Introduction
La plupart des tissus dans le corps sont des matériaux visco-élastiques souples avec un module d'Young allant de 0,1 kPa pour le cerveau de 100 kPa pour cartilage souple, encore, la plupart de la recherche sur les cellules in vitro est réalisée sur du polystyrène pour culture de tissus (TCP) qui a un module d'environ 1 GPa . 1 Ce décalage de rigidité affecte grandement la façon dont les cellules répondent à leur environnement. Un nombre croissant d'études est ainsi dédiée à élucider l'effet de la rigidité du substrat sur le sort de divers types de cellules, le 2,3 y compris des cellules souches. 4 En conséquence, plusieurs hydrogels ont été développés pour aider à la compréhension de la cellule de rigidité dépendante biologie, y compris polyacrylamide (PA), 5-7 polyéthylène glycol (PEG), 8,9 (PDMS), 10 et 11 alginate. Bien que la preuve que la rigidité du substrat a un impact considérable sur le sort de la cellule est de plus en plus, la plupart des études sont menées sur une petite échelle avec un petit nombre de sexemples. Systématiques, études multidimensionnelles sur l'effet de la rigidité de substrat pour un éventail de types de cellules ou les conditions environnementales sont rares. 12
Plusieurs technologies d'hydrogel à haut débit prometteuses ont été développées, y compris les microréseaux à base de PEG, 13 des dispositifs microfluidiques pour la production de microbilles d'agarose d'hydrogel, 14 ou des micro et nano-tiges où la rigidité est modulée par le diamètre et la hauteur des microrods. 15 Cependant , les technologies de préparer ces substrats sont sophistiqués et disponibles pour nombre limité de laboratoires. Beaucoup de recherches impliquant rigidité modulée réponses cellulaires utilise polyacrylamide (AP) gels qui ne sont pas seulement bon marché et simple à mettre en œuvre, mais présentent également une gamme physiologiquement pertinente de module de Young, à savoir 0,3 -. 300 kPa 16-22 Cependant, les méthodes existantes pour fabriquer PA gels pour la culture cellulaire sont de main-d'œuvre et par conséquent prepARED en petits lots. Certaines des difficultés liées à la préparation de gels PA comme substrats de cellules souches de l'exigence que les gels doivent être préparé: 1) en l'absence d'oxygène pour permettre la polymérisation complète, 2) avec une surface plane et lisse pour permettre cellulaire uniforme l'attachement et la propagation, et 3) fixée en permanence au fond de la boîte de culture cellulaire pour empêcher flottante.
Plusieurs groupes ont tenté de produire des gels PA pour la culture cellulaire en grandes séries. Semler et al. Les feuilles épaisses préparées de gels PA qui ont ensuite été "coupée" avec une perforatrice et placés dans des plaques à 96 puits. 23 Cependant, cette méthode est limitée à des gels sévères, ce est à dire,> 1 kPa dans le module de Young, parce que plus doux gels sont "collante", difficile à couper, et facilement endommagé. Mih et al. A développé une technique plus sophistiquée qui permet aux gels d'être directement polymérisés dans une plaque à puits multiples à fond de verre.
Cet article décrit un moyen simple et peu coûteux à assembler gels PA dans une plaque multi-puits qui pourrait être facilement adoptée par ne importe quel laboratoire. Ici, un support plastique flexible est utilisé, qui a deux côtés - un une hydrophobe, qui est répulsif pour gels PA, et un une hydrophile, qui se lie de manière covalente le gel PA lors du dépôt. Une fois les feuilles de gel PA sont déposés et permanente apposée sur le support plastique flexible, il permet une manipulation des gels de toute épaisseur ou la rigidité et les couper en toute forme souhaitée. Cette apprOach produit non seulement personnalisés "lamelles" en plastique de tailles pas autrement disponibles dans le commerce, mais évite également la nécessité de surfaces de verre-prétraiter, soit des lamelles de verre ou les puits de plaques à puits multiples à fond de verre coûteuses, avec une solution de liaison PA, qui est un fastidieux et une étape de temps. Enfin, feuilles de gels uniformes PA peuvent être préparés en grandes séries et stockés de-hydraté pendant plusieurs mois.
En résumé, l'analyse présentée ici est une amélioration par rapport aux méthodes existantes dans plusieurs aspects. Premièrement, le processus de montage de la plaque à puits multiples est efficace, et le coût total des matériaux requis est faible. Deuxièmement, les hydrogels sont produites en grandes quantités dans un film de gel homogène unique. Enfin, seuls des matériaux qui sont disponibles dans le commerce sont tenus. L'utilité de l'essai est illustré par la découverte de l'effet de la rigidité du substrat sur la morphologie cellulaire et la zone d'étalement.
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Protocol
1. Préparation des solutions et des aliquotes hydrogel associés
- Préparation de la solution de précurseur de gel de polyacrylamide.
- Préparer la solution de précurseur de gel de Polyacrylamide en mélangeant acrylamide (A) (40% p / v, M 71,08 g / mol), le bisacrylamide de réticulation (B) (2% p / v, M 154,17 g / mol), et dé- de l'eau ionisée dans les pourcentages en volume indiquées au tableau 1.
REMARQUE: Ces solutions peuvent être préparés en grandes séries et stockées à 4 ° C pendant plusieurs mois.- ATTENTION: L'acrylamide est toxique par inhalation ou ingestion, en particulier, lorsqu'il est sous forme de poudre: ainsi, utiliser de préférence de 40% w solution / v pour réduire les risques de toxicité. Manipuler seulement en portant des vêtements de protection, comme des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire. Stocker dans un récipient résistant à la lumière, bien fermé dans le réfrigérateur (<23 ° C, une zone bien ventilée).
- ATTENTION: Bis-acrylamide est toxique en cas d'inhalation ou d'ingestion, en particulier,lorsqu'elle est sous forme de poudre: ainsi, utiliser de préférence de 2% w solution / v pour réduire les risques de toxicité. Manipuler seulement en portant des vêtements de protection, comme des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire. Stocker dans un récipient résistant à la lumière, bien fermé dans le réfrigérateur (<4 ° C de la zone, bien ventilé).
- Préparer la solution de précurseur de gel de Polyacrylamide en mélangeant acrylamide (A) (40% p / v, M 71,08 g / mol), le bisacrylamide de réticulation (B) (2% p / v, M 154,17 g / mol), et dé- de l'eau ionisée dans les pourcentages en volume indiquées au tableau 1.
- La préparation et l'utilisation de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophénylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, M 492,40 g / mol) des parties aliquotes. ATTENTION: Sulfo-SANPAH provoque une irritation des yeux; Manipuler avec des gants et des lunettes bon ou de protection du visage. Conserver à -20 ° C dès réception et avant aliquotage.
- Pour stocker sulfo-SANPAH: dissoudre Sulfo-SANPAH dans dimethylsulfoxane (DMSO) à 50 mg / ml. Aliquoter la solution de stock en 50 micro-tubes de centrifugeuse de 20 pi par tube. Un gel rapide sur la glace sèche ou dans l'azote liquide (une étape facultative mais préférée pour préserver l'efficacité de réticulation maximum) et conserver à -80 ° C.
REMARQUE: Les aliquotes can être stockés pendant plusieurs mois. - Pour utiliser sulfo-SANPAH: décongeler brièvement aliquote et diluer dans 480 pi d'eau désionisée. Utiliser immédiatement. Sulfo-SANPAH hydrolyse rapidement dans l'eau: donc prendre la prudence se acquitter de toutes les étapes ci-dessus rapidement.
- Pour stocker sulfo-SANPAH: dissoudre Sulfo-SANPAH dans dimethylsulfoxane (DMSO) à 50 mg / ml. Aliquoter la solution de stock en 50 micro-tubes de centrifugeuse de 20 pi par tube. Un gel rapide sur la glace sèche ou dans l'azote liquide (une étape facultative mais préférée pour préserver l'efficacité de réticulation maximum) et conserver à -80 ° C.
- Préparation de persulfate d'ammonium (M r 228,18 g / mol) des parties aliquotes.
REMARQUE: persulfate d'ammonium provoque yeux, la peau et les voies respiratoires. Porter un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation. Manipulez la poudre de persulfate d'ammonium dans une hotte chimique. Conserver la poudre dans un endroit sec, bien ventilé. Une fois aliquotes, la solution diluée peut être utilisé sur la table de travail.- Dissoudre le persulfate d'ammonium dans de l'eau désionisée pour obtenir une concentration finale de persulfate d'ammonium à 10% p / v. Aliquoter et conserver à -20 ° C. Décongeler immédiatement avant l'utilisation.
- Préparation de la solution de collagène de type I.
- Préparer 0,2 mg / ml solution collagène par dilution de la sorte1x lution dans du tampon phosphate salin (PBS) de pH 7,4. Stocker brièvement de glace ou utiliser immédiatement après dilution.
2. Préparation d'hydrogel (Voir Figure 1)
- Préparation des lames de verre hydrophobes.
- Placez quelques gouttes d'une solution hydrophobe sur une plaque de verre et d'utiliser du papier de soie se propager à travers la surface. Laissez sécher à l'air et essuyer de nouveau avec un mouchoir en papier pour égaliser le revêtement hydrophobe.
REMARQUE: solution hydrophobe magasin dans une armoire inflammable à RT. Porter un équipement de protection individuelle lors de la manipulation. Travailler dans un endroit bien ventilé.
- Placez quelques gouttes d'une solution hydrophobe sur une plaque de verre et d'utiliser du papier de soie se propager à travers la surface. Laissez sécher à l'air et essuyer de nouveau avec un mouchoir en papier pour égaliser le revêtement hydrophobe.
- Préparation du support en matière plastique souple.
- Couper le support plastique flexible pour correspondre à la taille de la plaque de verre à revêtement hydrophobe.
- Marquer le côté hydrophobe du support plastique flexible en grattant légèrement la surface avec un outil pointu comme un scalpel.
NOTE: Une fois que le gel - qui est totalement transparent - sèche, Les rayures seront aider à distinguer de quel côté de support souple en plastique contient du gel.
REMARQUE: Le support plastique flexible a une hydrophobe et un côté hydrophile. Une fois déposé, le polyacrylamide adhère de façon permanente sur le côté hydrophile du support plastique qui facilite la manipulation d'hydrogel ultérieure facile.
- Préparation de gel (par exemple les volumes sont donnés pour des solutions de précurseur de gel de 5 ml).
NOTE: 5 ml seraient suffisants pour produire ~ 40 gels lorsque le gel épaisseur initiale est de 0,5 mm. Plus gels peuvent être produits si l'épaisseur du gel est réduite.- Passer 4972,5 ul de solution de précurseur de polyacrylamide concentration finale désirée (tableau 1) dans un tube conique de 50 ml. Placez dans une chambre de dégazage pendant 30 min avec le couvercle ouvert.
NOTE: L'oxygène agit comme un piège à radicaux libres et lorsqu'il est présent, il inhibe la polymérisation. - Ajouter 25 ul de 10% en poids / volume de persulfate d'ammonium (voir point 1.3) pour obtenir un finaleconcentration en persulfate d'ammonium à 0,05%.
- Ajouter 2,5 pi de N, N, N ', N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED, M 116,24 g / mol) à la solution dégazée de gel pour obtenir une concentration finale de TEMED 0,5%.
NOTE: Magasin TEMED dans une armoire inflammable à RT. Manipuler dans une hotte chimique lorsque vous portez un équipement de protection individuelle approprié. Gardez bien fermé sous gaz inerte, car il est très sensible à l'humidité et de l'air. - Mélanger doucement la solution par pipetage de haut en bas 3-5 fois. Ne vortex pour éviter la diffusion d'oxygène dans la solution de précurseur de gel.
- Pipeter la solution de gélatine sur le côté hydrophile du support en matière plastique souple et un sandwich avec lame de verre hydrophobe revêtu. Séparer les deux glissières par des entretoises de silicone d'une épaisseur désirée (par exemple, 0,5 mm). Laisser une petite quantité (~ 100 pi) d'une solution de précurseur de polymère dans le tube conique de 50 ml d'utiliser comme indicateur de gélification.
REMARQUE:Tout écartement pourrait être utilisé. Par exemple, une seule bande de Parafilm donne une épaisseur de gel gonflé finale de 100 - 120 um. - Placez une autre plaque de verre au sommet du sandwich en plastique souple support / gel pour assurer une surface plane hydrogel lors de la polymérisation.
- Laisser polymériser le gel pendant 45 minutes, bien que moins de temps peut être utilisé pour des gels supérieur% en poids, si désiré. Pour se assurer que le gel a polymérisé, observer la solution restante dans le tube conique de 50 ml; si la solution restante a gélifié, alors il est probable que la gélification de la plaque de verre a été initié ainsi. Toutefois, notez que l'ouverture prématurée de la moule empêcher la polymérisation complète.
- Une fois que le gel est formé, décoller le support de plastique souple avec le gel de polyacrylamide attaché de manière covalente sur le dessus, et mettre gel côté-up sécher à l'air.
REMARQUE: convection ou séchage à la chaleur peuvent aussi être utilisés pour accélérer cette étape. Une fois séché sur le support en matière plastique souple, le gel peut être magasinD indéfiniment.- Marquer des taches nues du support de plastique souple, où les gels de polyacrylamide ne font pas en raison de bulles. Mark tandis que le gel est encore hydratée car cela se fondre dans le support de plastique souple une fois que le gel est sec.
- Passer 4972,5 ul de solution de précurseur de polyacrylamide concentration finale désirée (tableau 1) dans un tube conique de 50 ml. Placez dans une chambre de dégazage pendant 30 min avec le couvercle ouvert.
3. Assemblée Multiwell Plate, Collagène revêtement, et stérilisation
- Assemblage de plaque à puits multiples.
- Une fois séché, coupé gels PA dans des formes souhaitées.
- Pour une plaque de 96 puits, utilisez une perforatrice lourd de devoir avec un diamètre de ~ 6 mm. Utilisez un coupe-papier robuste pour couper gels dans des formes carrées ou rectangulaires. Sinon, utilisez des ciseaux.
- Préparer environ 500 ul de PDMS par plaque à 96 puits selon les instructions du fabricant. Pour coller les gels au fond d'une plaque à puits multiples, placer une petite goutte (~ 5 pi) de polydiméthylsiloxane (PDMS) au centre de chaque puits. En utilisant des pinces, placer une polyacrylamidegel de e de chaque côté ainsi, flexible support en plastique vers le bas. Pour permettre PDMS pour guérir, laissez la plaque assemblée à 37 ° C pendant un minimum de 4 heures.
- Une fois séché, coupé gels PA dans des formes souhaitées.
- Collagène revêtement de gels de Polyacrylamide.
- Avec une pipette de transfert, placer une petite quantité (7-8 pi) de sulfo-SANPAH (se reporter au point 1.2.2) dans chaque puits et agiter de droite à gauche pour enrober la surface du gel uniformément. Travaillez rapidement depuis sulfo-SANPAH ne est pas stable dans l'eau.
- Placer la plaque de puits sous une lampe UV à haute intensité (intensité = 37 mW, λ = 302 à 365 nm) pendant 5 min. Rincer les gels avec du PBS pour éliminer sulfo-SANPAH excès.
- Pipette 50 ul de 0,2 mg / ml de collagène de type I solution (voir point 1.4) dans chaque puits. Laissez la plaque couverte à température ambiante pendant au moins 2 heures ou O / N à 4 ° C.
NOTE: Pour accélérer le processus de revêtement de collagène, une pipette de transfert peut être utilisé pour ajouter la solution de collagène. Typiquement, 1-2 gouttes de solution devrait être suffisant pour terminerly couvrent la surface du gel. - Laissez la plaque de puits à température ambiante pendant au moins 2 heures pour permettre la liaison de collagène.
- Rincer avec du PBS pour éliminer l'excès de solution de collagène et stériliser sous UV (λ = 200 nm) dans une hotte de culture tissulaire pendant 2 h.
- Faire tremper les gels dans un milieu complet (voir la section 4.1 pour la composition du milieu) O / N pour hydrater et équilibrer. Utilisez pour la cellule ensemencement immédiatement ou conserver au réfrigérateur jusqu'à 2 jours.
4. cellulaire semis sur PA Rigidité Assay
REMARQUE: Bien que typique de lignées cellulaires de mammifères communes, le protocole décrit dans cette section est utilisé spécifiquement avec le cancer du sein lignée cellulaire MDA-MB-231 (voir figures 4 et 5).
- Recueillir les cellules de flacon de culture de tissu par exposition à 5% de trypsine / EDTA pendant 5 min à 37 ° C. Utilisez ~ 80 pi de trypsine / EDTA pour chaque cm 2 de la culture zone de ballon; par exemple, utiliser 2 ml de trypsine / EDTA fora T25 du ballon de culture de cellules. Remettre en suspension les cellules récoltées dans du milieu complet supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine à une concentration finale souhaitée de la cellule. En tenant compte de temps de doublement cellulaire ainsi que la durée pendant laquelle les cellules sont ensemencées sur l'analyse, choisir une concentration cellulaire appropriée sous-confluentes. Assurez-vous que moyen supplémentaire est suffisant pour submerger complètement les hydrogels.
NOTE: Depuis les hydrogels ont été pré-équilibrée dans les médias (voir l'étape 3.2.6) un volume de 100 pi devrait être suffisant. Des volumes de taille typiques utilisés pour les plaques multi-puits devraient être suffisants puisque les gels ont été pré-équilibrée dans du support dans l'étape précédente.
NOTE: Le test serait approprié pour tout type de fixation des cellules dépendant.- Compter le nombre de cellules sous un microscope inversé en utilisant un hémacytomètre. Charge 10 pi de suspension cellulaire dans chaque port de hémacytomètre et la moyenne du nombre de cellules à partir d'au moins huit quadrants. Pour obtenir leconcentration cellulaire finale, il faut multiplier le nombre de cellules par 10 quatre.
REMARQUE: Les meilleurs résultats de comptage cellulaire sont obtenus lorsque le nombre de cellules dans chaque quadrant de hématimètre est 20-50.
- Compter le nombre de cellules sous un microscope inversé en utilisant un hémacytomètre. Charge 10 pi de suspension cellulaire dans chaque port de hémacytomètre et la moyenne du nombre de cellules à partir d'au moins huit quadrants. Pour obtenir leconcentration cellulaire finale, il faut multiplier le nombre de cellules par 10 quatre.
- Culture des cellules sur le test de rigidité PA dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. Changer de support tous les 2 à 3 jours. Recueillir les cellules en cas de besoin par une exposition à 5% de trypsine / EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Utilisation ~ 80 pi de trypsine / EDTA par cm2 de flacon de culture tissulaire. Au cours de toutes les étapes de manipulation cellulaire, prenez soin de ne pas perturber la surface d'hydrogel: aspirer ou moyen de pipette en inclinant légèrement la plaque à puits multiples sur le côté et de toucher la pointe de la pipette sur la paroi latérale de chaque puits, par opposition à toucher l'hydrogel.
REMARQUE: Sauf pour prendre soin de ne pas endommager la surface d'hydrogel lors de la manipulation de culture tissulaire standard, les cellules ensemencées sur le test de rigidité peut être manipulé de la même manière que si elles ont été ensemencées surd'une plaque multipuits régulière.
5. imagerie des cellules ensemencées sur PA Rigidité Assay
- cellules image directement sur le test de rigidité PA.
NOTE: Toute microscope - inversé, fluorescent ou confocale, peut être utilisé pour l'imagerie cellulaire.
REMARQUE: Le support en matière plastique souple utilisée pour construire le test de rigidité est entièrement transparent et ne pas interférer avec ou autofluorescence imagerie cellulaire. Cependant, même si le support en matière plastique souple lui-même est transparente, des capacités d'imagerie seront limités par la distance de travail de l'objectif. Le support en matière plastique souple a une épaisseur de 0,23 mm et une distance de travail typique d'un objectif 10X est ~ 4 mm, diminuant fortement pour des grossissements plus élevés.- Pour l'imagerie des cellules vivantes, la position PA rigidité test in support de plaque de microscope et l'image. Les séances d'imagerie sous 2 heures, ou utiliser un microscope équipé d'une chambre environnementale des durées d'imagerie.
- Lorsque im de cellules vivantesvieillissement ne est pas l'objectif, fixer les cellules dans une solution de formaldéhyde 4% complété avec 0,1% de détergent. Faire tremper les cellules dans un fixateur à température ambiante pendant un minimum de 2 heures. Rincer deux fois avec PBS. Jeter les déchets fixateur dans un conteneur de déchets désignés.
NOTE: Les cellules peuvent être visualisés immédiatement ou stockée immergés dans du PBS à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. ATTENTION: Le formaldéhyde est toxique par inhalation et par contact. Manipuler avec des gants dans une hotte chimique.
REMARQUE: Cellulaire protocole de fixation doit être choisi sur la base des protocoles de coloration de la cellule et la manipulation ultérieure, parce que certains fixateurs endommagent certaines protéines cellulaires. - Pour l'imagerie de fluorescence, colorer les cellules avec tache de cellule souhaitée directement dans la plaque multi-puits fixée. Image immédiatement.
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Representative Results
Polyacrylamide (AP) hydrogels sont largement utilisés pour tester les réponses cellulaires rigidité dépendante. 17,24 En mélangeant différentes concentrations d'acrylamide (A) et bis-acrylamide (B) on peut faire gels PA qui couvrent la gamme de rigidité de la plupart des tissus mous le corps - 0,3 -.. 300 le module de kPa Jeune 1 Cependant, la préparation de gels de polyacrylamide est long et fastidieux, ce qui limite souvent leur utilité dans des applications «à haut débit» comme pour le dépistage exemple de drogue 12 Ici, une méthode simple et rapide pour assemblage des gels d'AP dans des plaques multi-puits ou de tout autre récipient souhaitable de culture tissulaire est présentée (figure 1). La figure 2A montre un module d'Young en fonction de plusieurs concentrations A et B (également résumées dans le tableau 1). Les modules de combinaisons supplémentaires A et B sont rapportés dans la littérature 17,25,26 La rigidité de gel de pleinement swolle.n gels a été mesurée par rhéologie (AR 2000EX rhéomètre, TA Instruments) avec une géométrie parallèle 20 mm supérieure, la fréquence oscillatoire essai de balayage 1-10 Hz, et 2% de déformation constante. Comme prévu, il a été démontré que les deux module de conservation G 'et le module de perte, G ", sont indépendants de la fréquence (figure 2B). Il a également été confirmé que le séchage puis ré-hydratation des gels, ne affecte pas le module de leur jeune (figure 2C). Le module d'Young est lié au module de mémorisation par l'équation suivante: 
où E est le module de Young et v est le coefficient de Poisson qui a été approchée à 0,5 pour les gels PA. 27 Notez que les valeurs déclarées sont des hydrogels préparés avec TEMED. Hydrogels PA pourraient également être préparés par réticulation UV lorsque le temps d'exposition et l'intensité des UV sont optimisés (
En outre, il a été démontré que les cellules ensemencées sur des hydrogels de stiffne différentss exposé morphologie différente. Pour cette expérience, cancer du sein cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées sur des gels d'AP pour les 24 à 72 heures. Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline / streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. Les cellules ont été ensemencées à 1 x 10 5 cellules / ml ou de 1 x 10 4 cellules / puits pour une plaque à 96 puits. Il se agit d'une densité typique de l'ensemencement des cellules - 4 fois plus faible que la densité cellulaire de la confluence, où la confluence pour une lignée cellulaire de mammifère est atteint à ~ 1 x 10 5 cellules / cm 2. Les images ont été prises sur le microscope à fluorescence inversé et analysées sur ImageJ via le descripteur de forme et de plug-ins zone. Il a été observé que si elles sont ensemencées sur des gels d'AP pendant 24 heures, le cancer du sein cellules MDA-MB-231 sont restés ronde sur les douces 0,5 et une gels kPa, mais ont pu se propager et de se allonger sur le raide 100 gel kPa (Figure 4). Figure 4 qui valorise aussies le fait que les hydrogels fabriqués sur le dessus du support en matière plastique souple sont transparentes et permettent la visualisation et la microscopie facile. En outre, le support en matière plastique souple ne pas autofluorescence et ainsi ne interfère pas avec l'imagerie de cellules marquées par fluorescence. La morphologie cellulaire a encore été quantifiée en termes de la cellule globale zone et le facteur de forme de la cellule d'épandage - circularité (Figure 5). Cellule zone d'étalement est mesurée par la création d'un masque pour tracer le périmètre de chaque cellule. la forme des cellules (de circularité) a ensuite été calculée à partir de la relation suivante: 
Circularité est mesuré sur une échelle de 0 à 1, où 0,6 à 1 ont été prises pour désigner cellules arrondies et de 0 à 0,5 ont été prises pour désigner cellules allongées. Environ trois cents cellules provenant d'au moins trois expériences indépendantes ont été analysés pour chaque poin de données t. Les différences statistiques ont été calculées sur la base de l'analyse simple du facteur de variance (Anova) où les ensembles de données ont été considérés comme significativement différents lorsque p <0,05.
Figure 1. Représentation schématique de la préparation du gel de polyacrylamide sur support plastique flexible. Ce chiffre représente les différentes étapes de la préparation de gels PA sur support plastique flexible. Après le gel sèche complètement, il peut être coupé ou perforé dans ne importe quelle forme souhaitable. Un coup de poing entier (~ de 6 mm de diamètre) est plus pratique lors de la préparation des gels pour une plaque de 96 puits, tandis qu'une coupe-papier robuste peut être utilisé pour les formes carrées ou rectangulaires. La figure montre également les bords des puits, à la fois avec et sans gel, afin de démontrer que la couverture de fond de puits complet peut être obtenu avec cette méthode. ADO / 52643 / 52643fig1large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Raideur des hydrogels PA tel que mesuré par rhéologie. (A) un module d'représentative Young pour cinq concentrations A et B différents (voir le tableau 1 pour les acronymes), (B) le stockage et le module de perte en fonction de la fréquence telle que mesurée par rhéologie, (c) des gels présentent le même module d'Young au départ (initial) et après qu'ils aient été séchés et réhydratés (Re-hydraté) indépendante de la concentration de précurseur de polymère. Tous les gels pour les mesures de rhéologie ont été préparées comme des plaques de 20 mm de diamètre et de 1 à 1,5 mm de hauteur (à gonflement complet).
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Figure 3. Le collagène revêtement sur gels PA. Le revêtement de collagène (vert) est distribué efficacement et retenu sur le gel PA (rouge) de surface indépendante du module de rigidité hydrogel Young). Le collagène marqué au Cy5 a été utilisé pour ces données. Perles rouges fluorescentes ont été intégrés dans l'hydrogel PA à la visualisation de l'aide. Images transversales ont été prises sur un microscope confocal (barre d'échelle = 100 um). Image et adapté de Zustiak. al. 5 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. contrat de Phase (rangée du haut) et fluorescentes (rangée du bas) images de MDA-MB-231 cellules ensemencées sur des gels d'AP pendant 24 heures. MDA-MB-231 cellules restent ronde sur gels doux (Young 7; le module de de 0,5 et 1 kPa), mais allongé sur des gels d'AP rigides (module de 100 kPa de Young). Les cellules ont été ensemencées sur des gels pendant 24 heures, fixées dans de l'éthanol et colorées à l'orangé d'acridine (AO - vert) pour visualiser le cytoplasme cellulaire et le DAPI (bleu) pour visualiser les noyaux cellulaires; barre d'échelle = 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Cellule zone d'étalement et de circularité sont affectés par la rigidité du substrat sous-jacent. (A) MDA-MB-231 cellules zone d'étalement est augmenté de façon significative sur la 100 kPa, par opposition à des gels 0,5 kPa. (B) Cell circularité diminue avec l'augmentation de la rigidité de gel PA. Les astérisques désignent des différences significatives; p <0,05.
Figure 6. Représentation schématique d'une préparation de gel de polyacrylamide alternatif sur support plastique flexible. Ce chiffre représente les différentes étapes de la préparation de gels PA sur support plastique flexible. Ici, le support plastique flexible est d'abord pré-coupé en lamelles "" en plastique de forme désirée et la taille. Cette technique fonctionne mieux pour des hydrogels mous. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Acronyme | Acrylamide% | Bis-acrylamide% | Acrylamide de 40% de solution de stock (ml) | Bis-acrylamide de 2% solution mère (ml) | Eau (ml) | G '± SD (kPa) | E ± SD (kPa) |
| PA1 | 5 | 0,025 | 625 | 62,5 | 4312,5 | 0,62 ± 0,19 | 1,85 ± 0,57 |
| PA2 | 5 | 0,1 | 625 | 250 | 4125 | 3,55 ± 0,12 | 10,64 ± 0,36 |
| PA3 | 8 | 0,1 | 1000 | 250 | 3750 | 9,71 ± 0,64 | 29,14 ± 1,93 |
| PA4 | 8 | 0,25 | 1000 | 625 | 3375 | 22,00 ± 2,10 | 66,01 ± 6,31 |
| PA5 | 12 | 0,25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37,42 ± 2,68 | 112,25 ± 8,03 |
Tableau 1. Concentrations d'acrylamide (A) et agent de réticulation bis-acrylamide (B) et la rigidité de gel PA résultant. Rigidité, représentée ici par G 'et E, a été mesuré par rhéologie. G 'est le module de stockage à une fréquence Hz. Le module de Young, E, a été calculée à partir de l'équation. 1. La déviation standard (SD) a été calculé sur la base de trois expériences indépendantes avec 3-5 échantillons mesurés par expérience. Les acronymes dans le tableau correspondent aux acronymes utilisés dans la figure 2A.
| L'intensité UV = 15 mW / cm 2 | Temps d'exposition = 300 sec | ||
| Temps (s) | E (kPa) ± SD | Enintensité (mW / cm 2) | E (kPa) ± SD |
| 75 | 0,14 ± 0,03 | 15 | 28,05 ± 2,62 |
| 100 | 6,98 ± 2,34 | 26 | 21,13 ± 3,01 |
| 125 | 19,11 ± 2,29 | 37 | 20,01 ± 2,38 |
| 300 | 28,05 ± 2,62 | 66 | 19,35 ± 2,86 |
Tableau 2. polymérisation UV est une alternative et une méthode plus rapide pour PA préparation de gel lorsque les conditions de gélification sont optimisés; PA3 (voir le tableau 1) gel est représenté. Le tableau résume le module de la résultante Jeune lorsque soit la durée d'exposition (de gauche deux colonnes) ou l'intensité des UV (à droite deux colonnes) sont variés pour la même solution. D'après les résultats du tableau, il apparaît que 300 secondes de temps d'exposition et 15mW / cm 2 d'intensité d'UV donner une rigidité de gel de PA les plus élevés, qui est comparable à la rigidité du gel polymérisé traditionnellement comme indiqué dans le tableau 1.
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Discussion
Les gels de polyacrylamide, initialement mis au point pour l'électrophorèse, 28 sont maintenant couramment utilisés comme substrats de culture cellulaire pour étudier les effets de la rigidité du substrat sur la morphologie cellulaire, la motilité et la communication 3,24,29 parmi d'autres caractéristiques de cellules. Polyacrylamide permet la manipulation de la rigidité du substrat pour englober la rigidité de l'ensemble des tissus mous dans le corps (0,3 à 300 kPa) avec une simple modification de la concentration de précurseur de polymère (Figure 2, Tableau 1, voir aussi les références 17,25,26). Couplé au fait que les gels AP sont relativement peu coûteux et simple à préparer, ils sont devenus des plates-formes indispensables dans l'étude des interactions cellulaires matériau rigidité dépendante. Cependant, même si simple, la technique actuelle pour la préparation de gels PA est limitée à de petits lots. Ces limites résultent de la nature de la gélification de l'hydrogel, qui est une polymérisation radicalaire catalysée par du persulfate d'ammoniumet TEMED. 30 Etant donné que la réaction est une polymérisation radicalaire en chaîne, il peut être inhibé par ne importe quel élément qui sert de piège à radicaux libres, tels que l'oxygène. Par conséquent, puisque la diffusion de l'oxygène dans la solution de polymère doit être évitée pendant la polymérisation - qui pourrait prendre jusqu'à 45 minutes pour les gels les plus doux - pipetage simplement les gels PA dans une plaque multi-puits ouverte ne est pas réalisable. En outre, pour être utilisé comme un substrat de cellule à deux dimensions (2D), la surface du gel PA doit être plat. Les deux conditions ci-dessus exigent que, pour produire des gels d'AP en tant que substrats cellulaires 2D, PA solution de précurseur de gel doivent être pris en sandwich entre deux surfaces plates au cours de la polymérisation - pour inhiber la diffusion de l'oxygène et aplatir la surface du gel. En outre, la surface supérieure doit être telle qu'il puisse facilement se décoller de la surface à exposer le gel pour la fixation des cellules. Ceci est typiquement réalisé par un revêtement hydrophobe de surface du verre. Enfin, lorsqu'il est positionné en ee puits d'une plaque à puits multiples, les gels PA devraient couvrir la surface du puits ensemble et être restreinte de flotter. Une couverture complète de la surface de fond de puits est particulièrement important dans les applications où les tests utilisés pour évaluer les cellules sont du type qui prend en compte l'ensemble de la population de cellules dans le puits (par exemple, MTT). Si le gel PA ne couvre pas adéquatement la surface du puits, des précautions doivent être prises pour bloquer l'adhésion des cellules à la surface bien exposé que les cellules pourraient facilement tomber du gel sur le verre ou le plastique. Si nécessaire, suite à un blocage BSA en utilisant des protocoles standards ou hors du plateau de blocage kits adhésion cellulaire à base de BSA-devraient être suffisantes pour bloquer la fixation des cellules au fond de la plaque de puits. Par exemple, pour préparer une surface BSA-couverte, 0,5 mg / ml de solution de BSA dans du PBS, pH 7,4 doit être adsorbé sur la boîte de culture tissulaire pendant 20 min à température ambiante, rincées avec du PBS et utilisées immédiatement ou stockées à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines. BSA a été montré pour bloquer l'adhérence cellulaire odes cultures de cellules de mammifères f sur les deux surfaces de polystyrène hydrophiles et hydrophobes en réduisant fortement les forces d'adhésion cellulaire telle que mesurée par microscopie à force atomique. 31 BSA a été utilisé couramment pour bloquer l'adhérence des cellules de mammifères ainsi que de créer des surfaces à motifs cellulaires. 32,33
La technique décrite dans cet article, répond à toutes les exigences ci-dessus permettant la production de masse de gels PA uniformes de taille et de forme personnalisée. La technique est plus simple et plus efficace que la norme actuelle de sandwich solution de précurseur de gel PA entre deux lamelles de verre. En outre, il ne nécessite pas de matériel sophistiqué et donc facilement adoptable par un laboratoire de recherche. Il est également plus économique car il ne nécessite pas l'utilisation de plaques de verre ou des lamelles de verre, qui sont non seulement coûteux, mais aussi sont de tailles limitées. La technique est également plus rapide pour plusieurs raisons. Tout d'abord, il ne se agit pas d'étapes de prétraitementtypique pour les surfaces de verre depuis le support en matière plastique souple est conçue avec deux surfaces distinctes - un côté hydrophile qui se fixe de façon permanente à un polyacrylamide et latérale hydrophobe pouvant être facilement décollé après la formation de gel. Deuxièmement, parce que le support plastique est flexible, il est plus facile et plus rapide à décoller le gel formé: quand gels minces sont formés entre deux lames de verre, desquamation de la lame hydrophobe supérieure est difficile et aboutit souvent à la rupture qui compromet également le gel. Enfin, en raison de la transparence de support souple en matière plastique, plus rapide polymérisation UV peut être utilisée au lieu de la polymérisation à base de TEMED type qui peut prendre jusqu'à 45 minutes (tableau 2). Les données du tableau 2 montre que la rigidité similaire lorsque le temps de polymérisation et de l'intensité de lumière UV sont optimisées peut être atteint par les deux procédés de polymérisation TEMED et UV.
Les hydrogels sont préparés sur pl souplesupport ASTIC comme représenté sur la figure 1. Il est recommandé d'effectuer la gélification dans une chambre de dégazage pour éviter une polymérisation incomplète des bords de gel (ce est à dire, des effets de bord) en raison de la diffusion d'oxygène entre les deux surfaces qui prennent en sandwich la solution de polymère. Le but est de créer un grand film d'hydrogel sur le dessus du support en matière plastique souple, par conséquent, la plaque de verre de ne importe quelle taille serait approprié, mais il va dicter la taille du film de polyacrylamide pouvant être obtenue. Le verre peut être revêtue avec ne importe quel revêtement hydrophobe ou, en variante, la partie hydrophobe du support en matière plastique souple pourrait être utilisé à la place. Une fois qu'un film de gel PA est formé, il est séché, découpé en formes désirées, puis réhydratée avant l'utilisation. Une fois sec, les gels peuvent être stockées indéfiniment. Il a été confirmé par la rhéologie, que la rigidité de gel PA ne est pas modifiée lors de la réhydratation, même lorsque les gels sont stockés à l'état sec pendant plusieurs mois (figure 2C). Cependant, pour de très soft gels (≤ 1 kPa dans le module de Young) séchage et réhydratation rainurage de surface et exacerber la formation de fissures. Ce comportement est commun pour gels doux qui subissent de-hydratation et réhydratation ultérieure tout en étant géométriquement limitée. 34,35 Pas tous gels pli ou se fissurer, ainsi, il est possible d'examiner visuellement les hydrogels avant de l'utiliser et de ne utiliser les échantillons qui affichent une surface lisse. Pour éviter complètement formation de plis et à la fissuration, une méthode alternative pour préparer hydrogels mous est représenté sur la figure 6. Ici, le support de plastique souple est prédécoupée dans la forme désirée et le gel PA est formé au-dessus, donc, les gels ne le font pas doivent être dé-hydraté mais peut être utilisé tel que préparé. Un avantage supplémentaire de cette stratégie alternative est que plus de 2,5 ~ gels peuvent être produits à partir du même volume de solution de précurseur d'hydrogel (l'estimation est basée sur la préparation de gels pour une plaque à 96 puits standard, comme décrit dans la section de protocole). Une mise en garde lorsquela préparation des hydrogels de cette manière est de prendre soin d'éviter l'infiltration d'oxygène, en particulier pour les gels de plus petite taille (par exemple, les gels à être utilisés dans une plaque de 96 puits). Même lorsque la solution de précurseur de gel est complètement dégazé, à savoir, de l'oxygène libre, l'oxygène se diffuse entre les deux surfaces qui prennent en sandwich la solution PA. Ainsi, afin d'éviter les effets de bord ou la formation de gel incomplète le long des bords, il est préférable de permettre à la polymérisation de se produire en l'absence d'oxygène. Dans notre expérience, une chambre à vide fonctionne bien, même si un environnement de gaz inerte peut être utilisé avec un égal succès.
Une dernière précaution lors de la préparation PA hydrogels substrats cellulaires pour tester les réponses des cellules rigidité dépendante, est que l'épaisseur de l'hydrogel résultant est important: pour gels très minces, les cellules sont capables de détecter le substrat sous-jacent 36 En utilisant la théorie et l'expérience,. Lin et al. a démontré que la profondeur à laquelle les cellules peuvent feel le substrat sous-jacent est fonction de la dimension latérale de la cellule. 29 Etant donné que la recherche actuelle est contradictoire, l'identification de l'épaisseur minimale nécessaire pour empêcher les cellules de détection du substrat "cachée" à aller de quelques microns 36 à pas moins de 60 microns, 37 une épaisseur de gel minimum de 100 um devrait être recherché.
Lors du montage des gels d'AP dans une plaque multipuits, une petite gouttelette de PDMS est utilisé pour fixer le gel au fond du puits. PDMS a été choisi parce qu'il agit comme de la colle permanente après durcissement, il est complètement transparent et ne interfère pas avec des expériences de microscopie ultérieures, il est entièrement non-cytotoxique, et il durcit en environ 4-8 heures en laissant suffisamment de temps pour le montage de la plaque. Assurer en toute sécurité les hydrogels au fond des aides ainsi dans la manipulation de cellules: par exemple, un lavage vigoureux pourrait déloger hydrogels sinon solidement fixée. Si des changements fréquents dans la cellule media est pas un problème, les gels peuvent être fixés temporairement à la surface du puits par une petite gouttelette d'un liquide non cytotoxique et très visqueux tels que de la glycérine.
Les étapes finales avant ensemencement cellulaire impliquent ECM revêtement du gel, puis la stérilisation. Ici collagène de type I revêtement est représenté (figure 3) alors que la même technique peut être appliquée à d'autres protéines ECM. Le bi-fonctionnelle réticulation sulfo-SANPAH est utilisé pour obtenir une couche uniforme de monocouche. Des recherches antérieures ont démontré qu'une telle fixation covalente donne un revêtement plus uniforme que l'adsorption des protéines simple et permet un réglage de 12 fois de la quantité de protéine fixée en utilisant simplement une solution de protéine de concentration variable également. 6 Enfin, la plaque de gel à puits multiples assemblé est stérilisée sous UV dans la culture de tissus hotte jusqu'à 2 h. La stérilisation UV permet le dosage à être assemblé sur une paillasse de laboratoire à l'extérieur de la hotte, quirend le processus plus simple et logistique globale plus rapide.
Les figures 4 et 5 illustrent certains des résultats représentatifs de cellules MDA-MB-231 cancer du sein cultivées sur plastique flexibles soutien-joint PA gels de rigidité variable. MDA-MB-231 ont été choisis pour démontrer l'utilité de la méthode car ils se sont révélés réagir à la rigidité du substrat sous-jacent par des modifications mesurables dans leur morphologie. 5,12 Comme on s'y attendait, les cellules sont plus allongée et a une plus grande zone d'étalement sur les gels rigides 100 kPa PA par rapport aux 0,5 douces et une gels kPa PA (figures 4 et 5). La rangée inférieure sur la figure 4 montre également l'utilisation de deux colorants fluorescents qui se colorent le noyau cellulaire et le cytoplasme des cellules, mettre en valeur le fait que le support en matière plastique souple ne interfère pas avec l'imagerie par microscope à fluorescence.
En résumé, une méthode simple pour préparer des hydrogels de polyacrylamide dans unformat de plaque à puits multiples est présenté. La technique est plus rapide, plus efficace et moins coûteuse que les méthodes actuelles de préparation des gels PA être utilisés comme substrats cellulaires ainsi que permet la préparation de gels de formats personnalisés pas disponibles autrement. Comme il ne nécessite aucun équipement spécialisé, la méthode pourrait être facilement adopté par un laboratoire de recherche et serait particulièrement utile dans la recherche axée sur la compréhension des réponses des cellules rigidité dépendante.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
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