Abstract
expériences d'accouplement utilisant la drosophile ont grandement contribué à la compréhension de la sélection sexuelle et le comportement. Expériences nécessitent souvent des méthodes simples, faciles et bon marché de faire la distinction entre les individus dans un procès. Une technique standard pour ce est de CO 2 et l'anesthésie puis étiquetage ou AILES chaque volée. Cependant, ce est invasif et a été montré pour influer sur le comportement. D'autres techniques ont utilisé la coloration pour identifier les mouches. Cet article présente une méthode simple et non invasive pour l'étiquetage Drosophila qui leur permet d'être identifiés individuellement dans des expériences, en utilisant le colorant alimentaire. Cette méthode est utilisée dans les essais où deux mâles sont en concurrence pour se accoupler avec une femelle. Teinture permis l'identification rapide et facile. Il n'y a, cependant, une certaine différence dans la force de la coloration pour les trois espèces testées. Les données sont présentées montrant le colorant a un faible impact sur le comportement d'accouplement que le CO 2 chez la drosophile mélanoGaster. L'impact de CO 2 est disponible anesthésie dépendre de l'espèce de la drosophile, avec D. pseudoobscura et D. subobscura montrant aucun impact, tandis que D. melanogaster mâles avaient réduit succès d'accouplement. Procédé de teinture présenté est applicable à une large gamme de modèles expérimentaux.
Introduction
Au cours des dernières décennies, il a été un intérêt croissant dans la façon dont la sélection et la compétition sexuelle entre les hommes impact sur l'évolution de 1,2. Les expériences sur le comportement d'accouplement ont joué un rôle important dans le développement et tester des théories de la sélection sexuelle 3,4. En particulier les espèces, de recherche utilisant du genre Drosophila, a grandement contribué à la compréhension de la sélection sexuelle et le comportement. Cependant, il est important de déterminer si des techniques couramment utilisées pourraient biaiser artificiellement les résultats d'expériences d'accouplement 5,6 standards.
L'anesthésie est souvent utilisé pour la manipulation et l'identification dans des expériences 7. Par exemple, les mouches sont généralement collectés avant l'accouplement, ou triés dans génotypes ou traitements expérimentaux utilisant du dioxyde de carbone (CO 2) anesthésique. Dans les expériences où deux ou plusieurs personnes doivent être distingué, il est de pratique courante pour anesthésier la fls et clip partie de l'aile hors d'identifier chaque individu, groupe ou le traitement 5,8. Il est essentiel, cependant, de comprendre comment CO 2 traitement aura une incidence sur le comportement. L'effet de l'anesthésie de CO 2 a été examiné dans Drosophila melanogaster dans laquelle les mâles exposés au CO 2 a pris beaucoup plus de temps pour se accoupler et globale eu du succès d'accouplement inférieure que les hommes ou les hommes non-anesthésié anesthésiés en utilisant l'exposition au froid 5. Cet effet a été observé à la fois lorsque l'anesthésie a été appliquée sur le jour de l'expérience et lorsque les mouches ont reçu un jour à récupérer. Cependant, cette étude a été limitée dans les essais ne examinant où un seul mâle a été présenté à chaque femelle 5. Un scénario plus réaliste est pour une femme de rencontrer plusieurs mâles 9,10, permettre la concurrence entre les hommes, ce qui pourrait permettre la détection des pertes plus subtiles de remise en forme masculine due à l'anesthésie. L'utilisation de CO 2 a également anesthésiefr trouvé pour réduire la fécondité et la longévité des adultes D. melanogaster quand ils sont exposés peu de temps après l'éclosion, comme ce est souvent lors de la collecte vierge vole 11.
Une alternative à l'anesthésie CO 2 est de marquer les mouches en les nourrissant d'aliments colorés avec un colorant 4,6,10,12,13. Ce colorant pénètre dans l'intestin de la mouche et est visible à travers l'abdomen, ce qui permet mouches de couleur pour être distingués de vol non colorés ou marqués de vol avec une couleur différente. Les méthodes diffèrent dans la manière dont cela peut être appliqué: d'être ajouté directement à l'aliment 12, par l'intermédiaire de la pâte de levure-teinte complémentaire 6, ou par exposition à une nouvelle teinte substrat de produit alimentaire 13. Ces techniques de marquage semblent montrer aucun effet sur 4,6 de la capacité d'accouplement. Cependant, un document examinant directement les effets de la même colorant alimentaire sur adultes D. melanogaster a trouvé une forte réduction de la durée de vie 14. Des travaux antérieurs ont également porté almost entièrement D. melanogaster, à la fois en ce qui concerne les effets de l'anesthésie de CO 2 5,11 et colorant alimentaire 14 méthodes. Actuellement, il ya peu d'informations sur la façon dont le CO 2 anesthésie ou l'utilisation de la coloration intestinale affecte le comportement d'accouplement des autres drosophile.
L'étude suivante évalue l'effet de CO 2 anesthésie sur le comportement d'accouplement de trois espèces de Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura, et D. subobscura). L'effet de la collecte des mouches sur le CO 2 a été examiné à la fois simple et deux essais d'accouplement mâle. L'effet de CO 2 a également été trouvé pour varier en D. melanogaster 5 et ainsi de différentes périodes de latence entre l'exposition au CO 2 et l'accouplement ont été testés. Une méthode pour écrêtage anesthésie et l'aile marquage alternatif: l'utilisation de colorants alimentaires pour colorer vol est également évaluée.
Protocol
1. Préparation de Fly alimentaire avec du colorant alimentaire
- Prenez un flacon Drosophila standard avec environ 20 ml de nourriture dans le fond (figure 1). Utilisation suivant la recette de mélange de la nourriture en utilisant 1 litre d'eau bouillante: 10 g de gélose, 85 g de dextrose, 60 g de farine de maïs, 40 g de levure, et on agite pendant 5 min de fermenter. Ajouter 25 ml de 10% nipagen une fois que le mélange est refroidi à 75 ° C.
- Après la nourriture a refroidi et solidifié ajouter deux gouttes (environ 0,5 à 1 ml) de colorant alimentaire bleu en haut de la nourriture et répartis sur toute la surface du flacon (Figure 1). Utilisez un colorant de couleur différente si l'on préfère.
- Laisser la nourriture pendant deux jours dans le réfrigérateur afin que le colorant est absorbé par la couche supérieure de la nourriture; cela évite d'endommager l'humidité excessive vol pendant la période de maturation. Ajouter un petit morceau de papier de soie si l'humidité excessive est toujours un problème pour éponger l'humidité supplémentaire et ensuiteenleve le.
- Transfert d'oiseau sur les aliments individuellement ou en groupes.
Remarque: Les mouches gagneront coloration intestinale sein un jour d'être placé sur la nourriture. En variante, mûrir pleinement les mouches sur la nourriture teints avant l'expérience (augmentation de la mortalité pendant la période de maturation n'a pas été observé de l'exposition à colorant alimentaire). - Vérifiez que les mouches teints peuvent être facilement distingués des mouches non teints. Se ils ne peuvent être distingués, répétez les étapes 1.1 à 1.4 en utilisant soit une concentration plus élevée de colorant, ou un colorant différent.
2. Deux essais d'accouplement mâles, en utilisant colorant alimentaire
- Pour produire des descendants, configurer plusieurs flacons contenant des paires de mouches mâles et femelles (petits groupes de mâles et les femelles sont également appropriés, bien prendre soin d'éviter l'entassement des larves). Autoriser les femelles à pondre des oeufs et se déplacent les mouches à de nouveaux flacons tous les 5-7 jours. flacons de conserver à une température appropriée pour les espèces d'intérêt (22 ° C fou D. pseudoobscura et D. subobscura et 25 ° C pendant D. melanogaster).
- Avant de recueillir les mouches expérimentales supprimer toutes les mouches des flacons de collecte à un temps de jeu avant de recueillir des mâles et des femelles pour se assurer qu'ils seront vierges (D. melanogaster - 6 h à 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 h à 22 ° C, et D. subobscura - 24 h à 22 ° C).
Remarque: Si les mouches ne sont pas vierge cette volonté biais de leur comportement lors des essais d'accouplement 15.- Store et mâle adulte individuellement dans des flacons mm en plastique standard 75 x 20 (~ 20 ml contenant de la nourriture). Cela évite les effets négatifs sur le comportement d'accouplement mâle et remise en forme vu chez certaines espèces où les mâles sont gardés en groupes 16.
- Exposer la moitié des hommes du traitement désiré (CO 2 anesthésie dans ce cas). Utilisez un tapis de CO 2 ou appuyez sur pour exposer les mouches pendant le temps nécessaire. moitié de magasin du males dans chaque traitement sur les aliments de couleur jusqu'à ce que l'accouplement a lieu. Cela leur permettra de distinguer visuellement au cours des essais d'accouplement.
- Pour transférer vol utilisent un aspirateur 17. Étiqueter chaque flacon pour identifier à la fois le traitement et l'état de couleur du mâle. Ici, utiliser quatre traitements (anesthésie, non-couleur = G-NC, l'anesthésie, de couleur = GC, sans anesthésie, non coloré, NG-NC, et aucune anesthésie, coloré, NG-C).
- Transfert femelles nouvellement écloses dans des flacons de produits frais à mûrir en tant que groupes de dix.
- Permettre aux mouches de mûrir à l'âge d'accouplement (D. melanogaster - 3 jours, D. pseudoobscura - cinq jours, D. subobscura - 7 jours 18 magasin vole à une température appropriée pour les espèces étudiées (par exemple, 22 ° C D. . pseudoobscura et D. subobscura et 25 ° C pendant D. melanogaster).
- Déplacez les femelles à des flacons individuels (suiteaining ~ 20 ml de nourriture) un jour avant le procès d'accouplement pour l'acclimatation à la fiole d'accouplement. Marquez ces flacons de telle sorte que les flacons peuvent être différenciés. Soyez prudent pour aveugler l'expérience en utilisant l'étiquetage neutre (ce est à dire, de 1 à 150) de sorte qu'il ne est pas possible de deviner l'identité de vol dans ne importe quel flacon.
Remarque: La personne qui met les mouches dans chaque flacon devra connaître l'identité de vol placés dans chaque flacon, elles signaleront dont le traitement a été souillé. Cependant, l'observateur qui regarde l'accouplement ne doit pas connaître leur identité. Pour ce faire, au moins deux expérimentateurs seront nécessaires, une à installer et une à observer. - Commencer les essais d'accouplement entre 10 à 12 heures du matin, ou à un moment qui coïncide avec la lumière venant dans le cycle lumière / obscurité vol sont exposés à («aurore» pour les mouches). Ajouter deux mouches mâles à chaque flacon d'accouplement (contenant une seule mouche femelle) à l'aide d'un aspirateur. Veiller à ce que les deux hommes sont de différents traitements (anesthésie oucontrôle) et que l'on a coloration intestinal pour permettre de les différencier les uns des autres, et notez ce qui est mâle coloré.
- Si l'accouplement a lieu, enregistrer l'état de l'homme qui se accouple (soit en couleur ou non - de couleur). Si les essais durent 2 h, assument la femelle ne se accoupler.
Note: 2 h est approprié pour ces espèces, mais d'autres Drosophila peut avoir besoin de plus ou moins de temps.
3. seul mâle essais d'accouplement
- Pour les essais Homme seul, répéter protocole n ° 2 avec deux changements:
- Dans l'étape 2.3 ne gardez pas les hommes sur les aliments de couleur.
- A l'étape 2.7, ajouter un seul mâle à chaque flacon.
- A l'étape 2.8, enregistrer le temps à la volée est ajouté à la fiole, le démarrage de l'accouplement et le temps l'accouplement terminé devraient être enregistrées. De ces valeurs, calculer succès de l'accouplement, la latence, et la durée.
4. Analyse des données
- Utilisez le paquet de statistiques approprié pour analyse. Si les données sont normales et ne ont que deux traitements, utiliser des tests t ou modèle équivalent linéaire généralisé (GLM). Pour deux expériences de sexe masculin, utiliser des tests binomiale ou un GLM binomial qui sont disponibles dans un paquet de statistiques de base.
Remarque: Pour les données d'exemple, toutes les analyses ont été effectuées dans la version 3.0.3 R 19. - Vérifiez les données accouplement de latence et la durée de l'accouplement de la normalité, en traçant histogrammes de fréquence des temps de latence et la durée pour chaque traitement 20, et en utilisant un test de normalité comme Shapiro-Wilk. Si ce ne est pas normal, transformer ou utiliser statistiques équivalentes non paramétriques 20.
Remarque: Pour les données d'exemple des expériences simples masculins transformation logarithmique a rencontré les exigences de normalité et d'égalité des variances. - Si les données peuvent être normalisées, utilisation des tests t pour examiner les différences entre l'accouplement et la durée de latence dans les simples essais d'accouplement mâles en utilisant deux traitements 21. Si plusieurs traitements sont utilisés,essayez une analyse de variance (Anova) 20. Si les données ne peuvent être normalisées, essayez des tests non paramétriques équivalentes 21.
- Utilisez les tests binomiaux pour tester un effet de soit colorant alimentaire ou de CO 2 anesthésie sur le succès d'accouplement des mâles concurrents 20. Si plusieurs traitements sont utilisés, comme ce est le cas avec les données d'exemple, utiliser un GLM avec une structure d'erreur binomiale 21.
- Pour les deux essais de sexe masculin dans les données d'exemple, utilisez GLM avec des structures d'erreur binomiale. Un GLM examiné couleur comme une variable de réponse (couleur = 0 et non-couleur = 1) avec des espèces, l'état de gaz, et le traitement de gaz monté en explicative variables.One GLM examiné CO 2 comme une variable de réponse (gazés = 0 et non-gazés = 1) avec des espèces, l'état de la couleur, et de traitement de gaz équipés. Dans chaque cas, produire le modèle maximale, et effectuer simplification du modèle basé sur 20 AIC.
Representative Results
Deux essais d'accouplement mâle - L'effet de l'anesthésie de CO 2 sur le comportement d'accouplement
Le meilleur modèle trouvé pour expliquer la variation de l'effet de CO 2 contenue anesthésie espèces comme facteur (avec pseudoobscura D. et D. subobscura condensé comme ils ont montré aucune différence entre les uns les autres). Dans D. pseudoobscura et D. subobscura il n'y avait aucun effet significatif de CO 2 anesthésie en cas de succès de l'accouplement dans deux essais de sexe masculin (Z 1589 = 0,087, P = 0,931). Pour D. melanogaster, les mâles exposés à CO 2 anesthésie avaient succès d'accouplement significativement plus faible (= 2,467 Z1,589, P = 0,014). Il y avait aussi une interaction significative entre les espèces et le traitement (χ 2 = 6,83 1,589, P = 0,009) avec un effet plus être vu quand D. melanogaster ont été exposés au gaz lors de la collecte ou un jour avant que des essais (tableau 1). However, D. melanogaster mâles exposés à CO 2 deux jours avant le procès expérimentale ne ont pas montré un effet de CO 2.
Deux essais d'accouplement mâle - L'effet de la coloration intestinale sur le comportement d'accouplement
Modèle simplification montré aucun effet significatif de colorant alimentaire étant trouvé pour l'une des trois espèces (P> 0,1). Lorsque le traitement ou l'état de gaz ont été inclus dans l'analyse ci ne étaient pas non significative (P> 0,1). Les proportions des croisements réussis pour les mouches de couleur à travers les traitements sont présentés dans le tableau 2. La différence de coloration entre les mouches reprend en colorée et non colorée alimentaire peut être vu sur la figure 1. L'intensité de la coloration des aliments intestinal était supérieure à D. pseudoobscura et D. subobscura que dans D. melanogaster.
Accouplement essais simples - L'effet de l'utilisation de CO 2 m sur l'anesthésiele comportement de fonc-
Il n'y avait pas de différence dans la latence accouplement pour l'une des trois espèces de CO 2 lors de l'anesthésie a été utilisé pour recueillir récemment émergé adultes. Un effet a été trouvé pour la durée de l'accouplement dans D. subobscura quand elle a été exposée au CO 2 de deux jours avant les essais d'accouplement (figures 2 et 3; tableau 2).
Figure 1. Photo montrant flacons de couleur et coloré Fly Alimentation Non (A) et la force de intestinale Coloration à Malé D. Subobscura (B).
Figure 2. La moyenne et 95% des intervalles de confiance pour Copulation latence pour les trois espèces étudiées dans les essais Homme seul, lorsque les mâles étaient Anesthésierd (barres légères) ou non anesthésiés (barres foncées) lors Perçues comme vierges avant la maturité sexuelle.
Figure 3. La moyenne et 95% Intervalles de confiance à la copulation Durée pour les trois espèces étudiées dans les essais Homme seul, lorsque les mâles ont été anesthésiés (barres lumineuses) ou non Anesthésié (barres foncées) lors de la collecte que Vierges avant la maturité sexuelle.
| Traitement | Espèce | No. essais | No. mouches colorées qui se sont accouplés | p-valeur | No. mouches gazés qui se sont accouplés | p-valeur |
| Collection de CO 2 | D. mel | 73 | 36 | 1 | 27 | 0,0344 |
| D. pse | 79 | 41 | 0,8221 | 44 | 0,3682 | |
| D. sous | 71 | 40 | 0,3425 | 33 | 0,6353 | |
| Exposés à CO 2 18 heures avant | D. mel | 57 | 28 | 1 | 19 | 0,0163 |
| D. pse | 65 | 32 | 1 | 31 | 0,8043 | |
| D. sous | 68 | 38 | 0,3961 | 35 | 0,9036 | |
| Exposés à CO 2 deux jours. | D. mel | 56 | 19 | 0,0222 | 32 | 0,3497 |
| D. pse | 70 | 32 | 0,5504 | 33 | 0,7202 | |
| D. sous | 56 | 29 | 0,8939 | 26 | 0,6889 </ Td> |
Tableau 1. Résultats de deux expériences Homme Choice toutes les espèces et traitements examinés.
| Espèce | Trait | df | t-valeur | p-valeur |
| D. melanogaster | Latence | 58 | 1,379 | 0,174 |
| Durée | 58 | 1,243 | 0,221 | |
| D. pseudoobscura | Latence | 109 | 0,419 | 0,676 |
| Durée | 109 | 0,436 | 0,664 | |
| D. subobscura | Latence | 83 | 0,098 | 0,922 |
| Durée | 83 | 1,767 | 0,081 |
Tableau 2. Résultats de se accoupler expériences simples examinant l'effet de la collecte sur le CO 2 Anesthésie sur le accouplement latence et la durée. Les tests ont été réalisés sur trois espèces de Drosophila melanogaster (D., D. et D. pseudoobscura subobscura).
Discussion
Ces données montrent que l'impact de CO 2 anesthésie est incompatible entre les espèces, avec deux des trois espèces présentant peu d'impact. Nos résultats suggèrent étiquetage avec un colorant alimentaire a eu un impact plus faible sur le succès de l'accouplement mâle que le CO 2 anesthésie pour D. melanogaster. Ces expériences démontrent que les colorants alimentaires peuvent facilement et à moindre coût être utilisés pour marquer les mouches pour des essais d'accouplement impliquant plusieurs mâles.
Parmi les trois modèles espèces Drosophila examiné, seulement D. melanogaster a montré un effet de CO 2 anesthésie sur l'accouplement dans une situation concurrentielle. En revanche, aucune des espèces a montré un effet de la collecte sur le gaz dans les essais d'accouplement simples en termes de temps de latence accouplement, contrairement aux résultats précédents pour D. 5 melanogaster. L'effet de la concurrence pourrait donc être en soulignant les effets de conditionnement physique plus subtiles de CO 2 anesthésie, qui ne sont détectablesdans des situations où la concurrence est mâle-mâle. Exposition au début de la collecte et un jour avant le procès ont un effet négatif sur la capacité des hommes de D. melanogaster pour gagner un accouplement. Exposition deux jours avant le procès mais n'a pas montré d'effet. Tant D. pseudoobscura et D. subobscura n'a montré aucun effet de l'exposition au gaz dans l'un des essais. Une explication est que D. melanogaster était vulnérable à l'exposition précoce à CO 2, car il doit être collecté tôt dans la vie (0 - 6 h vieux) que les autres espèces pour se assurer mâles sont vierges. Ainsi mâle D. melanogaster de cet âge peut être plus sensible que la cuticule de la mouche est encore durcissement, par rapport aux autres espèces qui ont eu longtemps pour leur cuticule à durcir. En général, cela soutient l'idée que les effets du CO 2 anesthésie sont des espèces spécifiques et les enquêteurs devraient tester correctement l'effet dans leurs espèces cibles. Currently, la majorité des travaux sur l'effet de CO 2 anesthésie a été réalisée sur Drosophila melanogaster 5,11,22 et donc peut-être pas approprié d'appliquer à d'autres espèces apparentées.
Procédé non invasif pour différencier variante présentée vol est un colorant alimentaire. Les résultats suggèrent ce traitement n'a eu aucun effet en travers toutes les espèces examinées. Toutefois, bien que son utilisation a réussi à fournir un marqueur pas cher et facilement visible pour distinguer entre les individus, il convient de noter que le colorant était plus facile à distinguer dans D. pseudoobscura et D. subobscura que dans D. melanogaster. Précédent auteurs ont utilisé plusieurs couleurs (rouge, vert et bleu) 4,6. Nous avons trouvé coloration bleue d'être les plus faciles à distinguer dans toutes les espèces, en particulier D. pseudoobscura et D. subobscura. En utilisant plusieurs couleurs serait éventuellement permettre des expériences plus complexes avec plusieurs flie marqués individuellements. Cependant, des tests préliminaires de différents colorants sont essentiels, comme certains colorants alimentaires ne parviennent pas à colorer les mouches, pouvant être digéré lorsqu'ils sont consommés. D'autres colorants peuvent avoir des effets toxiques et réduire la survie des mouches, et doivent être évités 14). Méthodes de colorants alimentaires alternatifs utilisant des colorants plus chers ont également été utilisés pour examiner l'intégrité intestinale pour D. melanogaster 23. Ceux-ci peuvent fournir une alternative, bien que plus coûteux, procédé de teinture 23.
La méthode de teinture est aussi rapide que le CO 2 aile écrêtage que les mouches peuvent être stockés sur la nourriture teinte de la collection. L'absorption de la nourriture était rapide (~ 3 h), afin que le stockage O / N sur les aliments de couleur serait également suffisante pour marquer les mouches, tel qu'il est utilisé dans d'autres études 6. Toutefois, la durée de la coloration est relativement courte (~ 4-5 h) par rapport à l'écrêtage de l'aile (permanente) ou de la poussière marquage fluorescent (10-12 jours) 24. Comme espèces Drosophilavarient en apparence, différents colorants seront plus ou moins efficaces pour différentes espèces, et comme certaines souches (par exemple, les mutants knock-out) peuvent être vulnérables aux changements dans le régime alimentaire, l'utilisation d'un colorant nécessite un test préliminaire de son efficacité en particulier si plus exposition à long terme à des colorants peut être toxique 14. A la différence de l'étude par Kalaw et al. 14, nous avons trouvé aucune mortalité significative après un stockage de plusieurs jours sur les aliments colorés pour D. melanogaster (3 jours), D. pseudoobscura (5 jours), ou D. subobscura (7 jours), probablement en raison de la différence de colorant utilisé.
L'étape critique pour une bonne utilisation de la technique de colorant est l'étape 1.5, en validant ce que le colorant choisi fonctionne bien avec l'espèce et la souche utilisée. Une autre technique consiste à appliquer de la poussière de couleur à l'extérieur de la mouche avant l'utilisation dans des expériences sur le terrain 24. Cette méthode a été utilisée pour le suivi des individus dans le domaine en raison to la durée de marquage et la facilité de la masse de marquage 24 mouches. Bien que nous ne avons pas explicitement testé cette méthode dans des essais d'accouplement, il serait important d'examiner les effets que la poussière pourrait avoir sur les sens importants dans l'accouplement, en particulier chez la drosophile 25, 26. Chez les espèces, cependant, où la teinture intestinale ne est pas possible, ces méthodes pourraient convenir.
En conclusion, nous avons constaté que dans deux des trois espèces testées (D. et D. pseudoobscura subobscura) n'a été trouvée soit de CO 2 anesthésie ou colorant alimentaire sur la capacité d'accouplement des mâles aucun effet. Pour D. melanogaster un effet négatif de CO 2 anesthésie a été détectée, mais colorant alimentaire n'a pas affecté succès de l'accouplement de cette espèce. Dans l'ensemble, le procédé de teinture fournit un procédé simple et non invasive et pas cher pour identifier Drosophila individu qui est équivalente ou supérieure à celle des méthodes qui nécessitent CO 2 anesthésie. Ilest probablement cette méthode fonctionne à travers une gamme d'espèces.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Alex Hitchen et Meg Booth pour leur aide avec les essais d'accouplement. Ce travail a été soutenu par le NERC subvention NE / H015604 / 1 à TP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
| Fine mesh | Any haberdashery | - | Fine curtain mesh is suitable |
| 1 ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
| Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
| Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
| Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | - | Other dye colours and brands can have variable results. |
| CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
| Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
| Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |
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