Introduction
De fleste vev i kroppen er myke viskoelastiske materialer med en elastisitetsmodul i området fra 0,1 kPa til hjernen til 100 kPa for myk brusk, men de fleste in vitro celle forskning er gjennomført på vevskulturpolystyren (TCP) som har en elastisitetsmodul på ~ 1 GPa . 1 Dette stivhet mismatch i stor grad påvirker hvordan cellene reagerer på sine omgivelser. En økende mengde forskning er derfor viet til å belyse virkningen av substratet stivhet på skjebnen til forskjellige celletyper, inkludert 2,3 stamceller. 4 Som et resultat av dette har flere hydrogeler blitt utviklet for å hjelpe til i forståelsen av stivheten-avhengige celle biologi inkludert polyakrylamid (PA), 5-7 polyetylenglykol (PEG), 8,9 polydimethylsiloxane (PDMS), 10 og alginat. 11 Mens bevis for at underlaget stivhet har en betydelig innvirkning på celle skjebne er økende, er de fleste studier gjennomført på liten skala med et lite antall av samples. Systematiske, flerdimensjonale studier på effekten av underlaget stivhet for en rekke celletyper eller miljøforhold er sjeldne. 12
Flere lovende high-throughput hydrogel teknologi har blitt utviklet, inkludert PEG-baserte mikromatriser, 13 microfluidic enheter for produksjon av agarose hydrogel mikroperler, 14 eller mikro og nanostenger hvor stivhet er modulert av diameter og høyden på microrods. 15 Men de teknologier for å forberede slike substrater er sofistikert og tilgjengelig for begrenset antall laboratorier. Mye forskning som involverer stivhets modulert celle responser anvender polyakrylamid (PA) geler som ikke bare er billig og enkel å gjennomføre, men oppviser også en fysiologisk relevant spekter av Youngs modul, nemlig 0,3 -. 300 kPa 16-22 imidlertid eksisterende metoder for å fremstille PA Geler for cellekultur er arbeidskrevende og følgelig prepared i små grupper. Noen av de problemer forbundet med fremstillingen av PA-geler som celle substrater stammer fra kravet om at gelene må fremstilles: 1) i fravær av oksygen for å sikre fullstendig polymerisering, 2) med en plan og glatt overflate for å tillate ensartet celle festing og utspredning, og 3) permanent festet på undersiden av cellekulturskål for å hindre flytende.
Flere grupper har forsøkt å fremstille PA geler og cellekultur i store partier. Semler et al. Fremstilte tykke ark av PA-geler som så ble "klippe" med et hull, og som er lagt inn i 96-brønners plater. 23 Imidlertid er denne fremgangsmåte begrenset til stivere geler, dvs.> 1 kPa i Youngs modul, fordi mykere gels er "sticky", vanskelig å kutte, og lett skadet. MIH et al., Utviklet en mer avansert teknikk som gjør det mulig for de geler som skal polymeriseres direkte på en glassbunn flere brønner plate.
Dette notatet beskriver en enkel og rimelig måte å montere PA gels i en multiwell plate som kan være lett vedtatt av noen laboratorium. Her er en fleksibel plast støtte utnyttet, som har to sider - en hydrofob en, som er frastøtende å PA gels, og en hydrofil en, som kovalent binder PA gel ved deponering. Når PA gel ark samles og permanent festet til den fleksible plaststøtte, gjør det håndtering geler av en hvilken som helst tykkelse eller stivhet og kutte dem i hvilken som helst ønsket form. Dette ca.oach ikke bare produserer tilpassede plastdekk '' i størrelser som ikke er kommersielt tilgjengelige, men også unngår nødvendigheten av å forbehandle glassoverflater, enten dekkglass eller brønnene i kostbare glassbunn multibrønnplater, med en PA-bindende løsning, som er en omstendelig og tidkrevende trinn. Til slutt kan ensartede PA geler ark være forberedt i store partier og lagret de-hydrert i flere måneder.
Oppsummert analysen som presenteres her er en forbedring i forhold til eksisterende metoder i flere aspekter. For det første er prosessen med flerbrønn plateenhet effektiv, og de samlede kostnadene av de nødvendige materialer er lav. For det andre er de hydrogeler som produseres i store partier i en enkelt homogen gel-film. Til slutt er det bare materialer som er kommersielt tilgjengelige som kreves. Nytten av analysen er illustrert ved å utforske virkningen av substratet stivhet på cellemorfologi og sprer området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av hydrogel-tilknyttede løsninger og Aliquoter
- Utarbeidelse av polyacrylamidgel forløper løsning.
- Forbered polyakrylamid gel-forløper-løsning ved blanding av akrylamid (A) (40% vekt / volum, M r 71,08 g / mol), tverrbindings bisakrylamid (B) (2% w / v, M r 154,17 g / mol), og de- ionisert vann i volumprosenter som er angitt i tabell 1.
MERK: Disse oppløsninger kan fremstilles i store porsjoner og lagret ved 4 ° C i opptil flere måneder.- ADVARSEL: Akrylamid er giftig ved inhalering eller inntak, spesielt når den er i pulverform: således, fortrinnsvis bruke 40% vekt / volum løsning for å redusere toksisitetsrisiko. Håndtere bare mens iført verneutstyr som hansker, vernebriller og en frakk. Oppbevares i en lys-motstandsdyktig, tett lukket beholder i kjøleskapet (<23 ° C, godt ventilert område).
- FORSIKTIG: Bis-akrylamid er giftig ved innånding eller svelging, spesielt,når den er i pulverform: således, fortrinnsvis bruke 2% w / v-løsning for å redusere toksisitetsrisiko. Håndtere bare mens iført verneutstyr som hansker, vernebriller og en frakk. Oppbevares i en lys-motstandsdyktig, tett lukket beholder i kjøleskapet (<4 ° C, godt ventilert område).
- Forbered polyakrylamid gel-forløper-løsning ved blanding av akrylamid (A) (40% vekt / volum, M r 71,08 g / mol), tverrbindings bisakrylamid (B) (2% w / v, M r 154,17 g / mol), og de- ionisert vann i volumprosenter som er angitt i tabell 1.
- Fremstilling og bruk av N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrofenylamino) heksanoat (Sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) porsjoner. FORSIKTIG: Sulfo-SANPAH forårsaker alvorlig øyeirritasjon; håndtere med hansker og riktig øye eller ansiktsbeskyttelse. Oppbevares ved -20 ° C ved mottak og før alikvoteringsprosessen.
- For å lagre Sulfo-SANPAH: oppløse Sulfo-SANPAH i dimethylsulfoxane (DMSO) på 50 mg / ml. Alikvot av stamoppløsning i 50 mikro-sentrifugerør av 20 ul per rør. Flash fryse på tørris eller flytende nitrogen (en valgfri men foretrakk skritt for å bevare maksimal kryss kobling effektivitet) og oppbevar ved -80 ° C.
MERK: Aliquotene can lagres i flere måneder. - Å bruke Sulfo-SANPAH: tine delmengde kort og fortynne i 480 mL av de-ionisert vann. Brukes umiddelbart. Sulfo-SANPAH hydrolyserer raskt i vann: derfor ta forsiktighet for å utføre alle trinnene over raskt.
- For å lagre Sulfo-SANPAH: oppløse Sulfo-SANPAH i dimethylsulfoxane (DMSO) på 50 mg / ml. Alikvot av stamoppløsning i 50 mikro-sentrifugerør av 20 ul per rør. Flash fryse på tørris eller flytende nitrogen (en valgfri men foretrakk skritt for å bevare maksimal kryss kobling effektivitet) og oppbevar ved -80 ° C.
- Fremstilling av ammoniumpersulfat (M r 228,18 g / mol) porsjoner.
MERK: Ammoniumpersulfat forårsaker øye, hud og luftveier. Bruke egnet personlig verneutstyr ved håndtering. Håndtere ammoniumpersulfat pulver i et avtrekksskap. Oppbevar pulver i et tørt og godt ventilert sted. Når alikvotert, kan den fortynnede oppløsningen brukes på arbeidsbenken.- Oppløs ammoniumpersulfat i deionisert vann for å oppnå en endelig ammoniumpersulfat konsentrasjon på 10% vekt / volum. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C. Tine umiddelbart før bruk.
- Utarbeidelse av kollagen type I løsning.
- Forberede 0,2 mg / ml kollagen løsning ved å fortynne lager sårensning i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) med pH 7,4. Lagre på isen kort eller bruke umiddelbart etter fortynning.
2. Hydrogel Forberedelse (Se figur 1)
- Utarbeidelse av hydrofobe glassplater.
- Plassere et par dråper av en hydrofob oppløsning på en glassplate og bruk silkepapir å spre seg over overflaten. La lufttørke og tørk med et silkepapir igjen for å jevne ut hydrofobe belegg.
MERK: Oppbevar hydrofob løsning i en brennbar skap ved RT. Bruk personlig verneutstyr ved håndtering. Arbeid i et godt ventilert område.
- Plassere et par dråper av en hydrofob oppløsning på en glassplate og bruk silkepapir å spre seg over overflaten. La lufttørke og tørk med et silkepapir igjen for å jevne ut hydrofobe belegg.
- Utarbeidelse av plast støtte fleksibel.
- Skjær fleksibel plast støtte til å matche størrelsen på den hydrofobe-belagt glassplate.
- Markere den hydrofobe side av fleksibelt plast bæreren ved forsiktig å skrape overflaten med et skarpt verktøy, for eksempel en skalpell.
MERK: Når geleen - som er helt gjennomsiktig - tørkerVil klore merker hjelpe skille mellom hvilken fleksibel plast støtte side inneholder gel.
MERK: fleksibel plast støtte har en hydrofob og en hydrofil side. Når deponert permanent kleber polyakrylamid til den hydrofile siden av plast støtte som muliggjør enkel håndtering følgende hydrogel.
- Gel preparat (eksempel mengder er gitt i 5 ml gel forløper-løsninger).
MERK: 5 ml vil være tilstrekkelig til å gi ~ 40 geler når gelen opprinnelige tykkelse er 0,5 mm. Andre geler kan fremstilles dersom gelen tykkelsen reduseres.- Plasser 4972,5 ul av polyakrylamid forløper løsning av ønsket sluttkonsentrasjon (tabell 1) inn i et 50 ml konisk rør. Plasser i en avgassingskammeret i 30 minutter med lokket åpnet.
MERK: Oksygen virker som en fri-radikal felle og når det er tilstede, det hemmer polymerisasjon. - Legg 25 pl 10% w / v ammoniumpersulfat (se punkt 1,3) for å oppnå en endeligammoniumpersulfat konsentrasjon på 0,05%.
- Legg 2,5 mL av N, N, N ', N'-tetrametyletylendiamin (TEMED, M r 116,24 g / mol) til det avgassede gel-løsning for å oppnå en endelig TEMED konsentrasjon på 0,5%.
MERK: Oppbevar TEMED i en brennbar skap ved RT. Håndtere i et avtrekksskap når iført egnet personlig verneutstyr. Holdes tett lukket under inert gass, som det er meget luft og fuktighetsfølsomme. - Bland løsningen forsiktig ved å pipettere opp og ned 3-5 ganger. Ikke vortex å unngå oksygendiffusjon inn i gel-forløper-løsning.
- Pipetter gel løsning på den hydrofile siden av fleksibel plast støtte og sandwich med hydrofob-belagt glass lysbilde. Skille de to lysbildene med silikon avstandsstykker av ønsket tykkelse (f.eks 0,5 mm). La en liten mengde (~ 100 ul) av polymer-forløper-løsning i 50 ml konisk rør som skal brukes som en indikator for gelering.
MERK:Alle avstandsstykke kan benyttes. For eksempel, en enkelt stripe av Parafilm gir en endelig svellet gel tykkelse på 100 - 120 pm. - Plasser en annen glassplate på toppen av fleksibel plast støtte / gel sandwich å fastslå en enda hydrogel overflaten på polymerisasjon.
- La gelen polymerisere i 45 minutter, selv om kortere tid kan brukes til geler med høyere vekt-% hvis det er ønskelig. Å konstatere at gelen har polymerisert, observere de resterende løsning i 50 ml konisk rør; Hvis den gjenværende oppløsning er geleaktig, så er det sannsynlig at gelering på glassplaten har blitt initiert, så vel. Vær imidlertid oppmerksom på at for tidlig åpning av formen vil hindre full polymerisasjon.
- Når geleen er dannet, løsner den fleksible plaststøtten med kovalent festet polyakrylamidgelen på toppen, og sette gel side opp lufttørke.
MERK: konveksjon eller varmetørking kan også anvendes for å akselerere dette trinnet. Når tørket på fleksibel plast støtte, kan gelen være butikkend ubestemt tid.- Markere noen bare flekker av fleksibel plast støtte, hvor polyakrylamidgeler ikke dannet på grunn av bobler. Mark mens gelen er fortsatt hydrert som dette vil gli inn i den fleksible plast støtte når gelen er tørr.
- Plasser 4972,5 ul av polyakrylamid forløper løsning av ønsket sluttkonsentrasjon (tabell 1) inn i et 50 ml konisk rør. Plasser i en avgassingskammeret i 30 minutter med lokket åpnet.
3. flerbrønns Plate Assembly, Collagen Coating, og Sterilisering
- Multiwell plate montering.
- Når tørket, kuttet PA gels i ønskede former.
- For en 96-brønns plate, bruker en heavy-duty hull med en diameter på ~ 6 mm. Bruk en heavy-duty papirkniv for å skjære gels i kvadratiske eller rektangulære former. Alternativt kan du bruke saks.
- Forberede ca 500 mL av PDMS per 96-brønns plate i henhold til produsentens instruksjoner. Å lime gelene til bunnen av en flerbrønns platen, plasserer en liten dråpe (~ 5 ul) av polydimetylsiloksan (PDMS) ved midten av hver brønn. Bruk pinsett, plasserer man polyacrylamide gel i hver brønn, fleksibel plast støtte siden ned. For å tillate PDMS å herde, lar den sammensatte plate ved 37 ° C i minst 4 timer.
- Når tørket, kuttet PA gels i ønskede former.
- Kollagen belegg av polyakrylamidgeler.
- Med en overføring pipette, plassere en liten mengde (7-8 mL) av sulfo-SANPAH (se punkt 1.2.2) i hver brønn og swirl fra side til side for å belegge gel overflaten jevnt. Arbeid raskt siden sulfo-SANPAH er ikke stabil i vannet.
- Sett brønn plate under en UV-lampe med høy intensitet (intensitet = 37 mW, λ = 302-365 nm) i 5 min. Skyll geler med PBS for å fjerne overskudd av sulfo-SANPAH.
- Pipetter 50 ul 0,2 mg / ml kollagen type I-løsning (se punkt 1,4) i hver brønn. La platen dekket ved romtemperatur i minst 2 timer eller O / N ved 4 ° C.
MERK: For å få fortgang i prosessen med kollagen belegg, kan en overføring pipette brukes til å legge kollagen løsning. Typisk, 1 - 2 bør dråper av løsningen være tilstrekkelig til å fullførely dekke geloverflaten. - La brønnplate ved romtemperatur i minst 2 timer for å tillate binding av kollagen.
- Skyll med PBS for å fjerne overskudd av kollagen-oppløsning og sterilisere under UV (λ = 200 nm) i en vevskultur hette i 2 timer.
- Suge gels i fullstendig medium (se avsnitt 4.1 for medium sammensetning) O / N til hydrat og likevekt. Bruk for celle seeding umiddelbart eller butikken i kjøleskapet i opptil 2 dager.
4. Cell Seeding på PA Stivhet analysen
MERK: Selv om typiske for vanlige pattedyrcellelinjer protokollen som er beskrevet i dette avsnittet er spesielt brukt med brystkreft MDA-MB-231-cellelinjen (se figur 4 og 5).
- Samle celler fra vevkultur-kolbe ved eksponering overfor 5% trypsin / EDTA i 5 minutter ved 37 ° C. Bruk ~ 80 mL av trypsin / EDTA per hver cm 2 av kultur kolbe området; for eksempel bruke 2 ml trypsin / EDTA fora T25 cellekultur kolbe. Re-suspen oppsamlede celler i fullstendig medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin ved en ønsket endelig cellekonsentrasjon. Tar hensyn til cellefordoblingstiden så vel som lengden av tids cellene blir sådd ut på analyse, velge en passende sub-konfluent cellekonsentrasjon. Pass på at ekstra medium er nok til å fullstendig senk hydrogelene.
MERK: Siden hydrogelene har blitt preekvilibrert i media (se trinn 3.2.6) 100 fil volum bør være tilstrekkelig. Typiske medium volum brukes for multibrønnplater bør være tilstrekkelig ettersom gels har blitt preekvilibrert i media i forrige trinn.
MERK: Analysen ville være passende for noen vedlegg avhengig celletype.- Telle celle nummer under en invertert mikroskop ved hjelp av en hemacytometer. Last 10 mL av cellesuspensjon i hver hemacytometer port og gjennomsnittlig celletallet fra minst åtte kvadranter. For å fåendelig cellekonsentrasjonen, multiplisere celletallet med 10 4.
MERK: Best celle teller resultatene oppnås når celle nummer i hver hemacytometer kvadrant er 20 - 50.
- Telle celle nummer under en invertert mikroskop ved hjelp av en hemacytometer. Last 10 mL av cellesuspensjon i hver hemacytometer port og gjennomsnittlig celletallet fra minst åtte kvadranter. For å fåendelig cellekonsentrasjonen, multiplisere celletallet med 10 4.
- Kultur cellene bort på PA stivhet assay i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Endre media hver 2 - 3 dager. Samle celler når det er nødvendig ved eksponering overfor 5% trypsin / EDTA ved 37 ° C i 5 min. Bruk ~ 80 mL av trypsin / EDTA per cm 2 av vevskulturkolbe. Under alle celle manipulasjon skritt, ta spesielt vare for ikke å forstyrre hydrogel overflate: aspirer eller pipette medium med litt tipping for flere brønner plate sidelengs og rørende pipettespissen på sideveggen av hver brønn, i motsetning til å berøre hydrogel.
MERK: Med unntak for å ta spesielt vare for ikke å skade hydrogel overflaten under standard vev kultur håndtering, cellene sådd ut på stivhet analysen kan manipuleres på samme måte som om de ble sådd påtil en vanlig flerbrønn plate.
5. Imaging av celler sådd ut på PA Stivhet analysen
- Bildet celler direkte på PA stivhet analysen.
MERK: Eventuelle mikroskop - invertert, lysstoffrør, eller confocal, kan brukes til celle bildebehandling.
NB: Den fleksible plaststøtte brukes til å konstruere den stivhet analysen er fullstendig transparent og ikke autofluoresce eller forstyrre celle avbildning. Men selv om den fleksible plast støtte seg selv er gjennomsiktig, imaging evner vil være begrenset av arbeidsavstanden på objektivet. Den fleksible plaststøtte har en tykkelse på 0,23 mm og en typisk arbeidsavstand fra et 10X objektiv er ~ 4 mm, skarpt avtagende for høyere forstørrelse.- For levende celle bildebehandling, posisjon PA stivhet analysen i mikroskop plate holder og bilde. Hold bildebehandlings økter etter 2 timer, eller bruke et mikroskop utstyrt med et miljøkammer for lengre bildebehandlings ganger.
- Når levende celle imaldring er ikke målet, fikse celler i 4% formaldehyd løsning supplert med 0,1% vaskemiddel. Sug celler i fiksativ ved romtemperatur i minst 2 timer. Skyll med PBS to ganger. Kast fiksativ avfall i egen avfallsbeholder.
MERK: Celler kan avbildes umiddelbart eller oppbevares nedsenket i PBS ved 4 ° C i opptil 2 uker. FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig ved innånding og kontakt. Håndtere med hansker i avtrekksskap.
MERK: Cell fiksering protokollen må velges basert på den påfølgende cellefarging og håndtering protokoller, fordi visse fiksativ skade noen celle proteiner. - For fluorescerende bildebehandling, beis faste celler med ønsket celle flekken direkte i multiwell plate. Bilde umiddelbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polyakrylamid (PA) hydrogeler er mye brukt for å teste stivhets-avhengig celle-responser. 17,24 Ved å blande forskjellige konsentrasjoner av akrylamid (A) og bis-akrylamid (B) kan man foreta PA geler som spenner stivheten utvalg av de fleste myke vev i kroppen - 0,3 -.. 300 kPa Elastisitetsmodul en Imidlertid er fremstillingen av polyakrylamidgeler kjedelig og tidkrevende, ofte begrenser deres nytte i "high-throughput" applikasjoner så som for eksempel medikamentscreening 12 Her er en enkel og rask metode for montering PA geler på flerbrønnsplater eller andre ønskelige vevskultur fartøyet er vist (figur 1). Figur 2A viser elastisitetsmodul som en funksjon av flere A- og B-konsentrasjoner (også oppsummert i tabell 1). Moduliene av flere A- og B-kombinasjoner er rapportert i litteraturen. 17,25,26 Gelen stivhet av fullt swollen geler ble målt ved hjelp av reologi (AR 2000ex rheometer, TA Instruments) med en 20 mm parallell øvre geometri, oscillerende frekvenssveip test 1 - 10 Hz, og 2% konstant belastning. Som forventet, ble det vist at både lagringsmodul, G 'og tapsmodul, G ", er uavhengige av frekvens (figur 2B). Det ble også bekreftet at tørking og deretter re-fuktighetsgivende gele, påvirket ikke deres Youngs modulus (Figur 2C). Youngs modul er relatert til lagringsmodul ved følgende ligning: 
der E er Youngs modul og v er Poissons tall som ble anslått til 0,5 for PA gels. 27 Merk at de rapporterte verdiene er for hydrogelene tilberedt med TEMED. PA hydrogeler kan også fremstilles ved UV-kryssbinding når eksponeringstiden og UV-intensitet er optimalisert (
Videre ble det vist at cellene sådd ut på hydrogeler av forskjellig stiffness utstilt forskjellig morfologi. For dette forsøket ble brystkreft MDA-MB-231 celler sådd ut på toppen av PA-geler til 24 - 72 timer. Celler ble dyrket i RPMI-medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Celler ble sådd ut ved en 5 x 10 celler / ml eller 1 x 10 4 celler / brønn i en 96-brønns plate. Dette er en typisk celletetthet seeding - 4 ganger lavere enn den konfluens celletetthet, hvor konfluens i en pattedyrcellelinje er nådd på ~ 1 x 10 5 celler / cm2. Bildene ble tatt på invertert fluorescerende mikroskop og analysert på ImageJ via Shape Descriptor og området programvare plug-ins. Det ble observert at når utsådd på PA-geler i 24 timer, forble brystkreft MDA-MB-231-celler rundt på den myke 0,5 og 1 kPa geler, men var i stand til å spre seg og forlenges på stiv 100 kPa gel (figur 4). Figur 4 showcas ogsåes det faktum at hydrogeler laget på toppen av den fleksible plast støtte er transparent og gir enkel visualisering og mikroskopi. Videre gjør den fleksible plaststøtte ikke autofluoresce og således ikke forstyrrer den avbildning av fluorescens-merkede celler. Cellemorfologi ble ytterligere kvantifisert i form av generelle celle sprer området og cellen form faktor - sirkularitet (Figur 5). Celle spredning området ble målt ved å skape en maske for å spore omkretsen av hver celle. Celleform (sirkularitet) ble deretter beregnet ut fra følgende sammenheng: 
Sirkularitet er målt på en skala fra 0-1, hvor 0,6-1 ble tatt for å betegne avrundede celler og 0 - 0,5 ble tatt for å betegne langstrakte celler. Omtrent tre hundre celler fra minst tre uavhengige eksperimenter ble analysert for hver data pe t. Statistiske forskjeller ble beregnet på grunnlag av enkeltfaktoranalyse for varians (ANOVA), hvor datasettene ble betraktet som signifikant forskjellige når p <0,05.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av polyacrylamidgel forberedelse på fleksibel plast støtte. Figuren representerer de ulike trinnene involvert i utarbeidelsen av PA gels på plast støtte fleksibel. Etter at gelen er fullstendig tørr, kan det kuttes eller stanses i en hvilken som helst ønskelig form. En hel stempel (~ 6 mm diameter) er mest praktisk når fremstilling av geler for en 96-brønns plate, mens en kraftig papirkniv kan benyttes for kvadratiske eller rektangulære former. Figuren viser også kantene av brønner, både med og uten en gel, for å vise at komplette brønnbunnen dekning kan oppnås med denne fremgangsmåten. oad / 52643 / 52643fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Stivhet PA hydrogeler som målt ved reologi. (A) Representative Youngs modul for fem forskjellige A & B-konsentrasjoner (se tabell 1 for akronymer), (B) lagrings- og tapsmodul som en funksjon av frekvens målt ved reologi; (c) geler oppviser den samme elastisitetsmodul innledning (Initial) og etter at de er tørket og hydrert på nytt (re-hydratisert) uavhengig av polymer forløper konsentrasjon. Alle gels for reologi målingene ble utarbeidet som plater av 20 mm diameter og 1 - 1,5 mm høyde (ved fullstendig hevelse).
/52643fig3.jpg "/>
Figur 3. Collagen belegg på PA-geler. Kollagen belegg (grønn) blir effektivt fordelt og holdes på PA-gel (rød) overflate uavhengig av hydrogel stivhet Youngs modulus). Kollagen merket med Cy5 ble brukt for disse data. Rød-fluoriserende perler ble innebygd i PA hydrogel til hjelp visualisering. Cross-sectional bilder ble tatt på en konfokal mikroskop (skala bar = 100 mikrometer). Bilde tilpasset fra Zustiak et. al. 5 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Fase kontrakt (øverste rad) og fluoriserende (nederste rad) bilder av MDA-MB-231 celler seeded på PA gels for 24 timer. MDA-MB-231 celler forblir runde på myke gels (unge 7; s modul på 0,5 og 1 kPa), men på langstrakte stive PA-geler (Youngs modul på 100 kPa). Cellene ble sådd ut på gelene i 24 timer, fiksert i etanol og farget med acridin orange (AO - grønn) for å visualisere cellens cytoplasma og DAPI (blå) for å visualisere cellekjerne; skala bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Cellespredningsområde og sirkularitet påvirkes av stivheten av det underliggende substrat. (A) MDA-MB-231-celle spredning området er betydelig økt på 100 kPa i motsetning til 0,5 kPa geler. (B) Celle sirkularitet avtar med økning i PA gel stivhet. Stjernene utpeke signifikante forskjeller; p <0,05.
Figur 6 viser skjematisk en alternativ polyakrylamidgel forberedelse på plaststøtte fleksibel. I figuren representerer de forskjellige trinnene som er involvert i fremstillingen av PA geler på plaststøtte fleksibel. Her den fleksible plaststøtten er innledningsvis pre-skjær i plast "dekkglass" i en ønsket form og størrelse. Denne teknikken fungerer best for myke hydrogeler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Akronym | Akrylamid% | Bis-akrylamid% | Akrylamid fra 40% stamløsning (ml) | Bis-akrylamid fra 2% stamløsning (ml) | Vann (ml) | G '± SD (kPa) | E ± SD (kPa) |
| PA1 | 5 | 0,025 | 625 | 62.5 | 4312,5 | 0.62 ± 0.19 | 1.85 ± 0.57 |
| PA2 | 5 | 0.1 | 625 | 250 | 4125 | 3,55 ± 0,12 | 10.64 ± 0.36 |
| PA3 | 8 | 0.1 | 1000 | 250 | 3750 | 9.71 ± 0.64 | 29.14 ± 1.93 |
| PA4 | 8 | 0,25 | 1000 | 625 | 3375 | 22.00 ± 2.10 | 66.01 ± 6.31 |
| PA5 | 12 | 0,25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37.42 ± 2.68 | 112,25 ± 8.03 |
Tabell 1. Konsentrasjon av akrylamid (A) og tverrbindingsmiddel bis-akrylamid (B), og den resulterende gel PA stivhet. Stivhet, her representert ved G 'og E, ble målt ved reologi. G 'er lagringsmodul ved 1 Hz frekvens. Elastisitetsmodul, E, ble beregnet fra ligning. 1. Standardavvik (SD) ble beregnet basert på tre uavhengige eksperimenter med 3-5 prøver målt per eksperiment. Forkortelsene i tabellen tilsvarer de akronymer brukt i figur 2A.
| UV Intensitet = 15 mW / cm 2 | Eksponeringstid = 300 sek | ||
| Tid (s) | E (kPa) ± SD | Itensity (mW / cm2) | E (kPa) ± SD |
| 75 | 0.14 ± 0.03 | 15 | 28.05 ± 2.62 |
| 100 | 6,98 ± 2.34 | 26 | 21.13 ± 3.01 |
| 125 | 19.11 ± 2.29 | 37 | 20.01 ± 2.38 |
| 300 | 28.05 ± 2.62 | 66 | 19.35 ± 2.86 |
Tabell 2. UV-polymerisering er et alternativ, og en raskere fremgangsmåte for PA-gel-preparat når geleringsbetingelsene optimalisert; PA3 (se Tabell 1) gelen er avbildet. Tabellen oppsummerer den resulterende elastisitetsmodul når enten eksponeringstiden (til venstre to kolonner) eller UV-intensitet (høyre to kolonner) er variert for den samme oppløsning. Basert på resultatene fra tabellen, viser det seg at 300 sek eksponeringstid og 15.mW / cm2 UV-intensitet gir den høyeste gel-PA stivhet, noe som er sammenlignbart med stivheten av tradisjonelt polymeriserte gel som rapportert i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyakrylamidgeler, som opprinnelig ble utviklet for elektroforese, 28 er nå rutinemessig brukt som cellekultur substrater for å studere effektene av substratet stivhet på cellemorfologi, motilitet, og kommunikasjon 3,24,29 blant andre celleegenskaper. Polyakrylamid tillater manipulering av substratet stivhet til å omfatte stivheten av alle myke vev i kroppen (0,3 til 300 kPa) 1 med en enkel endring i polymerforløperen konsentrasjon (figur 2, tabell 1, også se referanser 17,25,26). Koplet til det faktum at geler PA er ganske billig og enkel å fremstille, de har blitt uunnværlig plattformer i studiet av stivhetsavhengig cellemateriale interaksjoner. Men selv om enkle, er dagens teknikk for å forberede PA gels begrenset til små grupper. Disse begrensninger stammer fra arten av den hydrogel gelering, som er en fri-radikal-polymerisasjon katalysert av ammoniumpersulfatog TEMED. 30 Ettersom reaksjonen er en fri-radikal-kjede polymerisasjon, det kan inhiberes av hvilket som helst element som fungerer som en fri radikal felle, slik som oksygen. Derfor, siden oksygendiffusjon inn i polymeroppløsningen må bli unngått under polymeriseringen - som kan ta opp til 45 minutter for de mykeste geler - bare pipettering av PA-geler i en åpen flere brønner plate er ikke gjennomførbart. Også, for å bli brukt som en to-dimensjonal (2D) cellesubstrat, bør overflaten av PA-gel være flat. Begge de ovennevnte krav tilsier at for å frem PA geler som 2D celle substrater, bør PA gel-forløper-løsning bli klemt mellom to flate overflater under polymeriseringen - å hindre oksygendiffusjon og flat geloverflaten. I tillegg har den øvre overflaten til å være slik at det lett kan skrelles av fra gelen eksponere overflaten for cellebinding. Dette oppnås typisk ved å hydrofobisk belegning av en glassoverflate. Til slutt, når plassert i the brønner på en multiwell plate, bør PA gels dekke hele godt underlag og være begrenset fra flytende. Komplett godt bunnoverflatedekning er spesielt viktig i applikasjoner der analysene brukes til å vurdere cellene er typen som tar hensyn til hele cellepopulasjonen i brønnen (f.eks MTT). Hvis PA gel ikke i tilstrekkelig grad dekker hele brønnoverflaten, må det utvises forsiktighet for å blokkere celle adhesjon til den eksponerte overflaten vel som celler kan lett rulle av gelen på glass eller plast. Hvis det er nødvendig, BSA blokkering følgende standardprotokoller eller ved hjelp rabatt-sokkelen BSA-basert celle adhesjon blokkeringssett bør være tilstrekkelig til å blokkere cellefesting til bunnen av platen også. For eksempel, for å fremstille en BSA-dekket overflate, 0,5 mg / ml oppløsning av BSA i PBS, pH 7,4, bør adsorbert på vevskulturskål i 20 minutter ved romtemperatur, skylt med PBS og brukes umiddelbart eller lagres ved 4 ° C i opp til to uker. BSA har blitt vist å blokkere celleadhesjon of pattedyrcellekulturer på både hydrofile og hydrofobe polystyren overflater reduseres vesentlig celle adhesjonskreftene som målt ved atomic force microscopy. 31 BSA har blitt brukt rutinemessig for å blokkere pattedyrcelle adhesjon samt lage celle mønstrede overflater. 32,33
Teknikken avbildet i denne artikkelen, tilfredsstiller alle kravene ovenfor slik at masseproduksjon av ensartede PA gels av tilpasset størrelse og form. Den teknikk som er enklere og mer effektiv enn den nåværende standard på sandwiching PA gel-forløper-løsning mellom to dekkglass. Videre krever det ikke noe avansert utstyr, og er dermed lett adoptable av noen forskningslaboratorium. Det er også mer kostnadseffektivt som den ikke nødvendiggjøre bruk av glassplater eller dekkglass, som ikke bare er kostbart, men også komme i begrensede størrelser. Teknikken er også raskere flere grunner. Først, betyr det ikke innebærer noen forbehandlingstrinntypisk for glassflater, siden den fleksible plaststøtten er utformet med to adskilte overflater - en hydrofil side som permanent festes til polyakrylamid og en hydrofob side som lett kan skrelles av etter geldannelse. For det andre, fordi plaststøtten er fleksibel, er det enklere og raskere å skrelle av dannet gel: når tynne gels er dannet mellom to glassplater, peeling av toppen hydrofobe lysbildet er vanskelig og ofte resulterer i brudd som også kompromitterer gel. Til slutt, på grunn av den fleksible plaststøtte gjennomsiktighet, raskere UV-polymerisering, kan anvendes, i motsetning til standard TEMED-basert polymerisasjon som kan ta så mye som 45 min (Tabell 2). Dataene i tabell 2 viser at når polymerisasjonstid og UV-lysintensitet er optimalisert lignende stivhet kan oppnås ved begge TEMED og UV-polymerisasjons- metoder.
Hydrogelene er forberedt på fleksibel plastic støtte som vist på figur 1. Det anbefales å gjennomføre gelering i et avgassingskammer for å unngå ufullstendig polymerisering av gelen kantene (dvs. kanteffekter) som skyldes oksygen diffusjon mellom de to overflater som sandwich-polymerløsning. Målet er å skape en stor hydrogel film på toppen av den fleksible plaststøtte således glassplate i alle størrelser vil være hensiktsmessig, men det vil diktere størrelsen på polyakrylamid film som kan oppnås. Glasset kan være belagt med hvilken som helst hydrofobt belegg eller alternativt, kan den hydrofobe side av fleksibelt plast støtten brukes i stedet. Når en gel-PA film er dannet, blir det tørket, skåret i ønskede former, og deretter re-hydrert før bruk. Når de er tørre, kan gelene skal lagres på ubestemt tid. Det ble bekreftet ved reologi, at PA gel stivhet er uendret ved rehydrering selv når gelene lagres i tørr tilstand i flere måneder (figur 2C). Men for meget soft gels (≤ 1 kPa i Youngs modulus) tørking og re-hydrering forverre overflaten det krøller og sprekkdannelse. Denne atferden er vanlig for myk gele som gjennomgår de-hydrering og påfølgende re-hydrering samtidig som geometrisk begrenset. 34,35 Ikke alle gels krøll eller sprekk, og dermed er det mulig å visuelt undersøke hydrogelene før bruk, og bare bruke prøvene som viser en glatt overflate. For å fullstendig unngå dannelse av skrukker og sprengning, en alternativ metode for å fremstille myke hydrogeler er avbildet på figur 6. Her er den fleksible plaststøtte pre-kutt i den ønskede form og PA gel er dannet på toppen, og dermed gelene ikke gjør trenger å være de-hydratiseres, men kan brukes som fremstilt. En ekstra fordel med dette alternativ strategi er at ~ 2,5 flere geler kan fremstilles fra det samme volum av hydrogel-forløper-løsning (estimatet bygger på fremstilling av geler for en standard 96-brønns plate som beskrevet i protokollen avsnitt). En forsiktig nårfremstilling av hydrogeler på denne måte er å ta vare for å unngå oksygen infiltrering, spesielt for geler av mindre størrelse (for eksempel, geler som skal benyttes i en 96-brønns plate). Selv når gel-forløper-løsning er fullstendig avgasset, dvs. oksygenfritt, oksygen vil diffundere mellom de to overflater som sandwich-PA-løsning. Derfor, for å unngå kanteffekter eller ufullstendig geldannelse langs kantene, er det best å tillate polymeriseringen å skje i fravær av oksygen. Etter vår erfaring er et vakuumkammer fungerer godt, selv om en inert gassmiljø kan brukes med like stor suksess.
En siste forsiktig ved fremstilling PA hydrogeler som celle-substrater for å teste stivhets-avhengig celle-responser, er at tykkelsen på det resulterende hydrogel er viktig: for svært tynne geler, cellene er i stand til å avføle det underliggende substrat 36 ved hjelp av teori og eksperiment. Lin et al., demonstrerte at dybden ved hvilken celler kan feel det underliggende substrat er avhengig av den laterale dimensjonen til cellen. 29 Siden dagens forskning er motstridende, å identifisere den minimale tykkelse som kreves for å hindre at celler fra avføling av "skjulte" substrat til å være fra flere mikrometer 36 til så mye som 60 mikron, 37 et minimum gel tykkelse på 100 mikrometer bør sikte etter.
Ved montering PA-geler i en flerbrønns plate, er en liten dråpe av PDMS brukes for å feste gelen til bunnen av brønnen. PDMS ble valgt fordi den fungerer som permanent lim på herding, det er helt gjennomsiktig og ikke forstyrrer med påfølgende mikros eksperimenter, det er helt ikke-cytotoksiske, og det botemidler i ca 4-8 timer forlater tilstrekkelig tid for plate montering. Trygg sikring hydrogelene til bunnen av brønn hjelpemidler i celle håndtering: for eksempel kan sprek vask løsne hydrogeler hvis ikke godt sikret. Hvis hyppig endring i celle media ikke er et problem, da gelene kan bli midlertidig festet til brønnoverflaten ved en liten dråpe av et ikke-cytotoksisk, og meget viskøs væske som for eksempel glyserin.
De siste trinnene før celle seeding involverer ECM belegg av gelen og deretter sterilisering. Her Collagen Type I belegget er vist (figur 3), selv om den samme teknikken kan brukes for hvilken som helst annen ECM-proteiner. Den bi-funksjonelle tverrbindingsmiddel sulfo-SANPAH utnyttes til å oppnå et jevnt monosjikt strøk. Tidligere forskning har vist at en slik kovalent binding gir et mer ensartet belegg enn enkle protein-adsorpsjon og gjør det mulig for en 12-ganger innstilling av mengden av protein som er festet ved å bruke et protein oppløsning av varierende konsentrasjon også. 6. Til slutt, den sammensatte flerbrønn gelplate steriliseres under UV i vevskultur hette for opptil 2 timer. UV-sterilisering tillater analysen som skal monteres på en laboratoriebenk utsiden av hetten, hvilkengjør prosessen logistisk enklere og generelle raskere.
Figurene 4 og 5 viser noen representative resultater fra MDA-MB-231 bryst-kreftceller dyrket på fleksible plast-støtte festet PA geler av varierende stivhet. MDA-MB-231-celler ble valgt for å demonstrere fremgangsmåten i verktøyet, fordi de har vist seg å reagere på det underliggende substrat stivhet ved målbare endringer i deres morfologi. 5,12 Som forventet, var cellene mer langstrakt og hadde en større spredningsområde på de stive 100 kPa PA-geler i forhold til den myke 0,5 kPa og en PA-geler (figur 4 og 5). Den nederste raden på figur 4 viser også bruk av to fluorescerende fargestoffer som flekker i cellekjernen og cellecytoplasmaet, som viser det faktum at det fleksible plaststøtte ikke forstyrrer fluorescerende mikroskop avbildning.
I sammendrag, til en enkel fremgangsmåte fremstille polyakrylamid hydrogel i enflerbrønns plateformat er presentert. Teknikken er raskere, mer effektiv og mindre kostnadskrevende enn dagens metoder for fremstilling av PA-geler til å bli brukt som celle-substrater så vel som muliggjør fremstilling av geler av tilpassede størrelser som ellers ikke er tilgjengelig. Som det ikke krever noen spesialutstyr, kan fremgangsmåten lett bli tatt i bruk av en hvilken som helst forskningslaboratorium, og vil være særlig nyttig i forskning fokusert på å forstå stivhets-avhengige celle-responser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
- Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
