Abstract
Parring eksperimenter med Drosophila har i høj grad bidraget til forståelsen af seksuel udvælgelse og adfærd. Eksperimenter ofte nødvendigt med enkle, nemme og billige metoder til at skelne mellem individer i en retssag. En standard teknik til dette er CO 2 anæstesi og derefter mærkning eller fløj klipning hver flue. Dette er imidlertid invasiv, og har vist sig at påvirke adfærd. Andre teknikker har brugt farvning til identifikation fluer. Denne artikel præsenterer en enkel og ikke-invasiv metode til mærkning Drosophila der tillader dem at være individuelt identificeret inden eksperimenter, ved hjælp af frugtfarve. Denne metode anvendes i forsøg, hvor to mænd konkurrerer om at parre sig med en kvinde. Farvning muliggjorde en hurtig og nem identifikation. Der var imidlertid en vis forskel i styrken af farvningen på tværs af de tre testede arter. Dataene præsenteres viser farvestoffet har en lavere effekt på parringsadfærd end CO 2 i Drosophila MelanoGaster. Virkningen af CO 2 anæstesi er vist at afhænge af arten af Drosophila, med D. pseudoobscura og D. subobscura viser ingen effekt, mens D. melanogaster hanner havde reduceret parring succes. Farvestoffet, der præsenteres er anvendelig til en bred vifte af eksperimentelle design.
Introduction
I de seneste årtier har der været stigende interesse for, hvordan seksuel udvælgelse og konkurrencen mellem mænd indvirkning på evolution 1,2. Forsøg med parringsadfærd har spillet en vigtig rolle i at udvikle og afprøve teorier om seksuel selektion 3,4. Især forskning med arter af slægten Drosophila, har i høj grad bidraget til forståelsen af seksuel udvælgelse og adfærd. Det er imidlertid vigtigt at undersøge, om almindeligt anvendte teknikker kan kunstigt forspænde resultaterne af standard samvirkende eksperimenter 5,6.
Anæstesi bruges ofte til håndtering og identifikation i forsøg 7. For eksempel er fluer almindeligvis indsamles før parring, eller sorteret i genotyper eller eksperimentelle behandlinger ved hjælp af kuldioxid (CO 2) bedøvelsesmiddel. I forsøg, hvor to eller flere personer skal skelnes, er det almindelig praksis at bedøve den flerne og klip en del af vingen ud på at identificere den enkelte eller behandlingsgruppe 5,8. Det er vigtigt imidlertid at forstå, hvordan CO 2-behandling vil påvirke adfærd. Effekten af CO 2 bedøvelsen er blevet undersøgt i Drosophila melanogaster, hvor hanner udsat for CO 2 tog betydeligt længere tid at parre sig og samlet havde lavere parring succes end ikke-bedøvet hanner eller hanner bedøvet ved hjælp af udsættelse for kulde 5. Denne virkning blev observeret, både når anæstesi blev anvendt på dagen for eksperimentet og når fluer fik en dag til at komme sig. Men denne undersøgelse var begrænset i kun undersøge forsøg, hvor en enkelt mand blev præsenteret for hver hun 5. Et mere realistisk scenarie er for en kvinde at støde flere hanner 9,10, så konkurrencen mellem mænd, der kunne give påvisning af mere subtile tab mandlige fitness på grund af anæstesi. Anvendelsen af CO 2 bedøvelsen er ogsåDA sig at reducere frugtbarhed og levetiden af voksne D. melanogaster, når de udsættes kort efter eclosion, som det er almindeligt i forbindelse med indsamling jomfru flyver 11.
Et alternativ til CO 2 bedøvelse er at markere fluer ved at fodre dem mad farvet med farvestof 4,6,10,12,13. Dette farvestof træder tarmene af fluen og er synlig gennem maven, så farvede fluer kan skelnes fra ufarvede fluer, eller fra fluer mærket med en anden farve. Metoder afviger i, hvordan dette kan anvendes: tilsættes direkte til fødevarer 12, via farvet supplerende gær pasta 6 eller via udsættelse for en ny farvet fødevarer substrat 13. Disse mærkning teknikker synes at vise nogen effekt på parring ydeevne 4,6. Men et papir direkte at undersøge virkningerne af den samme frugtfarve på voksen D. melanogaster fundet en kraftig reduktion i levetid 14. Tidligere arbejde har også fokuseret almost udelukkende på D. melanogaster, både med hensyn til virkningerne af CO 2 anæstesi 5,11 og frugtfarve 14 metoder. I øjeblikket er der kun få oplysninger om, hvordan CO 2 bedøvelse eller brugen af tarm farve påvirker parringsadfærd af andre Drosophila.
Den følgende undersøgelse evaluerer virkningen af CO 2 anæstesi på parringsadfærd tre arter af Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura og D. subobscura). Effekten af at indsamle fluer på CO 2 blev undersøgt i både single og to mandlige parring forsøg. Virkningen af CO 2 har også vist sig at variere i D. melanogaster 5 og så forskellige latensperioder mellem udsættelse for CO 2 og parring blev testet. En alternativ mærkningsmetode til anæstesi og fløj klipning: brugen af farvestoffer til levnedsmidler til farvning fluer også evalueret.
Protocol
1. Fremstilling af Fly Food med frugtfarve
- Læs standard Drosophila hætteglas med ca. 20 ml af mad i bunden (figur 1). Brug følgende opskrift for fødevarer mix anvendelse af 1 l kogende vand: 10 g agar, 85 g dextrose, 60 g majsmel, 40 g gær, og der omrøres i 5 minutter af ulmende. Tilsæt 25 ml 10% nipagen Når blandingen er afkølet til 75 ° C.
- Efter fødevarer er afkølet og størknet tilsættes to dråber (ca. 0,5-1 ml) blå levnedsmiddelfarve til toppen af fødevarer og spredes over hele overfladen af hætteglas (figur 1). Brug et andet farvestof, hvis det foretrækkes.
- Lad mad til to dage i køleskabet, således at farvestoffet absorberes af det øverste lag af fødevarer; dette undgår overdreven fugt beskadige fluer i modningsperiode. Tilføj et lille stykke silkepapir, hvis overdreven fugt er stadig et problem at skamplet op ekstra fugt og efterfølgendefjerne det.
- Transfer flyver på fødevarer enten individuelt eller i grupper.
Bemærk: Fluer vil få tarm farvning inden for 1 dag for at blive placeret på maden. Alternativt fuldt modne fluerne på farvet mad før forsøget (øget dødelighed under modningsperioden blev ikke observeret ved eksponering for fødevarer farvestof). - Kontroller, at de farvede fluer let kan skelnes fra de ikke-farvet fluer. Hvis de ikke kan skelnes Gentag trin 1,1-1,4 ved hjælp af enten en højere koncentration af farvestof, eller et andet farvestof.
2. To mænd Parring forsøg med frugtfarve
- For at producere afkom, der er oprettet af flere hætteglas indeholdende par af kvindelige og mandlige fluer (små grupper af mænd og kvinder er også egnede, selv sørge for at undgå fortrængning af larver). Lad hunnerne at lægge æg og flytte fluer til nye hætteglas hver 5-7 dage. Opbevar hætteglas ved en passende temperatur for de arter af interesse (22 ° C feller D. pseudoobscura og D. subobscura og 25 ° C i D. melanogaster).
- Før indsamlingen eksperimentelle fluer fjerne alle fluer fra indsamling hætteglas på et fastsat tidspunkt før indsamlingen hanner og hunner for at sikre, at de vil være jomfruer (D. melanogaster - 6 timer ved 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 timer ved 22 ° C, og D. subobscura - 24 timer ved 22 ° C).
Bemærk: Hvis fluer er ikke jomfru dette vil skævhed deres adfærd i parring forsøg 15.- Store og modne mandlige individuelt i standard 75 x 20 mm plast hætteglas (indeholdende ~ 20 ml fødevarer). Derved undgår de negative virkninger på mandlig parringsadfærd og fitness set hos nogle arter, når hanner holdes i flok 16.
- Bring halvdelen af hannerne til den ønskede behandling (CO 2 anæstesi i dette tilfælde). Brug en CO2 måtte eller tryk på for at udsætte fluerne for den krævede tid. Store halvdelen af males i hver behandling på farvet mad indtil parring finder sted. Dette vil gøre dem visuelt skelnes under parring forsøg.
- For at overføre fluer bruge en emhætte 17. Mærk hvert hætteglas til at identificere både behandling og farven status hannen. Her anvendes fire behandlinger (anæstesi, ufarvet = G-NC, anæstesi, farvet = GC, ingen anæstesi, ufarvet, NG-NC, og ingen anæstesi, farvet, NG-C).
- Overfør nyligt opstået hunner i friske fødevarer hætteglas til at modnes som grupper af 10.
- Tillad fluer at modne til parring alder (D. melanogaster - 3 dage, D. pseudoobscura - 5 dage, D. subobscura - 7 dag 18 Store flyver ved en passende temperatur for arten at blive undersøgt (fx 22 ° C i D. . pseudoobscura og D. subobscura og 25 ° C for D. melanogaster).
- Flyt hunner til individuelle hætteglas (fortsataining ~ 20 ml mad) 1 dag før parring retssag for akklimatisering til parring hætteglasset. Mærk så hætteglas kan differentieres disse hætteglas. Vær omhyggelig med at blinde eksperimentet ved hjælp af neutral mærkning (dvs. 1 - 150), så det er ikke muligt at gætte identiteten af fluerne i hætteglasset.
Bemærk: Den, der fluer i hvert hætteglas skal kende identiteten af fluerne placeret i hvert hætteglas, da de vil bemærke, hvilken behandling var plettet. Dog bør den observatør, der ure parringen ikke kender deres identitet. For at gøre dette mindst to eksperimentatorer vil være behov for, en til at sætte op og en til at observere. - Begynd parring forsøg mellem 10-12 AM, eller på et tidspunkt, der falder sammen med lys, der kommer på i lys / mørke cyklus fluerne er udsat for ("daggry" for fluer). Tilføj to mandlige fluer til hver parring hætteglas (som indeholder en enkelt kvindelig flue) ved hjælp af en aspirator. Sørg for, at de to mænd er fra forskellige behandlinger (bedøvelse ellerkontrol), og at man har tarm farvning for at gøre det muligt at skelne dem fra hinanden, og bemærk hvilke mandlige farves.
- Hvis samleje sker, registrerer status for den mandlige som hjælpere (farvet eller ikke - farvet). Hvis forsøg sidste i 2 timer, antager den kvindelige vil ikke parre sig.
Bemærk: 2 timer er velegnet til disse arter, men andre Drosophila kan have brug for mere eller mindre tid.
3. Single Mand Parring Trials
- For enlige mandlige forsøg, gentag protokol 2 med to ændringer:
- I trin 2.3 ikke holde hanner på farvet mad.
- I trin 2.7, tilføjer kun en enkelt mand til hvert hætteglas.
- I trin 2.8, registrerer den tid fluen føjes til hætteglasset, den tid de samvirkende starter, og det tidspunkt, hvor parring færdige skal registreres. Ud fra disse værdier beregner parring succes, latens og varighed.
4. Data Analysis
- Brug egnet statistik pakke til Analysis. Hvis data er normalt og har kun to behandlinger, bruge t-test eller tilsvarende Generaliseret lineær model (GLM). For to mandlige eksperimenter, brug binomial test eller en binomial GLM, der er tilgængelige i alle grundlæggende statistik pakke.
Bemærk: For eksempel data blev alle analyser i R-version 3.0.3 19. - Kontroller parring latenstid og parring varighed data for normalitet, ved at plotte frekvens histogrammer af ventetid og varighed for hver behandling 20, og ved hjælp af en test for normalitet som Shapiro-Wilk. Hvis det ikke er normal, omdanne det, eller bruge ikke-parametrisk tilsvarende statistikker 20.
Bemærk: For eksempel data fra de enkelte mandlige eksperimenter log transformation opfyldt kravene i normalitet og ens varianser. - Hvis data kan normaliseres, at brug t-tests undersøge forskelle mellem parring latency og varighed i de enkelte mandlige parring forsøg ved brug af to behandlinger 21. Hvis der anvendes flere behandlinger,prøve en variansanalyse (ANOVA) 20. Hvis dataene ikke kan normaliseres, prøv tilsvarende ikke-parametriske tests 21.
- Brug binomial tests til at teste for en effekt af enten frugtfarve eller CO 2 anæstesi på parring succes konkurrerende hanner 20. Hvis der anvendes flere behandlinger, som det er tilfældet med et eksempel data, bruge en GLM med binomial fejl struktur 21.
- For de to mandlige forsøg i eksemplet data, brug GLMs med binomial fejl strukturer. En GLM undersøgte farve som en variabel reaktion (farvet = 0 og ufarvet = 1) med arter, gas status, og røggasrensning monteret som forklarende variables.One GLM undersøgt CO 2 som en variabel reaktion (gasset = 0 og ikke-gassede = 1) med arter, farve status og røggasrensning monteret. I hvert tilfælde frembringe den maksimale model og udføre model forenkling baseret på AIC 20.
Representative Results
To mandlige parring forsøg - Effekten af CO 2 anæstesi på parringsadfærd
Den bedste model fundet at forklare variationen i effekten af CO 2 anæstesi indeholdt arter som en faktor (med D. pseudoobscura og D. subobscura fusioneret som de viste ingen forskelle mellem hinanden). I D. pseudoobscura og D. subobscura var der ingen signifikant effekt af CO 2 anæstesi på parring succes i to mandlige forsøg (Z 1.589 = 0,087, P = 0,931). For D. melanogaster, mænd udsat for CO 2 anæstesi havde signifikant lavere parring succes (Z1,589 = 2,467, P = 0,014). Der var også en signifikant interaktion mellem arter og behandling (χ 2 1.589 = 6,83, P = 0,009) med en større effekt at blive set, når D. melanogaster blev udsat for gas ved indsamling eller 1 dag før forsøg (tabel 1). HowevER, D. melanogaster hanner udsat for CO 2 to dage før den eksperimentelle forsøg viste ikke en effekt af CO 2.
To mandlige parring forsøg - Effekten af tarm farve på parringsadfærd
Model forenkling viste ingen signifikant effekt af frugtfarve blive fundet for nogen af de tre arter (P> 0,1). Når behandling eller gas status blev inkluderet i analysen disse var heller ikke signifikant (P> 0,1). Andelene af succesfulde parringer for farvet fluer tværs behandlinger er vist i tabel 2. Forskellen i farve mellem fluer holdes på farvet og ufarvet fødevarer kan ses i figur 1. Intensiteten af den intestinale levnedsmiddelfarvestof var større i D. pseudoobscura og D. subobscura end i D. melanogaster.
Single parring forsøg - Effekten af at bruge CO 2 anæstesi på mating adfærd
Der var ingen forskel i parring latenstid for nogen af de tre arter, når CO 2 anæstesi blev anvendt til at indsamle for nylig vist voksne. En effekt blev fundet for parring varighed i D. subobscura når det blev udsat for CO 2 to dage før parring forsøg (figur 2 og 3; tabel 2).
Figur 1. fotografi, der viser Hætteglas af farvede og Non Colored Fly Food (A) og styrke for Intestinal farve i Male D. Subobscura (B).
Figur 2. Mean og 95% konfidensintervaller for samleje Latency for de tre undersøgte arter i Single Mand Trials, når Mænd var bedøved (lyse søjler) eller ej bedøvet (mørke søjler) når Indsamlet som jomfruer før seksuel modenhed.
Figur 3. Mean og 95% konfidensintervaller for samleje varighed for de tre undersøgte arter i Single Mand Trials, da Hannerne blev bedøvet (lys barer) eller ej bedøvet (mørke søjler) når Indsamlet som jomfruer før seksuel modenhed.
| Behandling | Arter | Nej forsøg | Nej fluer farvet som parret | p-værdi | Nej fluer gasset at parret | p-værdi |
| Indsamling på CO 2 | D. mel | 73 | 36 | 1 | 27 | 0,0344 |
| D. PSE | 79 | 41 | 0,8221 | 44 | 0,3682 | |
| D. sub | 71 | 40 | 0,3425 | 33 | 0,6353 | |
| Udsat til CO 2 18 timer før | D. mel | 57 | 28 | 1 | 19 | 0,0163 |
| D. PSE | 65 | 32 | 1 | 31 | 0,8043 | |
| D. sub | 68 | 38 | 0,3961 | 35 | 0,9036 | |
| Udsat til CO 2 to dage. | D. mel | 56 | 19 | 0,0222 | 32 | 0,3497 |
| D. PSE | 70 | 32 | 0,5504 | 33 | 0,7202 | |
| D. sub | 56 | 29 | 0,8939 | 26 | 0,6889 </ Td> |
Tabel 1. Resultater fra to Mand Choice Experiments På tværs af alle Arter og behandlinger undersøgt.
| Arter | Trait | df | t-værdi | p-værdi |
| D. melanogaster | Latency | 58 | 1,379 | 0,174 |
| Varighed | 58 | 1.243 | 0,221 | |
| D. pseudoobscura | Latency | 109 | 0,419 | 0,676 |
| Varighed | 109 | 0,436 | 0,664 | |
| D. subobscura | Latency | 83 | 0,098 | 0,922 |
| Varighed | 83 | 1,767 | 0,081 |
Tabel 2. Resultater fra Single Parring Eksperimenter undersøge virkningen af Collection på CO2 Anæstesi på Parring Latency og varighed. Tests blev udført på tre arter af Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura og D. subobscura).
Discussion
Disse data viser, at effekten af CO 2 anæstesi er inkonsekvent mellem arterne, med to af tre arter, der udviser ringe virkning. Vores resultater tyder på mærkning med mad farvestof havde en lavere effekt på mandlig parring succes end CO 2 anæstesi til D. melanogaster. Disse eksperimenter viser, at farvestoffer til levnedsmidler nemt og billigt kan anvendes til at mærke fluer til parring assays involverer flere mænd.
Af de tre model Drosophila arter undersøgt, kun D. melanogaster viste en effekt af CO 2 anæstesi på parring ydeevne i en konkurrencesituation. I modsætning hertil ingen af de arter viste en virkning af indsamling af gas i en enkelt parring forsøg i form af parring latens, i modsætning til tidligere resultater for D. melanogaster 5. Virkningen af konkurrencen kan derfor fremhæve mere subtile fitness virkninger af CO 2 anæstesi, som kun kan påvisesunder situationer, hvor der er mand-mand konkurrence. Eksponering ved tidlig indsamling og en dag forud for retssagen have en negativ effekt på evnen af hanner af D. melanogaster at få en parring. Eksponering to dage forud for forsøget dog ikke viser nogen virkning. Både D. pseudoobscura og D. subobscura viste ikke nogen effekt af eksponering for gas i nogen af forsøgene. En forklaring er, at D. melanogaster var sårbare over for tidlig eksponering for CO 2, fordi det skal opsamles tidligere i livet (0 - 6 timer gammel) end de andre arter for at sikre mænd er jomfru. Derfor mandlige D. melanogaster i denne alder kan være mere følsom som kutikula af fluen stadig hærdning, i forhold til de andre arter, som har haft længere deres kutikula at hærde. Generelt dette støtter tanken om, at virkningerne af CO 2 anæstesi er artsspecifikke og efterforskere bør passende teste effekten på deres målarter. Currently, de fleste af arbejdet om effekten af CO 2 bedøvelsen er blevet udført på Drosophila melanogaster 5,11,22 og derfor måske ikke være hensigtsmæssigt at anvende andre beslægtede arter.
Den alternative ikke-invasiv metode præsenteret for differentiere fluer er mad farvestof. Resultaterne tyder på denne behandling havde ingen virkning på tværs af alle undersøgte arter. Men mens dets anvendelse lykkedes at tilvejebringe en billig og nemt synlig markør til at skelne mellem individer det skal bemærkes, at farvestoffet var lettere at skelne D. pseudoobscura og D. subobscura end i D. melanogaster. Tidligere forfattere har brugt flere farver (rød, grøn og blå) 4,6. Vi fandt blå farve til at være den nemmeste at skelne i alle arter, især D. pseudoobscura og D. subobscura. Anvendelse af flere farver ville potentielt give mere komplekse eksperimenter med mange individuelt mærket flies. Men indledende tests af forskellige farvestoffer er afgørende, da nogle fødevarer farvestoffer undlader at farve fluer, muligvis blive fordøjet, når de indtages. Andre farvestoffer kan have toksiske virkninger og reducere overlevelse fluer, og bør undgås 14). Alternative mad farvelægning metoder ved hjælp dyrere pletter er også blevet brugt til at undersøge intestinal integritet for D. melanogaster 23. Disse kan være et alternativ, selvom dyrere, farvning metode 23.
Farvestoffet metode er så hurtig som CO 2 fløj klipning som fluer kan gemmes på farvet mad fra indsamling. Optagelse af fødevarer var hurtig (~ 3 hr), så opbevaring O / N på farvet fødevarer ville også være tilstrækkeligt til at markere fluer, som anvendt i andre undersøgelser 6. Imidlertid varigheden af farve er relativt kort (~ 4-5 timer) i forhold til kanten klipning (permanent) eller fluorescerende støv mærkning (10-12 dage) 24. Drosophila artervarierer i udseende, vil forskellige farvestoffer være mere eller mindre effektive for forskellige arter, og som nogle stammer (f.eks knock-out mutanter), kan være sårbare over for ændringer i kosten, enhver brug af farvestof kræver en indledende test af dens effektivitet, især hvis længere tids udsættelse for farvestoffer kan være giftige 14. I modsætning til undersøgelsen af Kalaw et al. 14, fandt vi ingen signifikant mortalitet efter opbevaring i flere dage på farvede fødevarer til D. melanogaster (3 dage), D. pseudoobscura (5 dage) eller D. subobscura (7 dage), sandsynligvis på grund af forskellen i farvestof anvendes.
Den kritiske trin for vellykket anvendelse af farvestoffet teknik er trin 1.5, validere, at den valgte farvestof fungerer godt med art og stamme, der anvendes. En alternativ teknik involverer anvendelse farvet støv på ydersiden af fluen før anvendelse i markforsøg 24. Denne metode er blevet anvendt til at spore individer inden grund to varighed mærkningen og den lethed af masse-mærkning flyver 24. Selv om vi ikke har eksplicit testet denne metode i parring forsøg, ville det være vigtigt at undersøge eventuelle virkninger, støv kan have på sanserne vigtige i parring, især i Drosophila 25, 26. I art, saafremt intestinal farvning ikke er mulig, disse metoder kan være egnede.
Afslutningsvis fandt vi, at i to af de tre testede arter (D. pseudoobscura og D. subobscura) var der ingen effekt fundet af enten CO 2 anæstesi eller frugtfarve på parring evne hanner. For D. melanogaster en negativ effekt på CO 2 anæstesi blev registreret, men frugtfarve påvirkede ikke parring succes i denne art. Samlet farvestoffet fremgangsmåde tilvejebringer en enkel og billig ikke-invasiv fremgangsmåde til identifikation af individuelle Drosophila, som er tilsvarende eller bedre end fremgangsmåder, der kræver CO 2 anæstesi. Deter sandsynligvis denne metode ville arbejde på tværs af en række arter.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Alex Hitchen og Meg Booth for deres hjælp med de samvirkende forsøg. Dette arbejde blev støttet af NERC tilskud NE / H015604 / 1 til TP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
| Fine mesh | Any haberdashery | - | Fine curtain mesh is suitable |
| 1 ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
| Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
| Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
| Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | - | Other dye colours and brands can have variable results. |
| CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
| Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
| Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |
References
- Parker, G. A. Sperm competition and its consequences in insects. Biological Reviews. 45, 525-567 (1970).
- Hosken, D. J., Stockley, P., Tregenza, T., Wedell, N. Monogamy and the battle of the sexes. Annual Review of Entomology. 54, 361-378 (2009).
- Chapman, T., Liddle, L., John, K., Wolfner, M., Partridge, L. Female cost of mating caused by males accessory gland fluids. Nature. 373, 241-244 (1995).
- Avent, T. D., Price, T. A. R., Wedell, N. Age-based female preference in the fruit fly Drosophila pseudoobscura. Animal Behaviour. 75, 1413-1421 (2008).
- Barron, A. Anaesthetising Drosophila. for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Moeers, A. O., Rundle, H. D., Whitlock, M. C. The effects of selection and bottlenecks on male mating success in peripheral isolates. The American Naturalist. 153, 437-444 (1999).
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila. The Genetics and Biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
- Powell, J. Progress and Prospects in Evolutionary Biology: The Drosophila Model. , Oxford University Press. Oxford. (1997).
- Moore, A. J., Moore, P. J. Balancing sexual selection through opposing mate choice and male competition. Proceedings of the Royal Society of London, series B-Biological Sciences. 266, 711-716 (1999).
- Hollocher, H., Ting, C., Pollack, F., Wu, C. Incipient speciation by sexual isolation in Drosophila melanogaster.: Variation in Mating preference and Correlation between sexes. Evolution. 51, 1175-1181 (1997).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 18, 1869-1874 (1972).
- Wu, C. I., et al. Sexual isolation in Drosophila melanogaster : A possible case of incipient speciation. Proceedings of the National academy of sciences. 92, 2519-2523 (1995).
- Melcher, C., Pankratz, M. J. Candidate gustatory interneurons modulating feeding behaviour in the Drosophila brain. PLoS Biology. 3, e305 (2005).
- Kalaw, V., Drapeau, M. D., Long, A. D. Effects of food coloring on longevity and viability of Drosophila melanogaster. Dros. Inf. Serv. 85, 128-129 (2002).
- Friberg, U. Male perception of female mating status: its effect on copulation duration, sperm defence and female fitness. Animal Behaviour. 72, 1259-1268 (2006).
- Lizé, A., Price, T. A. R., Heys, C., Lewis, Z., Hurst, G. D. D. Extreme cost of rivalry in a monandrous species male − male interactions result in failure to acquire mates and reduced longevity. Proceedings of the Royal Society of London, series B-Biological Sciences. 281, 20140631 (2014).
- Yeh, S. -D., Chan, C., Ranz, J. M. Assessing differences in sperm competitive ability in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (78), e50547 (2013).
- Holman, L., Freckleton, R. P., Snook, R. R. What use is an infertile sperm? A comparative study of sperm-heteromorphic Drosophila. Evolution. 62, 374-385 (2008).
- R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2011).
- Crawley, M. J. Statistics: An introduction using R. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. (2005).
- Dytham, C. Choosing and Using Statistics: A Biologist's Guide. , Wiley-Blackwell, Oxford, UK. (2010).
- Kaiser, M. Influence of anaesthesia by carbon dioxide on hatching time and weight at eclosion in Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 76, 92-93 (1995).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila. PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14, 623-634 (2011).
- Crumpacker, D. W. The use of micronized fluorescent dusts to mark adult Drosophila pseudoobscura. American Midland Naturalist. 91, 118-129 (1974).
- Jallon, J. M. A few chemical words exchanged by Drosophila during courtship and mating. Behaviour genetics. 14, 441-478 (1984).
- Liimatainen, J. O., Jallon, J. M. Genetic analysis of cuticular hydrocarbons and their effect on courtship in Drosophila virilis and D. lummei. Behaviour Genetics. 37, 713-725 (2007).
