Abstract
ショウジョウバエを用いて、交配実験は性的選択と行動の理解に大きく貢献してきた。実験は、多くの場合、裁判での個人間で区別するために、シンプル、簡単で安価な方法を必要とする。このための標準的な手法は、それぞれのフライをクリップするCO 2麻酔した後、ラベル付けまたは翼です。しかし、これは侵襲的であり、動作に影響を与えることが示されている。他の技術は、ハエを同定するために着色を使用している。この記事では、食品着色料を使用して、それらを個別の実験内で識別することを可能にする標識のショウジョウバエのためのシンプルかつ非侵襲的な方法を提示します。この方法は、2つの男性は女性と嵌合する競合試験で使用されている。染色は、迅速かつ容易に同定を可能にした。試験した3つの種を超え着色の強さのいくつかの違いが、しかし、ありました。データは、染料を示す提示されているショウジョウバエのメラノ中のCO 2よりも交尾行動に低い影響を与えているガスター。 CO 2麻酔の影響がDで、 ショウジョウバエの種に依存することが示されているpseudoobscuraとD. subobscura、D.のに対しては影響を示さないキイロ男性は交尾の成功を減少させた。提示色素法は、実験計画の広い範囲に適用可能である。
Introduction
過去数十年にわたり進化1,2上の男性への影響との間にどのように性的選択と競争の中で関心が高まっている。配偶行動に関する実験性選択3,4の理論を開発およびテストに重要な役割を果たしてきた。特に、属ショウジョウバエの種を用いた研究は、性的選択と行動の理解に大きく貢献しています。しかし、一般的に使用される技術は、標準的な交配実験5,6の結果を人工的にバイアスをかける可能性があるかどうかを調べることが重要である。
麻酔は、多くの場合、実験7における取扱いと識別のために使用されている。例えば、ハエは、一般的に交配前に収集され、又は二酸化炭素（CO 2）麻酔を用いて遺伝子型または実験的治療に分類。二つ以上の個体を区別する必要の実験では、フルオロをanaesthetiseするのが一般的である新設翼オフのクリップ部分は、個々のまたは治療グループ5,8を識別する。しかし、CO 2治療は行動にどのような影響を与えるかを理解すること、が重要である。 CO 2に暴露され、男性れるキイロショウジョウバエで検討されているCO 2麻酔の効果がかみ合うようにかなり時間がかかったし、全体的な非麻酔し、男性または男性より低い交尾成功を持っていた冷5への露出を使用して麻酔。麻酔を、実験の日に適用したときのハエが回復する一日投与したとき、この効果は、両方の観察された。しかし、この研究は、独身男性は、各女性5に提示されただけ調べる試験で制限されていました。女性による麻酔の男性のフィットネスのより微妙な損失の検出を可能にするかもしれない男性、間の競争を可能にする複数の男性9,10に遭遇するのがより現実的なシナリオがある。 CO 2麻酔の使用もなけれいる大人D.の繁殖力と長寿を減少させることがわかっEN収集処女が11を飛ぶとき一般的であるように彼らは、間もなく羽化後に露出されているキイロ 。
2麻酔をCOへの代替は、彼らに染料4,6,10,12,13で着色食品を供給することによりハエをマークすることです。この色素は、ハエの腸に入り、腹部を通して見ることができる、着色されたハエは、ハエから無色、または異なる色で標識されたハエから区別することを可能にする。方法は、これを適用することができる方法が異なります：染め補足酵母ペースト6を介して、または新規染め食品基板13への曝露を経由して、食品12に直接添加されている。これらのマーキング技術は、嵌合性能4,6には影響を示さないように見える。しかし、紙に直接大人Dに同じ食品着色料の影響を調べるキイロは寿命14の強い削減を発見した。以前の研究はまた、ALM焦点を当ててきたD.に完全に韓国ドラマOST キイロ、両方のCO 2麻酔5,11及び食品着色料14メソッドの影響に関して。現在、CO 2麻酔または腸の着色の使用は他のショウジョウバエの交尾行動にどのように影響するかに関する情報はほとんどない。
以下の研究では、 ショウジョウバエの3種（キイロショウジョウバエ、D.のpseudoobscura、およびD.のsubobscura）の交尾行動上のCO 2麻酔の効果を評価する。 CO 2にハエを集める効果が単一の二雄型試験の両方で調べた。 CO 2の効果は、Dで変化することが見出されているCO 2への暴露との嵌合の間キイロ 5ので、異なる待ち時間期間を試験した。麻酔翼クリッピングマーキング方法の代替は：ハエを染色するための食用色素を使用することも評価される。
Protocol
食品着色料とフライ食品の調製
- 底部にある食品の約20ミリリットル（ 図1）を標準ショウジョウバエバイアルを取る。沸騰水1リットル使用して、食品ミックス以下の配合を使用します寒天10gのデキストロース、85gのトウモロコシ粉60gを、酵母を40gと、とろとろの5分間撹拌した。混合物を75℃に冷却した後、10％nipagenの25ミリリットルを追加します。
- 食品を冷却し、2滴加える固化した後-食品の最上部に青い食品着色料の（約0.5〜1 ml）を、バイアルの表面全体に広がった（ 図1）。好ましければ、異なる色の染料を使用してください。
- 染料が食品の最上層で吸収されるように、冷蔵庫に2日間食べ物を残し。これは、成熟期間中にハエを損傷し、過度の湿気を避けることができます。その後、その後、過剰な水分がまだ余分な水分を吸い取るための問題である場合にティッシュペーパーの小片を追加し、それを削除します。
- 転送は、個別またはグループで食品上に飛ぶ。
注：ハエが食べ物に置かれるの1日以内に腸の染色を得ることができます。また、完全に実験前（食用色素への暴露からは観測されなかった成熟期間中の死亡率の増加）に染め食べ物にハエ成熟。 - 染めハエが非染めハエと容易に区別することができることを確認してください。染料の濃度が高い、または異なる色素のいずれかを使用して1.4 - 彼らは区別することができない場合は、繰り返しが1.1を繰り返します。
食品ぬりえを使用して2つの男と交尾トライアル
- 子孫を製造するために、女性と男性のハエのペアを含む複数のバイアルを（幼虫の混雑を避けるために世話をするが、雄と雌の小グループが、また適している）を設定。 7日 - メスは卵を産むと、すべての5つの新しいバイアルにハエを移動できるようにします。対象の種に適した温度（22℃Fで保存バイアルまたはD. pseudoobscuraとD. Dのsubobscuraと25°C キイロ ）。
- 25°C、Dのpseudoobscuraで6時間- -実験的なハエを収集する前に、彼らは処女（ キイロショウジョウバエになり確実にするために、男性と女性を収集する前に設定した時間に収集バイアルからすべてのハエを取り除く、22℃で18時間とD.のsubobscura - 22℃で24時間）。
注：ハエが処女でない場合は、この意志バイアス交配試験15で彼らの行動。- ストアと個別に標準75×20ミリメートルのプラスチックバイアル中の成熟した男性（食品の〜20ミリリットルを含む）。これは、男性は、グループ16内に保持されている場合、いくつかの種で見られる男性の配偶行動とフィットネスにマイナスの影響を避けることができます。
- 所望の処置（この場合はCO 2麻酔）への男性の半分を公開します。 CO 2マットを使用するか、必要な時間のためにハエを露出するようにタップします。 MALの店舗の半分色の食品の各治療におけるES交配が行われるまで。これは交配試験中に、それらを視覚的に区別できるようになります。
- 転送するためのハエはアスピレータ17を使用しています。治療と男性の色の状態の両方を識別するために、各バイアルにラベルを付けます。ここでは、4つの処理を使用（麻酔を、無着色= G-NC、麻酔、色= GC、無麻酔、無着色、NG-NC、無麻酔、着色された、NG-C）。
- 10のグループとして成熟する生鮮食品バイアル中に新たに登場し、女性を転送します。
- 3日間、D.のpseudoobscura - - 5日、D.のsubobscura -ハエが交配年齢（ キイロショウジョウバエに成熟することを許可する。7日18ショップが検討されて種に適した温度D（例えば、22℃で飛ぶ。pseudoobscuraおよびD.のsubobscuraおよびキイロショウジョウバエのために25°C）。
- CONT（個々のバイアルにメスを移動交配バイアルに順化のための交配裁判の前に1日）食品の〜20ミリリットルをaining。バイアルを区別することができるように、これらのバイアルにラベルを付けます。ニュートラルラベリング（ すなわち 、1から150）を使用して実験を盲目にするように注意してくださいので、それはすべてのバイアル中にハエの身元を推測することはできません。
注：各バイアルにハエを置き人は、彼らが染色された治療法に注意するよう、各バイアルに入れハエの正体を知っている必要があります。しかし、交配時計観察者が自分の身元を知っているべきではありません。これを行うには、少なくとも2の実験者は1つがセットアップすると1が観察するために、必要とされるであろう。 - 10との間で交配試験を開始 - 午前12時、または光はハエが（ハエのための「夜明け」）にさらされている明/暗サイクルに乗って来ると一致している時。吸引器を使用して（シングル女性のフライを含む）を各交配バイアルに2つの雄ハエを追加します。 2人の男性が異なる処置（麻酔またはからのものであることを確認してくださいコントロール）と、その一方が互いに区別することを可能にし、雄が染色されている注意すべき腸の染色を有する。
- （ - 色の着色または非いずれか）交尾が発生した場合、仲間は男性の状態を記録。 2時間の最後の試験は、想定した場合、女性は交尾しません。
注：2時間は、これらの種に適しているが、他のショウジョウバエは、多かれ少なかれ時間を必要とするかもしれない。
3.独身男性の交尾トライアル
- 独身男性試験のため、2回交換してプロトコル2を繰り返します。
- ステップ2.3に着色食品に男性を保持しません。
- ステップ2.7では、各バイアルにのみ独身男性を追加します。
- ステップ2.8において、嵌合開始し、交配が終了時刻が記録されるべき、時間ハエがバイアルに添加された時間を記録する。これらの値から、交尾成功、遅延、および期間を計算。
4.データ解析
- ANAのための適切な統計パッケージを使用して、溶解。データが正常であり、唯一の2つの処理がある場合は、t検定または同等の一般化線形モデル（GLM）を使用します。 2つの雄の実験のために、すべての基本的な統計パッケージで提供され二項の試験または二項GLMを使用しています。
注：サンプル·データでは、すべての分析は、Rバージョン3.0.3 19で行った。 - 各治療20の待機時間と期間の頻度ヒストグラムをプロットし、そのようなシャピロ·ウィルクとして正規性のためのテストを使用することによって、正常のための交配の待ち時間と相手デュレーションデータを確認してください。それが正常でない場合は、それを変換し、または非パラメトリック同等の統計20を使用する。
注：たとえば、独身男性の実験からのデータは変換が正常と等分散の要件を満たしてログインします。 - データを標準化することができる場合、2つの治療法21を使用する場合、使用t検定は、単一の雄型試験における交配の遅延および持続時間の違いを調べた。複数の治療が使用される場合、分散分析（ANOVA）20を試してみてください。データを正規化することができない場合は、同等のノンパラメトリック検定21を試してみてください。
- 食品着色料や競合する男性20の嵌合成功時にCO 2麻酔のどちらかの効果をテストするための二項のテストを使用してください。データ例の場合のように、複数の治療法が、使用される場合、二項誤差構造21とGLMを使用する。
- 例データ内の2つの男性の臨床試験では、二項誤差構造を持つGLMSを使用しています。一GLMは応答変数（0 =脱気し、脱気しないようにCO 2を調べた説明variables.One GLM装備応答変数（着色= 0と非着色= 1）種と、気体の状態、およびガス処理として色を調べ= 1）種、色の状態、およびガス処理嵌め込まれている。それぞれのケースで、最大のモデルを作成し、AIC 20に基づいてモデルの簡略化を行う。
Representative Results
2つの雄交配試験-交尾行動にCO 2麻酔の効果
CO 2麻酔の効果の変化を説明するために発見された最良のモデルは、因子として（D.のpseudoobscuraおよびD.のsubobscura、お互いの間に差は認められなかったとして融合して）種を含有していた。 D.でpseudoobscuraとD. subobscura 2男性の臨床試験（Z 1589 = 0.087、P = 0.931）で交尾成功時にCO 2麻酔の有意な影響は認められなかった。 Dのキイロ 、2麻酔をCOにさらさ男性はかなり低い交尾成功（Z1,589 = 2.467、P = 0.014）であった。 D.見られる大きな効果を有する種と治療の間に有意な相互作用（χ2 1589 = 6.83、P = 0.009）もありましたキイロを試験した（ 表1）の前に収集または1日でガスに曝露した。 Howevえー、D.キイロ男性は実験的な裁判は、CO 2の効果を示さなかった二日前にCO 2に曝露した。
2つの雄交配試験 - 交尾行動に腸の着色の影響
モデルの単純化は、3種（P> 0.1）のいずれかのために見出される食品着色料の有意な効果を示さなかった。治療または気体の状態が分析に含めたときに、これらはまた、（P> 0.1）、有意ではなかった。治療全体で着色ハエ成功交配の割合を表2に示す。ハエとの間の着色の差が着色及び非着色食品に保管図1に見ることができる。腸の食品着色料の強度はDに大きかったpseudoobscuraとD. D.よりもsubobscuraキイロ 。
シングル交配試験- M上のCO 2麻酔を使用する効果ating挙動
CO 2麻酔が最近大人出現収集するために使用された3種のいずれかのための交配の待ち時間に差はなかった。効果は、Dに交配期間に発見されたそれは二日間の試験（;表2、図2および図3）を交配前にCO 2に暴露したsubobscura。
図1.着色および非着色フライ食品（A）のバイアルを示す写真やマレDの腸着色の強さSubobscura（B）。
男性は麻酔したときは、独身男性試験で研究3種のために交尾レイテンシ図2.平均および95％信頼区間D（ライトバー）か否麻酔し（暗いバー）性成熟前に処女として収集するとき。
性成熟前に処女として収集するとき（暗いバー）男性は麻酔独身男性試験、（ライトバー）で調べたりしない麻酔し3種のための交尾継続時間の平均値と95％信頼区間3.図。
| 治療 | 種 | いいえトライアル | いいえハエは交尾その色 | p値 | いいえハエは交尾そのガス処刑 | p値 |
| CO 2でのコレクション | D.メル | 73 | 36 | 1 | 27 | 0.0344 |
| D.のPSE | 79 | 41 | 0.8221 | 44 | 0.3682 | |
| D.サブ | 71 | 40 | 0.3425 | 33 | 0.6353 | |
| 前2 18時間のCOにさらさ | D.メル | 57 | 28 | 1 | 19 | 0.0163 |
| D.のPSE | 65 | 32 | 1 | 31 | 0.8043 | |
| D.サブ | 68 | 38 | 0.3961 | 35 | 0.9036 | |
| 2 2日のCOにさらさ。 | D.メル | 56 | 19 | 0.0222 | 32 | 0.3497 |
| D.のPSE | 70 | 32 | 0.5504 | 33 | 0.7202 | |
| D.サブ | 56 | 29 | 0.8939 | 26 | 0.6889 </ TD> |
表試験したすべての種と治療アクロス2つの雄の選択実験から。結果。
| 種 | トレイト | DF | t値 | p値 |
| キイロショウジョウバエ | 待ち時間 | 58 | 1.379 | 0.174 |
| デュレーション | 58 | 1.243 | 0.221 | |
| D. pseudoobscura | 待ち時間 | 109 | 0.419 | 0.676 |
| デュレーション | 109 | 0.436 | 0.664 | |
| D. subobscura | 待ち時間 | 83 | 0.098 | 0.922 |
| デュレーション | 83 | 1.767 | 0.081 |
表交尾レイテンシと継続時間にCO 2麻酔にコレクションの影響を調べるシングル交配実験から2.結果。テストは、 ショウジョウバエ （ キイロショウジョウバエ、D.のpseudoobscuraとのD. subobscura）の3種について行った。
Discussion
このデータは、CO 2麻酔の影響はほとんど影響を示す2 3の種で、種間で矛盾していることを示しています。我々の結果は食用色素で標識がDのCO 2麻酔よりも男性の交尾成功に低い影響を与えた示唆キイロ 。これらの実験は、食用色素、容易かつ安価に複数の男性を含む交配アッセイのためのハエを標識するために使用できることを示している。
3モデルショウジョウバエ種のみD.、検討キイロは競争力のある状況で、相手のパフォーマンスにCO 2麻酔の効果を示した。対照的に、種はいずれもDの前の結果に反して、嵌合待ち時間の観点から単一の交配試験においてガスで収集の効果を示さなかったキイロ 5。競争の影響は、そのためだけに検出可能であるCO 2麻酔のより微妙なフィットネス効果を、強調表示することができたオス - オスの競争があるような状況の下で。初期の収集と1日で暴露すると、裁判の前にDの男性の能力に悪影響を与える交配を得るためにキイロ 。二日前に裁判への暴露は、しかし、何の効果も示さなかった。 D.両pseudoobscuraとD. subobscuraは試験のいずれかのガスへの暴露の影響を示さなかった。一つの説明は、ということですD.男性は処女であることを確認するために- （旧6時間0）他の種よりも、以前の生活の中で収集する必要があるため、 キイロは、CO 2への早期の暴露に対して脆弱だった。したがって、男性のD.ハエのキューティクルがまだ硬化させる彼らのキューティクルのために長く持っていた他の種に比べて、硬化されるように、この時代のキイロはより敏感である。一般に、これはCO 2麻酔の効果が特定の種と適切に彼らの標的種で効果をテストする必要があり研究者であるという考えをサポートしています。 Currentlyは、CO 2麻酔の効果に関する研究の大部分は、 キイロショウジョウバエ 5,11,22に行われているので、他の関連種に適用することが適切でないかもしれない。
ハエを区別するために提示する代替の非侵襲的な方法は、食用色素である。結果は、この処理は全ての種を調査にわたってでは効果がなかった示唆する。しかし、その使用は、個体間で区別するために容易に安価な可視マーカーを提供することに成功したものの、それは染料Dに区別することが容易であったことに留意すべきであるpseudoobscuraとD. D.よりもsubobscuraキイロ。以前の著者は、4,6（赤、緑、青）複数の色を使用している。私たちは、特にD.、青い着色はすべての種で区別するのが最も簡単であることが判明pseudoobscuraとD. subobscura。潜在的に多くの個別にマークさflieとのより複雑な実験を可能にするいくつかの色を使用して、S。いくつかの食用色素を消費するとき、おそらく消化される、ハエを着色することができないようにしかし、異なる色素の予備試験は、必要不可欠である。他の色素）は、毒性作用を持つハエの生存を減少させ、14を避けるべきであることができる。より高価な汚れを使用する代替食品着色方法はまた、Dの腸の完全性を検査するために使用されているキイロ23。これらは、より高価な、染色方法23が、代替手段を提供することができる。
色素法は、ハエのようにクリッピングCO 2翼コレクションから染め食品上に格納することができる限り迅速である。食品の取り込みは（〜3時間）急速だったので、他の研究6で使用した色の食品上のストレージO / Nも、ハエをマークするのに十分であろう。 （ - 12日10）24翼クリッピング（永続的）または蛍光塵埃マーキングに比べ- （5時間〜4）が、着色の持続時間が比較的短い。 ショウジョウバエ種とし て異なる染料が多かれ少なかれ効果的な異なる種のためになる、外観が異なり、一部の株（ 例えば 、ノックアウト突然変異体）は食生活の変化に弱いことができますように、染料のいずれかの使用は、特に長い場合は、その有効性の予備試験を必要とする色素に長期暴露は14毒性であり得る。カローらの研究とは対照的に。14、我々はDの色の食品上に複数日間保存後は有意な死亡は認められなかったキイロ （3日間）、D. pseudoobscura（5日間）、またはD.使用する染料の差によるおそらくsubobscura（7日間）。
染料技術の使用の成功のための重要なステップは、選択された染料が使用されている種と株にうまく動作することを検証し、ステップ1.5である。代替技術は、フィールド実験24で使用する前にハエの外側に着色されたほこりを適用することを含む。この方法は、フィールドによりトンで個人を追跡するために使用されているOマーキングの期間とマーキング質量の容易さは24飛ぶ。我々は、明示的に交配試験では、この方法をテストしていませんが、それは、ほこりが特にショウジョウバエ 25、26に、交配における重要な感覚で持つことができる。種では、腸の染色が可能ではないが、どこにどんな影響を調べることが重要であろうこれらの方法は適切である可能性がある。
結論として、我々は、試験した3種（D.のpseudoobscuraとのD. subobscura）の2つの中のCO 2麻酔またはオスの交尾能力に食品着色料のいずれかで見ても効果がなかったことがわかった。 DのCO 2麻酔の負の影響キイロ検出されたが、食品着色料は、この種の成功を交配に影響しなかった。全体として、色素法は、同等またはCO 2麻酔を必要とする方法よりも優れている個々のショウジョウバエを識別するための簡単で安価な非侵襲的方法を提供する。それこの方法は、種の範囲にわたって動作します可能性があります。
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。
Acknowledgments
私たちは、交配試験に彼らの助けのためにアレックスHitchenとメグブースに感謝したいと思います。この作品は、TPにH015604 / 1 / NERCグラントNEによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
| Fine mesh | Any haberdashery | - | Fine curtain mesh is suitable |
| 1 ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
| Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
| Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
| Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | - | Other dye colours and brands can have variable results. |
| CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
| Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
| Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |
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