Introduction
Большинство тканей в организме мягкие вязкоупругие материалы с модулем Юнга в диапазоне от 0,1 кПа в течение мозга до 100 кПа для мягкой хряща, не менее, большинство в исследовании клеток пробирке осуществляется на тканевой культуры полистирола (TCP), который имеет модуль ~ 1 ГПа . 1 Это жесткость несоответствие значительно влияет на способ клетки реагируют на их среду. Все больше исследований, таким образом, посвященный выяснению влияния подложки жесткости на судьбу клеток разных типов, 2,3 в том числе стволовых клеток. 4 В результате, несколько гидрогели были разработаны, чтобы помочь в понимании жесткости в зависимости от клетки биологии, включая полиакриламид (РА), 5-7 полиэтиленгликоль (ПЭГ), 8,9 полидиметилсилоксана (ПДМС), 10 и альгината. 11 В то время как свидетельство того, что субстрат жесткости имеет существенное влияние на судьбы клеток растет, большинство исследований проводятся на малого масштаба с небольшим количеством секamples. Систематические, многомерные исследования о влиянии подложки жесткости для массива типов клеток и условий окружающей среды редки. 12
Несколько перспективных технологий гидрогелевые высокой пропускной были разработаны, в том числе на основе ПЭГ-микрочипов, 13 микрофлюидных устройств для производства агарозы гидрогеля микросфер, 14 или микро и нано-стержней, в которой жесткость модулируется по диаметру и высоте microrods. 15 Однако , технологии для подготовки таких субстратов являются сложными и доступны для ограниченного числа лабораторий. Многие исследования с участием жесткости модулируется клеточные реакции использует полиакриламид (ПА) гели, которые являются не только недорогим и простым в реализации, но также обладают физиологически соответствующем диапазоне модуля Юнга, а именно 0,3 -. 300 кПа 16-22 Однако, существующие методы для изготовления PA гели для клеточной культуры являются трудоемкими и, следовательно, подготовительныеared небольшими партиями. Некоторые из трудностей, связанных с подготовкой PA гелей как клеточных субстратов вытекают из требований, что гели должны быть подготовлены: 1) в отсутствие кислорода, чтобы позволить полную полимеризацию, 2) с плоской и гладкой поверхностью, чтобы обеспечить равномерное клетку Крепление и распространение, и 3) постоянно прикреплена к нижней части клетки культуральной чашке, чтобы предотвратить плавающей.
Несколько групп пытались производить PA гели для клеточной культуры в больших партиях. Semler и др. Подготовленные листы толщиной ПА гелей, которые были тогда "вырезать" с дыроколом и размещены в 96-луночных планшетах. 23 Тем не менее, этот метод ограничен жесткими гелей, т.е.> 1 кПа модуля Юнга, потому что мягче гели "липкий", трудно резать, и легко повреждены. Mih др. Разработали более сложный метод, который позволяет гели быть непосредственно полимеризованы в стеклянным дном многоямного пластины.
Эта статья описывает простой и недорогой способ собрать PA гели многоямного пластины, которые могут быть легко принятой любой лаборатории. Здесь гибкого пластика поддержка использовать, который имеет две стороны - гидрофобный один, который отталкивает PA гелей, и гидрофильного, которые ковалентно связывает гель PA при осаждении. После того, как гель листов PA оседают и постоянно прикреплен к гибкой пластиковой поддержки, что позволяет обработки гелей любой толщины или жесткости и резки их в любой желаемой форме. Это октренере не только производит на заказ пластиковые "покровные" в размерах не иначе имеющиеся в продаже, но и устраняет необходимость предварительной обработки стеклянных поверхностей, либо покровные стекла или лунки дорогостоящих стеклянным дном луночные планшеты, со связующим PA решения, которое является утомительным и трудоемким этапом. Наконец, однородные PA гели листов, могут быть получены в больших количествах и хранить де-гидратированных в течение нескольких месяцев.
Таким образом, по результатам анализа, представленные здесь, улучшение по сравнению с существующими методами в нескольких аспектах. Во-первых, процесс многоямного монтажной пластины является эффективным, и общая стоимость необходимых материалов низка. Во-вторых, гидрогели производятся большими партиями в одной однородной гелевой пленки. Наконец, только материалы, которые имеются в продаже, необходимо. Полезность анализа иллюстрируется изучения влияния подложки жесткости на клеточной морфологии и площади распространения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Гидрогель-ассоциированных растворов и аликвоты
- Приготовление раствора предшественника геля полиакриламида.
- Подготовка полиакриламидном геле раствор предшественника путем смешивания акриламида (A) (40% вес / объем, M R 71,08 г / моль), сшивающий агент бис-акриламида (В) (2% вес / об, M R 154,17 г / моль), и обозначим ионизированной воды в процентах объема, указанных в таблице 1.
Примечание: Эти растворы могут быть получены в больших количествах и хранили при 4 ° С в течение нескольких месяцев.- ВНИМАНИЕ: Акриламид является токсичным при вдыхании или проглатывании, особенно, когда в виде порошка: Таким образом, предпочтительно использовать 40% вес / объем раствора, чтобы снизить риски, связанные с токсичностью. Обращайтесь только тогда, когда ношение защитной одежды, такие как перчатки, защитные очки, и халате. Хранить в свет устойчивостью, плотно закрытом контейнере в холодильнике (<23 ° C, хорошо проветриваемом месте).
- ВНИМАНИЕ: Бис-акриламид является токсичным при вдыхании или проглатывании, особенно,Когда в виде порошка: Таким образом, предпочтительно использовать 2% вес / об раствора, чтобы снизить риски, связанные с токсичностью. Обращайтесь только тогда, когда ношение защитной одежды, такие как перчатки, защитные очки, и халате. Хранить в свет устойчивостью, плотно закрытом контейнере в холодильнике (<4 ° C, хорошо проветриваемом помещении).
- Подготовка полиакриламидном геле раствор предшественника путем смешивания акриламида (A) (40% вес / объем, M R 71,08 г / моль), сшивающий агент бис-акриламида (В) (2% вес / об, M R 154,17 г / моль), и обозначим ионизированной воды в процентах объема, указанных в таблице 1.
- Получение и использование N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-азидо-2'-нитрофениламино) гексаноата (сульфо-SANPAH, M R 492,40 г / моль) аликвоты. ВНИМАНИЕ: сульфо-SANPAH вызывает сильное раздражение глаз; ручка с перчатками и соответствующей очки или маску. Хранить при -20 ° C при получении и перед аликвоты.
- Чтобы сохранить сульфо-SANPAH: растворить сульфо-SANPAH в dimethylsulfoxane (ДМСО) при 50 мг / мл. Алиготе маточного раствора в 50 микро трубки центрифуги 20 мкл на пробирку. Флэш замораживание сухим льдом или жидким азотом (не обязательно, но предпочтительно, шаг, чтобы сохранить максимальную эффективность сшивающего) и хранят при -80 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: аликвоты окп храниться в течение нескольких месяцев. - Для использования сульфо-SANPAH: растопить на короткое время кратный и разбавить в 480 мкл деионизированной воды. Используйте немедленно. Сульфо-SANPAH быстро гидролизуется в воде: поэтому с осторожностью, чтобы выполнить все вышеперечисленные шаги быстро.
- Чтобы сохранить сульфо-SANPAH: растворить сульфо-SANPAH в dimethylsulfoxane (ДМСО) при 50 мг / мл. Алиготе маточного раствора в 50 микро трубки центрифуги 20 мкл на пробирку. Флэш замораживание сухим льдом или жидким азотом (не обязательно, но предпочтительно, шаг, чтобы сохранить максимальную эффективность сшивающего) и хранят при -80 ° С.
- Получение персульфата аммония (м г 228,18 г / моль) аликвоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: персульфат аммония вызывает раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты во время эксплуатации. Ручка персульфата аммония порошок в химическом вытяжном шкафу. Магазин порошок в сухом, хорошо проветриваемом месте. После того, как на аликвоты, разбавленный раствор может быть использован на верстаке.- Растворить персульфата аммония в деионизованной воде до конечной концентрации персульфата аммония в 10% вес / объем. Аликвоты и хранить при -20 ° С. Оттепель непосредственно перед использованием.
- Приготовление раствора коллагена типа I.
- Подготовка 0,2 мг / мл раствора коллагена путем разбавления состава, такразложения в 1x фосфатным буферным раствором (PBS) с рН 7,4. Храните на короткое льда или использовать сразу после разведения.
2. Гидрогель Подготовка (Обратитесь к рисунку 1)
- Получение гидрофобных стеклах.
- Поместите несколько капель гидрофобного раствора на стеклянную пластину и использовать бумажные салфетки, чтобы распространить по всей поверхности. Пусть воздух сухой и протрите папиросной бумаги снова, чтобы выровнять гидрофобного покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить гидрофобный раствор в горючей шкафу при комнатной температуре. Носите защитную одежду при использовании. Работа в хорошо проветриваемом помещении.
- Поместите несколько капель гидрофобного раствора на стеклянную пластину и использовать бумажные салфетки, чтобы распространить по всей поверхности. Пусть воздух сухой и протрите папиросной бумаги снова, чтобы выровнять гидрофобного покрытия.
- Получение гибкой пластиковой поддержки.
- Вырезать гибкий пластмассовый держатель в соответствии с размером гидрофобного покрытием стеклянной пластины.
- Отметить гидрофобный стороне гибкой пластиковой поддержки слегка царапать поверхность с острым инструментом, таким как скальпелем.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как гель - который полностью прозрачным - сушит, То царапины поможет определить, какой гибкий сторона пластмассовая опора содержит гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: гибкий пластиковый носитель имеет гидрофобный и гидрофильный сторону. После осаждения, полиакриламид, постоянно прилипает к гидрофильной стороне пластмассовой поддержки, что упрощает последующую обработку гидрогеля.
- Гель Подготовка (объемы пример приведены для 5 мл решений предшественника геля).
Примечание: 5 мл будет достаточно, чтобы произвести ~ 40 гели, когда гель исходная толщина составляет 0,5 мм. Другие гели могут быть получены, если толщина гель уменьшается.- Поместите 4972,5 мкл раствора полиакриламида предшественника желаемой конечной концентрации (таблица 1) в 50 мл коническую трубку. Место в камере дегазации в течение 30 мин с открытой крышкой.
Примечание: Кислород действует как ловушка свободных радикалов и, когда он присутствует, он ингибирует полимеризацию. - Добавить 25 мкл 10% вес / об персульфата аммония (см указывают 1,3) до достижения конечнойконцентрацию персульфата аммония в 0,05%.
- Добавить 2,5 мкл N, N, N ', N'-тетраметилэтилендиамина (TEMED, M R 116,24 г / моль) к раствору дегазированной гель до достижения конечной концентрации TEMED 0,5%.
Примечание: Храните TEMED в горючей шкафу при комнатной температуре. Обращаться в химической вытяжкой при ношении соответствующие средства индивидуальной защиты. Хранить плотно закрытым в атмосфере инертного газа, как это высоко воздуха и влаги чувствительной. - Смешайте решение мягко пипетки вверх и вниз 3 - 5 раз. Не вихрь, чтобы избежать диффузии кислорода в раствор предшественника геля.
- Внесите гель раствора на гидрофильной стороне гибкой пластиковой поддержки и бутерброд с гидрофобным покрытием стекло. Отделите два слайда с силиконовыми прокладками желаемой толщины (например, 0,5 мм). Оставьте небольшое количество (~ 100 мкл) раствора полимера-предшественника в 50 мл коническую трубку, чтобы использовать в качестве индикатора гелеобразования.
ПРИМЕЧАНИЕ:Любой прокладка может быть использована. Например, один полоса парафильмом дает конечную толщину набухший гель 100 - 120 мкм. - Поместите другой стеклянную пластину поверх гибкой сэндвич пластиковой поддержка / гель для выяснения еще гидрогеля поверхность, на полимеризации.
- Пусть гель полимеризации в течение 45 мин, хотя меньше времени, при желании могут быть использованы для гелей высшего% мас. Чтобы убедиться, что гель полимеризуется, наблюдать за оставшийся раствор в 50 мл коническую трубку; если оставшийся раствор гель, то есть вероятность, что гелеобразование на стеклянной пластине была начата, а также. Тем не менее, обратите внимание, что преждевременное открытие формы будет препятствовать полной полимеризации.
- После того, как образуется гель, снимите гибкий пластмассовый держатель с ковалентно связанного полиакриламидном геле на вершине, и установить геля стороной вверх высохнуть на воздухе.
Примечание: конвекции тепла или сушки также может быть использован, чтобы ускорить этот шаг. После сушки на гибкой пластиковой поддержки, гель можно хранитьD на неопределенный срок.- Отметить любые голые пятна гибкой пластмассовой подставке, где полиакриламидном геле не образуют связи с пузырьками. Марк в то время как гель-прежнему увлажненной, так как это будет гармонировать с гибкой пластмассовой подставке раз гель высохнет.
- Поместите 4972,5 мкл раствора полиакриламида предшественника желаемой конечной концентрации (таблица 1) в 50 мл коническую трубку. Место в камере дегазации в течение 30 мин с открытой крышкой.
3. многолуночные Plate Ассамблея, коллаген покрытия и стерилизация
- Многолуночные пластина в сборе.
- После того, как высушить, отрезать PA гели желаемые формы.
- Для 96-луночного планшета, использовать дырокола сверхпрочный с диаметром ~ 6 мм. Используйте сверхмощный резак для бумаги, чтобы сократить гели в квадратные или прямоугольные формы. Кроме того, используйте ножницы.
- Подготовка примерно 500 мкл PDMS в 96-луночного планшета в соответствии с инструкциями изготовителя. Приклеить гели на дно многоямного пластины, поместить маленькую капельку (~ 5 мкл) полидиметилсилоксана (ПДМС) в центре каждой лунке. Использование щипцов, положите одну полиакриламидноме гель в каждую лунку, гибкой пластиковой поддержки стороной вниз. Чтобы вылечить PDMS, оставить собранный пластину при 37 ° С в течение как минимум 4 часов.
- После того, как высушить, отрезать PA гели желаемые формы.
- Коллаген покрытие полиакриламидном геле.
- С пипетки, поместите небольшое количество (7 - 8 мкл) из сульфо-SANPAH (смотрите пункт 1.2.2) в каждую лунку и вихрем из стороны в сторону, чтобы покрыть поверхность геля равномерно. Работа оперативно, так как сульфо-SANPAH не является стабильным в воде.
- Место пластины также при высокой интенсивности УФ-лампы (интенсивность = 37 мВт, λ = 302 - 365 нм) в течение 5 мин. Промыть гели с PBS, чтобы удалить избыток сульфо-SANPAH.
- Пипетка 50 мкл 0,2 мг / мл коллагена I типа раствора (смотрите пункт 1.4) в каждую лунку. Оставьте пластину, покрытую при комнатной температуре в течение по меньшей мере 2 ч или O / N при 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ускорить процесс коллагена покрытием, пипетки может быть использован для добавления раствора коллагена. Как правило, 1 - 2 капли раствора должна быть достаточно, чтобы завершитьлы покрывают поверхность геля. - Оставьте пластину а при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 часа, чтобы дать коллагена склеивание.
- Промыть PBS, чтобы удалить избыток раствора коллагена и стерилизуют под УФ (λ = 200 нм) в капот культуры ткани в течение 2 часов.
- Замочите гели в полной среде (обратитесь к разделу 4.1 для среднего состава) O / N для увлажнения и уравновешивают. Используйте для посева клеток непосредственно или магазин в холодильнике до 2 дней.
4. посева клеток на ПА жесткости Пробирной
Примечание: Несмотря на то, типичные для обычных клеточных линий млекопитающих, протокол описано в данном разделе, в частности, используется при раке молочной железы клеточной линии MDA-MB-231 (см фиг.4 и 5).
- Сбор клеток из тканевой культуральной колбы посредством воздействия 5% трипсина / EDTA в течение 5 мин при 37 ° С. Используйте ~ 80 мкл трипсина / ЭДТА в каждый см 2 культуральной области колбы; Например, используют 2 мл трипсина / EDTA FOра T25 культуры клеток колбу. Повторное приостановить клетки, собранные в полной среде, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина при желаемой концентрации конечного элемента. Принимая во внимание время удвоения клетки, а также период времени клетки будут высевали на анализе, выбрать соответствующий суб-вырожденная концентрации клеток. Убедитесь, что добавили среда достаточно, чтобы полностью погрузить в воду гидрогели.
Примечание: Так как гидрогели были предварительно уравновешенную в средствах массовой информации (обратитесь к шагу 3.2.6) 100 мкл объем должен быть достаточным. Типичные объемы среды, используемой для луночные планшеты, должно быть достаточным, так как гели были предварительно уравновешенную в средствах массовой информации на предыдущей стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: анализ будет подходит для любого крепления зависит от типа клеток.- Количество количества клеток под инвертированным микроскопом с использованием гемоцитометра. Нагрузка 10 мкл клеточной суспензии в каждый порт гемоцитометра и в среднем число клеток, по меньшей мере 8 квадрантов. Чтобы получитьКонечная концентрация клеток, умножьте количество клеток на 10 4.
Примечание: Наилучшие результаты подсчета клеток получают, когда количество клеток в каждой гемоцитометра квадранте есть 20 - 50.
- Количество количества клеток под инвертированным микроскопом с использованием гемоцитометра. Нагрузка 10 мкл клеточной суспензии в каждый порт гемоцитометра и в среднем число клеток, по меньшей мере 8 квадрантов. Чтобы получитьКонечная концентрация клеток, умножьте количество клеток на 10 4.
- Культуры клеток на анализе жесткости ПА в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Изменить среды каждые 2 - 3 дня. Собирают клетки в случае необходимости под воздействием 5% трипсина / EDTA при 37 ° С в течение 5 мин. Используйте ~ 80 мкл трипсина / ЭДТА на см 2 ткани колбу культуры. Во всех этапов манипулирования клеток, проявлять особую осторожность, чтобы не нарушить поверхность гидрогеля: аспирация или пипетки среду, слегка наклонив Multiwell пластину в сторону и касания кончиком пипетки на боковой стенке каждой лунки, в отличие от прикосновения к гидрогель.
ПРИМЕЧАНИЕ: для особой заботы, чтобы не повредить поверхность гидрогеля во время стандартной обработки ткани культуры исключением, клетки высевали на жесткость анализ можно манипулировать так же, как если бы они были посеяны нав очередной многоямного пластины.
5. Визуализация клеток, посеянных на ПА жесткости Пробирной
- Клетки изображение непосредственно на жесткость анализа ПА.
Примечание: Все микроскопа - перевернутый, флуоресцентные или конфокальной, могут быть использованы для визуализации клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: гибкий пластиковый носитель, используемый для построения жесткости анализа полностью прозрачен и не autofluoresce или мешать визуализации клеток. Тем не менее, несмотря на то, гибкой пластиковой самой опоры прозрачна, возможности визуализации будет ограничено рабочее расстояние объектива. Гибкий пластиковый носитель имеет толщину 0,23 мм и типичной рабочее расстояние в цель 10X ~ 4 мм, резко убывает при большом увеличении.- Для получения изображений живых клеток, должность PA жесткость анализ в держателе микроскопа пластины и изображения. Держите сессий изображений при 2 ч, или использовать микроскоп, оснащенный климатической камере в течение более длительного времени визуализации.
- Когда жить им клетокстарение не цель, исправить клеток в 4% раствором формальдегида с добавлением 0,1% моющего средства. Замачивание клеток в фиксаторе при комнатной температуре в течение как минимум 2 ч. Промыть PBS в два раза. Отменить фиксирующий отходов в специально отведенных контейнер для отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть отображены немедленно или хранили погруженными в PBS при 4 ° С в течение 2 недель. ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен при вдыхании и попадании на. Обращаться с перчатками в химическом вытяжном шкафу.
Примечание: Протокол фиксации клеток должен быть выбран на основе последующих окрашивания клеток и обработки протоколов, поскольку некоторые фиксаторы повредить некоторые клеточные белки. - Для флуоресцентных изображений, пятно фиксированные клетки с нужной ячейке пятна непосредственно в многоямного пластины. Изображение немедленно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Полиакриламид (ПА) гидрогели широко используются для проверки жесткости в зависимости от клеточного ответа. 17,24 При смешивании различных концентраций акриламида (А) и бис-акриламида (B) можно сделать PA гели, которые охватывают диапазон жесткости большинстве мягких тканей в Тело - 0,3 -.. 300 модуль кПа Юнга 1 Тем не менее, подготовка полиакриламидном геле является утомительным и трудоемким, часто ограничивая их полезность в «высокой пропускной" приложений, таких как для скрининга пример наркотиков 12 Вот, простой и быстрый способ монтажных PA гели в несколько-луночных планшетах или любой другой желаемый тканевой культуры сосуд представлен (рис.1). 2А показывает модуль Юнга в зависимости от нескольких концентраций А и В (также приведены в таблице 1). Модули дополнительных комбинаций А и В представлены в литературе. 17,25,26 гель жесткость полностью swolleп гели измерялась реологии (AR 2000EX реометре TA Instruments) с 20 мм верхней параллельной геометрии, тест частоты колебательной развертки 1 - 10 Гц, и 2% постоянном напряжении. Как и ожидалось, было показано, что как модуль упругости G 'и модуль потерь, G', не зависят от частоты (фиг.2В). Было также подтверждено, что сушка и затем повторно увлажняющий гель, не влияет на модуль их Юнга (рис 2С). Модуль Юнга связан с модулем памяти с помощью следующего уравнения: 
где Е модуль Юнга и v является коэффициент Пуассона, который был приближен к 0,5 для PA гелей. 27 Обратите внимание, что приведенные значения являются для гидрогелей, приготовленных с TEMED. PA гидрогели могут быть также получены путем УФ-сшивки, когда время экспозиции и интенсивность УФ оптимизированы (
Кроме того, было показано, что клетки высевают на гидрогелей различной stiffneсс выставлены различные по морфологии. Для этого эксперимента, рака молочной железы MDA-MB-231 клетки высевали в верхней части гелей Па в течение 24 - 72 ч. Клетки культивировали в RPMI среде, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Клетки высевают при 1 × 10 5 клеток / мл или 1 х 10 4 клеток / лунку в 96-луночный планшет. Это типичный плотности посева клеток - в 4 раза ниже, чем плотность конфлюентности клеток, где конфлюентности для линии клеток млекопитающих достигается при ~ 1 × 10 5 клеток / см 2. Изображения были приняты на перевернутой флуоресцентного микроскопа и анализировали на ImageJ через Shape дескриптора и программных модулей. Было обнаружено, что, когда высевали на PA гелей в течение 24 ч, рака молочной железы MDA-MB-231 клетки остаются округлыми на мягких 0,5 и 1 кПа гелей, но были способны распространяться и на удлиненное жесткое 100 кПа гель (рисунок 4). Рисунок 4 также showcasES тот факт, что гидрогели выполнен на верхней части гибкой пластиковой поддержки прозрачны и позволяют легко визуализации и микроскопии. Кроме того, гибкий пластиковый носитель не autofluoresce и, таким образом, не мешает визуализации флуоресцентно меченых клеток. Морфология клеток дополнительно количественно с точки зрения общего распространения клеток площадь и коэффициент формы клеток - округлость (рисунок 5). Сотовый распространения площадь была измерена путем создания маски проследить периметр каждой ячейки. Форма ячеек (округлости) затем рассчитывали по следующему соотношению: 
Цикличность измеряется по шкале от 0 - 1, где 0,6 - 1 были приняты для обозначения округлые клетки и 0 - 0,5 были взяты для обозначения удлиненных клеток. Примерно триста клетки, по крайней мере в трех независимых экспериментах были проанализированы для каждого POIN данных т. Были рассчитаны Статистические различия на основе одного факторного анализа дисперсии (ANOVA), где наборы данных были рассмотрены значительно отличается при р <0,05.
Рисунок 1. Схематическое изображение подготовке полиакриламидном геле на гибкой пластиковой поддержки. Рисунок представляет различные этапы подготовки PA гелей на гибкой пластиковой поддержки. После гель полностью высохнет, его можно резать или нанесенные на любой желаемой форме. Весь удар (~ диаметр 6 мм) наиболее удобно при подготовке гели для 96-луночного планшета, а сверхпрочный нож для бумаги может быть использован для квадратных или прямоугольных форм. На рисунке также подчеркивает края лунки, так и без геля, чтобы показать, что полное и нижнего покрытия может быть достигнуто с помощью этого метода. OAD / 52643 / 52643fig1large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Жесткость ПА гидрогели, как измеряется реологии. (А) модуль репрезентативного Юнга для пяти различных концентраций А & B (см таблице 1 для сокращений), (б) хранение и модуль потерь в зависимости от частоты при измерении по реологии; (C) гели демонстрируют тот же модуль Юнга изначально (Начальный) и после того как они были высушены и повторно гидратируют (Re-гидратированный) зависит от концентрации полимера-предшественника. Все гели для реологических измерений были получены, как плит диаметром 20 мм и 1 - 1,5 мм в высоту (по полного набухания).
/52643fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Коллаген покрытие на ПА гелей. Коллаген покрытие (зеленый) эффективное распределение и сохранили на гель PA (красный) поверхность независимого модуля гидрогель жесткости Юнга). Коллаген помечены Cy5 был использован для этих данных. Красно-люминесцентные бусины были включены в ПА гидрогеля визуализации помощи. Поперечные снимки были сделаны на конфокальной микроскопии (масштаб бар = 100 мкм). Изображение взято из Zustiak и др. и др. 5 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Контракт фазы (верхний ряд) и флуоресцентные (нижний ряд) изображения MDA-MB-231 клеток, посеянных на ПА гелей в течение 24 часов. MDA-MB-231 клетки остаются круглый на мягких гелей (Young 7, S модуль 0,5 и 1 кПа), но удлиненная на жестких гелей PA (модуль Юнга от 100 кПа). Клетки высевали на гелей в течение 24 ч, фиксировали в этаноле и окрашивали акридинового оранжевого (АО - зеленый), чтобы визуализировать цитоплазме клеток и DAPI (синий) для визуализации клеточного ядра; Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Сотовый распространения зона и округлость зависят от жесткости основной подложки. (А) MDA-MB-231 распространения площадь клеток значительно увеличивается на 100 кПа по сравнению с 0,5 кПа гелей. (Б) Сотовый округлости уменьшается с увеличением жесткости гель PA. Звездочки обозначают существенные различия; р <0,05.
Рисунок 6. Схематическое изображение альтернативного препарата в полиакриламидном геле на гибкой пластиковой поддержки. Рисунок представляет различные этапы подготовки PA гелей на гибкой пластиковой поддержки. Здесь гибкий пластиковый носитель первоначально предварительно разрезать на пластик "покровные" в желаемую форму и размер. Этот метод лучше всего работает для мягких гидрогелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Акроним | Акриламид% | Бис-акриламид% | Акриламида от 40% основного раствора (мл) | Бис-акриламида от 2% раствора (мл) | Вода (мл) | G '± SD (кПа) | E ± SD (кПа) |
| PA1 | 5 | 0,025 | 625 | 62,5 | 4312,5 | 0,62 ± 0,19 | 1,85 ± 0,57 |
| PA2 | 5 | 0,1 | 625 | 250 | 4125 | 3.55 ± 0.12 | 10.64 ± 0.36 |
| ПО3 | 8 | 0,1 | 1000 | 250 | 3750 | 9.71 ± 0.64 | 29.14 ± 1.93 |
| PA4 | 8 | 0,25 | 1000 | 625 | 3375 | 22.00 ± 2.10 | 66.01 ± 6.31 |
| PA5 | 12 | 0,25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37.42 ± 2.68 | 112.25 ± 8.03 |
Таблица 1. Концентрации акриламида (А) и сшивающего агента бис-акриламида (B) и полученный гель жесткости ПА. Жесткости, представленные здесь G 'и Е, измеряли реологии. G 'представляет собой модуль накопления при частоте 1 Гц. Модуль Юнга Е, рассчитывали по формуле. 1. Стандартное отклонение (SD) был рассчитан на основе трех независимых экспериментов с 3-5 образцов, измеренных в эксперименте. Сокращения в таблице соответствуют сокращений, используемых на фиг.2А.
| УФ интенсивность = 15 мВт / см 2 | Время экспозиции = 300 сек | ||
| Время (с) | Е (кПа) ± SD | Винтенсивность (мВт / см 2) | Е (кПа) ± SD |
| 75 | 0,14 ± 0,03 | 15 | 28.05 ± 2.62 |
| 100 | 6,98 ± 2,34 | 26 | 21.13 ± 3.01 |
| 125 | 19.11 ± 2.29 | 37 | 20.01 ± 2.38 |
| 300 | 28.05 ± 2.62 | 66 | 19.35 ± 2.86 |
Таблица 2. УФ полимеризации является альтернативой и быстрый метод для приготовления PA гель, когда условия гелеобразования оптимизированы; ПО3 (обратитесь к таблице 1) гель представленного на изображении. Таблице приведены модуль равнодействующей Юнга, когда ни времени экспозиции (слева две колонки) или интенсивности УФ (справа две колонки) разнообразны по тем же раствором. На основании результатов из таблицы, по-видимому, что 300 сек времени экспозиции и 15мВт / см 2 Интенсивность УФ дает самую высокую жесткость ПА гель, который сопоставим с жесткостью, традиционно полимеризованного геля, как показано в Таблице 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Полиакриламидном геле, первоначально разработанные для электрофореза, в настоящее время обычно используется 28, культур клеток субстратов для изучения влияния субстрата жесткости на морфологии клеток, подвижности и общения 3,24,29 среди других характеристик клеток. Полиакриламид позволяет манипулирование подложкой жесткости, чтобы охватить жесткость всех мягких тканей в организме (0,3 - 300 кПа) 1 с простым изменением концентрации полимера-предшественника (фиг.2, таблица 1, также видеть ссылки 17,25,26). В сочетании с тем, что PA гели достаточно недорогой и простой в приготовлении, они стали незаменимыми платформы в изучении жесткости в зависимости от клеток-материал взаимодействий. Тем не менее, несмотря на то, просто, ток методика получения PA гели ограничена малыми партиями. Это ограничения вытекают из природы гидрогель гелеобразования, которая является свободно-радикальной полимеризации, катализируемой персульфата аммонияи TEMED. 30 Так как реакция является свободным радикалом цепи полимеризации, она может быть запрещена на любой элемент, который служит в качестве ловушки свободных радикалов, таких как кислород. Таким образом, так как диффузия кислорода в раствор полимера следует избегать во время полимеризации - что может занять до 45 минут для самых мягких гелей - просто пипетки гели PA в открытое многоямного пластины не представляется возможным. Кроме того, для использования в качестве двумерного (2D) подложки клеток, поверхность геля PA должна быть плоской. Оба вышеуказанных требований диктовать, что для производства PA гелей, клеточных субстратов 2D, PA раствор геля предшественник должны быть зажатым между двумя плоскими поверхностями в процессе полимеризации - замедлить диффузию кислорода и выровнять поверхность геля. Кроме того, верхняя поверхность должна быть такой, чтобы она могла легко отслаиваться от геля, подвергая поверхность для прикрепления клеток. Это обычно достигается путем гидрофобного покрытия на поверхность стекла. Наконец, когда они расположены в гое скважин многоямного пластины, гели PA должен охватывать поверхность а в целом, и быть запрещено плавание. Полный призабойной покрытие поверхности особенно важно в тех случаях, когда анализы, используемые для оценки клетки типа, который принимает во внимание всю популяцию клеток в лунке (например, МТТ). Если гель PA не адекватно охватить поверхность а в целом следует соблюдать осторожность, чтобы блокировать адгезию клеток к воздействию также поверхности, клетки могут легко скатываются гель на стекло или пластик. При необходимости блокирование БСА в соответствии со стандартными протоколами или с помощью офф-полки BSA на основе клеточной адгезии блокирующие наборы должны быть достаточными, чтобы блокировать прикрепление клеток к нижней части пластины также. Например, для получения БСА-покрытую поверхность, 0,5 мг / мл раствор BSA в PBS, рН 7,4, должны быть адсорбированы на тканевой культуральной чашке в течение 20 мин при комнатной температуре, промывали PBS и использовали немедленно или хранить при температуре 4 ° С в течение до 2 недель. БСА как было показано, блокируют адгезию клеток OF культуры клеток млекопитающих на обеих гидрофильных и гидрофобных поверхностей полистирола значительно снижает клеточной адгезии сил, как измерено с помощью атомно-силовой микроскопии. 31 BSA был использован обычно блокировать адгезию клеток млекопитающих, а также создавать клеточные образцу поверхностей. 32,33
Техника изображен в этой статье, удовлетворяет всем вышеперечисленным требованиям, позволяющих массовое производство унифицированных PA гелей нестандартного размера и формы. Техника проще и эффективнее, чем текущий уровень сэндвич PA решение предшественника геля между двумя покровные стекла. Кроме того, он не требует никакого сложного оборудования и, следовательно, легко применяемое в какой-либо научно-исследовательской лаборатории. Кроме того, более экономически эффективным, так как не требует использования стеклянных пластин или покровные стекла, которые не только дорогостоящим, но также входят в ограниченных размерах. Способ также быстрее по нескольким причинам. Во-первых, он не предполагает каких-либо шагов предварительной обработкиТипичный для стеклянных поверхностей, так как гибкий пластиковый носитель разработан с двух различных поверхностей - гидрофильной стороне, которые постоянно придает полиакриламида и гидрофобной части, что может быть легко отделен от после образования геля. Во-вторых, потому, что пластмассовая опора является гибким, легче и быстрее снимите образовавшуюся гель: когда тонкие гели образуются между двумя стеклами, пилинг с верхней гидрофобный слайд трудно и часто приводит к поломке, которая также ставит под угрозу гель. Наконец, из-за гибкой пластиковой прозрачности поддержки, быстрее УФ полимеризации могут быть использованы, в отличие от стандартного TEMED основе полимеризации в котором может принимать столько, сколько 45 минут (таблица 2). Данные в таблице 2 показывают, что, когда время полимеризации и интенсивность УФ-излучения оптимизированы аналогично жесткость может быть достигнута путем обоих методов полимеризации TEMED и УФ.
Гидрогели подготовлена на гибкой плASTIC поддержка, как показано на рисунке 1. Рекомендуется выполнить желируется дегазации камеры, чтобы избежать неполной полимеризации геля краев (т.е. краевые эффекты) из-за диффузии кислорода между двумя поверхностями, что бутерброд раствора полимера. Цель состоит в том, чтобы создать большое пленки гидрогеля в верхней части гибкой пластиковой поддержки, таким образом, стеклянная пластина любого размера было бы целесообразно, но она будет диктовать размер полиакриламидном пленки, которые могут быть достигнуты. Стекло может быть покрыта какой-либо гидрофобного покрытия или в качестве альтернативы, гидрофобную часть гибкой пластиковой поддержки может быть использован вместо. После того, как гель-пленки ПА образуется, его сушат, разрезают на желаемые формы, а затем повторно гидратируют перед использованием. При сухой, гели можно хранить неопределенно долго. Это было подтверждено реологии, что гель жесткости ПА остается неизменным при повторной гидратации, даже если в течение нескольких месяцев (фиг.2С) гели, хранящейся в сухом состоянии. Тем не менее, очень SOFт гели (≤ 1 кПа модуля Юнга) высушивание и повторное увлажнение усугубить поверхность Зиговочная и образованию трещин. Такое поведение является общим для мягких гелей, которые подвергаются де-гидратации и последующее повторное увлажнение, будучи геометрически ограничены. 34,35 Не все гели складки или трещины, таким образом, можно визуально изучить гидрогели перед использованием и использовать только образцы что отобразить гладкую поверхность. Чтобы полностью избежать складок и образование трещин, альтернативный способ получения мягких гидрогелей изображен на фиг.6. В данном случае гибкие пластиковые поддержка нарезанные в желаемую форму, и гель ПА формируется на верхней части, таким образом, не гели должны быть де-гидратированных, но может быть использован в качестве подготовки. Дополнительным преимуществом этой альтернативной стратегии является то, что больше ~ 2,5 гели могут быть получены из того же объема раствора гидрогеля предшественника (оценка основана на подготовку гели для стандартного 96-луночного планшета, как описано в разделе протокола). Одно предостережение, когдаподготовки гидрогели таким образом, чтобы заботиться, чтобы избежать инфильтрации кислорода, особенно для гелей меньшего размера (например, гели, которые будут использоваться в 96-луночный планшет). Даже тогда, когда раствор предшественника геля полностью дегазировали, т.е. бескислородной, кислород будет диффундировать между двумя поверхностями, что сэндвич-раствора ПА. Таким образом, для того, чтобы избежать краевых эффектов или образование неполное гель вдоль краев, то лучше, чтобы полимеризация происходить в отсутствие кислорода. По нашему опыту, вакуумная камера работает хорошо, хотя среде инертного газа могут быть использованы с равным успехом.
Последним осторожность при подготовке ПА гидрогели, как клеточные субстраты для проверки жесткости в зависимости от клеточного ответа, является то, что толщина полученного гидрогеля важно: для очень тонких гелей, клетки способны чувствовать основную подложку 36 с помощью теории и эксперимента,. Лин и др. показали, что глубина, на которой клетки могут Feэль основной субстрат зависит от поперечного размера ячейки. 29 Поскольку в настоящее время исследования противоречивы, выявление минимальную требуемую толщину, чтобы предотвратить клетки от чувствуя "скрытый" субстрат от нескольких микрон 36 до целых 60 мкм, 37 Минимальная толщина гель 100 мкм должна быть направлена на.
При сборке гели PA в многоямного пластины, небольшой капли из PDMS используется, чтобы обеспечить гель в нижней части скважины. PDMS был выбран потому, что он действует в качестве постоянного клей на упрочнение, что она полностью прозрачна и не вмешиваться в последующих экспериментах микроскопии, она полностью не цитотоксические и он лечит примерно 4 - 8 ч оставляя достаточно времени для пластины сборки. Безопасное обеспечения гидрогели на дно ямы средств в обращении клеток: например, энергичный стиральная мог выбить гидрогели, если не надежно закреплены. Если частая смена клеток мEdia не имеет значения, то гели могут быть временно прикреплен к поверхности а небольшой капли не-цитотоксических и очень вязкой жидкости, такие как глицерин.
Конечные стадии до посева клеток включают ECM покрытие из геля, а затем стерилизации. Здесь Коллаген I типа покрытия изображен (рис 3), хотя тот же метод может быть применен для любого другого белка ECM. Бифункциональный сшивающий агент сульфо-SANPAH используется для достижения равномерного монослоя покрытие. Предыдущие исследования показали, что, например ковалентной вложение дает более однородное покрытие, чем простой адсорбции белка, а также позволяет для 12-кратного настройки количества белка прикрепленной просто с помощью белкового раствора различной концентрации. 6 Наконец, собранный многоямного гель пластину стерилизуют при УФ-области в капот культуры ткани до 2 часов. УФ стерилизация позволяет анализ должны быть собраны на лабораторном столе за пределами капотом, которыйделает процесс более простым и логистики в целом быстрее.
4 и 5 иллюстрируют некоторые репрезентативные результаты MDA-MB-231 клеток рака молочной железы, культивированных на гибких пластиковых опорных подключением PA гелей с различной жесткостью. MDA-MB-231 клетки были выбраны, чтобы продемонстрировать полезность метода, потому что они, как было показано в реакцию с основным жесткости подложки по измерению изменений в морфологии. 5,12 Как и ожидалось, клетки были более удлиненным и имеет большую площадь распространения на Жесткие 100 кПа PA гели по сравнению с мягкими 0,5 и 1 кПа PA гелей (фиг.4 и 5). Нижняя строка на рисунке 4 также демонстрирует использование двух флуоресцентных красителей, что пятно клеточного ядра и цитоплазмы клеток, демонстрируя тот факт, что гибкий пластиковый поддержка не вмешиваться в флуоресцентных изображений микроскопа.
Таким образом, простой способ получения полиакриламидных гидрогелей вмногоямный формат пластина представлены. Методика является более быстрым, эффективным и менее дорогостоящим, чем в настоящее время способы получения ПА гели для использования в качестве клеточных субстратов, а также обеспечивает получение гелей нестандартных размеров не доступна в противном случае. Как это не требует каких-либо специального оборудования, метод может быть легко принят любой исследовательской лаборатории и будет особенно полезен в исследований, направленных на понимание жесткости в зависимости от ответов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
- Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
