Introduction
Vücutta en dokular ~ 1 GPa arasında bir elastisite modülüne sahiptir 0.1 kPa ila yumuşak kıkırdağın 100 kPa beyin, ancak, in vitro hücre araştırmalarında en doku kültür polistiren (TCP) üzerinde gerçekleştirilmiştir arasında değişen bir Young modülüne sahip yumuşak viskoelastik malzemelerdir . 1 Bu sertlik uyumsuzluğu ölçüde hücreler çevrelerine cevap şeklini etkiler. Araştırma artan vücut, 2,3 kök hücreler de dahil olmak üzere. Bunun sonucunda 4 farklı hücre tiplerinin kaderi üzerinde tabaka sertlik etkisi açıklık böylece adanmış, birden hidrojeller sertlik-bağımlı hücre anlaşılmasına yardım için geliştirilmiştir Yüzey sertliği hücre kaderi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu kanıtlar büyürken poliakrilamidin (PA), 5-7 polietilen glikol (PEG), 8,9 polidimetilsiloksan (PDMS), 10 ve aljinat içeren biyoloji. 11, en çalışmalar yürütülmektedir s az sayıda küçük ölçekliörnekleri şunlardır:. Hücre tipleri veya çevresel koşullar nadir bir dizi için substrat sertlik etkisi sistematik, çok boyutlu çalışmalar. 12
Çok ümit vaat eden yüksek verimli hidrojel teknolojisi PEG-bazlı microarrays, sertlik microrods çapı ve yüksekliği ile modüle edilen agaroz hidrojel mikro, 14 ya da mikro ve nano çubuklar üretim için 13 mikroakışkan cihazlar da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. 15 Ancak , teknolojileri, yüzeyler sofistike ve laboratuvarların sınırlı sayıda mevcuttur hazırlamak. Sertliği modüle hücre yanıtları kapsayan pek çok araştırma uygulanması, aynı zamanda Young'ın modülü, yani 0.3 fizyolojik olarak uygun bir aralığı gösteren sadece ucuz ve basit değildir, poliakrilamid (PA) jelleri kullanan -. 300 kPa 16-22 Ancak, PA imalatı için yöntem Mevcut Hücre kültürü için jeller, emek yoğun ve dolayısıyla hazırlık vardırKüçük gruplar halinde ared. Hücre alt-tabakalar olarak PA jellerin hazırlanması ile ilgili zorluklardan bazıları jeller hazırlanacak olması şartı kaynaklanmaktadır: 1) oksijen yokluğunda tam polimerizasyona olanak sağlamak için, 2), düz ve pürüzsüz bir yüzeye sahip tek tip hücre olanak sağlamak üzere eki ve yayma, ve 3) kalıcı yüzen önlemek için hücre kültürü çanak altına yapıştırılmıştır.
Çeşitli gruplar, büyük gruplar halinde hücre kültürü için PA jeller üretmek için çalıştılar. Semler ve diğ., Bir delikli zımba ile daha sonra "kesme" ve 96 oyuklu plakalara yerleştirildi PA jeller hazırlanmış kalın levhalar. 23 Bununla birlikte, bu yöntem, katı jeller, örneğin,> 1 kPa bir Young modülü de, yumuşak, çünkü sınırlıdır jeller, kesmek zor, ve kolayca zarar "yapışkan" bulunmaktadır. MIH ve diğ., Jeller, doğrudan bir cam alt oyuklu bir plaka içinde polimerize edilmesini sağlar, daha gelişmiş bir teknik geliştirdi.
Bu kağıt kolayca herhangi bir laboratuar tarafından kabul edilebilir bir multiwell plaka PA jeller araya için basit ve ucuz bir şekilde anlatılmaktadır. Itici PA jeller olan bir hidrofobik on, ve kovalent birikmesi üzerine PA jel bağlayan hidrofil bir on, - Burada, esnek bir plastik destek iki tarafı sahip olan kullanılır. PA jel yaprak esnek plastik bir desteğe tespit sürekli yatırılır ve sonra, herhangi bir kalınlığı ya da sertlik jeller kullanım ve arzu edilen herhangi bir şekil olarak kesilmesi mümkün kılar. Bu yakloach bir PA bağlayıcı çözelti ile, cam lamelleri ya da pahalı cam alt çukurlu plakaların kuyu ya aksi takdirde piyasada mevcut değil boyutlarda özel plastik 'lamelleri' üreten, aynı zamanda cam yüzeyler-tedavi öncesi gerekliliğini ortadan kaldırır sadece sıkıcı ve zaman alıcı bir adım. Son olarak, tek tip PA jeli yaprak büyük partiler halinde hazırlandı ve birkaç ay süreyle de hidratlanmamış saklanabilir.
Özetle, burada sunulan tahlil çeşitli yönleriyle mevcut yöntemlere göre bir gelişmedir. İlk olarak, çok oyuklu bir plaka montaj işlemi verimli ve gerekli malzemelerin toplam maliyeti düşüktür. İkinci olarak, hidrojeller tek bir homojen jel, film içinde büyük partiler halinde üretilmektedir. Son olarak, ticari olarak temin edilebilir, yalnızca malzeme gerekmektedir. Analizin yarar hücre morfolojisi üzerinde alt-tabaka sertliğinin etkisinin incelenmesi ve alan yayılması ile görüntülenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hidrojel-ilişkili Çözümleri ve Alikot 1. Hazırlık
- Poliakrilamid jel ön-madde çözeltisinin hazırlanması.
- Akrilamid, (A) karıştırılarak poliakrilamid jel ön-madde solüsyonu hazırlayın (w / v% 40, E r 71,08 g / Mol) ve çapraz bağlayıcı bisakrilamid (B), (a / h% 2, E 154,17 g / mol r), ve tespit edilen Tablo 1 'de belirtilen hacim yüzdeleri ile iyonize su.
NOT: Bu çözümler büyük partiler halinde hazırlanır ve birkaç aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.- DİKKAT: Akrilamid inhalasyon veya sindirim üzerine toksik olan, özellikle toz biçiminde olduğunda: bu durumda, tercihan, toksisite riskleri azaltmak / v solüsyonu ağırlık% 40 kullanılır. Eldiven, gözlük, ve bir laboratuvar önlüğü gibi, koruyucu giysiler giyerek sadece süre taşıyınız. Buzdolabında bir ışık dayanıklı, sıkıca kapalı bir kapta saklayın (<23 ° C, bölgeyi iyi havalandırılmış).
- DİKKAT: Bis-akrilamid, özellikle, inhalasyon ya da sindirim üzerine toksikzaman toz biçiminde: bu durumda, tercihan, toksisite riskleri azaltmak / v solüsyonu% 2 w kullanılır. Eldiven, gözlük, ve bir laboratuvar önlüğü gibi, koruyucu giysiler giyerek sadece süre taşıyınız. Buzdolabı (<4 ° C, iyi havalandırılmış alan) bir ışık dayanıklı, sıkıca kapalı bir kapta saklayın.
- Akrilamid, (A) karıştırılarak poliakrilamid jel ön-madde solüsyonu hazırlayın (w / v% 40, E r 71,08 g / Mol) ve çapraz bağlayıcı bisakrilamid (B), (a / h% 2, E 154,17 g / mol r), ve tespit edilen Tablo 1 'de belirtilen hacim yüzdeleri ile iyonize su.
- Hazırlama ve N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrofenilamino) heksanoat kullanım bölümü (Sülfo-SANPAH, E 492,40 g / mol r). DİKKAT: Sulfo-SANPAH Ciddi göz tahrişine neden olur; eldiven ve uygun göz ve yüz koruması ile anlaştım. Mağaza aldıktan sonra -20 ° C'de ve önceki şişelemeden.
- Sülfo-SANPAH saklamak için: 50 mg / ml dimethylsulfoxane (DMSO) içinde Sülfo-SANPAH çözülür. Tüp başına 20 ul 50 mikro santrifüj tüplerine stok çözeltisi alikosu. Kuru buz veya sıvı azot içinde hızlı dondurma -80 ° C'de ve mağaza (maksimum çapraz bağlayıcı verimliliği korumak için bir seçime bağlı, fakat tercih edilen bir aşaması).
NOT: tümbölenler can birkaç ay boyunca saklanabilir. - Sülfo-SANPAH kullanmak için: kısım kısaca çözülme ve deiyonize su içinde 480 ul seyreltin. Hemen kullanın. Sulfo-SANPAH suda hızlı hidrolize: bu nedenle hızlı bir şekilde yukarıdaki tüm adımları gerçekleştirmek için dikkat çekmek.
- Sülfo-SANPAH saklamak için: 50 mg / ml dimethylsulfoxane (DMSO) içinde Sülfo-SANPAH çözülür. Tüp başına 20 ul 50 mikro santrifüj tüplerine stok çözeltisi alikosu. Kuru buz veya sıvı azot içinde hızlı dondurma -80 ° C'de ve mağaza (maksimum çapraz bağlayıcı verimliliği korumak için bir seçime bağlı, fakat tercih edilen bir aşaması).
- Amonyum persülfat (M r 228,18 g / Mol) alikotları hazırlanması.
NOT: Amonyum persülfat göz, cilt ve solunum tahriş olmasına neden olur. Işlerken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Bir kimyasal davlumbaz amonyum persülfat tozu Kolu. Kuru, iyi havalandırılan bir yerde saklayın tozu. Aliquoted sonra, seyreltik çözelti çalışma tezgahı üzerinde kullanılabilir.- Ağ / hac% 10'luk bir nihai amonyum persülfat konsantrasyonu elde etmek için deiyonize su içinde amonyum persülfat çözülür. -20 ° C'de kısım ve mağaza. Kullanımdan hemen önce çözülme.
- Kolajen Tip I çözeltisinin hazırlanması.
- Böylece stok seyreltilmesi ile 0.2 mg / ml kollajen çözüm hazırlayınpH 7.4 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde dökülmesinden. Buz kısaca Mağaza veya seyreltme üzerine hemen kullanın.
2. Hidrojel Hazırlık (Şekil 1'e bakın)
- Hidrofobik cam slaytların hazırlanması.
- Bir cam plaka üzerine bir hidrofobik çözeltisinin bir kaç damla yerleştirin ve yüzey boyunca yaymak için kağıt mendil kullanmayın. Hava kurumasını bekleyin ve hidrofobik kaplama bile dışarı tekrar kağıt mendil ile silin.
NOT: oda sıcaklığında bir yanıcı kabine saklayın hidrofobik bir çözüm. Kullanırken kişisel koruyucu ekipman kullanın. Iyi havalandırılan bir alanda çalışın.
- Bir cam plaka üzerine bir hidrofobik çözeltisinin bir kaç damla yerleştirin ve yüzey boyunca yaymak için kağıt mendil kullanmayın. Hava kurumasını bekleyin ve hidrofobik kaplama bile dışarı tekrar kağıt mendil ile silin.
- Esnek plastik destek hazırlanması.
- Hidrofobik kaplı cam plakanın boyutuna uyacak şekilde esnek plastik desteği kesti.
- Hafifçe böyle bir neşter gibi keskin bir aletle yüzeyi çizilmeye esnek plastik destek hidrofobik yan işaretleyin.
NOT: jel kez - tamamen şeffaf - kurur, Çizikleri esnek plastik destek tarafı jel içeren ayırt yardımcı olacaktır.
Not: esnek plastik destek, bir hidrofobik ve hidrofilik bir tarafa sahiptir. Bir kez yatırılır, poliakrilamid kalıcı kolay sonraki hidrojel kullanımını kolaylaştırır plastik desteğin hidrofilik tarafına yapışır.
- Jel Hazırlanması (örneğin, miktarlar 5 ml jel prekürsör çözeltilerinde için verilmiştir).
Not: jel başlangıç kalınlığı, 0.5 mm olduğunda 5 mi ~ 40 jeller üretmek için yeterli olacaktır. Jel kalınlığı azalır, daha fazla jeller elde edilebilir.- 50 ml'lik konik bir tüp içinde arzu edilen nihai konsantrasyonu (Tablo 1) poliakrilamid ön-madde çözeltisi 4972,5 ul koyun. Açılan bir kapakla 30 dakika boyunca bir gaz tahliye açıklığının yerleştirin.
NOT: Oksijen serbest radikal tuzak gibi davranır ve mevcut, polimerizasyonu inhibe eder. - Amonyum persülfat ağ / hac% 10, 25 ul ekle nihai elde etmek için (1.3 noktasına bakınız)% 0.05 amonyum persülfat konsantrasyonu.
- N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamin 2.5 ul ekle% 0.5 bir son TEMED konsantrasyon elde etmek için gazı giderilmiş jel çözeltisine (TEMED, E 116,24 g / mol r).
NOT: Mağaza TEMED oda sıcaklığında bir yanıcı kabine içinde. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyen zaman kimyasal davlumbaz taşıyınız. Bu yüksek ölçüde hava ve neme duyarlı olduğu gibi sıkı bir atıl gaz altında kapalı tutun. - 5 kez - aşağı yukarı 3 pipetleme ve hafifçe karıştırın çözüm. Jel habercisi çözüm içine oksijen difüzyon önlemek için vorteks etmeyin.
- Hidrofobik kaplamalı cam slayt ile esnek plastik destek ve sandviç hidrofilik yüzüne jel çözümü Pipet. Istenilen kalınlıkta (örneğin, 0.5 mm), silikon ayırıcılar ile iki slayt ayırın. Jelleşme bir göstergesi olarak kullanmak için 50 ml konik bir tüp içinde bir polimer ön-madde ile az bir miktar (~ 100 ul) bırakın.
NOT:Herhangi bir boşluk kullanılabilir. 120 um - Örneğin, Parafilm tek bir şerit, bir son 100 şişmiş jel kalınlığı sağlar. - Polimerizasyon üzerine düz bir hidrojel yüzeye tespit esnek plastik destek / jel sandviç üstüne başka bir cam plaka yerleştirin.
- Arzu edildiği takdirde daha az zaman daha yüksek bir ağırlık% 'si arasında jeller için kullanılabilir olmasına rağmen, jel, 45 dakika boyunca polimerize olsun. Jel polimerize olduğunu tespit etmek için, 50 ml konik tüp içinde kalan çözümü gözlemlemek; Geri kalan çözelti, jel ise, o zaman cam plaka üzerine jelasyon de başlatılmıştır olasıdır. Bununla birlikte, kalıp erken açılması tam bir polimerizasyonu engellemek unutmayın.
- Jel oluşturulduktan sonra, üstte kovalent bağlı bir poliakrilamid jeli ile esnek plastik destek soyulabilir ve kuru hava jel tarafı yukarıya ayarlanır.
Not: konveksiyon veya sıcak kurutma bu basamağını hızlandırmak için kullanılabilir. Esnek plastik destek üzerine kurutulmuş sonra, jel deposu olabilirsüresiz d.- Poliakrilamid jeller kabarcıkları nedeniyle formu vermedi esnek plastik desteği, herhangi bir çıplak noktalar işaretleyin. Jel kuruduktan sonra bu esnek plastik desteği ile uyum gibi işaretle jel hala sulu ise.
- 50 ml'lik konik bir tüp içinde arzu edilen nihai konsantrasyonu (Tablo 1) poliakrilamid ön-madde çözeltisi 4972,5 ul koyun. Açılan bir kapakla 30 dakika boyunca bir gaz tahliye açıklığının yerleştirin.
3. multiwell plaka Meclisi, Kollajen Kaplama ve Sterilizasyon
- Multiwell plakası montaj.
- Bir kez kurutulduktan sonra, arzu edilen şekillerde PA jeller kesti.
- 96 oyuklu bir plaka için, ~ 6 mm bir çapı olan bir ağır-iş delik kullanımı. Kare veya dikdörtgen şekiller halinde jeller kesmek için bir ağır kağıt kesici kullanın. Seçenek olarak ise, makas kullanın.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak 96-çukurlu plaka başına PDMS yaklaşık 500 ul hazırlayın. Çok oyuklu bir plaka tabanına jeller tutkal için, her bir göze merkezinde küçük damlacık polidimetilsiloksan (PDMS), (± 5 ul) yerleştirin. Forseps kullanarak, bir poliakrilamid yerleştirinaşağı her iyi, esnek plastik destek tarafında e jel. PDMS, tedavi, 4 saat, en az 37 ° C 'de Prefabrik levha bırakmak için izin verilmesi.
- Bir kez kurutulduktan sonra, arzu edilen şekillerde PA jeller kesti.
- Poliakrilamid jellerin Kollajen kaplama.
- Bir transfer pipet, küçük bir miktar koyun - sülfo-SANPAH (7 8 ul) jel yüzeyi eşit şekilde kaplamak için yanlara iyi ve girdap her (1.2.2 noktasına bakınız). Sülfo-SANPAH suda stabil olmadığından derhal çalışın.
- 5 dakika boyunca - (365 nm, yoğunluk = 37 mW λ = 302), yüksek yoğunluklu UV lambası altında plaka yerleştirin. Aşırı sülfo-SANPAH kaldırmak için PBS ile jeller durulayın.
- 50 ul 0.2 mg Pipet / ml kolajen Tip I çözelti, her oyuğa (1.4 noktasına bakınız). 4 ° C'de en az 2 saat ya da O / N, oda sıcaklığında kapalı plaka bırakın.
NOT: kolajen kaplama sürecini hızlandırmak için, bir transfer pipet kollajen çözümü eklemek için kullanılabilir. Genellikle, 1 - çözümün 2 damlacıkları tamamlamak için yeterli olmalıdırly jel yüzeyini kaplayan. - Kollajen bağlanmasını sağlamak üzere, en az 2 saat boyunca oda sıcaklığında plaka bırakın.
- 2 saat boyunca bir doku kültür başlığı içinde fazla kolajen çözeltisi çıkarın ve UV (λ = 200 nm) altında sterilize etmek için PBS ile durulayın.
- Nemlendirmek ve dengelenmeye O / N (orta bileşim için bölüm 4.1 bakınız) tam orta jeller bekletin. Hücre kadar 2 gün boyunca buzdolabında hemen veya mağaza ekim için kullanın.
Pensilvanya Sertlik Testi 4. Hücre Tohumculuk
Not: ortak memeli hücre çizgileri için tipik olmakla birlikte, bu bölümde tarif protokolü özellikle meme kanseri MDA-MB-231 hücre çizgisi ile birlikte kullanılır (bakınız Şekil 4 ve 5).
- 37 ° C'de 5 dakika boyunca,% 5 tripsin / EDTA maruz bırakılarak doku kültür şişesi ile ilgili hücreler toplanır. Kültür şişesi alanının her cm 2 başına tripsin / EDTA ~ 80 ul kullanın; Örneğin fo tripsin / EDTA 2 ml kullanmakra T25 hücre kültürü şişesi. Yeniden askıya arzu edilen bir nihai hücre konsantrasyonunda% 10 cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş tam ortam içinde toplanan hücreler. Hesap zamanı iki katına hücrenin yanı sıra hücreler tahlil numaralı seribaşı olacak zamanın uzunluğu dikkate alındığında, uygun bir alt birleşik hücre konsantrasyonunu seçin. Eklenen ortam tamamen hidrojeller batığın için yeterli olduğundan emin olun.
Not: hidrojeller ortam içinde önceden-dengelenmiş olan bu yana yeterli olmalıdır 100 ul hacim (3.2.6 aşama bakınız). Jeller, önceki adımda ortam içinde önceden-dengelenmiş olan bu yana çukurlu bir levha için kullanılan tipik ortam hacimleri için yeterli olmalıdır.
NOT: deney herhangi bir bağlantı bağımlı bir hücre tipi için uygun olacaktır.- Bir hemasitometre kullanarak bir ters mikroskop altında hücre sayısı. Yük 10 her hemasitometre portuna hücre süspansiyonu ul ve en az 8 kadran hücre sayısını ortalama. Almak içinNihai hücre konsantrasyonu, 10 4 hücre sayısını çarpın.
NOT: Her hemasitometre kadranda hücre sayısı 20 olduğunda iyi hücre sayımı sonuçları elde edilir - 50.
- Bir hemasitometre kullanarak bir ters mikroskop altında hücre sayısı. Yük 10 her hemasitometre portuna hücre süspansiyonu ul ve en az 8 kadran hücre sayısını ortalama. Almak içinNihai hücre konsantrasyonu, 10 4 hücre sayısını çarpın.
- Kültür, 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde PA sertlik deneyi üzerine hücre ve% 5 CO2. 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek. 5 dakika boyunca 37 ° C'de% 5 tripsin / EDTA maruz bırakılarak gerektiğinde hücreler toplanır. Doku kültür şişesi cm2 tripsin / EDTA ~ 80 ul kullanın. Biraz yanlara çukurlu plaka devrilme ve hidrojel dokunmadan aksine, her bir yan duvarına üzerine pipet dokunarak aspire veya pipet orta: Tüm hücre manipülasyon adımları sırasında, özel hidrojel yüzeyi bozmayacak özen gösterin.
NOT: standart doku kültürü taşıma sırasında hidrojel yüzeye zarar vermemeye özel özen dışında, hücreler üzerinde seribaşı sanki sertlik deneyi aynı şekilde manipüle edilebilir üzerine numaralı seribaşınormal bir çok-yuvalı plaka.
Pensilvanya Sertlik Testi üzerine Tohumlu Hücre 5. Görüntüleme
- Doğrudan PA sertlik deneyi Görüntü hücreleri.
NOT: Herhangi bir mikroskop - ters, floresan veya konfokal, hücre görüntüleme için kullanılabilir.
Not: sertlik deneyi oluşturmak için kullanılan esnek bir plastik destek tamamen saydam olan ve autofluoresce veya hücre görüntüleme ile karışmaz. Bununla birlikte, esnek plastik desteğin kendisi şeffaf olsa bile, görüntüleme yetenekleri amacı çalışma mesafesi ile sınırlı olacaktır. Esnek plastik destek keskin yüksek büyütme için azalan, 0.23 mm kalınlığında ve 10X objektif bir tipik çalışma mesafesi ~ 4 mm vardır.- Canlı hücre görüntüleme için, mikroskop plaka tutucu ve görüntüde pozisyon PA sertlik deneyi. 2 saat altında görüntüleme oturumları tutun, ya da daha uzun görüntüleme kez bir çevre odasına sahip bir mikroskop kullanmak.
- Ne zaman canlı hücre imyaşlanma amaç değil,% 0.1 deterjan ile takviye% 4 formaldehit çözeltisi içinde hücreler düzeltmek. 2 saat içinde en az oda sıcaklığında sabitleyici hücreleri bekletin. PBS ile iki kez durulayın. Belirlenmiş bir çöp bidonuna sabitleyici atık atın.
Not: Hücreler hemen görüntülenebilir ya da 2 hafta süre ile, 4 ° C'de PBS içinde batık saklanan. DİKKAT: Formaldehit Teneffüs ve temas halinde toksiktir. Bir kimyasal davlumbaz eldiven kullanınız.
NOT: Belirli fiksatifler bazı hücre proteinlerini zarar nedeniyle Hücre tespit protokolü, daha sonra hücre boyama ve işleme protokolleri dayalı seçilmelidir. - Floresan görüntüleme için, leke multiwell plaka doğrudan istenen hücre boyası ile hücrelerin sabit. Görüntü hemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Poliakrilamid (PA) hidrojelleri yaygın sertlik bağımlı hücre tepkileri test etmek için kullanılır. 17,24 akrilamid, (A) ve bis-akrilamid (B) bir çok yumuşak dokuların sertlik aralığı içinde yayılan PA jeller yapabilir çeşitli konsantrasyonlarda karıştırarak gövde - 0.3 -.. Burada 300 kPa Young modülü 1 Bununla birlikte, bunlar, poliakrilamid jellerin hazırlanması sıkıcı ve zaman genellikle, örneğin, ilaç tarama gibi "yüksek verim" uygulamalarda faydalarını kısıtlayıcı, alıcı 12, basit ve hızlı bir yöntem için (Şekil 1) sunulmuştur, çok gözlü levhalar PA jeller ya da başka herhangi bir arzu edilen doku kültür kabı olan bir araya. Şekil 2A, çeşitli A ve B konsantrasyonlarının bir fonksiyonu (aynı zamanda, Tablo 1 'de özetlenmektedir) gibi Young modülüne gösterir. Ek A ve B kombinasyonları modülü literatürde rapor edilmiştir. 17,25,26 tam swolle jel sertliği10 Hz ve% 2 sabit gerginlik - n jeller 20 mm üst paralel geometri, salınım frekansı süpürme testi 1 ile Reolojinin (AR 2000ex reometre, TA Instruments) ile ölçüldü. Beklendiği gibi, her iki depolama modülü, G ', ve kayıp modülü G ", frekans (Şekil 2B) bağımsız olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, daha sonra kurutma ve yeniden nemlendirici bu jeller, bunların Young modülüne (Şekil 2C) etkilememiştir doğrulandı. Young modülü aşağıdaki denklem ile depolama modülü ilişkilidir: 
burada E, Young modülü ve v PA jeller için 0.5 yaklaşılmıştır Poisson oranıdır. bildirilen değerler TEMED ile hazırlanan hidrojellerin içindir 27 Not söyledi. Maruz kalma süresi ve UV yeğinlik optimize olduğunda PA hidrojeller UV çapraz bağlama işlemi ile hazırlanabilir (
Bundan başka, bu hücreler farklı stiffne arasında hidrojeller üzerine ekilmiş olduğu gösterilmiştirp farklı morfoloji sergilemiştir. 72 saat - Bu deney için, meme kanseri MDA-MB-231 hücreleri, 24 PA jellerinin üzerine ekilmiştir. Hücreler, 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş RPMI ortamı içinde kültürlenmiştir. Hücreler, 96 oyuklu bir plaka / oyuk 1 x 10 5 hücre / ml veya 1 x 10 4 hücre ekilmiştir. Bu tipik bir hücre tohum yoğunluğu - bir memeli hücre çizgisi için hücre birleşmesi yaklaşık 1 x 10 5 hücre / cm2 ulaşılır birbirine karışmaya hücre yoğunluğu, daha düşük 4 kat. Görüntüler Şekil tanımlayıcı ve Alan yazılım eklentileri yoluyla ImageJ üzerinde ters floresan mikroskop alındı ve analiz edildi. 24 saat PA jeller numaralı seribaşı zaman, meme kanseri MDA-MB-231 hücreleri yumuşak 0.5 ve 1 kPa jeller yuvarlak kaldı, ama (Şekil 4) yaymak ve sert 100 kPa jel üzerinde uzatmak mümkün olduğu gözlendi. Şekil 4, aynı zamanda showcases hidrojeller esnek plastik destek üstüne yapılmış olması şeffaf ve kolay görüntüleme ve mikroskopi için izin verir. Bundan başka, esnek plastik destek floresan etiketli hücre görüntüleme müdahale etmez, böylece autofluoresce ve etmez. Daireselliğe (Şekil 5) - hücre morfolojisi daha alanı ve hücre şekil faktörü yayılan toplam hücre açısından ölçülmüştür. Hücre yayılma alanı her hücrenin çevre izlemek için bir maske oluşturarak ölçülmüştür. Hücre şekli (yuvarlaklık) daha sonra aşağıdaki ilişki ile hesaplanır: 
1 yuvarlak hücreleri belirlemek için alındı ve 0 - - 0.5 uzunlamasına hücreleri belirlemek için alınmıştır 0.6 1, - yuvarlaklık 0 bir ölçekte ölçülür. Yaklaşık en az üç bağımsız deneyden üç yüz hücre her veri poin için analiz edildi t. İstatistiksel farklılıklar veri setleri <0.05 olduğunda p anlamlı farklı kabul edildi varyans tek faktör analizi (ANOVA) dayalı hesaplandı.
Şekil esnek plastik destek poliakrilamid jel hazırlama 1. şematik gösterimi. Rakam esnek plastik destek PA jeller hazırlanmasında yer alan çeşitli adımlar temsil eder. Jel tamamen kuruduktan sonra, kesilmiş veya herhangi bir arzu edilen şekil delik açılabilir. 96 oyuklu bir plaka için jeller hazırlanırken dayanıklı bir kağıt kesici kare ya da dikdörtgen şekilleri için kullanılabilir ise bir bütün zımba (~ 6 mm çapında), en uygundur. Şekil aynı zamanda, çeşitli ve jel ve olmayan, kuyu kenarları vurgulayan tam da alt kaplama, bu yöntemle elde edilebilir göstermek için. OAD / 52.643 / 52643fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Reolojinin ile ölçülen PA Şekil 2. Sertlik hidrojeller. (A), beş farklı A ve B konsantrasyonları (kısaltma için Tablo 1 'e bakınız) için Örnek Young modülü (B) bir frekans fonksiyonu olarak Depolama ve kayıp modülü reolojisi ile ölçüldüğü haliyle, (C) jeller başlangıçta aynı Young modülüne sahip (ilk) Onlar kurutulmuş ve-sulu yeniden sonra (Re-hidrate) polimer öncüsü konsantrasyonu bağımsız. (Tam şişme bağlı olarak) 1,5 mm yüksekliğinde - reoloji ölçümleri için tüm jeller, 20 mm çapa ve 1 plakalar gibi hazırlanmıştır.
/52643fig3.jpg "/>
PA jelleri üzerinde Şekil 3. Kolajen kaplama. Kollajen kaplama (yeşil) verimli bir şekilde dağıtılır ve PA jeli (kırmızı) hidrojel sertliği Young modülü yüzey bağımsız) üzerine tutulur. Cy5 ile etiketlenmiş kolajen bu veriler için kullanılmıştır. Kırmızı-floresan boncuk yardım görselleştirme PA hidrojel içine gömüldü. Kesit görüntüleri Zustiak et uyarlanan bir konfokal mikroskop (ölçek çubuğu = 100 mikron). Resim alınmıştır. al. 5 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
24 saat PA jeller numaralı seribaşı MDA-MB-231 hücrelerinin Şekil 4. Faz sözleşmesi (üst satır) ve floresan (alt sıra) görüntüler. MDA-MB-231 hücreleri yumuşak jeller yuvarlak kalır (GENÇ 7, s, 0.5, 1 kPa modülü), ancak sert PA jel (100 kPa, Young modülü) üzerinde uzunlamasına. Hücreler etanol içinde sabitlendi ve akridin turuncusu ile boyanmış, 24 saat süre ile jeller üzerinde tohumlandı (AO - yeşil) hücre çekirdeği görselleştirmek için hücre sitoplazmasına ve DAPI (mavi) görselleştirmek için; Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Hücre yayılan alanı ve daireselliği alttaki tabakanın sertliği etkilenir. 0.5 kPa jelleri yerine (a), MDA-MB-231 hücre yayılma alanı belirgin. 100 kPa ile artar, (b) hücre dairesellik PA jel sertliği artması ile azalmaktadır. P <0.05; Yıldız anlamlı farklılıklar tayin.
Şekil 6, esnek plastik desteğin alternatif bir poliakrilamid jel hazırlanması şematik temsili. Şekil esnek plastik destek PA jellerin hazırlanmasında kullanılan çeşitli adımları temsil etmektedir. Burada, esnek plastik destek ilk olarak istenilen şekil ve boyutta olan plastik "lamelleri" içine önceden kesilir. Bu teknik, yumuşak hidrojeller için en iyi çalışır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Kısaltma | Akrilamid% | Bis-akrilamid,% | % 40 stok çözeltisi (mi) ile ilgili Akrilamid | % 2 stok çözeltisinden bis-akrilamid (mi) | Su (mi) | G '± SD (kPa) | SD ± E (kPa) |
| PA1 | 5 | 0.025 | 625 | 62.5 | 4312,5 | 0.62 ± 0.19 | 1.85 ± 0.57 |
| PO2 | 5 | 0.1 | 625 | 250 | 4125 | 3.55 ± 0.12 | 10.64 ± 0.36 |
| PA3 | 8 | 0.1 | 1,000 | 250 | 3750 | 9.71 ± 0.64 | 29.14 ± 1.93 |
| PA4 | 8 | 0.25 | 1,000 | 625 | 3375 | 22.00 ± 2.10 | 66,01 ± 6.31 |
| PA5 | 12 | 0.25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37.42 ± 2.68 | 112.25 ± 8.03 |
Tablo burada G 've E ile temsil edilen akrilamid (A) ve çapraz bağlayıcı bis-akrilamid (B) ve elde edilen PA jel sertliği. Sertlik 1. konsantrasyonları, reoloji ile ölçülmüştür. G '1 Hz frekansta depolama modülü olduğunu. Young modülü, E Denk hesaplandı. 1. Standart sapma (SD) deney başına ölçülen 3-5 örnekleri ile üç bağımsız deneyler dayalı hesaplanmıştır. Tablodaki kısaltmalar Şekil 2A kullanılan kısaltmalar karşılık gelmektedir.
| UV Yoğunluk = 15 mW / cm 2 | Pozlama süresi = 300 saniye | ||
| Zaman (ler) | SD ± E (kPa) | Içindetensit (mW / cm2) | SD ± E (kPa) |
| 75 | 0.14 ± 0.03 | 15 | 28.05 ± 2.62 |
| 100 | 6.98 ± 2.34 | 26 | 21.13 ± 3.01 |
| 125 | 19.11 ± 2.29 | 37 | 20.01 ± 2.38 |
| 300 | 28.05 ± 2.62 | 66 | 19.35 ± 2.86 |
Tablo 2. UV polimerizasyonu alternatif ve jelleşme koşulları optimize edilmiştir PA jel hazırlanması için hızlı bir yöntem de sağlanmıştır; PA3 jel tasvir edilir (1 Tablo bakınız). Tablo (iki sütun sol) maruz kalma süresi veya UV yoğunluğu (sağ iki sütun) ya aynı çözümü için çeşitlidir Elde edilen Young modülü özetlemektedir. Tablodan sonuçlarına dayanarak, bu 300 sn pozlama süresi ve 15 belirirmW / cm2 UV yoğunluğu Tablo 1 'de belirtildiği gibi, geleneksel olarak polimerleştirilmiş jel sertliğine karşılaştırılabilir yüksek PA jel sertliği verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başlangıçta elektroforez için geliştirilen Poliakrilamid jeller, 28 şimdi rutin hücre morfolojisi, hareketliliği ve diğer hücre özellikleri arasındaki iletişimi 3,24,29 tarihinde substrat sertlik etkilerini incelemek için hücre kültürü substrat olarak kullanılır. (Şekil 2, Tablo 1 'de referans 17,25,26 bakınız) polimer ön-madde konsantrasyonu basit bir değişiklikle - (300 kPa 0.3) 1 Poliakrilamid alt-tabaka sertliğinin manipülasyon vücuttaki tüm yumuşak dokular sertliğini kapsayacak sağlar. PA jeller oldukça ucuz ve hazırlamak için basit olduğu için birleştiğinde, bu sertlik bağımlı hücre malzeme etkileşimleri çalışmada vazgeçilmez bir platformdur haline gelmiştir. Hatta basit olsa da, ancak, PA jellerin hazırlanması için olan mevcut teknik, küçük gruplar ile sınırlıdır. Bu sınırlamalar, amonyum persülfat ile katalize edilen bir serbest radikal polimerizasyon olduğu hidrojel jelleşme doğası kaynaklanıyorReaksiyon, bir serbest radikal zincir polimerizasyonu olduğu ve TEMED. 30, bu oksijen gibi, bir serbest kök tutucu olarak görev görür bir eleman tarafından inhibe edilebilir. Yumuşak jeller için 45 dakika kadar sürebilir - - polimer çözeltisi içine oksijen difüzyon polimerizasyon sırasında kaçınılması gereken beri nedenle, sadece açık bir multiwell plaka içine Pensilvanya jelleri pipetle mümkün değildir. Ayrıca, iki-boyutlu (2B) hücre alt-tabaka olarak kullanılmak üzere, Pensilvanya jel yüzeyinin düz olması gerekir. Oksijen difüzyon inhibe ve jel yüzeyi düzleştirmek için - Yukarıdaki gereksinimleri ikisi de bu 2B hücre yüzeyler, Pensilvanya jel habercisi çözüm polimerizasyon sırasında iki düz yüzeyler arasında sıkışmış olması gerektiği gibi Pensilvanya jeller üretmek için dikte. Buna ek olarak, üst yüzeyi kolayca hücre bağlanması için yüzey açığa jel sıyrılacak şekilde olması gerekir. Bu tipik olarak, bir cam yüzeyinin hidrofobik bir kaplama ile elde edilir. Son olarak, inci içine yerleştirildiğindeBir multiwell plaka e kuyuları, Pensilvanya jeller tüm yüzeye iyi kapsamalı ve yüzen kısıtlanabilir. Hücrelerin değerlendirilmesi için kullanılan deneyler, oyuk (örneğin, MTT) dikkate bütün hücre popülasyonu alır türü olduğu tam de alt yüzey kaplama uygulamalarında özellikle önemlidir. PA jel yeterince bütün iyi yüzeyini kaplayan değilse, bakım hücreleri kolayca cam veya plastik üzerine jel roll olarak maruz sıra yüzeye hücre yapışmasını engellemek için alınmalıdır. Gerekirse, BSA bloke standart protokoller izlenerek, ya da off-raf BSA göre hücre yapışma engelleme kitler alanda iyi plakasının tabanına kadar hücre eki engellemek için yeterli olmalıdır kullanılmıştır. Örneğin, bir BSA kaplı yüzeyin hazırlanması için 0.5 mg / PBS içinde BSA ml solüsyon, pH 7.4 PBS ile durulanmıştır, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca doku kültürü çanağı üzerine adsorbe edildi ve hemen kullanılabilir veya 4 ° C de muhafaza edilmelidir 2 haftaya kadar. BSA hücre yapışma o bloke ettiği gösterilmiştirbüyük ölçüde azaltır hücre yapışma güçlerinin hem hidrofilik hem de hidrofobik köpüğü yüzeyleri f memeli hücre kültürleri, atomik kuvvet mikroskopisi ile ölçüldüğü gibidir. 31, BSA gibi, hücre desenli yüzeyler oluşturmak gibi memeli hücre yapışmasını engellemek için rutin olarak kullanılmıştır. 32,33
Bu makalede tasvir tekniği, tatmin özel boyut ve şekil üniforma PA jellerinin seri üretime izin Yukarıdaki tüm gereksinimleri. tekniği, iki cam lamelleri arasında PA jel öncüsü çözüm sandviç mevcut standart daha basit ve daha verimlidir. Ayrıca, herhangi bir karmaşık donanım gerektirmez ve böylece kolayca herhangi bir araştırma laboratuarı tarafından uyarlanamıyor olduğunu. Sadece pahalı değil cam plakalar veya cam lamelleri, kullanımını zorunlu değil, aynı zamanda sınırlı boyutlarda gelmez olarak da daha düşük maliyetli olduğunu. Teknik, birkaç nedenden dolayı da daha hızlıdır. İlk olarak, herhangi bir ön-işlem aşamaları anlamına gelmezkalıcı poliakrilamidin ve kolayca jel oluşumundan sonra sıyrılır edilebilir bir hidrofobik yan verdiği bir hidrofil tarafı - esnek plastik destek iki ayrı yüzeyler ile tasarlanmıştır beri cam yüzeyler için tipik. İnce jeller soyulması, iki cam slaytlar arasında oluşan zaman üst hidrofobik slayt zordur ve genellikle de jel ödün kırılma sonuçlanır: plastik destek esnek olduğundan İkincisi, daha kolay ve oluşan jel kalkmasına daha hızlıdır. 45 dakika (Tablo 2) kadar sürebilir standart TEMED tabanlı polimerizasyona karşı Son olarak, çünkü esnek bir plastik destek şeffaflık, daha hızlı, UV polimerizasyonu kullanılabilir. Tablo 2'deki veriler, polimerizasyon süresi ve UV ışık yoğunluğu optimize edilmiştir içindeki katılıkların TEMED ve UV polimerizasyonu için yöntemler ile elde edilebileceğini göstermektedir.
hidrojeller esnek pl hazırlanırdolayı polimer çözeltisinin sandviç iki yüzey arasında oksijen difüzyon jel kenarları (yani, kenar etkileri) eksik polimerizasyonun engellenmesi için bir gazdan arındırma odası içinde jelleşme yapılması tavsiye edilmektedir Şekil 1 üzerinde gösterildiği gibi. astic desteği. amaç, böylece, herhangi bir boyutta bir cam levha, uygun olacaktır, esnek plastik bir destek üstünde büyük bir hidrojel film meydana getirmek üzere, ancak elde edilebilir poliakrilamid filmin boyutunu belirleyecektir. Cam bir hidrofobik kaplama ya da seçenek olarak, esnek plastik destek hidrofobik yan yerine kullanılabilir ile kaplanabilir. PA jel ince tabaka oluşturulduktan sonra, bu ile yıkandı, kurutuldu arzu edilen şekillerde kesilir ve daha sonra kullanım öncesi yeniden hidratlanır. Ne zaman kuru, jeller süresiz muhafaza edilebilir. Bu PA jel sertliği jeller birkaç ay (Şekil 2C) için kuru halde saklanır da rehidrasyon sonra da değişmedi olduğu, reoloji ile teyit edilmiştir. Bununla birlikte, çok soft jelleri (≤ 1 kPa Young modülü olarak) kurutulması ve yeniden hidrasyon kötüleştirici yüzey kırma ve çatlak oluşumuna. Bu davranış, geometrik kısıtlı olurken de-nemlendirme ve sonraki yeniden nemlendirme tabi yumuşak jeller için yaygındır. Ya da bu nedenle, görsel kullanımdan önce hidrojeller incelemek mümkündür, 34,35 Tüm jeller kırışık çatlak ve sadece örnekleri kullanın bu düzgün bir yüzey gösterir. Tamamen kat oluşumu ve çatlama, Şekil 6 üzerinde gösterilen yumuşak hidrojeller hazırlamak için alternatif bir yöntem önlemek için. Burada, esnek plastik destek arzu edilen şekilde önceden kesilmiş olan ve PA jel üstünde oluşturulur, böylece, jel yok de-hidratlanabilir ancak hazırlanan kullanılabilir gerekir. Bu alternatif stratejinin bir yararı ~ 2.5 daha fazla jeller hidrojel ön-madde çözeltisi (tahmin protokol bölümünde tarif edildiği gibi, standart bir 96-delikli plaka için jellerin hazırlanması dayalıdır), aynı hacimde üretilebilir olmasıdır. Bir uyarı zamanBu şekilde, hidrojel hazırlanması, özellikle küçük boyutu (örneğin, jel, 96 oyuklu bir plaka içerisinde kullanılmak üzere) arasında jeller, oksijen girmesini önlemek için dikkat etmektir. Jel öncü çözeltisi tamamen gazı alınmış olsa bile, örneğin, oksijen içermeyen oksijen PA çözeltisi sandviç iki yüzey arasında difüzyon edilecektir. Bu durumda, kenar etkileriyle veya kenarları boyunca eksik jel oluşumunu önlemek için, polimerizasyon, oksijen yokluğunda meydana sağlamak için uygundur. Bizim tecrübelerimize göre, bir vakum odası inert gaz ortamı eşit başarı ile kullanılabilir olsa bile, iyi çalışıyor.
Hücre alt-tabakalar sertlik bağımlı hücre yanıtları test etmek PA hidrojellerinin hazırlanması, elde edilen hidrojel kalınlığı önemli olduğu zaman bir son uyarı: çok ince jeller için, hücreler, alt katmana anlamda mümkün teori ve deney kullanılarak 36. Lin ve ark. gösterdi ki derinliği hangi hücrelerin fe can atEl altta yatan substrat hücre yan boyutuna bağlıdır. 29 güncel araştırma birkaç mikron 36 60 kadar mikron olmak "gizli" alt tabaka algılama hücreleri önlemek için gerekli minimum kalınlığı belirleme, çelişkili olduğundan, 100 mikron 37 minimum jel kalınlığı olması hedeflenmelidir.
Çok oyuklu bir plaka içerisine PA jeller monte edilirken, PDMS küçük bir damla Kuyunun dibine jel sabitlemek için kullanılır. Plaka montaj için yeterli zaman bırakarak 8 saat - o sertleşme üzerine kalıcı tutkal davranır çünkü PDMS tamamen sigara sitotoksik olduğunu ve yaklaşık 4 kürleri, tamamen şeffaf ve daha sonraki mikroskopi deneyleri ile karışmaz, seçildi. Güvenle hücre işleme iyi yardımların altına hidrojeller güvence: sıkıca güvenli değilse, örneğin, yoğun yıkama hidrojeller çıkarmak olabilir. Eğer hücre m sık değişiklikedia sonra jeller geçici gliserin gibi bir sitotoksik olmayan ve yüksek viskoziteli sıvının küçük bir damlacık tarafından iyi yüzeyine tespit edilebilir bir sorun değildir.
Hücre tohumlama öncesi son adım jel ve sonra sterilizasyon ECM kaplama içerir. Burada Kolajen Tip I kaplama aynı teknik başka bir ECM proteini için uygulanabilir olsa bile (Şekil 3) tasvir edilmiştir. iki fonksiyonlu çapraz bağlayıcı sülfo-SANPAH daha tek tabakalı kat elde etmek için kullanılır. Önceki araştırmalar, kovalent bağı basit bir protein adsorpsiyonu daha düzgün bir kaplama elde edilir ve aynı zamanda basit bir konsantrasyonunun değiştirilmesi bir protein çözeltisi ile bağlı protein miktarının 12 kat ayarlanmasına olanak verir olduğunu göstermiştir. 6 Son olarak, monte edilmiş çok-yuvalı jel plakası 2 saat kadar doku kültürü kaputu UV altında sterilize edilir. Tahlil kaput dışında bir laboratuar tezgah üzerine monte edilecek UV sterilizasyon sağlayanGenel hızlı işlem lojistik basit ve yapar.
Şekil 4 ve 5 sertliğini değiştirmek esnek plastik destek bağlı PA jelleri üzerinde kültürlenmiştir, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücrelerinin bazı temsili sonuçlar genel olarak göstermektedir. Onların morfolojisindeki değişikliklerle ölçülebilir altta yatan tabaka sertliği tepki gösterilmiştir için, MDA-MB-231 hücreleri bir yöntem programı göstermek için seçilmiştir. 5,12, beklendiği gibi, hücreler, daha uzatılmış ve daha büyük bir yayılma alanı vardı Yumuşak 0.5 ve 1 kPa PA jellere oranla sert 100 kPa PA jelleri (Şekiller 4 ve 5). Şekil 4 alt sıra aynı zamanda esnek plastik destek floresan mikroskop görüntüleme engel değildir gerçeğini vitrine, hücre çekirdeği ve hücre sitoplazma leke iki floresan boyaların kullanımını gösterir.
Özet olarak, basit bir yöntem poliakrilamid hidrojeller hazırlamakmultiwell plaka biçimi sunulmuştur. teknik boyutları, aksi mevcut değil aynı zamanda özel jellerinin hazırlanmasına imkan veren hücre alt-tabakalar olarak kullanılmak üzere, daha hızlı, daha verimli ve PA jellerin hazırlanması için olan mevcut yöntemlerden daha az maliyetlidir. Herhangi bir özel ekipman gerektirmez gibi, yöntem kolayca herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kabul edilebilir ve sertlik-bağımlı hücre yanıtlarını anlamak odaklanmış araştırma özellikle yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
- Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
