Introduction
Die meisten Gewebe im Körper weich sind viskoelastische Materialien mit einem Young-Modul im Bereich von 0,1 kPa für Gehirn bis 100 kPa für weiche Knorpel, doch sind die meisten in vitro Zellforschung auf Gewebekulturpolystyrol (TCP) durchgeführt, die einen Modul von ~ 1 GPa hat . 1 Diese Steifigkeit Mismatch großen Einfluss auf die Art und Weise Zellen reagieren auf ihre Umwelt. Eine wachsende Zahl von Untersuchungen ist somit gewidmet Erläuterung der Wirkung des Substrats Steifigkeit auf das Schicksal verschiedener Zelltypen, 2,3 einschließlich Stammzellen. 4 Als Ergebnis wurden mehrere Hydrogele entwickelt worden, um das Verständnis der steifigkeitsabhängigen Zell helfen Biologie einschließlich Polyacrylamid (PA), 5-7 Polyethylenglykol (PEG) 8,9 Polydimethylsiloxan (PDMS), 10 und Alginat. 11 Während der Beweis, dass das Substrat Steifigkeit hat einen wesentlichen Einfluss auf das Schicksal der Zelle wächst, die meisten Untersuchungen auf geführt in kleinem Maßstab mit einer kleinen Anzahl von sBeispiele. Systematische, mehrdimensionalen Studien über die Wirkung der Substrat Steifigkeit für eine Reihe von Zelltypen oder Umweltbedingungen selten. 12
Einige vielversprechende Hochdurch Hydrogel Technologien wurden entwickelt, einschließlich PEG-Microarrays, 13 mikrofluidischen Vorrichtungen zur Herstellung von Agarose Hydrogelmikroperlen, 14 oder Mikro- und Nanostäbe denen Steifigkeit wird durch den Durchmesser und die Höhe der Mikrostäbchen moduliert. 15. Jedoch , die Technologien zur Herstellung solcher Substrate sind anspruchsvoll und für eine begrenzte Anzahl von Laboratorien. Viel Forschung an Steifigkeit moduliert Zell-Reaktionen nutzt Polyacrylamid (PA) Gele, die nicht nur preiswert und einfach zu implementieren, aber auch zeigen einen physiologisch relevanten Bereich des E-Moduls, nämlich 0,3 liegen. - 300 kPa 16 bis 22 jedoch bestehende Methoden zu PA herzustellen Gele für die Zellkultur sind arbeitsintensiv und damit prepin kleinen Chargen ared. Einige der Schwierigkeiten, die mit der Herstellung von PA-Gelen als Zellsubstrate zugeordnet ergeben sich aus der Forderung, daß die Gele hergestellt werden müssen: 1) in Abwesenheit von Sauerstoff, um eine vollständige Polymerisation zu ermöglichen, 2) mit einer flachen und glatten Oberfläche, um eine einheitliche Zell ermöglichen Befestigung und Ausbreitung, und 3) fest auf dem Boden der Zellkulturschale Aufschwimmen verhindern befestigt.
Mehrere Gruppen haben versucht, PA-Gele für die Zellkultur in großen Stückzahlen zu produzieren. Semler et al. Vorbereiteten dicken Folien aus PA-Gelen, die dann einen "Schnitt" waren mit einem Locher und in 96-Well-Platten gegeben. 23. Dieses Verfahren ist jedoch begrenzt auf steifer Gele, dh> 1 kPa im Elastizitätsmodul, da weichere Gele sind "sticky", schwierig zu schneiden und leicht beschädigt. Mih et al. Entwickelten eine ausgefeiltere Technik, die Gele direkt in einem Glasbodenmultiwellplatte polymerisiert werden können.
Dieser Aufsatz beschreibt eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, PA-Gelen in einer Multiwellplatte, die leicht von jedem Labor angenommen werden könnte zubauen. Hierbei wird eine flexible Kunststoffunterlage verwendet wird, welches zwei Seiten hat - ein hydrophobes, die abweisend zu PA-Gelen, und einem hydrophilen eine, an das kovalent das PA-Gel bei der Abscheidung. Sobald PA Gelfolien abgeschieden und dauerhaft mit dem flexiblen Kunststoffträger befestigt sind, ermöglicht es der Handhabung Gele beliebiger Dicke oder Steifigkeit und schneidet sie in jede gewünschte Form. Diese ca.oach erzeugt nicht nur individuelle Kunststoff 'Deck' in Größen im Handel nicht erhältlich, sondern auch beseitigt die Notwendigkeit, Glasoberflächen-treat vorab entweder Glasplättchen oder die Vertiefungen der teuren Glasboden-Mikrotiterplatten mit einer PA-Bindungslösung, welche ist eine mühsame und zeitraubenden Schritt. Schließlich kann eine gleichmäßige PA Gele Blätter in großen Stückzahlen hergestellt und gelagert de-hydrierten mehrere Monate werden.
Zusammenfassend ist der Assay hier vorgestellt ist eine Verbesserung gegenüber bestehenden Verfahren in mehrfacher Hinsicht. Erstens ist der Prozeß der Vielmuldenplatten-Anordnung effizient, und die Gesamtkosten der benötigten Materialien ist gering. Zweitens werden die Hydrogele in großen Chargen in einem einzigen homogenen Gelfilm hergestellt. Schließlich werden nur Materialien, die im Handel erhältlich sind erforderlich. Die Nützlichkeit des Assays wird durch die Erforschung der Wirkung des Substrats Steifigkeit auf die Zellmorphologie und die Ausbreitungsfläche dargestellt.
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Protocol
1. Herstellung der Hydrogel-assoziierten Solutions und Aliquots
- Herstellung Polyacrylamidgel Precursorlösung.
- Bereiten Polyacrylamidgel Vorläuferlösung durch Mischen Acrylamid (A) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), das Vernetzungs Bisacrylamid (B) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), und Ent- entionisiertes Wasser in den in Tabelle 1 angegebenen Volumenanteile.
ANMERKUNG: Diese Lösungen können in großen Serien hergestellt und bei 4 ° C für bis zu mehreren Monaten gelagert werden.- ACHTUNG: Acrylamid ist giftig beim Einatmen oder Verschlucken, vor allem, wenn in Pulverform: So verwenden bevorzugt 40% w / v-Lösung, um die Toxizität Risiken zu reduzieren. Handle nur beim Tragen von Schutzkleidung, wie Handschuhe, Schutzbrille und Laborkittel. Speichern Sie in einem leicht-widerstandsfähigen, dicht geschlossenen Behälter im Kühlschrank (<23 ° C, gut belüfteten Bereich).
- ACHTUNG: Bis-Acrylamid ist giftig beim Einatmen oder Verschlucken, vor allem,wenn in Pulverform: So verwenden vorzugsweise 2% w / v-Lösung, um die Toxizität Risiken zu reduzieren. Handle nur beim Tragen von Schutzkleidung, wie Handschuhe, Schutzbrille und Laborkittel. Speichern Sie in einem leicht-widerstandsfähigen, dicht geschlossenen Behälter im Kühlschrank (<4 ° C, gut belüfteten Bereich).
- Bereiten Polyacrylamidgel Vorläuferlösung durch Mischen Acrylamid (A) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), das Vernetzungs Bisacrylamid (B) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), und Ent- entionisiertes Wasser in den in Tabelle 1 angegebenen Volumenanteile.
- Herstellung und Verwendung von N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat (Sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) Aliquots. ACHTUNG: Sulfo-SANPAH verursacht schwere Augenreizung; Handgriff mit Handschuhen und Augenschutz oder Gesichtsschutz. Lagerung bei -20 ° C nach Erhalt und vor der Aliquotierung.
- Um sulfo-SANPAH speichern: auflösen Sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) bei 50 mg / ml. Aliquot der Stammlösung in 50 Mikrozentrifugenröhrchen von 20 ul pro Röhrchen. Flash-Freeze auf Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff (optional aber bevorzugter Schritt, um eine maximale Effizienz zu bewahren Vernetzer) und bei -80 ° C.
HINWEIS: Die Aliquots can für mehrere Monate gelagert werden. - Um Sulfo-SANPAH verwenden: Auftauen des Aliquots kurz und in 480 ul entionisiertem Wasser verdünnen. Verwenden Sie sofort. Sulfo-SANPAH hydrolysiert schnell in Wasser: daher ist Vorsicht geboten, um alle der oben genannten Schritte schnell durchzuführen.
- Um sulfo-SANPAH speichern: auflösen Sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) bei 50 mg / ml. Aliquot der Stammlösung in 50 Mikrozentrifugenröhrchen von 20 ul pro Röhrchen. Flash-Freeze auf Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff (optional aber bevorzugter Schritt, um eine maximale Effizienz zu bewahren Vernetzer) und bei -80 ° C.
- Herstellung von Ammoniumpersulfat (M r 228.18 g / mol) Aliquots.
HINWEIS: Ammoniumpersulfat verursacht Augen, Haut und Atemwege reizen. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung beim Umgang. Griff Ammoniumpersulfat Pulver in einem Chemieabzug benutzen. Shop Pulver an einem trockenen, gut belüfteten Ort aufbewahren. Sobald aliquotiert könnte der verdünnten Lösung auf dem Arbeitstisch eingesetzt werden.- Löse Ammoniumpersulfat in entionisiertem Wasser auf eine endgültige Ammoniumpersulfat-Konzentration von 10% w / v zu erreichen. Aliquotieren und bei -20 ° C. Auftauen unmittelbar vor der Verwendung.
- Erstellung von Kollagen Typ I-Lösung.
- Bereiten 0,2 mg / ml Kollagenlösung durch das Lager Verdünnung sosung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) von pH 7,4. Lagerung auf Eis kurz oder verwenden Sie sofort nach Verdünnung.
2. Hydrogel Vorbereitung (Siehe Abbildung 1)
- Vorbereitung der hydrophoben Glasobjektträger.
- Legen Sie ein paar Tropfen einer hydrophoben Lösung auf einer Glasplatte und mit Seidenpapier über die Oberfläche verteilt. Luft trocknen lassen und mit einem Seidenpapier abzuwischen wieder zum Ausgleich der hydrophoben Beschichtung.
HINWEIS: Shop hydrophoben Lösung in einem brennbaren Schrank bei RT. Persönliche Schutzausrüstung Bei der Handhabung. Arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich.
- Legen Sie ein paar Tropfen einer hydrophoben Lösung auf einer Glasplatte und mit Seidenpapier über die Oberfläche verteilt. Luft trocknen lassen und mit einem Seidenpapier abzuwischen wieder zum Ausgleich der hydrophoben Beschichtung.
- Herstellung von flexiblen Kunststoffträger.
- Schneiden Sie das flexible Kunststoffträger, um die Größe der hydrophoben-beschichtete Glasplatte entsprechen.
- Markieren Sie die hydrophobe Seite der flexiblen Kunststoffträger durch leichtes Kratzer auf der Oberfläche mit einem scharfen Werkzeug, wie ein Skalpell.
HINWEIS: Sobald das Gel - die vollständig transparent ist - trocknetDie Kratzspuren hilft unterscheiden, welche flexible Kunststoffträgerseite des Gels enthält.
HINWEIS: Der flexible Kunststoffträger eine hydrophobe und eine hydrophile Seite. Einmal aufgebracht, Polyacrylamid haftet dauerhaft auf die hydrophile Seite der Kunststoffträger, der einfach nachfolgenden Hydrogel Handhabung erleichtert.
- Gel-Vorbereitung (zB Volumen werden 5 ml Gel-Vorstufe Lösungen angegeben).
HINWEIS: 5 ml ausreichen würde, um 40 Gelen ~ wenn das Gel Anfangsdicke beträgt 0,5 mm. Weitere Gele können hergestellt werden, wenn das Gel Dicke reduziert.- Platzieren 4972,5 ul Polyacrylamid Precursorlösung gewünschten Endkonzentration (Tabelle 1) in einer 50 ml konischen Röhrchen. In eine Entgasungskammer 30 min mit der Kappe geöffnet wird.
HINWEIS: Sauerstoff wirkt als Falle für freie Radikale und, falls vorhanden, es hemmt Polymerisation. - In 25 ul von 10% w / v Ammoniumpersulfat (siehe Punkt 1.3) eine endgültige zu erreichenAmmoniumpersulfat-Konzentration von 0,05%.
- Hinzufügen 2,5 ul N, N, N ', N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED, M r 116.24 g / mol), um die entgaste Gellösung, um eine endgültige TEMED-Konzentration von 0,5% zu erzielen.
HINWEIS: Shop TEMED in einer entflammbaren Schrank bei RT. Griff in einem Laborabzug, wenn das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. Dicht unter Schutzgas geschlossen, wie es ist sehr luft- und feuchtigkeitsempfindlich. - Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Auf-und Abpipettieren 3-5 mal. Vortexen keine Sauerstoffdiffusion in das Gel Vorläuferlösung zu vermeiden.
- Pipettieren Gel-Lösung auf die hydrophile Seite der flexiblen Kunststoffträger und Sandwich mit hydrophob beschichteten Objektträger. Man trennt die beiden Schieber mit Silikonabstandshalter mit der gewünschten Dicke (zum Beispiel 0,5 mm). Hinterlassen eine kleine Menge (~ 100 & mgr; l) aus Polymervorläufer-Lösung im 50 ml konischen Röhrchen als ein Indikator für die Gelierung verwendet werden.
HINWEIS:Jede Abstands könnten verwendet werden. Beispielsweise kann ein einzelner Streifen von Parafilm zu einer endlichen gequollenen Gels Dicke von 100 bis 120 & mgr; m. - Legen Sie eine andere Glasplatte oben auf dem flexiblen Kunststoffträger / Gel-Sandwich, eine noch Hydrogeloberfläche bei der Polymerisation zu ermitteln.
- Lassen Sie das Gel polymerisieren 45 min, wenn auch weniger Zeit für Gele höherer% Gew falls gewünscht, verwendet werden. Um sicherzustellen, daß das Gel polymerisiert, beobachten die verbleibende Lösung im 50 ml konischen Röhrchen; wenn die verbleibende Lösung geliert, dann ist es wahrscheinlich, dass die Gelbildung auf der Glasplatte wurde ebenfalls eingeleitet. Beachten Sie jedoch, dass eine vorzeitige Öffnen der Form wird eine vollständige Polymerisation zu verhindern.
- Sobald das Gel gebildet wird, ziehen Sie die flexible Kunststoffträger mit dem kovalent gebundenen Polyacrylamidgel auf, und stellen Sie Gel-Seite nach oben an der Luft trocknen.
HINWEIS: Konvektion oder Wärmetrocknung kann auch verwendet werden, um diesen Schritt zu beschleunigen. Einmal auf das flexible Kunststoffträger getrocknet, kann das Gel Speicher seinauf unbestimmte Zeit d.- Markieren Sie keine blanken Stellen der flexiblen Kunststoffträger, in Polyacrylamidgelen nicht aufgrund von Blasen zu bilden. Mark, während das Gel noch mit Feuchtigkeit, da dies harmonisch in die flexible Kunststoffträger, sobald das Gel trocken ist.
- Platzieren 4972,5 ul Polyacrylamid Precursorlösung gewünschten Endkonzentration (Tabelle 1) in einer 50 ml konischen Röhrchen. In eine Entgasungskammer 30 min mit der Kappe geöffnet wird.
3. Multiwellplatte Montage, Collagen-Beschichtung und Sterilisation
- Multiwell-Platte Montage.
- Einmal getrocknet, geschnitten PA-Gele in die gewünschte Form.
- Für eine 96-Well-Platte, mit einem schweren Locher mit einem Durchmesser von ca. 6 mm. Verwenden Sie einen schweren Papierschneider zu Gelen in quadratische oder rechteckige Form. Alternativ können Sie auch eine Schere.
- Bereiten etwa 500 ul PDMS pro 96-Well-Platte nach den Angaben des Herstellers. Um die Gele zum Boden einer Multiwell-Platte zu kleben, legen ein kleines Tröpfchen (~ 5 & mgr; l) aus Polydimethylsiloxan (PDMS) in der Mitte der jeweils gut. Mit einer Pinzette, legen Sie eine Polyacrylamide-Gel in jede Vertiefung, flexible Kunststoffträger nach unten. Damit PDMS zu heilen, lassen Sie die montierten Platte bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden.
- Einmal getrocknet, geschnitten PA-Gele in die gewünschte Form.
- Kollagenbeschichtung von Polyacrylamidgelen.
- Mit einer Transferpipette, legen Sie eine kleine Menge (7-8 ul) sulfo- SANPAH (siehe Punkt 1.2.2) von der Seite gut und Wirbel in jeweils zur Beschichtung der Gel-Oberfläche gleichmäßig und her. Arbeiten schnell, da Sulfo-SANPAH in Wasser nicht stabil sind.
- Legen Sie die Well-Platte unter einer hohen Intensität UV-Lampe (Intensität = 37 mW, λ = 302 bis 365 nm) für 5 min. Spülen Sie die Gele mit PBS, um überschüssige sulfo-SANPAH entfernen.
- Je 50 ul 0,2 mg / ml Kollagen Typ I-Lösung (siehe Punkt 1.4) in jede Vertiefung. Lassen Sie das bei RT, abgedeckt für mindestens 2 h oder O / N bei 4 ° C Platte.
HINWEIS: Um den Prozess der Kollagenbeschichtung kann eine Transferpipette verwendet werden, um die Kollagenlösung hinzuzufügen. In der Regel 1 - 2 sollte Tröpfchen Lösung genug, um zu vollendenly decken die Gel-Oberfläche. - Verlassen Sie die Well-Platte bei Raumtemperatur für mindestens 2 h, Kollagen Bindung ermöglichen.
- Spülen mit PBS, um überschüssige Kollagenlösung in einem Gewebekulturabzug für 2 h zu entfernen und zu sterilisieren, unter UV (λ = 200 nm).
- Weichen Sie die Gele in Vollmedium (siehe Abschnitt 4.1 für den Mittelzusammensetzung) O / N zu Hydrat und ins Gleichgewicht kommen. Verwenden Sie für die Zell Aussaat sofort oder lagern im Kühlschrank bis zu 2 Tage.
4. Zellaussaat auf PA Steifigkeit Assay
HINWEIS: Obwohl typisch für gemeinsame Säugerzelllinien, das Protokoll in diesem Abschnitt beschrieben ist speziell mit dem Brustkrebs MDA-MB-231 Zelllinie verwendet (siehe 4 und 5).
- Sammeln Zellen aus Gewebekulturkolben durch Behandlung mit 5% Trypsin / EDTA für 5 min bei 37 ° C. Verwenden ~ 80 ul Trypsin / EDTA pro jeder cm2 Kulturflasche Bereich; zum Beispiel verwenden 2 ml Trypsin / EDTA-fora T25 Zellkulturflasche. Resuspendieren gesammelten Zellen in komplettem Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt war, bei einer gewünschten Endkonzentration an Zellen. Unter Berücksichtigung der Zellverdopplungszeit sowie der Länge der Zeit die Zellen auf den Assay ausgesät werden, wählen einen geeigneten subkonfluenten Zellkonzentration. Stellen Sie sicher, dass hinzugefügt Medium ist genug, um die Hydrogele vollständig bedeckt.
HINWEIS: Da die Hydrogele wurden in Medien voräquilibriert (siehe 3.2.6 Schritt) 100 ul Volumen ist ausreichend. Typische mittlere Volumen für Multiwell-Platten verwendet wird, sollte ausreichend sein, da die Gele wurden in Medien, voräquilibriert in dem vorherigen Schritt.
Hinweis: Der Test wäre für jede Anlage abhängigen Zelltyp geeignet.- Zählen der Zellzahl unter einem Umkehrmikroskop unter Verwendung eines Hämacytometers. Last 10 ul Zellsuspension in jede Hämazytometer Port und mittelt die Zellenzahl von mindestens 8 Quadranten. Um das zu bekommenEndzellkonzentration, multiplizieren Sie die Zellzahl um 10 4.
HINWEIS: Best Zellzahl Ergebnisse werden erhalten, wenn die Zellzahl in jeder Hämazytometer Quadranten 20-50.
- Zählen der Zellzahl unter einem Umkehrmikroskop unter Verwendung eines Hämacytometers. Last 10 ul Zellsuspension in jede Hämazytometer Port und mittelt die Zellenzahl von mindestens 8 Quadranten. Um das zu bekommenEndzellkonzentration, multiplizieren Sie die Zellzahl um 10 4.
- Kultur die Zellen auf der PA Steifigkeit Assay in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. Sammeln Zellen, wenn es durch Behandlung mit 5% Trypsin / EDTA für 5 min benötigt bei 37ºC. Verwenden ~ 80 ul Trypsin / EDTA pro cm 2 Zellkulturflasche. In allen Zellmanipulationsschritte, besonders darauf achten, um das Hydrogel Oberfläche stören: absaugen oder Pipettenmedium leicht Kippen der Multiwellplatte seitlich und Berühren der Pipettenspitze auf die Seitenwand jeder Vertiefung, im Gegensatz zum Berühren des Hydrogels.
HINWEIS: Außer für die besondere Sorgfalt, nicht um das Hydrogel Oberfläche während des Standard-Gewebekultur Handhabung Schäden verursachen, ausgesät die Zellen auf die Steifigkeit Test kann auf die gleiche Weise manipuliert, als ob sie auf ausgesät wurden werdenzu einem regulären Multiwellplatte.
5. Imaging von Zellen auf PA Steifigkeit Assay Gesetzte
- Bildzellen direkt an der PA Steifigkeit Assay.
HINWEIS: Jedes Mikroskop - invertiert, fluoreszierenden oder konfokalen kann für Cell Imaging verwendet werden.
HINWEIS: Das flexible Kunststoffträger verwendet werden, um die Steifigkeit Assay zu konstruieren ist völlig transparent und nicht Autofluoreszenz oder stören Cell Imaging. Jedoch, obwohl der flexible Kunststoffträger selbst ist transparent, Abbildungsfunktionen werden von der Arbeitsabstand der Objektiv begrenzt. Das flexible Kunststoffträger hat eine Dicke von 0,23 mm und einem typischen Arbeitsabstand von einem 10X-Objektiv ist ca. 4 mm, stark abnehm höheren Vergrößerungen.- Für Live Cell Imaging, Position PA Steifigkeit Assay in Mikroskopplattenhalter und Bild. Halten Sie Imaging-Sitzungen unter 2 Stunden, oder verwenden Sie ein Mikroskop mit einer Klimakammer für längere Aufnahmezeiten ausgestattet.
- Bei lebenden Zellen imAltern ist nicht das Ziel, zu beheben Zellen in 4% Formaldehyd-Lösung mit 0,1% Reinigungsmittel ergänzt. Tränken Zellen Fixiermittel bei RT für mindestens 2 Stunden. Spülen Sie zweimal mit PBS. Entsorgen Fixiermittel Abfälle in einem bestimmten Abfallbehälter.
HINWEIS: Die Zellen können unmittelbar abzubildenden oder gelagert in PBS für bis zu 2 Wochen unter Wasser bei 4 ° C. ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig beim Einatmen und Berührung. Mit Handschuhen in einem Chemieabzug benutzen.
HINWEIS: Zellfixierung Protokoll muss auf der Grundlage der nachfolgenden Zellfärbung und Handhabung Protokolle gewählt werden, weil bestimmte Fixative beschädigen einige Zellproteine. - Für Fluoreszenz-Imaging, Fest Fleck Zellen mit gewünschten Zell Fleck direkt in der Multiwellplatte. Sofort Bild.
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Representative Results
Polyacrylamid (PA) Hydrogele werden allgemein verwendet, um die Steifigkeit abhängige Zell-Reaktionen zu testen. 17,24 durch Mischen verschiedener Konzentrationen von Acrylamid (A) und bis-acrylamid (B) kann man PA-Gelen, welche die Steifigkeit Bereich der meisten Weichgewebe in umspannen machen der Körper - 0,3 -. 300 1 ist jedoch Herstellung Polyacrylamidgelen mühsam und zeitaufwendig, häufig ihre Nützlichkeit in "Hochdurchsatz" Anwendungen, wie zum Beispiel Arzneimittel-Screening Begrenzungs 12 Hier kPa Elastizitätsmodul, ein einfaches und schnelles Verfahren zur. Zusammenbauen PA Gele in Multi-Well-Platten oder andere wünschenswerte Gewebekulturgefäß dargestellt (Abbildung 1). Die 2A zeigt das Elastizitätsmodul in Abhängigkeit von mehreren A und B-Konzentrationen (ebenfalls in Tabelle 1 zusammengefaßt). Die E-Module A und B zusätzliche Kombinationen sind in der Literatur 17,25,26 Das Gel Steifigkeit vollständig Swolle gemeldet.10 Hz und 2% Dauerbelastung - n Gele wurde von Rheologie (AR 2000ex Rheometer TA Instruments) mit einem 20 mm obere parallele Geometrie, Schwingungsfrequenz Vibrationstest 1 gemessen. Wie erwartet, wurde demonstriert, dass sowohl Speichermodul G 'und Verlustmodul G ", sind unabhängig von der Frequenz (2B). Es wurde auch bestätigt, dass das Trocknen und dann wieder die feuchtigkeitsspendende Gele, nicht ihre E-Modul (2C) zu beeinflussen. Young-Modul wurde mit dem Speichermodul durch folgende Gleichung bezogen werden: 
wobei E der Elastizitätsmodul ist und v der Poisson-Konstante, die 0,5 für PA-Gelen angenähert wurde. 27 bemerkt, daß die angegebenen Werte gelten für Hydrogele mit TEMED hergestellt. PA Hydrogele können auch durch UV-Vernetzung vorbereitet, wenn die Belichtungszeit und die UV-Intensität optimiert werden (
Ferner wurde gezeigt, dass Zellen auf Hydrogele unterschiedlicher stiffne ausgesätss zeigten unterschiedliche Morphologie. 72 h - Für dieses Experiment wurden Brustkrebs MDA-MB-231-Zellen auf der Oberseite der PA-Gele für 24 geimpft. Die Zellen wurden in RPMI-Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C und 5% CO 2 ergänzt in einem befeuchteten Inkubator kultiviert. Zellen wurden bei 1 x 10 5 Zellen / ml oder 1 x 10 4 Zellen / Vertiefung für eine 96-Well-Platte geimpft. Dies ist eine typische Zellansiedlungsdichte - 4-fach niedriger als die Konfluenz der Zelldichte, bei Konfluenz eine Säugerzelllinie bei ~ 1 x 10 5 Zellen / cm 2 erreicht wird. Bilder wurden auf umgekehrten Fluoreszenzmikroskop auf ImageJ über die Form und Descriptor Bereich Software-Plugins entnommen und analysiert. Es wurde beobachtet, dass, wenn auf dem PA-Gele für 24 Stunden angeimpft blieben Brustkrebs MDA-MB-231-Zellen über auf den weichen 0,5 und 1 kPa Gele, konnten aber zu verbreiten und auf der länglichen steifen 100 kPa Gel (Abbildung 4). Abbildung 4 showcas auches die Tatsache, dass Hydrogele auf der Oberseite des flexiblen Kunststoffträger hergestellt sind transparent und ermöglichen eine einfache Visualisierung und Mikroskopie. Weiterhin hat der flexible Kunststoffträger keine Autofluoreszenz und somit nicht mit der Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Zellen stören. Rundheit (Bild 5) - Zellmorphologie wurde in Bezug auf die gesamte Zellausbreitung Bereichs- und Zellenformfaktor quantifiziert. Zellausbreitungsfläche wurde durch die Bildung einer Maske, um den Umfang jeder Zelle zu verfolgen gemessen. Zellenform (Rundheit) wurde dann aus der folgenden Beziehung berechnet wird: 
1, wobei 0,6 - - 1 wurden genommen, um abgerundete Zellen bezeichnen und auf 0 - 0,5 wurden zur länglichen Zellen bezeichnen Kreisförmigkeit wird auf einer Skala von 0 gemessen. Ungefähr dreihundert Zellen von mindestens drei unabhängigen Experimenten wurden für jeden Daten poin analysiert t. Statistische Unterschiede wurden basierend auf Einzelfaktor-Varianzanalyse (ANOVA), wo Datensätze wurden als signifikant, wenn p <0,05 berechnet.
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Polyacrylamidgel Vorbereitung auf flexiblen Kunststoffträger. Die Figur stellt die verschiedenen Schritte bei der Herstellung von PA-Gelen auf flexiblen Kunststoffträger beteiligt. Nachdem das Gel vollständig trocknet, kann es ausgeschnitten oder in jede gewünschte Form gestanzt werden. Eine ganze Stempel (~ 6 mm Durchmesser) ist am bequemsten, wenn Herstellung von Gelen für eine Platte mit 96 Vertiefungen, während eine schwere Papierschneider kann für quadratische oder rechteckige Formen verwendet werden. Die Figur zeigt auch die Ränder der Vertiefungen, sowohl mit als auch ohne ein Gel, um zu zeigen, daß eine vollständige und unteren Abdeckung kann mit diesem Verfahren erreicht werden kann. oad / 52.643 / 52643fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Steifigkeit PA Hydrogele wie Rheologie gemessen. (A) Beauftragte Young-Modul für fünf verschiedene A & B-Konzentrationen (siehe Tabelle 1 für Akronyme), (B) Lagerung und Verlustmodul als Funktion der Frequenz, wie Rheologie gemessen, (C) Gele weisen die gleiche E-Modul zunächst (Initial) und nachdem sie getrocknet und rehydratisiert (rehydratisiert) unabhängig von Polymervorstufenkonzentration. 1,5 mm Höhe (bei vollständiger Quellung) - Alle Gele für die Rheologie-Messungen wurden als Platten von 20 mm Durchmesser und 1 hergestellt.
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Abbildung 3. Collagen-Beschichtung auf PA-Gelen. Die Kollagenbeschichtung (grün) wird effizient verteilt und auf die PA-Gel (rot) Oberfläche unabhängig von Hydrogel Steifigkeit Elastizitätsmodul) erhalten. Kollagen mit Cy5 markiert wurde für diese Daten verwendet wird. Red-fluoreszierende Kügelchen wurden in die PA-Hydrogel, Beihilfen Visualisierung eingebettet. Schnittbilder wurden auf einem konfokalen Mikroskop (Maßstab = 100 um). Bild von Zustiak et angepasst übernommen. al. 5 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Phase Vertrag (obere Reihe) und Leuchtstofflampen (untere Reihe) Bilder von MDA-MB-231-Zellen auf PA-Gele für 24 Stunden ausgesät. MDA-MB-231-Zellen bleiben Runde auf weichen Gele (Young 7; E-Modul von 0,5 und 1 kPa), sondern länglich auf steifen PA-Gelen (Young-Modul von 100 kPa). Die Zellen wurden auf die Gele für 24 Stunden ausgesät, in Ethanol fixiert und mit Acridinorange angefärbt (AO - grün), um die Zelle Zytoplasma und DAPI (blau), um Zellkern sichtbar zu visualisieren; Balken = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Zellausbreitungsfläche und Kreisförmigkeit werden durch die Steifigkeit des darunterliegenden Substrats beeinflußt. (A) MDA-MB-231 Zellausbreitungsfläche signifikant auf 100 kPa erhöht, im Gegensatz zu den 0,5 kPa Gele. (B) Zell Kreisförmigkeit mit Zunahme PA Gelsteifheit abnimmt. Sternchen bezeichnen signifikante Unterschiede; p <0,05.
Figur 6 Schematische Darstellung einer alternativen Polyacrylamidgel Vorbereitung auf flexiblen Kunststoffträger. Die Figur stellt die verschiedenen Schritte bei der Herstellung von PA-Gelen auf flexiblen Kunststoffträger beteiligt. Hier wird der flexible Kunststoffträger wird zunächst in Kunststoff "Deck" einer gewünschten Form und Größe vorgeschnitten. Diese Technik funktioniert am besten für weichen Hydrogele. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| Akronym | Acrylamid% | Bisacrylamid% | Acrylamid von 40% Stammlösung (ml) | Bisacrylamid von 2% Stammlösung (ml) | Wasser (ml) | G '± Standardabweichung (kPa) | E ± Standardabweichung (kPa) |
| PA1 | 5 | 0,025 | 625 | 62,5 | 4312,5 | 0,62 ± 0,19 | 1,85 ± 0,57 |
| PA2 | 5 | 0.1 | 625 | 250 | 4125 | 3,55 ± 0,12 | 10,64 ± 0,36 |
| PA3 | 8 | 0.1 | 1000 | 250 | 3750 | 9,71 ± 0,64 | 29,14 ± 1,93 |
| PA4 | 8 | 0,25 | 1000 | 625 | 3375 | 22,00 ± 2,10 | 66,01 ± 6,31 |
| PA5 | 12 | 0,25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37,42 ± 2,68 | 112,25 ± 8,03 |
Tabelle 1 Konzentrationen von Acrylamid (A) und Vernetzungsmittel bis-Acrylamid (B), und die resultierende PA Gelsteifheit. Steifigkeit, hier von G 'und E dargestellt ist, wurde von der Rheologie gemessen. G 'der Speichermodul bei 1 Hz Frequenz. Elastizitätsmodul, E, wurde aus der Gleichung berechnet. 1. Standardabweichung (SD) wurde auf drei unabhängigen Experimenten mit 3-5 Proben gemessen pro Experiment berechnet. Die Abkürzungen in der Tabelle entsprechen den in 2A verwendeten Akronyme.
| UV-Intensität = 15 mW / cm 2 | Expositionszeit = 300 Sekunden | ||
| Zeit (s) | E (kPa) ± SD | InIntensität (mW / cm 2) | E (kPa) ± SD |
| 75 | 0,14 ± 0,03 | 15 | 28,05 ± 2,62 |
| 100 | 6,98 ± 2,34 | 26 | 21,13 ± 3,01 |
| 125 | 19,11 ± 2,29 | 37 | 20,01 ± 2,38 |
| 300 | 28,05 ± 2,62 | 66 | 19,35 ± 2,86 |
Tabelle 2. UV-Polymerisation ist eine Alternative und eine schnellere Methode zur PA-Zubereitung, wenn Gelieren Bedingungen optimiert werden; PA3 (siehe Tabelle 1) gel dargestellt. Tabelle fasst die resultierenden Elastizitätsmodul, wenn eine Belichtungszeit (links zwei Spalten) oder UV-Intensität (rechts zwei Spalten) abwechslungsreich für die gleiche Lösung sind. Basierend auf den Ergebnissen der Tabelle geht hervor, daß 300 Sekunden Belichtungszeit und 15mW / cm 2 UV-Intensität geben die höchste PA Gelsteifheit, die vergleichbar mit der Steifigkeit der traditionell polymerisierten Gel ist, wie in Tabelle 1 angegeben.
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Discussion
Polyacrylamid-Gele, die ursprünglich für die Elektrophorese entwickelten, 28 werden nun routinemßig als Zellkultursubstrate verwendet werden, um die Auswirkungen von Substrat Steifigkeit auf die Zellmorphologie, Motilität und Kommunikations 3,24,29 unter anderem Zelleigenschaften zu untersuchen. Polyacrylamid ermöglicht die Bearbeitung der Substratsteifigkeit um die Steifigkeit aller Weichteile im Körper umfassen (0,3 bis 300 kPa) 1 mit einer einfachen Änderung der Polymervorstufe Konzentration (Abbildung 2, Tabelle 1, siehe auch Referenzen 17,25,26). Der Tatsache, dass PA-Gele sind relativ preisgünstig und einfach herzustellen gekoppelt, haben sie nicht mehr wegzudenken Plattformen in der Studie der Steifigkeit abhängige zell Material Wechselwirkungen. Jedoch, obwohl einfach, die aktuelle Technik zur Herstellung von PA-Gelen auf kleine Chargen beschränkt. Diese Grenzen ergeben sich aus der Natur des Hydrogels Gelierung, die eine radikalische Polymerisation von Ammoniumpersulfat katalysierteund TEMED. 30. Da die Reaktion eine Radikalkettenpolymerisation, es kann von jedem Element, das als Falle für freie Radikale dient, wie Sauerstoff gehemmt werden kann. Da die Sauerstoffdiffusion in die Polymerlösung muss während der Polymerisation vermieden werden - die bis zu 45 Minuten dauern könnte für die weichsten Gele - einfach Pipettieren der PA-Gele in eine offene Multiwellplatte nicht möglich ist. Auch als eine zweidimensionale (2D) Zellsubstrat verwendet wird, sollte die Oberfläche des PA-Gel flach sein. Beide der oben genannten Anforderungen diktieren, dass der PA-Gele herzustellen, wie 2D Zellsubstrate, PA Gelvorstufe Lösung sollte zwischen zwei ebenen Flächen bei der Polymerisation eingeschlossen werden - Sauerstoffdiffusion inhibiert und glätten die Geloberfläche. Zusätzlich hat die obere Fläche zu sein, daß sie leicht lösen könnte aus dem Gel Aussetzen der Oberfläche für die Zellanheftung. Dies wird typischerweise durch hydrophobe Beschichtung einer Glasoberfläche erreicht. Schließlich, wenn es in th positionierte Wells einer Multiwellplatte, sollten die PA-Gelen die gesamte Erdoberfläche abzudecken und Aufschwimmen begrenzt werden. Komplette sowie Unterseite Abdeckung ist in Anwendungen besonders wichtig, wenn die verwendet werden, um die Zellen zu bewerten Assays sind der Typ, der in der Vertiefung (zB, MTT) berücksichtigt die gesamte Zellpopulation. Wenn der PA-Gel nicht ausreichend die gesamte Erdoberfläche abzudecken, muss darauf geachtet werden, die Zelladhäsion an dem freiliegenden Bohrlochoberfläche zu blockieren als Zellen leicht rollen kann aus dem Gel auf das Glas oder Kunststoff sein. Ggf. BSA Sperr nach Standardprotokollen oder mit handelsRegal BSA Basis Zelladhäsion Sperr Kits sollte ausreichen, um die Zellbindung an die Unterseite der Platte und zu blockieren. Zum Beispiel, um eine BSA-bedeckte Oberfläche vorzubereiten, 0,5 mg / ml Lösung von BSA in PBS, pH 7,4, sollte auf die Gewebekulturschale für 20 min bei RT inkubiert, mit PBS gespült adsorbiert und oder bei 4 ° C gelagert sofort verwendet bis zu 2 Wochen. BSA wurde gezeigt, Zelladhäsion o blockierenf Säugerzellkulturen auf beiden hydrophilen und hydrophoben Polystyroloberflächen werden erheblich reduziert Zelladhäsion Kräfte, wie durch Rasterkraftmikroskopie gemessen. 31 BSA wurde routinemäßig verwendet, um Säugetier-Zell-Adhäsion zu erstellen sowie Zell gemusterten Oberflächen zu blockieren. 32,33
Die in diesem Artikel dargestellt Technik erfüllt alle der oben genannten Anforderungen ermöglicht die Massenproduktion von einheitlichen PA-Gele von kundenspezifischen Größe und Form. Die Technik ist einfacher und effizienter als der aktuelle Standard der sandwich PA Gelvorläufer-Lösung zwischen zwei Glasdeckgläschen. Darüber hinaus macht es keinen hoch entwickelten Geräten erfordern und ist daher leicht Herrenlose von einem Forschungslabor. Es ist auch kostengünstiger, da es nicht die Verwendung von Glasplatten oder Glasplättchen, die nicht nur teuer sind erforderlich, jedoch kommen auch in begrenzten Größen. Die Technik ist auch schneller aus mehreren Gründen. Erstens ist es nicht irgendwelche Vorbehandlungsschritte umfassentypisch für Glasflächen, da die flexible Kunststoffträger wird mit zwei verschiedenen Oberflächen entwickelt - eine hydrophile Seite, die ständig wird an Polyacrylamid und einer hydrophoben Seite, die sich leicht ab, nachdem Gelbildung abgezogen werden konnte. Zweitens, weil der Kunststoffträger ist flexibel, ist es einfacher und schneller ablösen gebildeten Gels: wenn dünne Gele werden zwischen zwei Glasplättchen gebildet wird, das Abziehen der oberen hydrophoben Schieber ist schwierig und führt häufig zu einem Bruch der ebenfalls beeinträchtigt das Gel. Schließlich müssen, da der flexible Kunststoffträger Transparenz können schneller UV-Polymerisation eingesetzt werden, im Gegensatz zu dem Standard TEMED Polymerisationsinitiator auf der Basis der bis zu 45 min (Tabelle 2) einnehmen kann. Die Daten in Tabelle 2 zeigt, dass, wenn die Polymerisationszeit und UV-Lichtintensität optimiert ähnliche Steifigkeit kann durch beide TEMED und UV-Polymerisationsverfahren erreicht werden.
Die Hydrogele auf flexiblen pl vorbereitetastic Träger wie auf Abbildung 1 dargestellt ist. Es wird empfohlen, um die Gelierung in einer Entgasungskammer durchzuführen unvollständigen Polymerisation der Gel Kanten (dh Kanteneffekte) infolge Sauerstoffdiffusion zwischen den beiden Oberflächen, die die Polymerlösung zwischen sich vermeiden. Das Ziel ist es, eine große Hydrogel Film auf der Oberseite des flexiblen Kunststoffträger zu schaffen, damit Glasplatte jeder Größe angemessen ist, aber es wird die Größe des Polyacrylamid-Film, der erreicht werden kann diktieren. Das Glas kann mit einer beliebigen hydrophoben Beschichtung oder alternativ könnte die hydrophobe Seite des flexiblen Kunststoffträger stattdessen verwendet werden, beschichtet werden. Sobald ein PA Gelfilm gebildet wird, wird es getrocknet, in die gewünschten Formen geschnitten und dann rehydratisiert vor der Verwendung. Wenn es trocken ist, können die Gele unbegrenzt lagerfähig. Es wurde von Rheologie bestätigt, dass der PA-Gel Steifigkeit unverändert bei der Rehydratisierung selbst wenn die Gele in trockenem Zustand über mehrere Monate (2C) gespeichert. Jedoch für sehr soft-Gelen (≤ 1 kPa Elastizitätsmodul) Trocknen und Rehydration exacerbate Fläche Rillen und Rissbildung. Dieses Verhalten ist für weiche Gele, die de-Hydration und anschließende Rehydratation unterziehen, während sie geometrisch beschränkt verbreitet. 34,35 Nicht alle Gele Falte oder knacken, so ist es möglich, visuell untersuchen die Hydrogele vor der Verwendung und nur die Proben dass eine glatte Oberfläche an. Vollständig zu vermeiden Faltenbildung und Rissbildung, eine alternative Methode zur weichen Hydrogelen herzustellen ist auf Abbildung 6 dargestellt. Hier ist der flexible Kunststoffträger vorgeschnitten in der gewünschten Form und das PA-Gel ist auf der Oberseite ausgebildet, damit die Gele nicht benötigen, um de-hydratisiert werden, sondern kann verwendet werden, hergestellt. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Strategie ist, dass alternative ~ 2.5 weitere Gele können aus dem gleichen Volumen der Hydrogel-Precursorlösung (die Schätzung basiert auf der Herstellung von Gelen für eine Standard-96-Well-Platte wie in dem Protokoll beschrieben basiert) hergestellt werden. Eine Vorsicht, wennHerstellung von Hydrogelen auf diese Weise ist dafür Sorge zu tragen, um Sauerstoff-Infiltration zu vermeiden, insbesondere bei Gelen mit kleinerer Größe (beispielsweise Gele, in einem 96-Well-Platte verwendet werden). Selbst wenn das Gel Vorläuferlösung vollständig entgast, dh sauerstofffreien, Sauerstoff diffundiert werden zwischen den beiden Oberflächen, die die PA-Lösung Sandwich. Somit wird, um Randeffekte oder unvollständige Gelbildung entlang der Kanten zu vermeiden, ist es am besten, damit die Polymerisation in Abwesenheit von Sauerstoff geschieht. Nach unserer Erfahrung ist eine Vakuumkammer funktioniert gut, obwohl ein Inertgas-Umgebung kann mit gleichem Erfolg verwendet werden.
Ein letzter Vorsicht bei der Vorbereitung PA Hydrogele als Zellsubstrate, um die Steifigkeit abhängige Zell-Reaktionen zu testen, ist, dass die Dicke der resultierenden Hydrogel ist wichtig: für sehr dünne Gele sind die Zellen in der Lage, das darunter liegende Substrat spüren 36 Verwenden Theorie und Experiment. Lin et al., dass die Tiefe, in welcher sich die Zellen feel das darunterliegende Substrat ist abhängig von der Querdimension der Zelle. 29. Da die gegenwärtige Forschung ist widersprüchlich, Identifizieren der erforderlichen Mindestdicke, um die Zellen von der Erfassung der "verborgenen" Substrat von mehreren Mikron 36 bis zu 60 Mikrometer zu verhindern, 37 mindestens Gel Dicke von 100 um anzustreben.
Bei der Montage der PA-Gelen in einer Multiwellplatte, wird ein kleiner Tropfen der PDMS verwendet, um das Gel zu dem Boden der Vertiefung zu sichern. PDMS wurde gewählt, weil es sich als permanente Klebstoff beim Aushärten, es ist vollständig transparent und nicht mit nachfolgenden Mikroskopieexperimente stören, es ist vollständig nicht-zytotoxischen, und es härtet in ca. 4 - 8 h lässt genügend Zeit für die Plattenanordnung. Sicher Sicherung der Hydrogele auf den Grund der auch hilft bei der Zell Umgang: zum Beispiel könnten kräftiges Waschen Hydrogele zu vertreiben, wenn nicht richtig geschlossen ist. Wenn häufige Veränderung der Zell mEdia kein Problem ist, dann werden die Gele könnten vorübergehend an die Erdoberfläche durch eine kleine Tröpfchen einer nicht-zytotoxisch und hochviskose Flüssigkeit wie Glycerin gesichert werden.
Die letzten Schritte vor dem Aussähen der Zellen beinhalten ECM Beschichtung des Gels und Sterilisation. Hier Kollagen Typ I Beschichtung dargestellt (Figur 3), obwohl die gleiche Technik kann für andere ECM-Protein angewandt werden. Die bi-funktionale Vernetzer Sulfo-SANPAH wird verwendet, um einen noch Mono Schicht zu erreichen. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass solche kovalente Bindung ergibt eine gleichförmigere Beschichtung als einfache Proteinadsorption und ermöglicht auch eine 12-fache Abstimmung der Menge des Proteins durch die Verwendung eines Protein-Lösung verschiedener Konzentration beigefügt. 6 schließlich den montierten Multiwell-Platte unter UV in der Gewebekulturhaube für bis zu 2 Stunden sterilisiert. Die UV-Entkeimung erlaubt der Test auf einem Labortisch außerhalb der Haube, zusammengesetzt werden, diemacht den Prozess logistisch einfacher und insgesamt schneller.
Die 4 und 5 zeigen einige repräsentative Ergebnisse von MDA-MB-231-Brustkrebszellen auf flexiblen Kunststoffträger befestigt PA-Gelen mit unterschiedlicher Steifigkeit gezüchtet. MDA-MB-231-Zellen wurden gewählt, um die Verfahren Dienstprogramm nachweisen, weil sie gezeigt haben, um zu dem darunterliegenden Substrat Steifigkeit durch messbare Veränderungen in der Morphologie zu reagieren. 5,12 Wie erwartet, wurden die Zellen weitere längliche und hatte einen größeren Ausbreitungsfläche auf die steifen 100 kPa PA-Gelen im Vergleich zu den weichen 0,5 und 1 kPa PA-Gelen (4 und 5). Die untere Reihe in Figur 4 veranschaulicht auch die Verwendung von zwei fluoreszierenden Farbstoffen, die in den Zellkern und Zell Cytoplasma färben, präsentiert, dass der flexible Kunststoffträger nicht mit dem Fluoreszenzmikroskop Abbildungs stören.
Zusammenfassend ist eine einfache Methode, um Polyacrylamid-Hydrogele in eine VorbereitungMultiwell-Platten-Format dargestellt. Das Verfahren ist schneller, effizienter und weniger kostspielig als die derzeitigen Verfahren zur Herstellung von PA-Gelen als Zellsubstrate sowie ermöglicht die Herstellung von Gelen von benutzerdefinierten verwendet werden Größen sonst nicht zur Verfügung. Da er keine spezielle Ausrüstung erfordert, könnte das Verfahren leicht von jedem Forschungslabor angenommen und wäre besonders nützlich in der Forschung auf dem Verständnis Steifigkeit abhängige Zell-Reaktionen fokussiert werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
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