Abstract
Parring eksperimenter ved hjelp Drosophila har bidratt sterkt til forståelsen av seksuell seleksjon og atferd. Eksperimenter krever ofte enkle, enkle og billige metoder for å skille mellom individer i en rettssak. En standard teknikk for dette er CO 2 anestesi og deretter merking eller vinge klipping hvert fly. Men dette er invasiv og har blitt vist å påvirke virkemåten. Andre teknikker er brukt for å identifisere fargen fluer. Denne artikkelen presenterer en enkel og ikke-invasiv metode for merking Drosophila som tillater dem å være individuelt identifisert innen eksperimenter, ved hjelp av konditorfarge. Denne metoden brukes i forsøk hvor to hanner konkurrerer om å parre seg med en kvinne. Farging lov rask og enkel identifisering. Det var imidlertid en viss forskjell i styrken av fargen på de tre undersøkte arter. Dataene presenteres viser fargestoff har en lavere innvirkning på parring atferd enn CO 2 i Drosophila MelanoGaster. Virkningen av CO 2 anestesi er vist å være avhengig av arten av Drosophila, med D. pseudoobscura og D. subobscura viser ingen effekt, mens D. melanogaster menn hadde redusert parring suksess. Fargestoffet metoden presentert er anvendbar på et vidt spekter av eksperimentelle design.
Introduction
I løpet av de siste tiårene har det vært økende interesse for hvordan seksuell seleksjon og konkurranse mellom hannene innvirkning på utviklingen 1,2. Eksperimenter på paringsatferd har spilt en viktig rolle i å utvikle og teste teorier om seksuell seleksjon 3,4. Spesielt forskning ved hjelp av arter i slekten Drosophila, har bidratt sterkt til forståelsen av seksuell seleksjon og atferd. Imidlertid er det viktig å undersøke hvorvidt vanlig brukte teknikker kan kunstig påvirke resultatene av standard passende eksperimenter 5,6.
Anestesi er ofte brukt for håndtering og identifikasjon i eksperimenter 7. For eksempel er fluer ofte samles før parring, eller sorteres i genotyper eller eksperimentelle behandlinger med karbondioksid (CO 2) bedøvelse. I forsøk hvor to eller flere personer må skilles, er det vanlig praksis å bedøve flkaper og klippet en del av vingen av for å identifisere hver enkelt eller behandlingsgruppe 5,8. Det er avgjørende, men for å forstå hvordan CO 2 behandling vil påvirke virkemåten. Effekten av CO 2 anestesi har blitt undersøkt i Drosophila melanogaster der hanner utsatt til CO 2 tok betydelig lengre tid å pare seg og hadde samlet lavere parring suksess enn ikke-bedøvet menn eller menn bedøvet ved hjelp eksponering for kulde 5. Denne effekten ble observert både når anestesi ble påført på dagen for eksperimentet, og når fluer ble gitt en dag å komme seg. Men denne studien var begrenset i bare undersøke studier der en enkelt mann ble presentert for hver kvinnelig 5. Et mer realistisk scenario er for en kvinne å møte flere hanner 9,10, slik at konkurransen mellom hanner, som kan tillate påvisning av mer subtile tap av mannlige fitness på grunn av anestesi. Bruken av CO 2 anestesi har ogsåno funnet å redusere fruktbarhet og lang levetid av voksen D. melanogaster når de blir utsatt kort tid etter eklosjonshormon, som er vanlig når du samler jomfru flyr 11.
Et alternativ til CO 2 anestesi er å markere fluer ved å mate dem mat farget med fargestoff 4,6,10,12,13. Dette fargestoff trer tarmen på flua og er synlig gjennom magen, slik at fargede fluer skal skilles fra ufargede fluer, eller mot fluer merket med en annen farge. Metoder skiller i hvordan dette kan brukes: blir lagt direkte til mat 12, via farget supplerende gjær pasta 6, eller via eksponering til en roman farget mat underlaget 13. Disse merke teknikker synes å vise noen effekt på paring ytelse 4,6. Imidlertid, et papir direkte å undersøke effekten av den samme konditorfarge på voksen D. melanogaster funnet en sterk reduksjon i levetid 14. Tidligere arbeid har også fokusert almost helt på D. melanogaster, både med hensyn til effekten av CO 2 anestesi 5,11 og konditorfarge 14 metoder. Foreløpig er det lite informasjon om hvordan CO 2 anestesi eller bruk av intestinal farge påvirker parring oppførselen til andre Drosophila.
Den følgende studien evaluerer effekten av CO 2 anestesi på parring oppførselen til tre arter av Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura og D. subobscura). Effekten av å samle fluer på CO 2 ble undersøkt i både single og to mannlige parringsforsøk. Virkningen av CO 2 har også blitt funnet å variere i D. melanogaster 5 og så forskjellige latensperioder mellom eksponering for CO 2 og parring ble testet. Et alternativ merking metode til anestesi og vinge klipping: bruk av mat fargestoffer å farge fluene er også vurdert.
Protocol
1. Utarbeidelse av Fly Mat med konditorfarge
- Ta en standard Drosophila hetteglass med ca 20 ml av mat i bunnen (figur 1). Bruk følgende oppskrift for mat miks ved hjelp av en liter kokende vann: 10 g agar, 85 g dextrose, 60 g av mais mel, 40 g gjær, og rør i 5 min av simmering. Legg 25 ml 10% nipagen Når blandingen er avkjølt til 75 ° C.
- Etter maten er avkjølt og størknet legge to dråper (ca 0,5 til 1 ml) av blå konditorfarge til toppen av maten og spredt over hele overflaten av hetteglasset (figur 1). Bruk en annen farge fargestoff hvis ønskelig.
- La maten i to dager i kjøleskapet, slik at fargestoffet absorberes av det øverste laget av mat; dette unngår overdreven fukt skader fluer under modningsperioden. Legg et lite stykke silkepapir hvis overdreven fuktighet er fortsatt et problem å klatt opp ekstra fuktighet og deretter senerefjern det.
- Overføring flyr på mat, enten individuelt eller i grupper.
Merk: Fluer vil få tarm farging innen en dag for å bli plassert på mat. Alternativt fullt modne fluer på farget mat før eksperimentet (økt dødelighet under modningsperioden ble ikke observert fra eksponering for mat fargestoff). - Kontroller at farget fluer kan lett skilles fra de ikke-farget fluer. Hvis de ikke kan skilles, gjentar du trinn 1.1 til 1.4 ved hjelp av enten en høyere konsentrasjon av fargestoff, eller en annen farge.
2. To Mann Mating forsøk med konditorfarge
- For å produsere avkom, sette opp flere hetteglass som inneholder par av kvinnelige og mannlige fluer (små grupper av menn og kvinner er også egnet, men ta vare for å unngå trengsel av larver). Tillate kvinner å legge egg og flytte fluene til nye ampuller hver 5 - 7 dager. Oppbevar ampuller ved en egnet temperatur for arten av interesse (22 ° C feller D. pseudoobscura og D. subobscura og 25 ° C i D. melanogaster).
- Før samle eksperimentelle fluer fjerne alle fluene fra oppsamlingshetteglass på en angitt tid før samle menn og kvinner for å sikre at de vil være jomfruer (D. melanogaster - 6 timer ved 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 timer ved 22 ° C, og D. subobscura - 24 timer ved 22 ° C).
Merk: Hvis fluer er ikke jomfru dette vil skjevhet deres atferd i parringsforsøk 15.- Store og moden mannlig individuelt i standard 75 x 20 mm plasthetteglass (som inneholder ~ 20 ml av mat). Dette unngår de negative konsekvensene for mannlig paringsatferd og fitness sett i noen arter når menn blir holdt i grupper 16.
- Eksponere halvparten av hannene til den ønskede behandlingen (CO 2 anestesi i dette tilfellet). Bruk en CO 2 matte eller trykk for å utsette fluene til ønsket tid. Butikk halvparten av males i hver behandling på farget mat før parring finner sted. Dette vil gjøre dem visuelt skjelnes i paringsforsøk.
- For overføring av fluer bruke en aspirator 17. Merk hver ampulle for å identifisere både behandling og fargen status for hannen. Her bruker fire behandlinger (anestesi, ikke-farget = G-NC, anestesi, farget = GC, ingen bedøvelse, ikke-farget, NG-NC, og ingen bedøvelse, farget, NG-C).
- Overføre nylig oppståtte kvinner inn fersk mat ampuller å modnes som grupper på 10.
- Tillat fluene til å modne til parring alder (D. melanogaster - 3 dager, D. pseudoobscura - 5 dager, D. subobscura - 7 dager 18 Butikk flyr ved en egnet temperatur for artene som blir undersøkt (for eksempel 22 ° C til D. . pseudoobscura og D. subobscura og 25 ° C i D. melanogaster).
- Flytt hunner til individuelle ampuller (fortsinnelukker ~ 20 ml mat) en dag før parring rettssaken for akklimatisering til paring hetteglasset. Etikett disse ampuller slik at ampuller kan differensieres. Vær nøye med å forblinde eksperimentet ved hjelp nøytral merking (dvs. 1-150) så det er ikke mulig å gjette identiteten til fluene i noen hetteglass.
Merk: Den person som fluer i hvert hetteglass må kjenne identiteten til fluene plassert i hvert hetteglass som de vil merke hvilken behandling var farget. Imidlertid bør observatøren som klokker parings ikke kjenner sin identitet. For å gjøre dette minst to forskere vil være nødvendig, en til å sette opp og en til å observere. - Begynn paring studiene mellom 10 - 12 AM, eller på et tidspunkt som sammenfaller med lyset kommer på i lys / mørke syklus fluene er utsatt for ("dawn" for fluene). Legg to mannlige fluer til hver parring hetteglass (som inneholder en singel kvinne flue) ved hjelp av en vifte. Sørg for at de to hannene er fra forskjellige behandlinger (anestesi ellerkontroll) og at man har tarm flekker å gjøre det mulig å skille dem fra hverandre, og legg merke til hvilken mannlig er farget.
- Hvis copulation skjer, ta opp status for den mannlige som mates (enten farget eller ikke - farget). Hvis prøvelser siste for 2 timer, antar den kvinnelige ikke vil parre seg.
Merk: 2 timer er egnet for disse artene, men andre Drosophila kan trenge mer eller mindre tid.
3. Enkelt Mann Mating Trials
- For enkeltmanns forsøk, gjenta protokoll 2 med to endringer:
- I trinn 2.3 ikke holde menn på farget mat.
- I trinn 2.7, legger bare en enkelt mann til hvert hetteglass.
- I trinn 2.8, registrerer tiden flua legges til hetteglasset, tiden paring starter og tiden parings ferdig bør registreres. Fra disse verdiene, beregne parring suksess, ventetid, og varighet.
4. Data Analysis
- Bruk egnet statistikk pakke for analyse. Hvis dataene er normalt og bare ha to behandlinger, bruke t-test eller tilsvarende Generalized Linear Model (GLM). For to mannlige eksperimenter, bruker binomiske tester eller en binomisk GLM som er tilgjengelige i noen grunnleggende statistikk pakke.
Merk: For eksempeldataene, ble alle analyser utført i R versjon 3.0.3 19. - Sjekk parring ventetid og parring varighet data for normalitet, ved å plotte frekvens histogrammer av ventetid og varighet for hver behandling 20, og ved hjelp av en test for normalitet som Shapiro-Wilk. Hvis det ikke er normal, forvandle den, eller bruke ikke-paratilsvarende statistikk 20.
Merk: For eksempel data fra de enkelte mannlige eksperimenter logge transformasjon oppfylt kravene i normalitet og likeverdige avvik. - Hvis dataene kan være normalisert, å bruke t-tester undersøke forskjeller mellom parring ventetid og varighet i de enkelte mannlige parringsforsøk ved bruk av to behandlinger 21. Hvis flere behandlinger anvendes,prøv en variansanalyse (ANOVA) 20. Hvis dataene ikke kan normaliseres, prøve tilsvarende ikke-parametriske tester 21.
- Bruk binomiske tester for å teste for en effekt av enten konditorfarge eller CO 2 anestesi på parings suksess for konkurrerende hanner 20. Hvis flere behandlinger blir brukt, slik tilfellet er med eksempeldata, bruke en GLM med binomial feilkonstruksjon 21.
- For de to mannlige forsøk i eksempelet data, bruker GLMs med binomiske feilkonstruksjoner. En GLM undersøkt farge som en responsvariabel (farget = 0 og ikke-farget = 1) med arter, gass status, og gassbehandling montert som forklarende variables.One GLM undersøkt CO 2 som en responsvariabel (gasset = 0 og ikke-gasset = 1) med arter, farge status og gassbehandling montert. I hvert tilfelle produserer den maksimale modellen, og modell utføre forenkling basert på AIC 20.
Representative Results
To mannlige parringsforsøk - Effekten av CO 2 anestesi på parring oppførsel
Den beste modellen funnet å forklare variasjon i virkningen av CO 2 anestesi inneholdt arter som en faktor (med D. pseudoobscura og D. subobscura kondensert som de viste ingen forskjeller mellom hverandre). I D. pseudoobscura og D. subobscura var det ingen signifikant effekt av CO 2 anestesi på parring suksess i to mannlige studier (Z 1589 = 0,087, P = 0,931). For D. melanogaster, hanner utsatt til CO 2 anestesi hadde signifikant lavere parring suksess (Z1,589 = 2,467, p = 0,014). Det var også en signifikant interaksjon mellom arter og behandling (χ 2 1589 = 6.83, P = 0,009) med en større effekt å bli sett når D. melanogaster ble utsatt for gass ved samling eller en dag før forsøkene (Tabell 1). Howeveh, D. melanogaster hanner utsatt til CO 2 to dager før den eksperimentelle studien viste ingen effekt av CO 2.
To mannlige parringsforsøk - Effekten av tarm farge på paringsatferd
Modellen forenkling viste ingen signifikant effekt av konditorfarge blir funnet for noen av de tre arter (P> 0,1). Ved behandling eller gass status ble inkludert i analysen disse var også ikke signifikant (P> 0,1). Andelene av vellykkede parringer for fargede fluer på tvers av behandlinger er vist i tabell 2. Forskjellen i farge mellom fluene holdt på fargede og ufargede mat kan sees i figur 1. Intensiteten av tarmkonditorfarge var større i D. pseudoobscura og D. subobscura enn i D. melanogaster.
Enkeltparringsforsøk - Effekten av å bruke CO 2 anestesi på mkende atferd
Det var ingen forskjell i parring ventetid for en hvilken som helst av de tre artene når CO2-anestesi ble brukt til å samle nylig dukket opp voksne. En effekt ble funnet for parring varighet i D. subobscura når den ble eksponert til CO 2 to dager før parring forsøk (figur 2 og 3, Tabell 2).
Figur 1. Foto viser Ampuller av Farget og Non Farget Fly Food (A) og styrke for Intestinal Coloration i Male D. Subobscura (B).
Figur 2. Mean og 95% konfidensintervall for copulation ventetid for de tre artene undersøkt i Enkelt Mann Trials, Når Hanner var bedøverd (lys barer) eller ikke bedøvet (mørke søyler) når Collected som jomfruer før seksuell modenhet.
Figur 3. The Mean og 95% konfidensintervall for copulation Varighet for de tre artene undersøkt i Enkelt Mann Trials, når Hanner ble bedøvet (lyse søyler) eller ikke bedøvet (mørke søyler) når Collected som jomfruer før seksuell modenhet.
| Behandling | Arter | Antall forsøk | Antall fluer farget som parret | p-verdi | Antall fluer gasset som parret | p-verdi |
| Samling på CO 2 | D. mel | 73 | 36 | 1 | 27 | 0,0344 |
| D. PSE | 79 | 41 | 0,8221 | 44 | 0,3682 | |
| D. sub | 71 | 40 | 0,3425 | 33 | 0,6353 | |
| Utsettes til CO 2 18 timer før | D. mel | 57 | 28 | 1 | 19 | 0,0163 |
| D. PSE | 65 | 32 | 1 | 31 | 0,8043 | |
| D. sub | 68 | 38 | 0,3961 | 35 | 0,9036 | |
| Utsettes til CO 2 2days. | D. mel | 56 | 19 | 0,0222 | 32 | 0,3497 |
| D. PSE | 70 | 32 | 0,5504 | 33 | 0,7202 | |
| D. sub | 56 | 29 | 0,8939 | 26 | 0,6889 </ Td> |
Tabell 1. Resultater fra to mannlige Choice Eksperimenter på tvers av alle arter og behandlinger Undersøkte.
| Arter | Trait | df | t-verdi | p-verdi |
| D. melanogaster | Ventetid | 58 | 1,379 | 0,174 |
| Varighet | 58 | 1,243 | 0,221 | |
| D. pseudoobscura | Ventetid | 109 | 0,419 | 0,676 |
| Varighet | 109 | 0,436 | 0,664 | |
| D. subobscura | Ventetid | 83 | 0,098 | 0,922 |
| Varighet | 83 | 1,767 | 0.081 |
Tabell 2. Resultater fra enkelt parring Eksperimenter Undersøke effekten av Collection på CO 2 Anestesi på Mating ventetid og varighet. Testene ble utført på tre arter av Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura og D. subobscura).
Discussion
Disse dataene viser at effekten av CO 2 anestesi er inkonsekvent mellom arter, med to av tre arter som viser liten effekt. Våre resultater tyder på merking med mat fargestoff hadde en lavere innvirkning på mannlig parring suksess enn CO 2 anestesi for D. melanogaster. Disse eksperimentene demonstrerer at matvarefargestoffer kan enkelt og billig kan brukes til å merke fluer for sammenpassende analyser som involverer flere menn.
Av de tre modell Drosophila arter undersøkt, bare D. melanogaster viste en effekt av CO 2 anestesi på parring ytelse i en konkurransesituasjon. I motsetning til dette ble ingen av de arter viste en effekt av samlingen av gass i enkelt parring forsøk i form av sammenpassende ventetid, i motsetning til tidligere resultater for D. melanogaster 5. Effekten av konkurranse kan derfor fremheve mer subtile fitness virkningene av CO 2 anestesi, som er bare påviseshenhold til situasjoner der det er manns mannlig konkurranse. Eksponering ved tidlig samling og en dag før rettssaken ha en negativ effekt på evnen til hanner av D. melanogaster å få en parring. Eksponering to dager før rettssaken imidlertid ikke vise noen effekt. Både D. pseudoobscura og D. subobscura viste ingen virkning av eksponering for gass i noen av forsøkene. En forklaring er at D. melanogaster var sårbare for tidlig eksponering for CO 2 fordi det må samles tidligere i livet (0 - 6 timer gammel) enn de andre artene for å sikre menn er jomfru. Derfor mannlig D. melanogaster i denne alderen kan være mer følsomme som skjellaget på flua er fortsatt herding, sammenlignet med de andre artene som har hatt lenger for deres hårstråene å stivne. Generelt, støtter denne ideen om at effekten av CO 2 anestesi er artsspesifikke og undersøkere bør hensiktsmessig teste effekten i sine målartene. Currently, mesteparten av arbeidet på effekten av CO 2 anestesi har blitt utført på Drosophila melanogaster 5,11,22 og kan derfor ikke være riktig å legge til andre beslektede arter.
Den alternative ikke-invasiv metode presentert for å differensiere fluer er mat fargestoff. Resultatene tyder på denne behandlingen hadde ingen effekt på tvers undersøkt alle artene. Imidlertid, mens bruken lyktes i å gi en billig og lett synlig markør for å skille mellom individer det bør bemerkes at fargestoffet var lettere å skille i D. pseudoobscura og D. subobscura enn i D. melanogaster. Forrige forfattere har brukt flere farger (rød, grønn og blå) 4,6. Vi fant blå farge for å være den enkleste å skille i alle arter, spesielt D. pseudoobscura og D. subobscura. Bruk av flere farger ville potensielt tillate mer komplekse eksperimenter med mange individuelt merket flies. Men foreløpige tester av ulike fargestoffer er viktig, som noen mat fargestoffer ikke klarer å farge fluene, muligens blir fordøyd når det forbrukes. Andre fargestoffer som kan ha en toksisk virkning og redusere overlevelse av fluer, og bør unngås 14). Alternative konditorfarge metoder ved hjelp av dyrere flekker har også blitt brukt for å undersøke tarm integritet for D. melanogaster 23. Disse kan gi et alternativ, selv om dyrere, farging metode 23.
Fargestoffet metoden er like rask som CO 2 vinge klipping som fluer kan lagres på farget mat fra samlingen. Opptak av maten var hurtig (~ 3 timer), slik at lagrings O / N på farget mat vil også være tilstrekkelig til å markere fluer, som anvendt i andre studier 6. Imidlertid er varigheten av farge relativt kort (~ 4-5 timer) sammenlignet med vinge klipping (permanent) eller fluorescerende støv markering (10 - 12 dager) 24. Som Drosophila artervariere i utseende, vil forskjellige fargestoffer være mer eller mindre effektiv for forskjellige arter, og som noen stammer (f.eks knockout-mutanter) kan være utsatt for endringer i dietten, en hvilken som helst bruk av fargestoff krever en preliminær test av dens effektivitet spesielt hvis lengre tids eksponering for fargestoffer kan være giftig 14. I motsetning til studiet av Kalaw et al. 14, fant vi ingen signifikant mortalitet etter lagring i flere dager på fargede matvarer for D. melanogaster (3 dager), D. pseudoobscura (5 dager), eller D. subobscura (7 dager), sannsynligvis på grunn av forskjellen i fargestoff som brukes.
Det kritiske trinnet for vellykket bruk av fargestoffet teknikk er trinn 1.5, validering at den valgte fargestoff fungerer godt med arten og stamme som benyttes. En alternativ teknikk er å anvende farget støv til utsiden av flue før bruk i feltforsøk 24. Denne fremgangsmåten har blitt brukt for å spore individer i felten på grunn av to varigheten av merking og enkel massemerking flyr 24. Selv om vi ikke er eksplisitt testet denne metoden i sammenpassende forsøk, ville det være viktig å undersøke eventuelle virkninger som støv kan ha på sansene viktige i parring, særlig i Drosophila 25, 26. I arter, men hvor intestinal farging ikke er mulig, Disse metoder kan være egnet.
I konklusjon fant vi at i to av de tre artene som ble testet (D. pseudoobscura og D. subobscura) var det ingen effekt funnet av enten CO 2 anestesi eller konditorfarge på parring evne hanner. For D. melanogaster en negativ effekt av CO 2 anestesi ble oppdaget, men konditorfarge påvirket ikke parring suksess i denne arten. Samlet gir fargestoffmetoden en enkel og billig, ikke-invasiv metode for å identifisere individuelle Drosophila som er tilsvarende eller bedre enn de fremgangsmåter som krever CO 2 anestesi. Deter sannsynlig denne metoden vil fungere på tvers av en rekke arter.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Alex Hitchen og Meg Booth for deres hjelp med paring prøvelser. Dette arbeidet ble støttet av NERC stipend NE / H015604 / 1 til TP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
| Fine mesh | Any haberdashery | - | Fine curtain mesh is suitable |
| 1 ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
| Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
| Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
| Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | - | Other dye colours and brands can have variable results. |
| CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
| Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
| Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |
References
- Parker, G. A. Sperm competition and its consequences in insects. Biological Reviews. 45, 525-567 (1970).
- Hosken, D. J., Stockley, P., Tregenza, T., Wedell, N. Monogamy and the battle of the sexes. Annual Review of Entomology. 54, 361-378 (2009).
- Chapman, T., Liddle, L., John, K., Wolfner, M., Partridge, L. Female cost of mating caused by males accessory gland fluids. Nature. 373, 241-244 (1995).
- Avent, T. D., Price, T. A. R., Wedell, N. Age-based female preference in the fruit fly Drosophila pseudoobscura. Animal Behaviour. 75, 1413-1421 (2008).
- Barron, A. Anaesthetising Drosophila. for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Moeers, A. O., Rundle, H. D., Whitlock, M. C. The effects of selection and bottlenecks on male mating success in peripheral isolates. The American Naturalist. 153, 437-444 (1999).
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila. The Genetics and Biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
- Powell, J. Progress and Prospects in Evolutionary Biology: The Drosophila Model. , Oxford University Press. Oxford. (1997).
- Moore, A. J., Moore, P. J. Balancing sexual selection through opposing mate choice and male competition. Proceedings of the Royal Society of London, series B-Biological Sciences. 266, 711-716 (1999).
- Hollocher, H., Ting, C., Pollack, F., Wu, C. Incipient speciation by sexual isolation in Drosophila melanogaster.: Variation in Mating preference and Correlation between sexes. Evolution. 51, 1175-1181 (1997).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 18, 1869-1874 (1972).
- Wu, C. I., et al. Sexual isolation in Drosophila melanogaster : A possible case of incipient speciation. Proceedings of the National academy of sciences. 92, 2519-2523 (1995).
- Melcher, C., Pankratz, M. J. Candidate gustatory interneurons modulating feeding behaviour in the Drosophila brain. PLoS Biology. 3, e305 (2005).
- Kalaw, V., Drapeau, M. D., Long, A. D. Effects of food coloring on longevity and viability of Drosophila melanogaster. Dros. Inf. Serv. 85, 128-129 (2002).
- Friberg, U. Male perception of female mating status: its effect on copulation duration, sperm defence and female fitness. Animal Behaviour. 72, 1259-1268 (2006).
- Lizé, A., Price, T. A. R., Heys, C., Lewis, Z., Hurst, G. D. D. Extreme cost of rivalry in a monandrous species male − male interactions result in failure to acquire mates and reduced longevity. Proceedings of the Royal Society of London, series B-Biological Sciences. 281, 20140631 (2014).
- Yeh, S. -D., Chan, C., Ranz, J. M. Assessing differences in sperm competitive ability in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (78), e50547 (2013).
- Holman, L., Freckleton, R. P., Snook, R. R. What use is an infertile sperm? A comparative study of sperm-heteromorphic Drosophila. Evolution. 62, 374-385 (2008).
- R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2011).
- Crawley, M. J. Statistics: An introduction using R. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. (2005).
- Dytham, C. Choosing and Using Statistics: A Biologist's Guide. , Wiley-Blackwell, Oxford, UK. (2010).
- Kaiser, M. Influence of anaesthesia by carbon dioxide on hatching time and weight at eclosion in Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 76, 92-93 (1995).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila. PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14, 623-634 (2011).
- Crumpacker, D. W. The use of micronized fluorescent dusts to mark adult Drosophila pseudoobscura. American Midland Naturalist. 91, 118-129 (1974).
- Jallon, J. M. A few chemical words exchanged by Drosophila during courtship and mating. Behaviour genetics. 14, 441-478 (1984).
- Liimatainen, J. O., Jallon, J. M. Genetic analysis of cuticular hydrocarbons and their effect on courtship in Drosophila virilis and D. lummei. Behaviour Genetics. 37, 713-725 (2007).
