Introduction
La mayoría de los tejidos en el cuerpo son materiales viscoelásticos suaves con un módulo de Young que varía de 0,1 kPa para el cerebro a 100 kPa para el cartílago suave, sin embargo, la mayoría en la investigación de células in vitro se lleva a cabo en poliestireno de cultivo de tejido (TCP), que tiene un módulo de ~ 1 GPa . 1 Este desajuste rigidez afecta en gran medida la forma en las células responden a su medio ambiente. Un cuerpo creciente de investigación es, pues, dedicada a elucidar el efecto de la rigidez del sustrato sobre el destino de diversos tipos de células, incluidas las células madre 2,3. 4 Como resultado, múltiples hidrogeles han sido desarrollados para ayudar en la comprensión de la célula de rigidez dependiente biología incluyendo poliacrilamida (PA), 5-7 polietilenglicol (PEG), 8,9 polidimetilsiloxano (PDMS), 10 y alginato. 11 Mientras que la evidencia de que la rigidez del sustrato tiene un impacto sustancial en el destino celular está creciendo, se llevan a cabo en la mayoría de los estudios una pequeña escala con un pequeño número de sejemplos. Los estudios sistemáticos, multidimensionales sobre el efecto de la rigidez del sustrato para una gran variedad de tipos de células o las condiciones ambientales son raros. 12
Varias tecnologías de hidrogel de alto rendimiento prometedores se han desarrollado, incluyendo microarrays basados en PEG, 13 dispositivos de microfluidos para la producción de microperlas de agarosa de hidrogel, 14 o micro y nano-barras, donde la rigidez es modulada por el diámetro y la altura de los los micro. 15 Sin embargo , las tecnologías de la preparación de dichos sustratos son sofisticados y disponible para un número limitado de laboratorios. Mucha investigación que implica rigidez modulada respuestas de células utiliza poliacrilamida (PA) geles que no sólo son de bajo costo y simple de implementar, sino también exhibir una gama fisiológicamente relevante del módulo de Young, es decir, 0,3 -. 300 kPa 16-22 Sin embargo, los métodos existentes para fabricar PA geles para el cultivo celular son mano de obra intensiva y, en consecuencia prepared en pequeños lotes. Algunas de las dificultades asociadas con la preparación de geles PA como sustratos de células madre a partir de la exigencia de que los geles tienen que estar preparados: 1) en ausencia de oxígeno para permitir la polimerización completa, 2) con una superficie plana y lisa para permitir celular uniforme apego y difusión, y 3) fijado de forma permanente a la parte inferior de la placa de cultivo celular para prevenir flotante.
Varios grupos han intentado producir geles PA para el cultivo de células en grandes lotes. Semler et al. Láminas gruesas preparados de geles PA que fueron luego "cortada" con un punzón y se colocaron en placas de 96 pocillos. 23 Sin embargo, este método está limitado a geles más rígidos, es decir,> 1 kPa en el módulo de Young, ya que más suave geles son "pegajosos", difícil de cortar, y se dañan fácilmente. Mih et al. Desarrolló una técnica más sofisticada que permite a los geles a polimerizar directamente en una placa de múltiples pocillos con fondo de cristal.
Este documento describe una manera sencilla y económica de montar geles PA en una placa de múltiples pocillos que podría ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio. Aquí, se utiliza un soporte de plástico flexible, que tiene dos lados - un uno hidrofóbico, que es repelente a los geles PA, y uno hidrofílico, que se une covalentemente el gel de PA sobre la deposición. Una vez láminas de gel de PA se depositan y permanentemente fijada en el soporte de plástico flexible, permite un manejo geles de cualquier grosor o rigidez y cortarlos en cualquier forma deseada. Este aproach no sólo produce personalizados '' cubreobjetos de plástico en tamaños no disponibles comercialmente, sino que también elimina la necesidad de las superficies de vidrio-tratamiento previo, ya sea cubreobjetos de vidrio o los pozos de las costosas placas de múltiples pocillos con fondo de cristal, con una solución PA vinculante, que es un tedioso y un paso de tiempo. Por último, las hojas de geles PA uniformes se pueden preparar en grandes lotes y se almacenaron-de hidratado durante varios meses.
En resumen, el ensayo que aquí se presenta es una mejora sobre los métodos existentes en varios aspectos. En primer lugar, el proceso de montaje de placa de pocillos múltiples, es eficiente, y el coste global de los materiales requeridos es baja. En segundo lugar, los hidrogeles se producen en grandes lotes en una única película de gel homogénea. Finalmente, sólo se requieren materiales que están disponibles comercialmente. La utilidad del ensayo se ilustra por explorar el efecto de la rigidez del sustrato sobre la morfología celular y el área de difusión.
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Protocol
1. Preparación de soluciones y alícuotas asociados hidrogel
- Preparación de la solución de poliacrilamida precursor del gel.
- Preparar la solución de precursor de gel de poliacrilamida mediante la mezcla de acrilamida (A) (40% w / v, r M 71,08 g / mol), el bisacrilamida reticulante (B) (2% w / v, r M 154,17 g / mol), y de- agua ionizada en los porcentajes en volumen especificados en la Tabla 1.
NOTA: Estas soluciones se pueden preparar en grandes lotes y se almacenaron a 4 ° C durante hasta varios meses.- PRECAUCIÓN: La acrilamida es tóxico por inhalación o ingestión, en particular, cuando en forma de polvo: por lo tanto, utilizar preferentemente 40% w solución / v para reducir los riesgos de toxicidad. Manipular sólo con ropa de protección, como guantes, gafas y una bata de laboratorio. Almacenar en un recipiente resistente a la luz, bien cerrado en la nevera (<23 ° C, zona bien ventilada).
- PRECAUCIÓN: Bis-acrilamida es tóxico por inhalación o ingestión, en particular,cuando está en forma de polvo: por lo tanto, utilizar preferentemente 2% w solución / v para reducir los riesgos de toxicidad. Manipular sólo con ropa de protección, como guantes, gafas y una bata de laboratorio. Almacenar en un recipiente resistente a la luz, bien cerrado en la nevera (<4 ° C, zona bien ventilada).
- Preparar la solución de precursor de gel de poliacrilamida mediante la mezcla de acrilamida (A) (40% w / v, r M 71,08 g / mol), el bisacrilamida reticulante (B) (2% w / v, r M 154,17 g / mol), y de- agua ionizada en los porcentajes en volumen especificados en la Tabla 1.
- Preparación y uso de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4 '-azido-2' nitrofenilamino) hexanoato (sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) alícuotas. PRECAUCIÓN: sulfo-SANPAH provoca irritación ocular grave; manejar con guantes y adecuado de los ojos o la cara. Almacenar a -20 ° C al recibirla y antes de alícuotas.
- Para almacenar sulfo-SANPAH: disolver sulfo-SANPAH en dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Alícuota de la solución madre en 50 tubos de centrífuga micro de 20 l por tubo. Congelación de Flash en hielo seco o en nitrógeno líquido (un paso opcional, pero preferido para preservar la máxima eficiencia reticulante) y almacenar a -80 ° C.
NOTA: Las alícuotas can almacenarse durante varios meses. - Para utilizar sulfo-SANPAH: descongelar brevemente alícuota y se diluye en 480 l de agua desionizada. Utilizar inmediatamente. Sulfo-SANPAH hidroliza rápidamente en agua: por lo tanto, tomar la precaución de realizar todos los pasos anteriores rápidamente.
- Para almacenar sulfo-SANPAH: disolver sulfo-SANPAH en dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Alícuota de la solución madre en 50 tubos de centrífuga micro de 20 l por tubo. Congelación de Flash en hielo seco o en nitrógeno líquido (un paso opcional, pero preferido para preservar la máxima eficiencia reticulante) y almacenar a -80 ° C.
- Preparación de persulfato de amonio (M r 228,18 g / mol) alícuotas.
NOTA: persulfato de amonio provoca ojos, piel y vías respiratorias. Llevar equipo de protección personal adecuado al manipular. Manejar polvo persulfato de amonio en una campana de extracción química. Conserve el polvo en un lugar seco y bien ventilado. Una vez en alícuotas, la solución diluida se podría utilizar en el banco de trabajo.- Disolver persulfato de amonio en agua desionizada para lograr una concentración final de persulfato de amonio del 10% w / v. Alícuota y almacenar a -20 ° C. Descongelar inmediatamente antes del uso.
- Preparación de solución de colágeno de tipo I.
- Preparar 0,2 mg solución de colágeno / ml por dilución de la acción de modolución en 1x tampón fosfato salino (PBS) de pH 7,4. Almacene en breve hielo o utilizar inmediatamente después de la dilución.
2. Preparación de hidrogel (Ver Figura 1)
- Preparación de portaobjetos de vidrio hidrófobos.
- Coloque unas pocas gotas de una solución hidrófoba sobre una placa de vidrio y el uso de papel de seda para propagarse a través de la superficie. Deje que se seque al aire y limpie con un pañuelo de papel de nuevo para igualar el recubrimiento hidrófobo.
NOTA: Guarde la solución hidrófoba en un armario inflamable a temperatura ambiente. Llevar equipo de protección personal durante la manipulación. Trabajar en un lugar bien ventilado.
- Coloque unas pocas gotas de una solución hidrófoba sobre una placa de vidrio y el uso de papel de seda para propagarse a través de la superficie. Deje que se seque al aire y limpie con un pañuelo de papel de nuevo para igualar el recubrimiento hidrófobo.
- Preparación de soporte de plástico flexible.
- Cortar el soporte de plástico flexible para que coincida con el tamaño de la placa de vidrio hidrófobo revestido.
- Marcar el lado hidrófobo del soporte de plástico flexible por arañar ligeramente la superficie con una herramienta afilada tal como un bisturí.
NOTA: Una vez que el gel - que es totalmente transparente - se seca, Las marcas de arañazos ayudarán a distinguir qué lado flexibles de soporte de plástico contiene el gel.
NOTA: El soporte de plástico flexible tiene una hidrofóbico y un lado hidrofílico. Una vez depositado, de poliacrilamida se adhiere permanentemente a la parte hidrófila del soporte de plástico que facilita un fácil manejo de hidrogel posterior.
- Preparación Gel (Ejemplo volúmenes se dan para soluciones precursoras gel 5 ml).
NOTA: 5 ml sería suficiente para producir ~ 40 geles cuando el espesor inicial gel es 0,5 mm. Más geles se pueden producir si el grosor del gel se reduce.- Coloque 4972,5 l de solución de precursor de poliacrilamida de concentración final deseada (Tabla 1) en un tubo cónico de 50 ml. Colocar en una cámara de desgasificación durante 30 minutos con la tapa abierta.
NOTA: oxígeno actúa como una trampa de radicales libres y cuando está presente, se inhibe la polimerización. - Añadir 25 l de 10% w / v de persulfato de amonio (véase el punto 1.3) para lograr una finalconcentración de persulfato de amonio de 0,05%.
- Añadir 2,5 l de N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina (TEMED, M r 116,24 g / mol) a la solución de gel de desgasificado para lograr una concentración final de 0,5 TEMED%.
NOTA: Tienda TEMED en un armario inflamable a temperatura ambiente. Manejar en una campana de humos químicos al usar el equipo de protección personal adecuado. Mantener bien cerrado bajo gas inerte, ya que es altamente sensible a la humedad y aire. - Mezclar la solución suavemente pipeteando arriba y abajo de 3 - 5 veces. No vortex para evitar la difusión de oxígeno en la solución de precursor de gel.
- Pipetear la solución de gel en el lado hidrófila del soporte de plástico flexible y sándwich con portaobjetos de vidrio hidrófobo revestido. Separar las dos correderas con espaciadores de silicona de espesor deseado (por ejemplo, 0,5 mm). Dejar una pequeña cantidad (~ 100 l) de solución de precursor de polímero en el tubo cónico de 50 ml para usar como un indicador de la gelificación.
NOTA:Cualquier espaciador podría ser utilizado. Por ejemplo, una sola tira de Parafilm da un espesor final de gel hinchado de 100 a 120 micras. - Coloque otra placa de vidrio encima del sándwich de soporte / gel de plástico flexible para determinar una superficie uniforme de hidrogel en la polimerización.
- Deje que el gel de polimerizar durante 45 min, aunque menos tiempo se puede utilizar para geles de mayor% en peso si se desea. Para cerciorarse de que el gel se haya polimerizado, observar la solución restante en el tubo cónico de 50 ml; Si la solución restante ha gelificado, entonces es probable que la gelificación en la placa de vidrio se ha iniciado también. Sin embargo, tenga en cuenta que la apertura prematura del molde evitará polimerización completa.
- Una vez formado el gel, retire el soporte de plástico flexible con el gel de poliacrilamida unido covalentemente en la parte superior, y establecer gel de lado hasta que se seque al aire.
NOTA: convección o secado por calor también se pueden utilizar para acelerar este paso. Una vez seco sobre el soporte de plástico flexible, el gel puede ser tiendad indefinidamente.- Marque las áreas descubiertas del soporte de plástico flexible, donde los geles de poliacrilamida no se formaron debido a las burbujas. Marcos mientras que el gel se sigue hidratada ya que esto se mezclan con el apoyo de plástico flexible una vez que el gel se seque.
- Coloque 4972,5 l de solución de precursor de poliacrilamida de concentración final deseada (Tabla 1) en un tubo cónico de 50 ml. Colocar en una cámara de desgasificación durante 30 minutos con la tapa abierta.
3. Asamblea Multiwell Plate, colágeno, Revestimientos, y Esterilización
- Conjunto de la placa de múltiples pocillos.
- Una vez seco, cortar geles PA en las formas deseadas.
- Para una placa de 96 pocillos, utilice una perforadora de alta resistencia con un diámetro de ~ 6 mm. Utilice un cortador de papel de alta resistencia para cortar geles en formas cuadradas o rectangulares. Alternativamente, use tijeras.
- Preparar aproximadamente 500 l de PDMS por placa de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para pegar los geles a la parte inferior de una placa de múltiples pocillos, colocar una pequeña gota (~ 5 l) de polidimetilsiloxano (PDMS) en el centro de la cada pocillo. Con unas pinzas, coloque una poliacrilamidagel de correo en cada lado del soporte de plástico bien, flexible hacia abajo. Para permitir PDMS para curar, deje la placa montada a 37 ° C durante un mínimo de 4 horas.
- Una vez seco, cortar geles PA en las formas deseadas.
- Recubrimiento de colágeno de geles de poliacrilamida.
- Con una pipeta de transferencia, coloque una pequeña cantidad (7-8 l) de sulfo-SANPAH (véase el punto 1.2.2) en cada pocillo y agitar de lado a lado para cubrir la superficie del gel uniformemente. Trabajar con prontitud desde sulfo-SANPAH no es estable en agua.
- Coloque la placa de pocillos bajo una lámpara de UV de alta intensidad (intensidad = 37 mW, λ = 302 a 365 nm) durante 5 min. Enjuagar los geles con PBS para eliminar el exceso de sulfo-SANPAH.
- Yo solución de la pipeta 50 l de 0,2 mg / ml de colágeno tipo (Véase el punto 1.4) en cada pocillo. Deje el plato cubierto a temperatura ambiente durante al menos 2 horas o O / N a 4 ° C.
NOTA: Para acelerar el proceso de recubrimiento de colágeno, una pipeta de transferencia se puede utilizar para añadir la solución de colágeno. Típicamente, 1 - 2 gotas de solución debe ser suficiente para completarLy cubre la superficie del gel. - Deje la placa de pocillos a temperatura ambiente durante al menos 2 horas para permitir la unión de colágeno.
- Enjuagar con PBS para eliminar el exceso de solución de colágeno y esterilizar bajo UV (λ = 200 nm) en una campana de cultivo de tejidos durante 2 h.
- Remoje los geles en medio completo (Consulte la Sección 4.1 para medianas composición) O / N para hidratar y equilibrar. El uso para la siembra de células inmediatamente o almacenar en el refrigerador hasta por 2 días.
4. siembra de células en Rigidez Ensayo PA
NOTA: Aunque típico para líneas celulares de mamíferos comunes, el protocolo descrito en esta sección se utiliza específicamente con el cáncer de mama línea celular MDA-MB-231 (ver figuras 4 y 5).
- Recoger células del matraz de cultivo de tejido por la exposición a 5% de tripsina / EDTA durante 5 min a 37 ° C. Utilice ~ 80 l de tripsina / EDTA por cada cm 2 de área frasco de cultivo; por ejemplo, usar 2 ml de tripsina / EDTA fora T25 matraz de cultivo celular. Vuelva a suspender las células recogidas en medio completo suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina a una concentración celular final deseada. Teniendo en cuenta tiempo de duplicación celular, así como la longitud de tiempo, las células se sembraron en el ensayo, elegir una concentración apropiada de células sub-confluente. Asegúrese de que el medio añadido es suficiente para sumergir completamente los hidrogeles.
NOTA: Debido a que los hidrogeles han sido previamente equilibrada en los medios de comunicación (consulte el paso 3.2.6) un volumen de 100 l debería ser suficiente. Volúmenes medios típicos utilizados para las placas de múltiples pocillos deben ser suficientes ya que los geles han sido previamente equilibrada en los medios de comunicación en el paso anterior.
NOTA: El ensayo sería apropiado para cualquier tipo de célula apego dependiente.- Contar el número de células bajo un microscopio invertido usando un hemocitómetro. Carga 10 l de suspensión celular en cada puerto hemocitómetro y promediar el recuento de células de al menos 8 cuadrantes. Para obtener elconcentración final de células, se multiplica el número de células en un 10 4.
NOTA: Se obtienen los mejores resultados del conteo de células cuando el número de células en cada cuadrante hemocitómetro es 20 - 50.
- Contar el número de células bajo un microscopio invertido usando un hemocitómetro. Carga 10 l de suspensión celular en cada puerto hemocitómetro y promediar el recuento de células de al menos 8 cuadrantes. Para obtener elconcentración final de células, se multiplica el número de células en un 10 4.
- Cultivar las células en el ensayo de rigidez PA en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. Cambie medios cada 2-3 días. Recoger las células cuando sea necesario por la exposición a 5% de tripsina / EDTA a 37 ° C durante 5 min. Utilice ~ 80 l de tripsina / EDTA por cm2 de matraz de cultivo de tejidos. Durante todas las etapas de manipulación celular, tener especial cuidado de no perturbar la superficie del hidrogel: aspirado o medio pipeta inclinando ligeramente la placa de pocillos múltiples lados y tocar la punta de la pipeta sobre la pared lateral de cada bien, en lugar de tocar el hidrogel.
NOTA: Excepto por teniendo especial cuidado de no dañar la superficie del hidrogel durante la manipulación de cultivo de tejidos estándar, las células sembradas en el ensayo de rigidez puede ser manipulado de la misma manera como si se sembraron ena una placa de múltiples pocillos regular.
5. Obtención de imágenes de células sembradas en Rigidez Ensayo PA
- Celdas de imagen directamente en el ensayo de rigidez PA.
NOTA: Cualquier microscopio - invertida, fluorescente o confocal, se puede utilizar para obtener imágenes de células.
NOTA: El soporte de plástico flexible utilizado para construir el ensayo de rigidez es completamente transparente y no autofluoresce o interfiere con imágenes de células. Sin embargo, a pesar de que el propio soporte de plástico flexible es transparente, las capacidades de formación de imágenes estarán limitados por la distancia de trabajo del objetivo. El soporte de plástico flexible tiene un espesor de 0,23 mm y una distancia de trabajo típica de un objetivo de 10X es ~ 4 mm, fuertemente decreciente para ampliaciones superiores.- Para imágenes de células vivas, la posición de ensayo de rigidez PA en soporte de la placa de microscopio y la imagen. Mantenga las sesiones de formación de imágenes por debajo de 2 horas, o utilizar un microscopio equipado con una cámara ambiental para tiempos de imagen más largos.
- Cuando im células vivasel envejecimiento no es el objetivo, fijar las células en solución de formaldehído al 4% suplementado con 0,1% de detergente. Remojar las células en fijador a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 horas. Enjuague con PBS dos veces. Deseche los residuos fijador en un contenedor de residuos designado.
NOTA: Las células se pueden obtener imágenes inmediatamente o almacenada sumergidos en PBS a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico por inhalación y por contacto. Manipular con guantes en una campana de extracción química.
NOTA: protocolo de fijación de la célula tiene que ser elegido en base a los protocolos de tinción celular y la manipulación posterior, debido a que algunos fijadores dañan algunas proteínas de la célula. - Para imágenes fluorescentes, mancha células con tinción celular deseada directamente en la placa de múltiples pocillos fijo. Imagen de inmediato.
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Representative Results
Poliacrilamida (PA) hidrogeles son ampliamente utilizados para probar las respuestas de células de rigidez dependiente. 17,24 Mediante la mezcla de varias concentraciones de acrilamida (A) y bis-acrilamida (B) se puede hacer geles de PA que abarcan el rango de rigidez de la mayoría de los tejidos blandos en el cuerpo - 0,3 -.. 300 módulo de kPa joven 1 Sin embargo, la preparación de geles de poliacrilamida es tedioso y consume mucho tiempo, a menudo limita su utilidad en aplicaciones de "alto rendimiento", tales como para la detección ejemplo de drogas 12 Aquí, un método sencillo y rápido para montaje de geles PA en placas de múltiples pocillos o cualquier otro recipiente de cultivo de tejido deseable se presenta (Figura 1). La Figura 2A muestra el módulo de Young como una función de varias concentraciones de A y B (también resume en la Tabla 1). Los módulos de combinaciones adicionales A y B son reportados en la literatura. 17,25,26 La rigidez de gel totalmente swollen geles se midió por la reología (reómetro 2000EX AR, TA Instruments) con una geometría paralela 20 mm superior, frecuencia oscilatoria prueba de barrido de 1 a 10 Hz, y la tensión constante del 2%. Como se preveía, se demostró que tanto el módulo de almacenamiento, G ', y módulo de pérdida, G ", son independientes de la frecuencia (Figura 2B). También se confirmó que el secado y luego re-hidratar los geles, no afectó el módulo de su joven (Figura 2C). El módulo de Young estaba relacionado con el módulo de almacenamiento por la siguiente ecuación: 
donde E es el módulo de Young y v es la relación de Poisson que se aproxima a 0,5 para geles PA. 27 Nótese que los valores reportados son para los hidrogeles preparados con TEMED. Hidrogeles PA también pueden ser preparados por reticulación UV cuando el tiempo de exposición y la intensidad UV están optimizados (
Además, se demostró que las células sembradas en hidrogeles de diferente stiffness exhibió diferente morfología. Para este experimento, las células de cáncer de mama MDA-MB-231 se sembraron en la parte superior de los geles PA por 24 - 72 h. Las células se cultivaron en medio RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina / estreptomicina en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. Las células se sembraron a 1 x 10 5 células / ml o 1 x 10 4 células / pocillo para una placa de 96 pocillos. Esta es una densidad típica siembra de células - 4 veces menor que la densidad celular confluencia, donde se alcanzaron la confluencia para una línea celular de mamífero en ~ 1 x 10 5 células / cm 2. Las imágenes fueron tomadas en microscopio de fluorescencia invertida y se analizaron en ImageJ través del descriptor de forma y de software Área plug-ins. Se observó que cuando se sembró en geles de PA durante 24 horas, las células de cáncer de mama MDA-MB-231 permanecieron redonda sobre las suaves 0,5 y 1 geles kPa, pero fueron capaces de extender y alargar en el rígido 100 kPa gel (Figura 4). Figura 4 también showcases el hecho de que los hidrogeles preparados en la parte superior del soporte de plástico flexible son transparentes y permiten la fácil visualización y microscopía. Además, el soporte de plástico flexible no autofluoresce y por lo tanto no interfiere con la obtención de imágenes de células marcadas con fluorescencia. La morfología celular se cuantificó además en términos de célula general de la zona y el factor de forma de la célula de propagación - circularidad (Figura 5). Área de difusión celular se midió mediante la creación de una máscara para trazar el perímetro de cada celda. Entonces la forma de la célula (circularidad) se calcula a partir de la siguiente relación: 
La circularidad se mide en una escala de 0 - 1, donde 0,6-1 fueron llevados a designar células redondeadas y 0-0,5 fueron llevados a designar células alargadas. Aproximadamente se analizaron tres cientos de células de al menos tres experimentos independientes para cada poin datos t. Se calcularon las diferencias estadísticas en base al análisis factor de varianza (ANOVA), donde se consideraron los conjuntos de datos significativamente diferentes cuando p <0,05.
Figura 1. Representación esquemática de la preparación en gel de poliacrilamida en soporte de plástico flexible. La figura representa los diversos pasos implicados en la preparación de geles PA en soporte de plástico flexible. Después de que el gel se seque por completo, se puede cortar o perfora en cualquier forma deseable. Todo un punzón (~ 6 mm de diámetro) es más conveniente en la preparación de geles para una placa de 96 pocillos, mientras que un cortador de papel de alta resistencia puede ser utilizado para formas cuadradas o rectangulares. La figura también destaca los bordes de los pozos, con y sin un gel, para demostrar que la cobertura completa del fondo del pozo se puede lograr con este método. oad / 52643 / 52643fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Rigidez del PA hidrogeles, medida por la reología. (A) el módulo de Representante joven para cinco concentraciones diferentes de A & B (consulte la Tabla 1 para los acrónimos), (B) el almacenamiento y el módulo de pérdida como una función de la frecuencia medida por reología; (C) geles exhiben el mismo módulo de Young inicialmente (inicial) y después de que se han secado y re-hidratado (Re-hidratado) independiente de la concentración precursor de polímero. Todos los geles para las mediciones de reología se prepararon como losas de 20 mm de diámetro y 1 a 1,5 mm de altura (al hincharse completa).
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Figura 3. recubrimiento en geles de colágeno PA. El recubrimiento de colágeno (verde) se distribuye de manera eficiente y retenido sobre el gel de PA (rojo) superficie independiente de módulo de rigidez de hidrogel de Young). El colágeno marcado con Cy5 se utilizó para estos datos. Red bolas fluorescentes fueron incorporados en el hidrogel PA a la visualización de la ayuda. Imágenes de cortes transversales fueron tomadas en un microscopio confocal (barra de escala = 100 micras). Imagen adaptada de Zustiak et. al. 5 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. contrato Fase (fila superior) y fluorescentes (fila inferior) imágenes de las células MDA-MB-231 sembradas en geles de PA durante 24 horas. MDA-MB-231 células permanecen redonda sobre geles suaves (Young 7; s módulo de 0,5 y 1 kPa), pero alargado en geles rígidos PA (módulo de Young de 100 kPa). Las células se sembraron en los geles durante 24 h, se fijaron en etanol y se tiñeron con naranja de acridina (AO - verde) para visualizar el citoplasma de la célula y DAPI (azul) para visualizar núcleo de la célula; barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. área de extensión de la célula y la circularidad se ven afectados por la rigidez del sustrato subyacente. (A) área de extensión de células MDA-MB-231 se incrementa significativamente en el 100 kPa a diferencia de los geles de 0,5 kPa. (B) la circularidad de la célula disminuye con el aumento de la rigidez de gel de PA. Los asteriscos designan diferencias significativas; p <0,05.
Figura 6. Representación esquemática de una preparación alternativa en gel de poliacrilamida en soporte de plástico flexible. La figura representa los diversos pasos implicados en la preparación de geles PA en soporte de plástico flexible. Aquí, el soporte de plástico flexible está inicialmente de pre-corte en "cubreobjetos" plástico de una forma y tamaño deseados. Esta técnica funciona mejor para los hidrogeles blandos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Acrónimo | La acrilamida% | Bis-acrilamida% | La acrilamida del 40% solución madre (ml) | Bis-acrilamida del 2% solución madre (ml) | Agua (ml) | G '± SD (kPa) | E ± SD (kPa) |
| PA1 | 5 | 0,025 | 625 | 62.5 | 4312.5 | 0.62 ± 0.19 | 1,85 ± 0,57 |
| PA2 | 5 | 0.1 | 625 | 250 | 4125 | 3.55 ± 0.12 | 10,64 ± 0,36 |
| PA3 | 8 | 0.1 | 1000 | 250 | 3750 | 9.71 ± 0.64 | 29,14 ± 1,93 |
| PA4 | 8 | 0.25 | 1000 | 625 | 3375 | 22,00 ± 2,10 | 66,01 ± 6,31 |
| PA5 | 12 | 0.25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37,42 ± 2,68 | 112,25 ± 8,03 |
Tabla 1. Las concentraciones de acrilamida (A) y el reticulante bis-acrilamida (B) y la resultante rigidez de gel de PA. Rigidez, aquí representados por G 'y E, se midió mediante reología. G 'es el módulo de almacenamiento a 1 Hz de frecuencia. El módulo de Young, E, se calcula a partir de la Ec. 1. La desviación estándar (SD) se calculó sobre la base de tres experimentos independientes con 3-5 muestras medidas por experimento. Los acrónimos en la tabla corresponden a los acrónimos utilizados en la figura 2A.
| La intensidad UV = 15 mW / cm 2 | Tiempo de exposición = 300 sec | ||
| Tiempo (s) | E (kPa) ± SD | Enintensidad (mW / cm 2) | E (kPa) ± SD |
| 75 | 0.14 ± 0.03 | 15 | 28,05 ± 2,62 |
| 100 | 6,98 ± 2,34 | 26 | 21,13 ± 3,01 |
| 125 | 19,11 ± 2,29 | 37 | 20,01 ± 2,38 |
| 300 | 28,05 ± 2,62 | 66 | 19,35 ± 2,86 |
Tabla 2. polimerización UV es una alternativa y un método más rápido para la preparación de gel de PA cuando se optimizan las condiciones de gelificación; PA3 (véase Tabla 1) gel se representa. La tabla resume módulo de la resultante de Young cuando sea el tiempo de exposición (a la izquierda dos columnas) o la intensidad UV (derecha dos columnas) son variadas por la misma solución. Basándose en los resultados de la tabla, parece que 300 seg tiempo de exposición y 15mW / cm 2 intensidad UV dar la rigidez de gel de PA más alta, que es comparable a la rigidez del gel polimerizado tradicionalmente como se informa en la Tabla 1.
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Geles de poliacrilamida, desarrollados originalmente para la electroforesis, 28 ahora se utilizan rutinariamente como sustratos de cultivo celular para estudiar los efectos de la rigidez del sustrato sobre la morfología celular, la motilidad y la comunicación 3,24,29 entre otras características de las células. Poliacrilamida permite la manipulación de la rigidez del sustrato para abarcar la rigidez de los tejidos blandos del cuerpo (0,3 a 300 kPa) 1 con un simple cambio en la concentración de precursor de polímero (Figura 2, Tabla 1, ver también referencias 17,25,26). Junto al hecho de que los geles PA son bastante baratos y fáciles de preparar, se han convertido en plataformas indispensables en el estudio de las interacciones célula-material de rigidez-dependiente. Sin embargo, aunque simple, la técnica actual para la preparación de geles de PA se limita a pequeños lotes. Este limitaciones se derivan de la naturaleza de la gelificación de hidrogel, que es una polimerización por radicales libres catalizada por persulfato de amonioy. TEMED 30 Puesto que la reacción es una polimerización en cadena de radicales libres, que puede ser inhibida por cualquier elemento que sirve como una trampa de radicales libres, tales como el oxígeno. Por lo tanto, desde la difusión de oxígeno en la solución polimérica ha de evitarse durante la polimerización - que podría tomar hasta 45 minutos para los geles suaves - simplemente pipetear los geles PA en una placa de múltiples pocillos abierto no es factible. Además, para ser utilizado como un sustrato de células en dos dimensiones (2D), la superficie del gel PA debe ser plana. Ambos de los requisitos anteriores dictan que para producir geles de PA como sustratos celulares 2D, solución de precursor de gel de PA deben ser intercalada entre dos superficies planas durante la polimerización - para inhibir la difusión de oxígeno y aplanar la superficie del gel. Además, la superficie superior tiene que ser tal que pueda desprenderse fácilmente del gel exposición de la superficie para la fijación celular. Esto se logra típicamente por recubrimiento hidrófobo de una superficie de vidrio. Por último, cuando se coloca en ºe pocillos de una placa de múltiples pocillos, los geles PA deben cubrir bien la superficie total y limitarse flote. Cobertura de la superficie del fondo del pozo completo es especialmente importante en aplicaciones en las que los ensayos utilizados para evaluar las células son del tipo que tiene en cuenta toda la población de células en el pozo (por ejemplo, MTT). Si el gel de PA no cubre adecuadamente la superficie entera así, se debe tener cuidado para bloquear la adhesión celular a la superficie expuesta así como células podrían fácilmente rodar el gel sobre el vidrio o plástico. Si es necesario, el bloqueo de BSA siguiendo protocolos estándar o usando fuera de la plataforma kits bloqueo de la adhesión celular a base de BSA deberían ser suficientes para bloquear la unión de células a la parte inferior de la placa de pocillos. Por ejemplo, para preparar una superficie cubierta de BSA, 0,5 mg / ml de solución de BSA en PBS, pH 7,4 debe ser adsorbido sobre la placa de cultivo de tejido durante 20 min a RT, se enjuagaron con PBS y se utiliza inmediatamente o se almacenó a 4 ° C durante hasta 2 semanas. BSA se ha demostrado que bloquear la adhesión celular ocultivos de células de mamíferos f en ambas superficies de poliestireno hidrófilos e hidrófobos en gran medida mediante la reducción de las fuerzas de adhesión celular como midieron por microscopía de fuerza atómica. 31 BSA se ha usado rutinariamente para bloquear la adhesión de células de mamíferos, así como crear superficies modeladas de células 32,33.
La técnica descrita en este artículo, satisface todos los requisitos anteriores que permiten la producción en masa de geles PA uniformes de tamaño y forma personalizada. La técnica es más simple y más eficiente que el estándar actual de intercalando solución de precursor de gel de PA entre dos cubreobjetos de vidrio. Además, no requiere ningún equipo sofisticado y por lo tanto es fácilmente adoptable por cualquier laboratorio de investigación. También es más rentable, ya que no requiere el uso de placas de vidrio o cubreobjetos de vidrio, que no son sólo es costoso, sino que también vienen en tamaños limitados. La técnica es también más rápido por varias razones. En primer lugar, que no implica ningún etapas de pretratamientotípico de las superficies de vidrio ya que el soporte de plástico flexible, está diseñado con dos superficies distintas - un lado hidrofílico que se conecta permanentemente a poliacrilamida y un lateral hidrofóbica que podría ser fácilmente se quitó después de la formación de gel. En segundo lugar, debido a que el soporte de plástico es flexible, es más fácil y más rápido para despegar el gel formado: cuando los geles se forman delgadas entre dos portaobjetos de vidrio, descamación fuera de la diapositiva hidrófobo superior es difícil y a menudo resulta en la rotura que también compromete el gel. Por último, debido a la transparencia flexible de soporte de plástico, la polimerización UV más rápido se puede emplear en oposición a la polimerización basado TEMED estándar que podría tomar tanto como 45 min (Tabla 2). Los datos en la Tabla 2 demuestra que cuando el tiempo de polimerización y la intensidad de luz UV se optimizan rigidez similar puede lograrse por ambos métodos de polimerización TEMED y UV.
Los hidrogeles se preparan en pl flexiblesapoyo astic como se representa en la Figura 1. Se recomienda llevar a cabo la gelificación en una cámara de desgasificación para evitar la polimerización incompleta de los bordes de gel (es decir, los efectos de borde) debido a la difusión de oxígeno entre las dos superficies que intercalan la solución de polímero. El objetivo es crear una gran película de hidrogel en la parte superior del soporte de plástico flexible, por lo tanto, la placa de vidrio de cualquier tamaño sería apropiado, pero va a dictar el tamaño de la película de poliacrilamida que se puede lograr. El vidrio puede ser recubierto con cualquier revestimiento hidrófobo o, alternativamente, la parte hidrófoba del soporte de plástico flexible podría ser utilizado en su lugar. Una vez que se forma una película de gel de PA, se seca, se corta en las formas deseadas, y luego re-hidratado antes de su uso. Cuando está seco, los geles se pueden almacenar indefinidamente. Se confirmó por reología, que la rigidez de gel de PA es sin cambios después de la rehidratación, incluso cuando los geles se almacenan en estado seco durante varios meses (Figura 2C). Sin embargo, para muy soft geles (≤ 1 kPa en el módulo de Young) de secado y rehidratación de pliegue superficie exacerban y la formación de grietas. Este comportamiento es común que los geles suaves que sufren de deshidratación y posterior re-hidratación mientras es limitado geométricamente 34,35. No todos los geles pliegue o grieta, por lo tanto, es posible examinar visualmente los hidrogeles antes de su uso y sólo utilizar las muestras que muestran una superficie lisa. Para evitar completamente la formación de arrugas y agrietamiento, un método alternativo para preparar hidrogeles blandos se representa en la Figura 6. Aquí, el soporte de plástico flexible es pre-corte en la forma deseada y el gel de PA se forma en la parte superior, por lo tanto, los geles no lo hacen necesitar ser hidratado de but se puede utilizar como preparado. Un beneficio adicional de esta estrategia alternativa es que ~ 2.5 geles más pueden producirse a partir del mismo volumen de solución de precursor de hidrogel (la estimación se basa en la preparación de geles para una placa de 96 pocillos estándar como se describe en la sección de protocolo). Una precaución cuandola preparación de hidrogeles de esta manera es tener cuidado para evitar la infiltración de oxígeno, especialmente para los geles de menor tamaño (por ejemplo, geles para ser utilizado en una placa de 96 pocillos). Incluso cuando la solución de precursor de gel está completamente desgasificada, es decir, libre de oxígeno, el oxígeno se difunde entre las dos superficies que intercalan la solución PA. Por lo tanto, a fin de evitar efectos de borde o la formación de gel incompleta a lo largo de los bordes, lo mejor es permitir la polimerización ocurra en ausencia de oxígeno. En nuestra experiencia, una cámara de vacío funciona bien, a pesar de un entorno de gas inerte podría utilizarse con igual éxito.
Una última precaución al preparar PA hidrogeles como sustratos celulares para probar las respuestas de células de rigidez dependiente, es que el grosor del hidrogel resultante es importante: para geles muy delgadas, las células son capaces de sentir el sustrato subyacente 36 Usando la teoría y la experimentación,. Lin et al. demostró que la profundidad a la que las células pueden Feel sustrato subyacente depende de la dimensión lateral de la célula. 29 Dado que la investigación actual es contradictoria, identificando el espesor mínimo requerido para evitar que las células de detección del sustrato "oculta" ser de varias micras 36 a tanto como 60 micras, 37 un espesor mínimo de 100 micras gel deberá tratar de lograrse.
Cuando el montaje de los geles de PA en una placa de múltiples pocillos, una pequeña gota de PDMS se utiliza para asegurar el gel a la parte inferior del pozo. PDMS fue elegido debido a que actúa como pegamento permanente al endurecimiento, es completamente transparente y no interfiere con los experimentos de microscopía posteriores, es totalmente no citotóxico, y se cura en aproximadamente 4 - 8 horas dejando tiempo suficiente para conjunto de la placa. Asegurar de forma segura los hidrogeles a la parte inferior de las ayudas así en la manipulación de la célula: por ejemplo, un lavado vigoroso podría desalojar hidrogeles si no está firmemente asegurado. Si el cambio frecuente en la celda media no es una preocupación, a continuación, los geles pueden ser asegurados temporalmente a la superficie bien por una pequeña gota de un líquido no citotóxico y altamente viscoso, tal como glicerina.
Los pasos finales antes de la siembra de células implican recubrimiento ECM de la esterilización gel y, a continuación. Aquí recubrimiento de colágeno tipo I se representa (Figura 3) a pesar de que la misma técnica se puede aplicar para cualquier otra proteína ECM. El reticulante bi-funcional sulfo-SANPAH se utiliza para lograr un recubrimiento monocapa uniforme. La investigación anterior ha demostrado que tal unión covalente produce un revestimiento más uniforme que la simple adsorción de proteínas y también permite una sintonización de 12 veces de la cantidad de proteína unida por el simple uso de una solución de proteína de concentración variable. 6 Por último, la placa de gel de múltiples pocillos montado se esteriliza bajo UV en la campana de cultivo de tejidos para un máximo de 2 hr. La esterilización UV permite que el ensayo se monta en un banco de laboratorio fuera de la campana, quehace que el proceso logísticamente más sencillo y en general más rápido.
Las figuras 4 y 5 ilustran algunos resultados representativos de las células MDA-MB-231 de cáncer de mama cultivadas en plástico flexibles de apoyo conectado PA geles de rigidez variable. MDA-MB-231 células fueron elegidos para demostrar la utilidad método porque se ha demostrado para reaccionar a la rigidez del sustrato subyacente por los cambios mensurables en su morfología. 5,12 Como se esperaba, las células fueron más alargada y tenía un área de extensión más grande en los geles rígidos 100 kPa PA en comparación con las suaves 0,5 y 1 kPa geles PA (Figuras 4 y 5). La fila inferior en la Figura 4 también muestra el uso de dos colorantes fluorescentes que tiñen el núcleo celular y el citoplasma celular, mostrando el hecho de que el soporte de plástico flexible no interfiera con la formación de imágenes de microscopio fluorescente.
En resumen, un método simple para preparar hidrogeles de poliacrilamida en unaformato de placa de múltiples pocillos se presenta. La técnica es más rápido, más eficiente y menos costoso que los métodos actuales para la preparación de geles de PA para ser utilizados como sustratos celulares, así como permite la preparación de geles de tamaños personalizados de otro modo no disponibles. Como no se requiere ningún equipo especializado, el método podría ser adoptada fácilmente por cualquier laboratorio de investigación y sería particularmente útil en la investigación se centró en la comprensión de las respuestas de células de rigidez dependiente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
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