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Bioengineering

सरल Polyacrylamide आधारित कठोरता निर्भर सेल प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए multiwell कठोरता परख

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52643
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

Introduction

शरीर में सबसे ऊतकों ~ एक GPA के एक मापांक है, जो 0.1 किलो पास्कल से नरम उपास्थि के लिए 100 किलो पास्कल को मस्तिष्क, अभी तक, इन विट्रो सेल अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे टिशू कल्चर में polystyrene (टीसीपी) पर आयोजित किया जाता है के लिए लेकर एक यंग मापांक के साथ नरम viscoelastic सामग्री रहे हैं । एक यह कठोरता बेमेल बहुत कोशिकाओं को उनके पर्यावरण का जवाब जिस तरह से प्रभावित करता है। शोध के एक उभरते शरीर, 2,3 स्टेम कोशिकाओं को भी शामिल है। एक परिणाम के रूप में चार विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के भाग्य पर सब्सट्रेट कठोरता के प्रभाव elucidating करने के लिए इस प्रकार समर्पित है, कई हाइड्रोजेल कठोरता निर्भर सेल की समझ में सहायता करने के लिए विकसित किया गया है सब्सट्रेट कठोरता सेल भाग्य पर काफी प्रभाव पड़ता है कि सबूत से बढ़ रहा है जबकि polyacrylamide (पीए), 5-7 पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), 8,9 polydimethylsiloxane (PDMS), 10 और alginate सहित जीव विज्ञान। 11, ज्यादातर अध्ययनों पर आयोजित की जाती हैं एस के एक छोटे समूह के साथ एक छोटे पैमानेamples। सेल प्रकार या पर्यावरण की स्थिति दुर्लभ हैं की एक सरणी के लिए सब्सट्रेट कठोरता के प्रभाव पर व्यवस्थित, बहुआयामी अध्ययन करता है। 12

कई होनहार उच्च throughput हाइड्रोजेल प्रौद्योगिकियों खूंटी आधारित प्रोटीन, जकड़न microrods के व्यास और ऊंचाई द्वारा संग्राहक है जहाँ से agarose हाइड्रोजेल microbeads, 14 या माइक्रो और नैनो-छड़ के उत्पादन के लिए 13 microfluidic उपकरणों सहित विकसित किया गया है। 15 बहरहाल , प्रौद्योगिकियों ऐसे substrates के परिष्कृत और प्रयोगशालाओं की सीमित संख्या के लिए उपलब्ध हैं तैयार करने के लिए। कठोरता संग्राहक सेल प्रतिक्रिया को शामिल अधिक से अधिक शोध को लागू करने, लेकिन यह भी यंग मापांक, अर्थात 0.3 की एक physiologically प्रासंगिक रेंज प्रदर्शन करने के लिए केवल सस्ता और सरल नहीं कर रहे हैं, जो polyacrylamide (पीए) जैल का इस्तेमाल -। 300 किलो पास्कल 16-22 हालांकि, फिलीस्तीनी अथॉरिटी के निर्माण की विधियों मौजूदा सेल संस्कृति के लिए जैल श्रम गहन और फलस्वरूप प्रस्तुत करने का कर रहे हैंछोटे समूहों में ared। सेल substrates के रूप में पीए जैल की तैयारी के साथ जुड़े कठिनाइयों के कुछ जैल तैयार रहना होगा कि आवश्यकता से स्टेम: 1) ऑक्सीजन के अभाव में पूरा polymerization की अनुमति देने के लिए, 2) एक फ्लैट और चिकनी सतह के साथ वर्दी सेल की अनुमति के लिए लगाव और प्रसार, और 3) स्थायी रूप से अस्थायी रोकने के लिए सेल संस्कृति डिश के तल से चिपका।

कई समूहों बड़े समूहों में सेल संस्कृति के लिए पीए जैल का उत्पादन करने का प्रयास किया है। Semler एट अल। एक छेद पंच के साथ फिर "कट" थे और 96 अच्छी तरह से प्लेट में रखा गया है, जो पीए जैल तैयार मोटी चादरें। 23 बहरहाल, इस विधि में stiffer जैल, यानी,> 1 किलो पास्कल यंग मापांक में, नरम क्योंकि तक सीमित है जैल, कटौती करने के लिए मुश्किल है, और आसानी से क्षतिग्रस्त "चिपचिपा" हैं। MIH एट अल। जैल सीधे एक गिलास नीचे multiwell थाली में polymerized करने की अनुमति देता है जो एक और अधिक परिष्कृत तकनीक विकसित की है। छह हालांकि बहुत होनहार, मामूली बढ़त प्रभाव अभी भी इस तकनीक के साथ मनाया गया। साथ ही, तकनीक कई प्रयोगशालाओं के साथ ही महंगा गिलास नीचे multiwell प्लेटों को तुरंत सुलभ नहीं एक कस्टम डिजाइन सरणी की आवश्यकता है।

इस पत्र में आसानी से किसी भी प्रयोगशाला द्वारा अपनाया जा सकता है कि एक multiwell थाली में पीए जैल इकट्ठा करने के लिए एक सरल और सस्ता तरीका है वर्णन करता है। से बचाने वाली क्रीम पीए जैल के लिए है जो एक हाइड्रोफोबिक एक, और covalently बयान पर पीए जेल बांधता है जो एक हाइड्रोफिलिक एक, - यहाँ, एक लचीले प्लास्टिक समर्थन के दो पहलू है, जो उपयोग किया जाता है। पीए जेल चादरें लचीले प्लास्टिक समर्थन से चिपका स्थायी रूप से जमा कर रहे हैं और एक बार, यह किसी भी मोटाई या जकड़न की जैल से निपटने के लिए और किसी भी वांछित आकार में उन्हें काटने में सक्षम बनाता है। इस approach है जो एक फिलीस्तीनी अथॉरिटी बाध्यकारी समाधान के साथ, कांच coverslips या महंगा गिलास नीचे multiwell प्लेटों के कुओं या तो अन्यथा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं आकारों में कस्टम प्लास्टिक 'coverslips के' पैदा करता है, लेकिन यह भी कांच की सतहों इलाज के लिए पूर्व आवश्यकता अनावश्यक न केवल एक थकाऊ और एक समय लेने वाली कदम है। अन्त में, वर्दी पीए जैल चादरें बड़े समूहों में तैयार किया है और कई महीनों के लिए डी-हाइड्रेटेड संग्रहित किया जा सकता है।

सारांश में, यहाँ प्रस्तुत परख कई पहलुओं में मौजूदा तरीकों पर एक सुधार है। सबसे पहले, multiwell थाली विधानसभा की प्रक्रिया कुशल है, और आवश्यक सामग्री की कुल लागत कम है। दूसरा, हाइड्रोजेल एक भी सजातीय जेल फिल्म में बड़े समूहों में उत्पादित कर रहे हैं। अंत में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं कि केवल सामग्री के लिए आवश्यक हैं। परख की उपयोगिता सेल आकृति विज्ञान पर सब्सट्रेट कठोरता के प्रभाव की खोज और क्षेत्र के प्रसार के द्वारा सचित्र है।

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Protocol

Hydrogel जुड़े सॉल्यूशंस और aliquots की 1. तैयारी

  1. Polyacrylamide जेल अग्रदूत समाधान की तैयारी।
    1. एक्रिलामाइड (ए) के मिश्रण से polyacrylamide जेल अग्रदूत समाधान तैयार (वी / डब्ल्यू 40%, एम आर 71.08 ग्राम / मोल), crosslinker bisacrylamide (बी) (वी / डब्ल्यू 2%, एम 154.17 छ / मोल आर), और डे तालिका 1 में निर्दिष्ट मात्रा प्रतिशत में पानी ionized।
      नोट: ये समाधान बड़े समूहों में तैयार किया है और कई महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
      1. चेतावनी: Acrylamide साँस लेना या घूस पर विषैला होता है, विशेष रूप से, पाउडर के रूप में जब: इस प्रकार, अधिमानतः विषाक्तता के जोखिम को कम करने के लिए / वी समाधान डब्ल्यू 40% का उपयोग करें। ऐसे दस्ताने, चश्मे, और एक प्रयोगशाला कोट के रूप में, सुरक्षात्मक कपड़े पहने हुए ही, जबकि संभाल लेना। फ्रिज में एक प्रकाश-प्रतिरोधी, कसकर बंद कंटेनर में स्टोर (<23 डिग्री सेल्सियस, क्षेत्र अच्छी तरह हवादार)।
      2. चेतावनी: बीआईएस-एक्रिलामाइड, विशेष रूप से, साँस लेना या घूस पर विषैला होता हैजब पाउडर के रूप में: इस प्रकार, अधिमानतः विषाक्तता के जोखिम को कम करने के लिए / वी समाधान डब्ल्यू 2% का उपयोग करें। ऐसे दस्ताने, चश्मे, और एक प्रयोगशाला कोट के रूप में, सुरक्षात्मक कपड़े पहने हुए ही, जबकि संभाल लेना। फ्रिज (<4 डिग्री सेल्सियस, अच्छी तरह हवादार क्षेत्र) में एक प्रकाश-प्रतिरोधी, कसकर बंद कंटेनर में स्टोर।
  2. तैयारी और एन -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate के उपयोग aliquots (sulfo-SANPAH, एम 492.40 छ / मोल आर)। चेतावनी: sulfo-SANPAH गंभीर आंख में जलन का कारण बनता है; दस्ताने और उचित आंख या चेहरे की सुरक्षा के साथ संभाल। स्टोर प्राप्त होने पर -20 डिग्री सेल्सियस पर और पूर्व aliquoting करने के लिए।
    1. Sulfo-SANPAH की दुकान करने के लिए: 50 मिलीग्राम / एमएल पर dimethylsulfoxane (DMSO) में sulfo-SANPAH भंग। ट्यूब प्रति 20 μl के 50 माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूबों में शेयर समाधान विभाज्य। सूखी बर्फ पर या तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज -80 डिग्री सेल्सियस पर और दुकान (अधिकतम crosslinker दक्षता बनाए रखने के लिए एक वैकल्पिक लेकिन वरीय कदम)।
      नोट: aliquots के caएन कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
    2. Sulfo-SANPAH का उपयोग करने के लिए: विभाज्य संक्षिप्त पिघलना और de-ionized पानी के 480 μl में पतला। तुरंत का उपयोग करें। Sulfo-SANPAH पानी में जल्दी hydrolyzes: इसलिए जल्दी से ऊपर के सभी चरणों के प्रदर्शन करने के लिए सावधानी रखना।
  3. अमोनियम persulfate (एम आर 228.18 छ / mol) aliquots की तैयारी।
    नोट: अमोनियम persulfate आंख, त्वचा और सांस की जलन का कारण बनता है। जब से निपटने उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। एक रासायनिक धूआं हुड में अमोनियम persulfate पाउडर संभाल लेना। एक सूखी, अच्छी तरह हवादार जगह में स्टोर पाउडर। Aliquoted एक बार, पतला समाधान काम बेंच पर इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. / वी डब्ल्यू 10% की एक अंतिम अमोनियम persulfate एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए विआयनीकृत पानी में अमोनियम persulfate भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान। उपयोग करने के लिए तुरंत पहले गला लें।
  4. कोलेजन प्रकार मैं समाधान की तैयारी।
    1. इसलिए शेयर गिराए द्वारा 0.2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन समाधान तैयार7.4 पीएच की 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में lution। बर्फ संक्षिप्त पर दुकान या कमजोर पड़ने पर तुरंत का उपयोग करें।

2. Hydrogel तैयारी (एक चित्र में देखें)

  1. हाइड्रोफोबिक गिलास स्लाइड तैयार करना।
    1. एक गिलास प्लेट पर एक हाइड्रोफोबिक समाधान की कुछ बूँदें प्लेस और सतह भर में प्रसार करने के लिए टिशू पेपर का उपयोग करें। शुष्क हवा हैं और हाइड्रोफोबिक कोटिंग बाहर भी फिर से एक टिशू पेपर से पोंछ।
      नोट: आरटी पर एक ज्वलनशील कैबिनेट में स्टोर हाइड्रोफोबिक समाधान। जब से निपटने व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में काम करते हैं।
  2. लचीले प्लास्टिक समर्थन की तैयारी।
    1. हाइड्रोफोबिक-लेपित ग्लास प्लेट के आकार से मिलान करने के लिए लचीले प्लास्टिक समर्थन काटें।
    2. हल्के से इस तरह के एक स्केलपेल के रूप में एक तेज उपकरण के साथ सतह scratching द्वारा लचीले प्लास्टिक के समर्थन की हाइड्रोफोबिक साइड निशान।
      नोट: जेल एक बार - पूरी तरह से पारदर्शी है - जो सूख जाता हैखरोंच के निशान लचीले प्लास्टिक समर्थन पक्ष जेल शामिल हैं जो भेद करने में मदद करेगा।
      नोट: लचीले प्लास्टिक समर्थन एक हाइड्रोफोबिक और एक हाइड्रोफिलिक पक्ष है। एक बार जमा, Polyacrylamide स्थायी रूप से आसान बाद हाइड्रोजेल से निपटने की सुविधा है, जो प्लास्टिक के समर्थन की हाइड्रोफिलिक पक्ष का पालन करता है।
  3. जेल तैयारी (उदाहरण के संस्करणों 5 ​​मिलीलीटर जेल अग्रदूत समाधान के लिए दिया जाता है)।
    नोट: जेल प्रारंभिक मोटाई 0.5 मिमी है जब 5 मिलीलीटर ~ 40 जैल का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त होगा। जेल मोटाई कम हो जाता है अगर अधिक जैल का उत्पादन किया जा सकता है।
    1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में वांछित अंतिम एकाग्रता (तालिका 1) के polyacrylamide अग्रदूत समाधान के 4972.5 μl रखें। खोला टोपी के साथ 30 मिनट के लिए एक degassing कक्ष में रखें।
      नोट: ऑक्सीजन एक मुफ्त कट्टरपंथी जाल के रूप में कार्य करता है और जब मौजूद है, यह है polymerization रोकता।
    2. अमोनियम persulfate वी / डब्ल्यू 10% के 25 μl जोड़ें एक अंतिम लक्ष्य को हासिल करने के लिए (1.3 बात करने के लिए देखें)0.05% की अमोनियम persulfate एकाग्रता।
    3. एन, एन, एन ', N'- tetramethylethylenediamine के 2.5 μl जोड़ें 0.5% की एक अंतिम TEMED एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए degassed जेल समाधान करने के लिए (TEMED, एम 116.24 छ / मोल आर)।
      नोट: स्टोर TEMED आरटी पर एक ज्वलनशील कैबिनेट में। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने जब एक रासायनिक धूआं हुड में संभाल। यह अत्यधिक हवा और नमी के प्रति संवेदनशील है, के रूप में कसकर अक्रिय गैस के तहत बंद रखें।
    4. 5 बार - नीचे 3 से ऊपर pipetting और धीरे समाधान मिलाएं। जेल अग्रदूत समाधान में ऑक्सीजन प्रसार से बचने के लिए भंवर मत करो।
    5. हाइड्रोफोबिक लेपित गिलास स्लाइड के साथ लचीले प्लास्टिक का समर्थन और सैंडविच की हाइड्रोफिलिक पक्ष पर जेल समाधान पिपेट। इच्छित मोटाई (जैसे, 0.5 मिमी) की सिलिकॉन spacers के साथ दो स्लाइड्स अलग करें। जमाना का एक संकेतक के रूप में उपयोग करने के लिए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बहुलक अग्रदूत समाधान की एक छोटी राशि (~ 100 μl) छोड़ दें।
      ध्यान दें:किसी भी स्पेसर इस्तेमाल किया जा सकता है। 120 माइक्रोन - उदाहरण के लिए, parafilm का एक पट्टी 100 के अंतिम सूजन जेल मोटाई देता है।
    6. Polymerization के पर एक भी हाइड्रोजेल सतह पता लगाने के लिए लचीले प्लास्टिक का समर्थन / जेल सैंडविच के ऊपर एक और गिलास प्लेट रखें।
    7. अगर वांछित कम समय उच्च% WT की जैल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि जेल, 45 मिनट के लिए भाजन करते हैं। जेल polymerized गया है कि पता लगाने के लिए, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में शेष समाधान का निरीक्षण; शेष समाधान gelled है, तो यह कांच की प्लेट पर जमाना के रूप में अच्छी तरह से शुरू किया गया है कि संभावना है। हालांकि, मिट्टी के समय से पहले उद्घाटन पूरा polymerization रोकने जाएगा कि ध्यान दें।
    8. जेल का गठन किया है, एक बार शीर्ष पर covalently संलग्न polyacrylamide जेल के साथ लचीले प्लास्टिक समर्थन बंद छील, और शुष्क हवा की जेल-पक्ष की स्थापना की।
      नोट: संवहन या गर्मी सुखाने भी इस चरण में तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लचीले प्लास्टिक समर्थन पर एक बार सूखे, जेल स्टोर किया जा सकता हैअनिश्चित काल के लिए चाहते हैं।
      1. Polyacrylamide जैल बुलबुले की वजह से फार्म नहीं था जहां लचीले प्लास्टिक का समर्थन है, के किसी भी नंगे स्पॉट निशान। जेल से सूखा है एक बार इस लचीले प्लास्टिक समर्थन के साथ मिश्रण होगा के रूप में मार्क जेल में अभी भी हाइड्रेटेड जाता है।

3. multiwell प्लेट विधानसभा, कोलेजन कोटिंग, और बंध्याकरण

  1. Multiwell थाली विधानसभा।
    1. एक बार सूखे, वांछित आकार में पीए जैल में कटौती।
      1. एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए, ~ 6 मिमी की एक व्यास के साथ एक भारी शुल्क छेद पंच का उपयोग करें। चौकोर या आयताकार आकार में जैल में कटौती करने के लिए एक भारी शुल्क पेपर कटर का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, कैंची का उपयोग करें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 96 अच्छी तरह से थाली प्रति PDMS की लगभग 500 μl तैयार करें। एक multiwell प्लेट के नीचे करने के लिए जैल गोंद के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह के केंद्र में एक छोटा सा छोटी बूंद polydimethylsiloxane (PDMS) की (~ 5 μl) रखें। संदंश का प्रयोग, एक polyacrylamid जगहनीचे प्रत्येक अच्छी तरह से, लचीले प्लास्टिक समर्थन पक्ष में ई जेल। PDMS, इलाज 4 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इकट्ठे थाली को छोड़ने के लिए अनुमति देने के लिए।
  2. Polyacrylamide जैल के कोलेजन कोटिंग।
    1. एक हस्तांतरण विंदुक के साथ, एक छोटी राशि जगह - sulfo-SANPAH (7 8 μl) जेल सतह समान रूप से कोट करने के लिए पक्ष की ओर से अच्छी तरह से और चक्कर आने प्रत्येक में (1.2.2 बिंदु को देखें)। Sulfo-SANPAH पानी में स्थिर नहीं है के बाद से तुरंत काम करते हैं।
    2. 5 मिनट के लिए - (365 एनएम, तीव्रता = 37 मेगावाट λ = 302) एक उच्च तीव्रता यूवी दीपक के नीचे अच्छी तरह से थाली रखें। अतिरिक्त sulfo-SANPAH दूर करने के लिए पीबीएस के साथ जैल कुल्ला।
    3. 50 μl 0.2 मिलीग्राम की पिपेट / मिलीलीटर कोलेजन प्रकार मैं समाधान अच्छी तरह से प्रत्येक में (1.4 बिंदु को देखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम दो घंटा या हे / N के लिए आरटी पर कवर प्लेट छोड़ दें।
      नोट: कोलेजन कोटिंग की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, एक हस्तांतरण पिपेट कोलेजन समाधान जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आमतौर पर, 1 - समाधान के 2 बूंदों को पूरा करने के लिए पर्याप्त होना चाहिएly के जेल की सतह को कवर किया।
    4. कोलेजन संबंध अनुमति देने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए आरटी पर अच्छी तरह से थाली छोड़ दें।
    5. 2 घंटे के लिए एक टिशू कल्चर हुड में अतिरिक्त कोलेजन समाधान निकालने और यूवी (λ = 200 एनएम) के तहत बाँझ पीबीएस के साथ कुल्ला।
    6. हाइड्रेट और संतुलित करने के लिए ओ / एन (मध्यम रचना के लिए खंड 4.1 देखें) पूरा मध्यम में जैल भिगोएँ। सेल अप करने के लिए दो दिनों के लिए फ्रिज में तुरंत या दुकान बोने के लिए उपयोग करें।

पीए कठोरता परख पर 4. सेल बोने

नोट: आम स्तनधारी सेल लाइनों के लिए ठेठ हालांकि, इस खंड में उल्लिखित प्रोटोकॉल विशेष रूप से स्तन कैंसर एमडीए MB-231 सेल लाइन के साथ प्रयोग किया जाता है (आंकड़े 4 करें और देखें 5)।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5% / trypsin EDTA के लिए जोखिम के टिशू कल्चर कुप्पी से कोशिकाओं को इकट्ठा। संस्कृति कुप्पी क्षेत्र के प्रत्येक 2 सेमी प्रति / trypsin EDTA के ~ 80 μl का उपयोग करें; उदाहरण के लिए, के लिए / trypsin EDTA के 2 मिलीलीटर का उपयोगआरए T25 सेल संस्कृति कुप्पी। पुनः निलंबित एक वांछित अंतिम सेल एकाग्रता में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक पूरा मध्यम में एकत्र कोशिकाओं। खाते समय दोहरीकरण सेल के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं को परख पर वरीयता प्राप्त किया जाएगा समय की लंबाई में ले रहा है, एक उपयुक्त उप मिला हुआ सेल एकाग्रता का चयन करें। जोड़ा मध्यम पूरी तरह से हाइड्रोजेल डूब के लिए पर्याप्त है कि सुनिश्चित करें।
    नोट: हाइड्रोजेल मीडिया में पूर्व equilibrated किया गया है के बाद से पर्याप्त होना चाहिए 100 μl मात्रा (3.2.6 कदम को देखें)। जैल पिछले चरण में मीडिया में पूर्व equilibrated किया गया है के बाद से multiwell प्लेटों के लिए इस्तेमाल किया ठेठ मध्यम संस्करणों पर्याप्त होना चाहिए।
    नोट: परख किसी भी लगाव पर निर्भर सेल प्रकार के लिए उपयुक्त होगा।
    1. एक hemacytometer का उपयोग करके एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत सेल संख्या की गणना। लोड प्रत्येक 10 hemacytometer पोर्ट में सेल निलंबन के μl और कम से कम 8 चतुर्भागों से सेल गिनती औसत। पाने के लिएअंतिम सेल एकाग्रता, 10 4 द्वारा कोशिका गिनती गुणा।
      नोट: प्रत्येक hemacytometer चक्र में सेल नंबर 20 है सबसे अच्छा है जब सेल गिनती परिणाम प्राप्त कर रहे हैं - 50।
  2. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में पीए कठोरता परख पर कोशिकाओं और 5% सीओ 2। 3 दिन - हर 2 मीडिया बदलें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% / trypsin EDTA के लिए जोखिम से जब जरूरत कोशिकाओं को इकट्ठा। टिशू कल्चर कुप्पी के 2 सेमी प्रति / trypsin EDTA के ~ 80 μl का प्रयोग करें। थोड़ा बग़ल में multiwell थाली ढोने और हाइड्रोजेल छू विरोध के रूप में, अच्छी तरह से प्रत्येक की ओर दीवार पर विंदुक टिप छू द्वारा महाप्राण या पिपेट मध्यम: सभी सेल हेरफेर चरणों के दौरान विशेष हाइड्रोजेल सतह को बाधित करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
    नोट: मानक टिशू कल्चर से निपटने के दौरान हाइड्रोजेल सतह को नुकसान नहीं विशेष ख्याल रखने के लिए छोड़कर, कोशिकाओं वे पर वरीयता प्राप्त थे के रूप में अगर कठोरता परख उसी तरह से चालाकी से किया जा सकता है पर वरीयता प्राप्तएक नियमित रूप से multiwell थाली करने के लिए।

पीए कठोरता परख पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के 5. इमेजिंग

  1. सीधे पीए कठोरता परख पर छवि कोशिकाओं।
    नोट: कोई माइक्रोस्कोप - उल्टे, फ्लोरोसेंट, या confocal, सेल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: कठोरता परख का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल प्लास्टिक लचीला समर्थन पूरी तरह से पारदर्शी है और autofluoresce या सेल इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। हालांकि, लचीले प्लास्टिक समर्थन में ही पारदर्शी है, भले ही इमेजिंग क्षमताओं उद्देश्य के काम दूरी से सीमित हो जाएगा। लचीले प्लास्टिक समर्थन तेजी से उच्च आवर्धन के लिए कम 0.23 मिमी की मोटाई और एक 10x उद्देश्य का एक विशिष्ट काम दूरी ~ 4 मिमी है।
    1. लाइव सेल इमेजिंग के लिए, माइक्रोस्कोप थाली धारक और छवि में स्थिति पीए कठोरता परख। 2 घंटे के तहत इमेजिंग सत्र रखें, या लंबे समय तक इमेजिंग समय के लिए एक पर्यावरण कक्ष के साथ सुसज्जित एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    2. जब जीवित कोशिका आईएमउम्र बढ़ने के लक्ष्य नहीं है, 0.1% डिटर्जेंट के साथ पूरक 4% formaldehyde समाधान में कोशिकाओं को ठीक। 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए आरटी पर लगानेवाला में कोशिकाओं भिगोएँ। दो बार पीबीएस के साथ कुल्ला। एक नामित अपशिष्ट कंटेनर में लगानेवाला बेकार त्यागें।
      नोट: कोशिकाओं तुरंत imaged किया जा सकता है या 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में डूबे हुए संग्रहीत। चेतावनी: Formaldehyde साँस लेना और संपर्क पर विषैला होता है। एक रासायनिक धूआं हुड में दस्ताने के साथ संभाल।
      नोट: कुछ fixatives के कुछ सेल प्रोटीन को नुकसान पहुंचा है क्योंकि सेल निर्धारण प्रोटोकॉल, बाद में सेल धुंधला और हैंडलिंग प्रोटोकॉल के आधार पर चुना जाना है।
    3. फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए, दाग multiwell थाली में सीधे वांछित सेल दाग के साथ कोशिकाओं तय की। छवि तुरंत।

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Representative Results

Polyacrylamide (पीए) हाइड्रोजेल व्यापक रूप से कठोरता निर्भर सेल प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। 17,24 एक्रिलामाइड (ए) और भारतीय मानक ब्यूरो-एक्रिलामाइड (बी) के एक सबसे कोमल ऊतकों की कठोरता रेंज में है कि अवधि पीए जैल कर सकते हैं के विभिन्न सांद्रता मिश्रण करके शरीर - 0.3 -।। यहाँ 300 किलो पास्कल यंग मापांक 1 हालांकि, polyacrylamide जैल की तैयारी थकाऊ है और समय अक्सर ऐसे उदाहरण दवा स्क्रीनिंग के लिए "के रूप में उच्च throughput" अनुप्रयोगों में उनकी उपयोगिता सीमित लेने वाली 12, एक सरल और तेजी से विधि के लिए (चित्रा 1) प्रस्तुत बहु अच्छी तरह प्लेटें में पीए जैल या किसी भी अन्य वांछनीय टिशू कल्चर पोत है कोडांतरण। 2A चित्रा कई ए और बी सांद्रता के एक समारोह (भी 1 टेबल में संक्षेप) के रूप में यंग मापांक से पता चलता है। अतिरिक्त ए और बी संयोजनों की moduli साहित्य में रिपोर्ट कर रहे हैं। 17,25,26 पूरी तरह swolle की जेल कठोरता10 हर्ट्ज, और 2% निरंतर तनाव - एन जैल एक 20 मिमी ऊपरी समानांतर ज्यामिति, oscillatory आवृत्ति झाड़ू परीक्षण 1 के साथ rheology (ए आर 2000ex Rheometer, टीए उपकरण) द्वारा मापा गया था। प्रत्याशित रूप में, यह दोनों भंडारण मापांक, जी ', और नुकसान मापांक, जी ", आवृत्ति (चित्रा 2B) से सम्बंधित प्रदर्शन किया गया। यह भी तब सुखाने और फिर से hydrating कि जैल, उनके यंग मापांक (चित्रा -2) को प्रभावित नहीं किया पुष्टि की गई। यंग मापांक निम्न समीकरण द्वारा भंडारण मापांक से संबंधित था:
1 समीकरण

जहां ई यंग मापांक है और वी पीए जैल के लिए 0.5 अनुमानित किया गया था जो प्वासों अनुपात है। सूचना दी मूल्यों TEMED के साथ तैयार हाइड्रोजेल के लिए कर रहे 27 नोट हैं। जोखिम समय और यूवी तीव्रता अनुकूलित कर रहे हैं जब पीए हाइड्रोजेल भी यूवी crosslinking के द्वारा तैयार किया जा सकता है ( 5,7 के रूप में 27 अन्य तरीकों में भी उपयुक्त हैं। Polyacrylamide हाइड्रोजेल अकेले निष्क्रिय कर रहे हैं; इस प्रकार, प्रकाश में लाना करने के लिए सेल लगाव बाह्य मैट्रिक्स अणुओं को अलग से जोड़ा जाना चाहिए। कोलेजन प्रकार मैं हाइड्रोजेल कोटिंग के लिए चुना गया था, लेकिन एक ही विधि कोट पसंद के किसी भी अन्य बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 3 चित्रा दर्शाता है कि crosslinker sulfo-SANPAH, किसी भी कठोरता के हाइड्रोजेल पर एक समान कोलेजन कोटिंग का उपयोग करके हासिल किया जा सकता है। 5

इसके अलावा, यह कोशिकाओं को अलग stiffne की हाइड्रोजेल पर वरीयता प्राप्त है कि प्रदर्शन किया गयाएसएस अलग आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया। 72 घंटा - इस प्रयोग के लिए, स्तन कैंसर एमडीए MB-231 कोशिकाओं 24 के लिए पीए जैल के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त थे। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक humidified इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक RPMI माध्यम में सुसंस्कृत थे। कोशिकाओं को एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए अच्छी तरह / 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल या 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त थे। यह एक विशिष्ट सेल बोने घनत्व है - एक स्तनधारी सेल लाइन के लिए confluency ~ 1 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी पर पहुंच गया है, जहां confluency सेल घनत्व, की तुलना में कम चार गुना। छवियाँ आकार विवरणक और क्षेत्र सॉफ्टवेयर प्लग इन के माध्यम ImageJ पर औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर ले लिया है और विश्लेषण किया गया। यह 24 घंटे के लिए पीए जैल पर वरीयता प्राप्त करते हैं, तो स्तन कैंसर एमडीए MB-231 कोशिकाओं नरम 0.5 और 1 किलो पास्कल जैल पर दौर बना रहा, लेकिन (चित्रा 4) में फैल गया है और कठोर 100 किलो पास्कल जेल पर बढ़ाना करने में सक्षम थे कि मनाया गया। चित्रा 4 भी showcasतों हाइड्रोजेल लचीले प्लास्टिक समर्थन के शीर्ष पर किए गए तथ्य यह है कि पारदर्शी होते हैं और आसानी से दृश्य और माइक्रोस्कोपी के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, लचीले प्लास्टिक समर्थन fluorescently लेबल कोशिकाओं की इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, इस प्रकार autofluoresce और नहीं करता है। घेरा (चित्रा 5) - सेल आकृति विज्ञान आगे क्षेत्र और सेल आकार कारक प्रसार समग्र सेल के मामले में मात्रा निर्धारित किया गया था। सेल प्रसार क्षेत्र प्रत्येक कोशिका की परिधि का पता लगाने के लिए एक मुखौटा बनाने के द्वारा मापा गया था। सेल आकार (घेरा) तो निम्नलिखित रिश्ते से गणना की गई:
1 समीकरण

1 गोल कोशिकाओं को नामित करने के लिए ले जाया गया और 0 - - 0.5 लम्बी कोशिकाओं को नामित करने के लिए ले जाया गया 0.6 जहां 1, - घेरा 0 के पैमाने पर मापा जाता है। लगभग कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से तीन सौ कोशिकाओं प्रत्येक डेटा poin के लिए विश्लेषण किया गया टी। सांख्यिकीय मतभेद डेटा सेट <0.05 जब पी काफी अलग विचार किया गया, जहां विचरण का एक कारक विश्लेषण (एनोवा) के आधार पर गणना की गई।

चित्र 1
चित्रा लचीले प्लास्टिक के समर्थन पर polyacrylamide जेल तैयारी 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। आंकड़ा लचीले प्लास्टिक के समर्थन पर पीए जैल की तैयारी में शामिल विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करता है। जेल पूरी तरह से सूख जाता है, के बाद यह कटौती या किसी भी वांछित आकार में मुक्का मारा जा सकता है। एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए जैल तैयार करते समय एक भारी शुल्क कागज कटर चौकोर या आयताकार आकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि एक पूरी पंच (~ 6 मिमी व्यास), सबसे अधिक सुविधाजनक है। आंकड़ा भी, के साथ और एक जेल के बिना, दोनों कुओं के किनारों पर प्रकाश डाला गया है कि पूरा अच्छी तरह से नीचे कवरेज इस विधि के साथ प्राप्त किया जा सकता प्रदर्शित करने के लिए। oad / 52,643 / 52643fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Rheology द्वारा मापा के रूप में पीए चित्रा 2. कठोरता हाइड्रोजेल। (ए) के पांच अलग एक सूचना और प्रसारण सांद्रता (परिवर्णी के लिए 1 टेबल देखें) के लिए प्रतिनिधि यंग मापांक, (बी) आवृत्ति के एक समारोह के रूप में भंडारण और नुकसान मापांक rheology द्वारा मापा के रूप में, (ग) जैल शुरू में एक ही यंग मापांक का प्रदर्शन (प्रारंभिक) वे सूख गया है और हाइड्रेटेड पुनः के बाद और (पुनः हाइड्रेटेड) बहुलक अग्रदूत एकाग्रता की स्वतंत्र। (पूरा सूजन पर) 1.5 मिमी ऊंचाई - rheology मापन के लिए सभी जैल 20 मिमी व्यास और 1 के स्लैब के रूप में तैयार किया गया था।

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पीए जैल पर चित्रा 3. कोलेजन कोटिंग। कोलेजन कोटिंग (हरा) कुशलता से वितरित और पीए जेल (लाल) हाइड्रोजेल कठोरता यंग मापांक की सतह स्वतंत्र) पर बनाए रखा है। Cy5 के साथ लेबल कोलेजन इस डेटा के लिए इस्तेमाल किया गया था। लाल फ्लोरोसेंट मोती सहायता दृश्य करने के लिए पीए हाइड्रोजेल में एम्बेडेड थे। क्रॉस अनुभागीय छवियों Zustiak ईटी से अनुकूलित एक confocal खुर्दबीन (पैमाने बार = 100 माइक्रोन)। छवि पर ले जाया गया। अल। 5 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
24 घंटा के लिए पीए जैल पर वरीयता प्राप्त एमडीए MB-231 कोशिकाओं की चित्रा 4. चरण अनुबंध (शीर्ष पंक्ति) और फ्लोरोसेंट (नीचे पंक्ति) छवियों। एमडीए MB-231 कोशिकाओं सॉफ्ट जैल पर दौर बने रहने (यंग 7 के 0.5 और 1 किलो पास्कल की मापांक), लेकिन कड़ी पीए जैल (100 किलो पास्कल की यंग मापांक) पर बढ़ाना। कोशिकाओं इथेनॉल में तय की और acridine नारंगी के साथ दाग, 24 घंटा के लिए जैल पर वरीयता प्राप्त थे (ए ओ - ग्रीन) सेल नाभिक कल्पना करने के लिए सेल कोशिका द्रव्य और DAPI (नीला) कल्पना करने के लिए; पैमाने बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. सेल प्रसार क्षेत्र और घेरा अंतर्निहित सब्सट्रेट की कठोरता से प्रभावित हैं। 0.5 किलो पास्कल जैल के लिए विरोध के रूप में (एक) एमडीए MB-231 सेल प्रसार क्षेत्र में काफी। 100 किलो पास्कल पर बढ़ जाती है (ख) सेल घेरा पीए जेल कठोरता में वृद्धि के साथ कम हो जाती है। पी <0.05, तारक महत्वपूर्ण मतभेद नामित।

हमेशा ">:" रख-together.within पृष्ठ = के लिए "ve_content चित्रा 6
चित्रा 6 लचीले प्लास्टिक के समर्थन पर एक वैकल्पिक polyacrylamide जेल तैयारी की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। आंकड़ा लचीले प्लास्टिक के समर्थन पर पीए जैल की तैयारी में शामिल विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ लचीले प्लास्टिक समर्थन शुरू में एक वांछित आकार और आकार के प्लास्टिक "coverslips" में पूर्व में कटौती कर रहा है। इस तकनीक को नरम हाइड्रोजेल के लिए सबसे अच्छा काम करता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संक्षिप्त Acrylamide% बीआईएस-एक्रिलामाइड% 40% शेयर समाधान (माले) से acrylamide 2% शेयर समाधान से बीआईएस-एक्रिलामाइड (एमएल) जल (एमएल) जी '± एसडी (kPa) एसडी ± ई (kPa)
PA1 5 0.025 625 62.5 4312.5 0.62 ± 0.19 1.85 ± 0.57
PA2 5 0.1 625 250 4125 3.55 ± 0.12 10.64 ± 0.36
PA3 8 0.1 1000 250 3750 9.71 ± 0.64 29.14 ± 1.93
PA4 8 0.25 1000 625 3375 22.00 ± 2.10 66.01 ± 6.31
PA5 12 0.25 1,500 625 2875 37.42 ± 2.68 112.25 ± 8.03

टेबल यहाँ जी 'और ई द्वारा प्रतिनिधित्व एक्रिलामाइड (ए) और crosslinker बीआईएस एक्रिलामाइड (बी) और उसके एवज में पीए जेल कठोरता। कठोरता के 1. सांद्रता, rheology द्वारा मापा गया था। जी 'एक हर्ट्ज आवृत्ति पर भंडारण मापांक है। यंग मापांक, ई, Eq से गणना की गई। 1. मानक विचलन (एसडी) प्रयोग प्रति मापा 3-5 नमूनों के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के आधार पर गणना की गई। तालिका में परिवर्णी 2A चित्रा में इस्तेमाल परिवर्णी के अनुरूप हैं।

यूवी तीव्रता = 15 मेगावाट / 2 सेमी एक्सपोजर समय = 300 सेकंड
बार) एसडी ± ई (kPa) मेंशर्मंदगी (मेगावाट / 2 सेमी) एसडी ± ई (kPa)
75 0.14 ± 0.03 15 28.05 ± 2.62
100 6.98 ± 2.34 26 21.13 ± 3.01
125 19.11 ± 2.29 37 20.01 ± 2.38
300 28.05 ± 2.62 66 19.35 ± 2.86

तालिका 2. यूवी polymerization के एक विकल्प है और जमाना शर्तों अनुकूलित कर रहे हैं जब पीए जेल तैयारी के लिए एक तेज विधि है; PA3 जेल में दर्शाया जाता है (1 तालिका देखें)। तालिका (दो कॉलम बाएं) जोखिम समय या यूवी तीव्रता (दाएं दो कॉलम) या तो एक ही समाधान के लिए विविध रहे हैं जब परिणामी यंग मापांक सार। तालिका से परिणाम के आधार पर, यह है कि 300 सेकंड जोखिम समय और 15 प्रकट होता हैमेगावाट / 2 सेमी यूवी तीव्रता तालिका 1 में रिपोर्ट के रूप में पारंपरिक रूप से polymerized जेल की कठोरता के बराबर है जो उच्चतम पीए जेल कठोरता, दे।

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Discussion

मूल रूप से वैद्युतकणसंचलन के लिए विकसित polyacrylamide जैल, 28 अब नियमित सेल आकृति विज्ञान, गतिशीलता, और अन्य सेल विशेषताओं के बीच संचार 3,24,29 पर सब्सट्रेट कठोरता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृति substrates के रूप में उपयोग किया जाता है। (चित्रा 2, 1 टेबल भी सन्दर्भ 17,25,26 देखें) बहुलक अग्रदूत एकाग्रता में एक साधारण परिवर्तन के साथ - (300 किलो पास्कल 0.3) एक polyacrylamide सब्सट्रेट कठोरता के हेरफेर के शरीर में सभी नरम ऊतकों की कठोरता धरना की अनुमति देता है। पीए जैल काफी सस्ती और तैयार करने के लिए सरल कर रहे हैं कि इस तथ्य के लिए युग्मित, वे कठोरता निर्भर सेल सामग्री बातचीत के अध्ययन में अपरिहार्य प्लेटफार्मों बन गए हैं। यहां तक ​​कि साधारण हालांकि, हालांकि, पीए जैल तैयार करने के लिए मौजूदा तकनीक छोटे समूहों तक सीमित है। यह सीमाओं अमोनियम persulfate द्वारा उत्प्रेरित एक मुक्त कट्टरपंथी polymerization है जो हाइड्रोजेल जमाना की प्रकृति, से स्टेमप्रतिक्रिया एक मुफ्त कट्टरपंथी श्रृंखला polymerization के बाद से और TEMED। 30, यह एक ऐसी ऑक्सीजन के रूप में, एक मुक्त कणों जाल के रूप में कार्य करता है कि किसी भी तत्व से हिचकते जा सकता है। नर्म जैल के लिए 45 मिनट तक का समय लग सकता है - - जो बहुलक समाधान में ऑक्सीजन प्रसार polymerization के दौरान टाला जा सकता है, क्योंकि इसलिए, बस एक खुला multiwell थाली में पीए जैल pipetting संभव नहीं है। इसके अलावा, एक दो आयामी (2 डी) सेल सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, फिलीस्तीनी अथॉरिटी जेल की सतह सपाट होना चाहिए। ऑक्सीजन प्रसार को रोकना और जेल सतह को समतल करने के लिए - ऊपर आवश्यकताओं की है कि दोनों 2 डी सेल substrates के पीए जेल अग्रदूत समाधान polymerization के दौरान दो फ्लैट सतहों के बीच sandwiched किया जाना चाहिए के रूप में पीए जैल का उत्पादन करने के लिए नियंत्रित करती हैं। इसके अलावा, ऊपरी सतह यह आसानी से सेल लगाव के लिए सतह को उजागर जेल से दूर छील कर सकता है कि इस तरह हो गया है। यह आमतौर पर एक कांच की सतह के हाइड्रोफोबिक कोटिंग द्वारा हासिल की है। अन्त में, वीं में तैनात जबएक multiwell थाली के ई कुओं, पीए जैल पूरे अच्छी तरह से सतह को कवर करना चाहिए और फ्लोटिंग से प्रतिबंधित किया। कोशिकाओं का आकलन किया assays के अच्छी तरह से (जैसे, MTT) में खाते में पूरे सेल की आबादी लेता है कि टाइप कर रहे हैं, जहां पूर्ण अच्छी तरह से नीचे की सतह कवरेज अनुप्रयोगों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। पीए जेल पर्याप्त रूप से पूरे अच्छी तरह से सतह को कवर नहीं करता है, देखभाल कोशिकाओं को आसानी से कांच या प्लास्टिक पर जेल बंद रोल सकता है के रूप में उजागर अच्छी तरह से सतह के लिए कोशिका आसंजन ब्लॉक करने के लिए लिया जाना चाहिए। यदि आवश्यक हो, बीएसए अवरुद्ध मानक प्रोटोकॉल का पालन या बंद शेल्फ बीएसए आधारित कोशिका आसंजन अवरुद्ध किट अच्छी तरह से थाली के नीचे करने के लिए सेल लगाव ब्लॉक करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए इस्तेमाल करते हैं। उदाहरण के लिए, एक बीएसए से ढके सतह तैयार करने के लिए, 0.5 मिलीग्राम / पीबीएस में बीएसए की मिलीलीटर समाधान, पीएच 7.4 पीबीएस के साथ rinsed आरटी पर 20 मिनट के लिए टिशू कल्चर पकवान पर adsorbed और तुरंत इस्तेमाल किया या के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए दो सप्ताह तक। बीएसए कोशिका आसंजन ओ ब्लॉक करने के लिए दिखाया गया हैबहुत कम करने कोशिका आसंजन बलों द्वारा दोनों हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक polystyrene के सतहों पर च स्तनधारी सेल संस्कृतियों परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा। 31 बीएसए के रूप में अच्छी तरह से सेल नमूनों सतहों बनाने के रूप में स्तनधारी सेल आसंजन ब्लॉक करने के लिए नियमित तौर पर इस्तेमाल किया गया है। 32,33

इस लेख में चित्रित तकनीक, संतुष्ट कस्टम आकार और आकार की वर्दी पीए जैल का बड़े पैमाने पर उत्पादन की अनुमति के ऊपर आवश्यकताओं के सभी। तकनीक दो गिलास coverslips के बीच पीए जेल अग्रदूत समाधान sandwiching के मौजूदा मानक की तुलना में आसान और अधिक कुशल है। इसके अलावा, यह किसी भी अत्याधुनिक उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है और इस तरह आसानी से किसी भी अनुसंधान प्रयोगशाला द्वारा ग्रहणीय है। यह केवल महंगी नहीं हैं जो गिलास प्लेट या कांच coverslips, के उपयोग की जरूरत है, लेकिन यह भी सीमित आकार में नहीं आता है के रूप में यह भी अधिक लागत प्रभावी है। तकनीक कई कारणों के लिए भी तेज है। सबसे पहले, यह किसी भी pretreatment के चरणों को शामिल नहीं करतास्थायी रूप से polyacrylamide और आसानी से जेल के गठन के बाद से खुली किया जा सकता है कि एक हाइड्रोफोबिक ओर करने के लिए देता है कि एक हाइड्रोफिलिक पक्ष - लचीले प्लास्टिक समर्थन दो अलग सतहों के साथ बनाया गया है के बाद से कांच की सतहों के लिए विशिष्ट। पतली जैल बंद छीलने, दो गिलास स्लाइड के बीच का गठन कर रहे हैं जब शीर्ष हाइड्रोफोबिक स्लाइड मुश्किल है और अक्सर यह भी जेल समझौता जो टूटना में परिणाम: प्लास्टिक समर्थन लचीला है क्योंकि दूसरा, यह आसान है और गठन जेल बंद छील करने के लिए तेजी से होता है। 45 मिनट (तालिका 2) के रूप में के रूप में ज्यादा समय लग सकता है, जो मानक TEMED आधारित polymerization के विरोध के रूप में अंत में, क्योंकि लचीले प्लास्टिक समर्थन पारदर्शिता की, तेज यूवी polymerization के नियोजित किया जा सकता है। तालिका 2 में डेटा polymerization के समय और यूवी प्रकाश की तीव्रता अनुकूलित कर रहे हैं जब इसी तरह की कठोरता दोनों TEMED और यूवी polymerization के तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है कि यह दर्शाता है।

हाइड्रोजेल लचीला PL पर तैयार कर रहे हैंयह कारण बहुलक समाधान सैंडविच कि दो सतहों के बीच ऑक्सीजन प्रसार करने के लिए जेल किनारों (यानी, धार प्रभाव) का अधूरा polymerization से बचने के लिए एक degassing कक्ष में जमाना प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है चित्रा 1 पर दर्शाया के रूप में। astic समर्थन करते हैं। लक्ष्य है, इस प्रकार, किसी भी आकार के गिलास प्लेट उपयुक्त होगा लचीले प्लास्टिक समर्थन के शीर्ष पर एक बड़ी हाइड्रोजेल फिल्म बनाने के लिए है, लेकिन इसे हासिल किया जा सकता है कि polyacrylamide फिल्म के आकार के हुक्म चलाना होगा। कांच किसी भी हाइड्रोफोबिक कोटिंग या वैकल्पिक रूप से, लचीले प्लास्टिक के समर्थन की हाइड्रोफोबिक पक्ष के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ लेपित किया जा सकता है। एक फिलीस्तीनी अथॉरिटी जेल फिल्म बनाई है एक बार, यह सूख वांछित आकार में कटौती, और फिर उपयोग करने से पहले फिर से हाइड्रेटेड है। जब सूखे, जैल अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है। यह पीए जेल कठोरता जैल कई महीनों (चित्रा -2) के लिए शुष्क राज्य में जमा हो जाती है, तब भी जब पुनर्जलीकरण पर अपरिवर्तित है कि, rheology द्वारा पुष्टि की गई। हालांकि, के लिए बहुत sofटी जैल (≤ 1 किलो पास्कल यंग मापांक में) सुखाने और पुनः जलयोजन ख़राब सतह बढ़ती है और गठन दरार। यह व्यवहार ज्यामितीय विवश किया जा रहा है, जबकि डे-जलयोजन और बाद में पुनः जलयोजन से गुजरना है कि सॉफ्ट जैल के लिए आम बात है। या इस प्रकार, यह नेत्रहीन उपयोग से पहले हाइड्रोजेल की जांच करने के लिए संभव है, 34,35 नहीं सभी जैल क्रीज दरार और केवल नमूने का उपयोग कि एक चिकनी सतह प्रदर्शित करते हैं। पूरी तरह से क्रीज गठन और खुर, चित्रा 6 पर दर्शाया जाता है मुलायम हाइड्रोजेल तैयार करने के लिए एक वैकल्पिक विधि से बचने के लिए। यहाँ, लचीले प्लास्टिक समर्थन वांछित आकार में पूर्व में कटौती और पीए जेल शीर्ष पर बनाई है, इस प्रकार, जैल नहीं करते de-हाइड्रेटेड की लेकिन तैयार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है की जरूरत है। इस विकल्प रणनीति का एक अतिरिक्त लाभ ~ 2.5 अधिक जैल हाइड्रोजेल अग्रदूत समाधान (अनुमान प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए जैल तैयार करने पर आधारित है) की उसी मात्रा से उत्पादन किया जा सकता है। एक सावधानी जबइस तरीके में हाइड्रोजेल तैयारी विशेष रूप से छोटे आकार (उदाहरण के लिए, जैल एक 96 अच्छी तरह से थाली में इस्तेमाल किया जा सकता है) की जैल के लिए, ऑक्सीजन घुसपैठ से बचने के लिए देखभाल करने के लिए है। जेल अग्रदूत समाधान पूरी तरह से degassed है यहां तक कि जब, यानी, ऑक्सीजन मुक्त, ऑक्सीजन पीए समाधान सैंडविच कि दो सतहों के बीच diffusing किया जाएगा। इस प्रकार, धार प्रभाव या किनारों के साथ अधूरा जेल गठन से बचने के क्रम में, यह polymerization के ऑक्सीजन के अभाव में होने की अनुमति देने के लिए सबसे अच्छा है। हमारे अनुभव में, एक निर्वात चैम्बर एक अक्रिय गैस वातावरण बराबर सफलता के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, भले ही अच्छी तरह से काम करता है।

सेल substrates के कठोरता निर्भर सेल प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के रूप में पीए हाइड्रोजेल तैयारी, परिणामी हाइड्रोजेल की मोटाई महत्वपूर्ण है वह यह है कि जब एक अंतिम चेतावनी: बहुत पतली जैल के लिए, कोशिकाओं अंतर्निहित सब्सट्रेट समझ में सक्षम हैं सिद्धांत और प्रयोग का प्रयोग 36,। लिन एट अल। दिखा दिया कि गहराई जो कोशिकाओं फ़े कर सकते हैंएल अंतर्निहित सब्सट्रेट सेल के पार्श्व आयाम पर निर्भर है। 29 वर्तमान शोध कई माइक्रोन से 36 के रूप में ज्यादा के रूप में 60 माइक्रोन के लिए होने के लिए "छिपा" सब्सट्रेट संवेदन से कोशिकाओं को रोकने के लिए आवश्यक न्यूनतम मोटाई की पहचान, विरोधाभासी है के बाद से, 100 माइक्रोन से 37 एक न्यूनतम जेल मोटाई के लिए उद्देश्य से किया जाना चाहिए।

एक multiwell थाली में पीए जैल कोडांतरण करते हैं, PDMS की एक छोटी सी छोटी बूंद अच्छी तरह से की तह तक जेल सुरक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्लेट विधानसभा के लिए पर्याप्त समय छोड़ने 8 घंटा - यह सख्त पर के रूप में स्थायी गोंद में कार्य करता है क्योंकि PDMS यह पूरी तरह से गैर साइटोटोक्सिक है, और उस में लगभग 4 इलाज है, यह पूरी तरह से पारदर्शी है और बाद में माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, चुना गया था। सुरक्षित रूप से सेल से निपटने में अच्छी तरह से एड्स की तह तक हाइड्रोजेल हासिल: मजबूती से सुरक्षित नहीं, तो उदाहरण के लिए, जोरदार धोने हाइड्रोजेल बेदखल कर सकता है। अगर सेल मीटर में लगातार परिवर्तनedia तो जैल अस्थायी रूप से ऐसे ग्लिसरीन के रूप में एक गैर-साइटोटोक्सिक और अत्यधिक चिपचिपा तरल की एक छोटी छोटी बूंद से अच्छी तरह से सतह के लिए सुरक्षित किया जा सकता है एक चिंता का विषय नहीं है।

सेल बोने से पहले अंतिम चरणों जेल और उसके बाद नसबंदी के ईसीएम कोटिंग शामिल है। यहाँ कोलेजन प्रकार मैं कोटिंग एक ही तकनीक के किसी भी अन्य ईसीएम प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है, भले ही (चित्रा 3) में दिखाया गया है। द्वि-कार्यात्मक crosslinker sulfo-SANPAH एक भी monolayer की कोट प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है। पिछले अनुसंधान में इस तरह के सहसंयोजक लगाव सरल प्रोटीन सोखना की तुलना में एक अधिक समान कोटिंग पैदावार और भी बस एकाग्रता बदलती के एक प्रोटीन समाधान का उपयोग करके संलग्न प्रोटीन की मात्रा का एक 12 गुना ट्यूनिंग के लिए अनुमति देता है कि प्रदर्शन किया है। 6 अन्त में, इकट्ठे multiwell जेल प्लेट 2 घंटे के लिए ऊपर के लिए टिशू कल्चर हुड में यूवी के तहत निष्फल है। परख हुड, बाहर एक प्रयोगशाला बेंच पर इकट्ठा किया जा करने के लिए यूवी बंध्याकरण की अनुमति देता हैसमग्र प्रक्रिया तेजी से logistically सरल और आसान बनाता है।

4 और 5 कठोरता बदलती के लचीले प्लास्टिक समर्थन संलग्न पीए जैल पर सुसंस्कृत एमडीए MB-231 स्तन कैंसर की कोशिकाओं से कुछ प्रतिनिधि परिणाम उदाहरण देकर स्पष्ट आंकड़े। वे अपनी आकृति विज्ञान में औसत दर्जे का परिवर्तन से अंतर्निहित सब्सट्रेट कठोरता के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है क्योंकि एमडीए MB-231 कोशिकाओं विधि उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए चुने गए हैं। 5,12 जैसी कि उम्मीद थी, कोशिकाओं को और अधिक लम्बी थे और पर एक बड़ा प्रसार क्षेत्र था मुलायम 0.5 और 1 किलो पास्कल पीए जैल की तुलना में कठोर 100 किलो पास्कल पीए जैल (आंकड़े 4 और 5)। चित्रा 4 पर नीचे पंक्ति भी लचीले प्लास्टिक समर्थन फ्लोरोसेंट खुर्दबीन इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है तथ्य यह है कि प्रदर्शन, सेल नाभिक और सेल कोशिका द्रव्य दाग है कि दो फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग को दर्शाता है।

सारांश में, एक सरल तरीका है एक में polyacrylamide हाइड्रोजेल तैयार करने के लिएmultiwell थाली प्रारूप प्रस्तुत किया है। तकनीक आकार अन्यथा उपलब्ध नहीं के रूप में अच्छी तरह से कस्टम की जैल की तैयारी के लिए सक्षम बनाता है के रूप में सेल substrates के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, तेजी से और अधिक कुशल, और पीए जैल तैयार करने के लिए मौजूदा तरीकों की तुलना में कम महंगा है। यह किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है के रूप में, विधि आसानी से किसी भी अनुसंधान प्रयोगशाला द्वारा अपनाया जा सकता है और कठोरता निर्भर सेल प्रतिक्रिया को समझने पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान के क्षेत्र में विशेष रूप से उपयोगी होगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
40% Acrylamide Bio-Rad 161-0140
2% Bis-acrylamide Bio-Rad 161-0142
Ammonium Persulfate Bio-Rad 161-07000
TEMED Sigma Aldrich T9281
Sulfo-SANPAH Thermo Scientific 22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml BD Biosciences 354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100
Hydrophobic solution — Repel Silane GE Healthcare Bio-Sciences 17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4 HyClone SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] Elsworth Adhesives 3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x) Sigma Aldrich 44174
RPMI-1640 Medium (1x) HyClone SH30027-02
Fetal Bovine Serum HyClone SH30073-03
Penicillin Streptomycin MP Biomedicals 1670046
Detergent: Triton-X Sigma Aldrich T8787
Formaldehyde 37% Solution Sigma Aldrich F1635
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit Chemicon International ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels GE Healthcare Bio-Sciences 309819
Glass Plates Slumpys GBS4100SFSL
50 ml conical tubes Fisher Scientific 3181345107
15 ml conicals tubes FALCON 352097
Micro centrifuge tubes Fisher Scientific 2 ml: 02681258
96-well plate (flat bottom) Fisher Scientific 12565501
Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) Fisher Scientific 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes Fisher Scientific 5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Fisher Scientific 2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9D
Parafilm PARAFILM  PM992
Powder Free Examination Gloves Quest 92897
Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm Grace Bio-Labs JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) Zeiss 3820005619
Microscope Software Zeiss AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven UVITRON UV1080
Vacuum chamber/degasser BelArt 999320237
Vacuum pump for degasser KNF Lab 5097482
Tissue Culture Hood NUAIRE NU-425-600
Chemical Fume Hood KEWAUNEE 99151
Inverted Microscope (Axiovert 25) Zeiss 663526
Incubator NUAIRE NU-8500
Pipette Aid Drummond Scientific Co. P-76864
Hemacytometer Bright-Line 383684

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References

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 97 multiwell सब्सट्रेट कठोरता दवा स्क्रीनिंग Polyacrylamide यंग मापांक उच्च throughput
सरल Polyacrylamide आधारित कठोरता निर्भर सेल प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए multiwell कठोरता परख
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Syed, S., Karadaghy, A., Zustiak, S. Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses. J. Vis. Exp. (97), e52643, doi:10.3791/52643 (2015).

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