. Young's modulus, E, werd berekend uit verg. 1. Standaard deviatie (SD) werd berekend op basis van drie onafhankelijke experimenten met 3-5 monsters gemeten per experiment. De afkortingen in de tabel komen overeen met de acroniemen die in figuur 2A.

UV-intensiteit = 15 mW / cm2 Belichtingstijd = 300 sec
Tijd (s) E (kPa) ± SD Inintensiteit (mW / cm2) E (kPa) ± SD
75 0,14 ± 0,03 15 28.05 ± 2.62
100 6.98 ± 2.34 26 21.13 ± 3.01
125 19.11 ± 2.29 37 20.01 ± 2.38
300 28.05 ± 2.62 66 19.35 ± 2.86

Tabel 2. UV polymerisatie is een alternatief en een snellere methode voor PA gelbereiding wanneer geleren voorwaarden wordt geoptimaliseerd; PA3 (zie tabel 1) gel afgebeeld. Tabel vat de resulterende elasticiteitsmodulus wanneer ofwel blootstelling (linker twee kolommen) of UV-intensiteit (rechter twee kolommen) worden gevarieerd voor dezelfde oplossing. Gebaseerd op de resultaten uit de tabel blijkt dat 300 sec belichtingstijd en 15mW / cm2 UV-intensiteit geeft de hoogste PA gel stijfheid vergelijkbaar met de stijfheid van de traditioneel gepolymeriseerde gel volgens tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Polyacrylamide gels, oorspronkelijk ontwikkeld voor elektroforese, 28 worden nu routinematig gebruikt als celkweek substraten om de effecten van substraat stijfheid op celmorfologie, beweeglijkheid en communicatie 3,24,29 onder celeigenschappen bestuderen. Polyacrylamide staat manipulatie substraat stijfheid om de stijfheid van alle zachte weefsels in het lichaam omvatten (0,3-300 kPa) 1 met een eenvoudige verandering in polymeervoorloper concentratie (Figuur 2, Tabel 1, zie referenties 17,25,26). Gekoppeld aan het feit dat PA gels zijn vrij goedkoop en eenvoudig te bereiden, zijn ze onmisbaar platforms in de studie van stijfheid-afhankelijke cel-materiaal interacties. Zelfs hoewel eenvoudig, de huidige techniek voor het bereiden PA gels beperkt tot kleine batches. Deze beperkingen voort uit de aard van de hydrogel gelering, een vrije radicaal polymerisatie gekatalyseerd door ammoniumpersulfaaten TEMED. 30 Aangezien de reactie een vrije radicaal keten polymerisatie kan worden geremd door een element dat fungeert als een vrije radicalen val, zoals zuurstof. Aangezien diffusie zuurstof in de polymere oplossing gedurende de polymerisatie te vermijden - dat kan oplopen tot 45 min voor het zachtste gels - pipetteren eenvoudigweg de PA gels in een open multi- putjesplaat niet haalbaar. Ook te gebruiken als een tweedimensionale (2D) celsubstraat, moet het oppervlak van de PA gel plat. Beide bovenstaande vereisten dicteren dat voor PA gels 2D celsubstraten moeten PA gel precursor oplossing tussen twee platte vlakken tijdens de polymerisatie - zuurstof diffusie remmen en plat het gel oppervlak. Bovendien, het bovenvlak moet die gemakkelijk kan loslaten van de gel bloot het oppervlak celhechting zijn. Dit wordt typisch bereikt door hydrofobe bekleding van een glasoppervlak. Ten slotte, wanneer het zich in de te putjes van een plaat met meerdere putjes, moet de PA gels het geheel goed bedekken en moeten beperkt blijven drijven. Compleet goed bodemoppervlak dekking is bijzonder belangrijk in toepassingen waarbij de assays gebruikt om de cellen te beoordelen het type dat rekening houdt met de gehele celpopulatie in de put (bijvoorbeeld MTT). Als de PA gel heel goed oppervlak niet voldoende dekt, moet ervoor worden gezorgd dat de cel adhesie aan het blootgestelde goed oppervlak te blokkeren als cellen gemakkelijk kunnen roll off van de gel op het glas of plastic. Eventueel BSA blokkering volgens standaard protocollen of met off-the shelf-BSA gebaseerde celadhesie blokkering kits voldoende om celhechting aan de onderkant van het putje te blokkeren dienen. Bijvoorbeeld, een BSA bedekte oppervlak te prepareren, 0,5 mg / ml oplossing van BSA in PBS, pH 7,4 worden geadsorbeerd op de weefselkweekschaal gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, gespoeld met PBS en direct gebruikt of opgeslagen bij 4 ° C maximaal 2 weken. BSA is aangetoond celadhesie o blokkerenf zoogdiercelkweken zowel hydrofiele als hydrofobe polystyreen oppervlakken door sterk verminderen celadhesie krachten gemeten door atomaire kracht microscopie. 31 BSA werd routinematig gebruikt om zoogdiercel adhesie blokkeren en creëren cel gepatroneerde oppervlakken. 32,33

De techniek afgebeeld in dit artikel, voldoet aan alle bovenstaande vereisten waardoor de massaproductie van uniforme PA gels aangepaste grootte en vorm. De techniek is eenvoudiger en efficiënter dan de huidige standaard van klemmen PA gel precursor oplossing tussen twee dekglaasjes. Bovendien heeft het geen geavanceerde apparatuur nodig en is dus gemakkelijk te adopteren door een onderzoekslaboratorium. Het is ook kosteneffectief aangezien het niet noodzakelijk het gebruik van glasplaten of glazen dekglaasjes, die niet alleen kostbaar, maar ook in een gelimiteerde afmetingen. De techniek is ook sneller om verschillende redenen. Ten eerste, heeft het geen voorbehandeling stappen omvattentypisch voor glazen oppervlakken, omdat de flexibele kunststof steun is ontworpen met twee verschillende oppervlakken - een hydrofiele kant die permanent hecht aan polyacrylamide en een hydrofobe kant die gemakkelijk kunnen worden afgepeld na gelvorming. Ten tweede, omdat de kunststof drager flexibel, is het makkelijker en sneller te pellen van de gevormde gel: als dunne gels gevormd tussen twee glasplaatjes, afpellen boven hydrofobe glijbaan is moeilijk en vaak tot breuk die ook compromitteert de gel. Tenslotte vanwege de flexibele kunststof steun transparantie, sneller UV polymerisatie kan worden gebruikt in tegenstelling tot de standaard TEMED gebaseerde polymerisatie die wel 45 minuten (Tabel 2) duren. De gegevens in tabel 2 blijkt dat wanneer polymerisatietijd en UV lichtintensiteit geoptimaliseerd soortgelijke stijfheid kan worden bereikt door zowel TEMED en UV polymerisatiewerkwijzen.

De hydrogels worden bereid op flexibele plastic steun zoals weergegeven in figuur 1. Aanbevolen wordt de gelering presteren in een ontgassingskamer onvolledige polymerisatie van de gel randen (dwz randeffecten) door diffusie van zuurstof tussen de twee oppervlakken die de polymeeroplossing sandwich voorkomen. Het doel is om een ​​groot hydrogel film bovenop de flexibele kunststof draagvlak dus glasplaat van elke omvang zou passend zijn, maar het zal de grootte van polyacrylamide film die kan worden bereikt dicteren. Het glas kan worden bekleed met een hydrofobe bekleding of als alternatief, kunnen de hydrofobe zijde van de flexibele drager van kunststof worden gebruikt. Zodra een PA gel wordt gevormd, wordt het gedroogd, gesneden in de gewenste vorm, en vervolgens opnieuw gehydrateerd worden voor gebruik. Wanneer het droog is, kunnen de gels voor onbepaalde tijd worden opgeslagen. Het werd bevestigd door reologie, dat de PA gel stijfheid onveranderd na rehydratatie, zelfs wanneer de gels wordt opgeslagen in droge toestand gedurende enkele maanden (figuur 2C). Voor zeer SOFt gels (≤ 1 kPa in Young's modulus) drogen en rehydratie verergert oppervlak kreuken en scheurvorming. Dit gedrag is gebruikelijk voor zachte gels die dehydratatie en daaropvolgende rehydratie ondergaan terwijl ze geometrisch beperkt. 34,35 Niet alle gels vouw of crack, dus is het mogelijk om de hydrogels voor gebruik visueel onderzoeken en alleen de samples dat een glad oppervlak te geven. Om volledig te vermijden plooi vorming en kraken, een alternatieve methode om zachte hydrogels bereiden is afgebeeld in Figuur 6. Hier, de flexibele kunststof drager voorgesneden in de gewenste vorm en de PA gel wordt gevormd bovenop dus de gels niet moeten de-gehydrateerd, maar kan worden gebruikt zoals bereid. Een bijkomend voordeel van deze alternatieve strategie is dat ~ 2,5 more gels kunnen worden geproduceerd uit dezelfde hoeveelheid hydrogel precursor oplossing (de schatting gebaseerd op de voorbereiding gels voor een standaard 96-putjesplaat zoals beschreven in de paragraaf protocol). Een voorzichtig bijbereiden hydrogels op deze wijze te zorgen voor zuurstof infiltratie voorkomen, vooral gels kleinere afmeting (bijvoorbeeld gels voor gebruik in een 96-well plaat). Zelfs wanneer de gel precursor oplossing volledig ontgast, dwz zuurstofvrije, zuurstof zal diffunderen tussen de twee oppervlakken die het PA oplossing sandwich. Dus om randeffecten of onvolledige vorming gel langs de randen te voorkomen, is het het beste om de polymerisatie gebeurt in afwezigheid van zuurstof. In onze ervaring, een vacuümkamer werkt goed, ook al is een inert gas milieu kunnen worden gebruikt met evenveel succes.

Een laatste voorzichtig bij het ​​bereiden PA hydrogelen als celsubstraten stijfheid afhankelijke cel responsen testen, is dat de dikte van de resulterende hydrogel is belangrijk bij zeer dunne gels, de cellen kunnen het onderliggende substraat detecteren 36 Gebruik theorie en experiment. Lin et al. aangetoond dat de diepte waarop cellen kunnen feel het onderliggende substraat is afhankelijk van de dwarsafmeting van de cel. 29 Aangezien huidig ​​onderzoek tegenstrijdig, om het minimale gewenste dikte te voorkomen dat de cellen van het aftasten van de "verborgen" substraat te zijn van enkele microns 36 tot wel 60 microns, 37 minimaal gel dikte van 100 urn worden nagestreefd.

Bij de montage van de PA gels in een multi-putjesplaat, wordt een kleine druppel van PDMS gebruikt om de gel te bevestigen aan de bodem van de put. PDMS werd gekozen omdat het fungeert als vaste lijm bij uitharden, is volledig transparant en niet interfereert latere microscopie experimenten is volledig niet-cytotoxisch en geneest ongeveer 4-8 uur met voldoende tijd voor plaatsamenstel. Veilig vastzetten van de hydrogels op de bodem van de put steun in cel lossen: zo kunnen vaak wast hydrogels los als niet stevig. Als frequente verandering in cel mEdia is geen probleem, dan de gels kan tijdelijk het oppervlak goed worden vastgezet met een kleine druppel van een niet-cytotoxisch en zeer viskeuze vloeistof zoals glycerine.

De laatste stappen voordat cel zaaien betrekken ECM coating van de gel en dan sterilisatie. Hier Collageen type I bekleding is weergegeven (figuur 3), hoewel dezelfde techniek kan worden toegepast voor andere ECM eiwitten. De bifunctionele verknopingsmiddel sulfo-SANPAH wordt gebruikt om een ​​nog monolaag laag bereiken. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat een dergelijke covalente binding levert een uniforme bekleding dan eenvoudig eiwitadsorptie en ook zorgt voor een 12-voudige afstemming van de hoeveelheid eiwit gebonden door simpelweg met een eiwitoplossing van verschillende concentraties. 6 tenslotte de samengestelde multi- gelplaat gesteriliseerd onder UV in de weefselkweek kap tot 2 uur. De UV sterilisatie zorgt voor de test te worden gemonteerd op een laboratoriumtafel buiten de kap, diemaakt het proces logistiek eenvoudiger en algemeen sneller.

Figuren 4 en 5 illustreren enkele representatieve resultaten van MDA-MB-231-borstkankercellen gekweekt op flexibele plastic support bevestigd PA gels variërende stijfheid. MDA-MB-231 cellen werden gekozen om de hulpprogrammamethode tonen omdat is aangetoond dat het onderliggende substraat stijfheid reageren van meetbare veranderingen in hun morfologie. 5,12 Zoals verwacht, waren de cellen meer langwerpig en hebben een groter verspreidingsgebied op de stijve 100 kPa PA gels vergeleken met de zachte 0,5 en 1 kPa PA gels (figuren 4 en 5). De onderste rij in figuur 4 toont ook het gebruik van twee fluorescerende kleurstoffen die de celkern en cytoplasma vlek, demonstrerend dat de flexibele drager van kunststof niet verstoort fluorescentiemicroscoop beeldvorming.

Kortom, een eenvoudige methode om polyacrylamide hydrogels in voorbereidingmulti- plaat formaat wordt gepresenteerd. De techniek is sneller, efficiënter en goedkoper dan de huidige werkwijzen voor het bereiden van PA gels te gebruiken als celsubstraten en maakt de bereiding van gels van aangepaste afmetingen niet anderszins beschikbaar. Aangezien geen gespecialiseerde apparatuur nodig, de methode kan gemakkelijk door een onderzoekslaboratorium aangenomen zou bijzonder nuttig in het onderzoek gericht op het begrijpen stijfheid afhankelijke cel responsen zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
40% Acrylamide Bio-Rad 161-0140
2% Bis-acrylamide Bio-Rad 161-0142
Ammonium Persulfate Bio-Rad 161-07000
TEMED Sigma Aldrich T9281
Sulfo-SANPAH Thermo Scientific 22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml BD Biosciences 354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100
Hydrophobic solution — Repel Silane GE Healthcare Bio-Sciences 17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4 HyClone SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] Elsworth Adhesives 3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x) Sigma Aldrich 44174
RPMI-1640 Medium (1x) HyClone SH30027-02
Fetal Bovine Serum HyClone SH30073-03
Penicillin Streptomycin MP Biomedicals 1670046
Detergent: Triton-X Sigma Aldrich T8787
Formaldehyde 37% Solution Sigma Aldrich F1635
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit Chemicon International ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels GE Healthcare Bio-Sciences 309819
Glass Plates Slumpys GBS4100SFSL
50 ml conical tubes Fisher Scientific 3181345107
15 ml conicals tubes FALCON 352097
Micro centrifuge tubes Fisher Scientific 2 ml: 02681258
96-well plate (flat bottom) Fisher Scientific 12565501
Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) Fisher Scientific 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes Fisher Scientific 5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Fisher Scientific 2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9D
Parafilm PARAFILM  PM992
Powder Free Examination Gloves Quest 92897
Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm Grace Bio-Labs JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) Zeiss 3820005619
Microscope Software Zeiss AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven UVITRON UV1080
Vacuum chamber/degasser BelArt 999320237
Vacuum pump for degasser KNF Lab 5097482
Tissue Culture Hood NUAIRE NU-425-600
Chemical Fume Hood KEWAUNEE 99151
Inverted Microscope (Axiovert 25) Zeiss 663526
Incubator NUAIRE NU-8500
Pipette Aid Drummond Scientific Co. P-76864
Hemacytometer Bright-Line 383684

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
  2. Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  5. Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
  6. Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
  7. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
  8. Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
  9. Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
  10. Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
  11. Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
  13. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  14. Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
  15. Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
  16. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  17. Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
  18. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  19. Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  20. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  21. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  22. Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
  23. Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
  24. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  25. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  26. Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
  27. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  28. Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
  30. Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
  31. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
  32. Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
  33. Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
  34. Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
  35. Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
  36. Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  37. Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).

Tags

Biotechniek Multiwell substraat stijfheid drug discovery polyacrylamide Young's modulus high-throughput
Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Syed, S., Karadaghy, A., Zustiak, S. More

Syed, S., Karadaghy, A., Zustiak, S. Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses. J. Vis. Exp. (97), e52643, doi:10.3791/52643 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter