Abstract
Experimentos de apareamiento utilizando Drosophila han contribuido en gran medida a la comprensión de la selección y el comportamiento sexual. Los experimentos a menudo requieren métodos sencillos, fáciles y baratas para distinguir entre los individuos en un juicio. Una técnica estándar para esto es CO 2 anestesia y luego etiquetar o ala de recorte cada marcha. Sin embargo, esto es invasivo y se ha demostrado que afecta el comportamiento. Otras técnicas han utilizado coloración para identificar moscas. En este artículo se presenta un método simple y no invasivo para el etiquetado de Drosophila que les permita ser identificados individualmente dentro de experimentos, utilizando colorante de alimentos. Este método se utiliza en los ensayos en los dos machos compiten para aparearse con una hembra. Teñido permitió la identificación rápida y fácil. Hubo, sin embargo, alguna diferencia en la intensidad de la coloración a través de las tres especies ensayadas. Los datos se presentan mostrando el tinte tiene un menor impacto en el comportamiento de apareamiento de CO 2 en Drosophila melanogaster. El impacto de la anestesia CO 2 se muestra a depender de las especies de Drosophila, con D. pseudoobscura y D. subobscura mostrando ningún impacto, mientras que D. machos melanogaster habían reducido el éxito de apareamiento. El método de colorante presentada es aplicable a una amplia gama de diseños experimentales.
Introduction
Durante las últimas décadas se ha producido un creciente interés en la forma en la selección sexual y la competencia entre los machos impacto en la evolución 1,2. Los experimentos sobre el comportamiento de apareamiento han jugado un papel importante en el desarrollo y prueba las teorías de la selección sexual 3,4. En particular las especies, investigación usando del género Drosophila, ha contribuido en gran medida a la comprensión de la selección y el comportamiento sexual. Sin embargo, es importante investigar si las técnicas comúnmente utilizadas pueden sesgar artificialmente los resultados de experimentos de apareamiento estándar 5,6.
Anestesia se usa a menudo para la manipulación y la identificación en los experimentos 7. Por ejemplo, las moscas se recogen comúnmente antes del apareamiento, o clasifican en genotipos o tratamientos experimentales utilizando dióxido de carbono (CO 2) anestésico. En experimentos en los que hay que distinguir dos o más personas, es una práctica común para anestesiar la flies y clip de parte del ala de identificar cada grupo individual o tratamiento 5,8. Es vital, sin embargo, para entender cómo CO 2 tratamiento afectará el comportamiento. El efecto del CO 2 anestesia ha sido examinado en Drosophila melanogaster en la que machos expuestos a CO 2 tomó mucho más tiempo para aparearse y en general tuvimos éxito de apareamiento más bajo que los hombres o los hombres no anestesiado anestesiado mediante la exposición al frío 5. Este efecto se observó tanto cuando se aplicó anestesia en el día del experimento y cuando las moscas se les dio un día para recuperarse. Sin embargo, este estudio fue limitado en los ensayos que examinaban donde un solo macho se presentó a cada mujer 5. Un escenario más realista es para una mujer encontrar varios machos 9,10, lo que permite la competencia entre los machos, que podrían permitir la detección de pérdidas más sutiles de la aptitud masculina debido a la anestesia. El uso de anestesia CO 2 también ha seres encontrado para reducir la fecundidad y la longevidad de los adultos de D. melanogaster cuando se exponen poco después de la eclosión, como es común en la recogida de virgen vuela 11.
Una alternativa a CO 2 anestesia es marcar moscas alimentándolos coloreado con colorante 4,6,10,12,13 alimentos. Este colorante entra en los intestinos de la marcha y es visible a través del abdomen, lo que permite moscas de colores para distinguir de moscas incoloro, o de las moscas marcados con un color diferente. Los métodos difieren en la forma en que esto puede ser aplicado: se añade directamente a la comida 12, a través de teñido de pasta de levadura suplementaria 6, o mediante la exposición a una novela teñido sustrato alimenticio 13. Estas técnicas de marcado parecen mostrar ningún efecto sobre 4,6 capacidad de apareamiento. Sin embargo, un documento de examinar directamente los efectos de la misma colorante de alimentos en adultos de D. melanogaster encontró una fuerte reducción de la vida útil 14. El trabajo previo se ha centrado también almost enteramente en D. melanogaster, tanto con respecto a los efectos de la anestesia de CO 2 5,11 y alimentos para colorear 14 métodos. Actualmente, hay poca información sobre cómo CO 2 anestesia o el uso de coloración intestinal afecta al comportamiento de apareamiento de otra Drosophila.
El siguiente estudio evalúa el efecto del CO 2 anestesia en el comportamiento de apareamiento de tres especies de Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura y D. subobscura). El efecto de la recolección de moscas en CO 2 fue examinado tanto en dos ensayos de apareamiento masculino individual y. El efecto de CO 2 también se ha encontrado a variar en D. melanogaster 5 y así diferentes períodos de latencia entre la exposición a CO 2 y el apareamiento se pusieron a prueba. Un método para recorte de la anestesia y el ala marcado alternativa: Se evaluó también el uso de los colorantes de alimentos para teñir las moscas.
Protocol
1. Preparación de Alimentos Fly con colorante de alimentos
- Tomar un vial estándar Drosophila con aproximadamente 20 ml de la comida en la parte inferior (Figura 1). Utilice la siguiente receta para la mezcla de alimentos utilizando 1 L de agua hirviendo: 10 g de agar, 85 g de dextrosa, 60 g de harina de maíz, 40 g de levadura, y se agita durante 5 min de cocer a fuego lento. Añadir 25 ml de 10% nipagen una vez que la mezcla se ha enfriado a 75 ° C.
- Después de la comida se ha enfriado y solidificado añadir dos gotas (aproximadamente 0,5 a 1 ml) de colorante azul de la parte superior de la comida y se extienden por toda la superficie del vial (Figura 1). Utilice un tinte de color diferente, si se prefiere.
- Deje la comida durante dos días en la nevera para que el colorante es absorbido por la capa superior de los alimentos; esto evita el exceso de humedad dañar las moscas durante el período de maduración. Añadir un pequeño trozo de papel de seda, si la humedad excesiva sigue siendo un problema para secar la humedad extra y, posteriormente,removerlo.
- Transferencia vuela sobre el alimento, ya sea de forma individual o en grupos.
Nota: Las moscas ganarán tinción intestinal dentro de 1 día de ser colocado en la comida. Alternativamente, madurar plenamente las moscas en la comida teñido antes del experimento (aumento de la mortalidad durante el período de maduración no se observó a partir de la exposición al colorante alimenticio). - Compruebe que las moscas teñidos pueden distinguirse fácilmente de las moscas no teñidos. Si no pueden distinguirse, repita los pasos 1.1 a 1.4 utilizando una mayor concentración de colorante, o un colorante diferente.
2. Dos ensayos de apareamiento masculino el uso de alimentos para colorear
- Para la producción de progenie, configurar varios viales que contienen pares de moscas hembras y machos (pequeños grupos de hombres y mujeres también son adecuadas, aunque tenga cuidado para evitar el hacinamiento de las larvas). Permita que las hembras pongan huevos y se mueven las moscas a los nuevos viales cada 5-7 días. Guarde los viales a una temperatura adecuada para la especie de interés (22 ° C fo D. pseudoobscura y D. subobscura y 25 ° C para D. melanogaster).
- Antes de recoger las moscas experimentales eliminan todas las moscas de los viales de concentración en un tiempo determinado antes de recoger los machos y hembras para asegurar que serán vírgenes (D. melanogaster - 6 horas a 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 horas a 22 ° C, y D. subobscura - 24 horas a 22 ° C).
Nota: si las moscas no son virgen este sesgo voluntad de su comportamiento en los ensayos de apareamiento 15.- Tienda y macho maduro individualmente en 75 x 20 mm viales de plástico estándar (que contiene ~ 20 ml de alimento). Esto evita los impactos negativos en el comportamiento de apareamiento masculino y fitness visto en algunas especies cuando los machos se mantienen en grupos de 16.
- Exponga la mitad de los varones para el tratamiento deseado (CO 2 anestesia en este caso). Use un tapete CO 2 o toque para exponer las moscas durante el tiempo requerido. Media tienda del males en cada tratamiento en los alimentos de color hasta que el apareamiento tiene lugar. Esto hará que sean visualmente distinguibles durante los ensayos de apareamiento.
- Para la transferencia de moscas utilizan un aspirador 17. Etiqueta de cada vial para identificar tanto el tratamiento y el estado de color de la masculina. Aquí, utilizar cuatro tratamientos (anestesia, no coloreado = G-NC, anestesia, color = GC, sin anestesia, no coloreado, NG-NC, y sin anestesia, coloreado, NG-C).
- Traslado hembras recién emergidas en viales de alimentos frescos a madurar como grupos de 10.
- Permitir moscas maduren a la edad de apareamiento (D. melanogaster - 3 días, D. pseudoobscura - 5 días, D. subobscura - 7 días 18 tienda moscas a una temperatura adecuada para la especie en estudio (por ejemplo, 22 ° C para D. . pseudoobscura y D. subobscura y 25 ° C para D. melanogaster).
- Mueva las hembras a viales individuales (containing ~ 20 ml de alimento) 1 día antes de la prueba de apareamiento para la aclimatación al vial de apareamiento. Marque estos viales a fin de que los viales se pueden diferenciar. Tenga cuidado para cegar el experimento mediante el uso de etiquetado neutro (es decir, de 1 - 150) por lo que no es posible adivinar la identidad de las moscas en cualquier vial.
Nota: La persona que ponga las moscas en cada vial tendrá que conocer la identidad de las moscas colocados en cada vial, ya que se tenga en cuenta que el tratamiento estaba manchada. Sin embargo, el observador que mira el apareamiento no debe conocer su identidad. Para ello se necesitarán esto por lo menos dos experimentadores, uno de configurar y uno de observar. - Comience los ensayos de apareamiento entre 10-12 am, o en un momento que coincide con la luz que entra en el ciclo luz / oscuridad de las moscas están expuestos a ("amanecer" para las moscas). Añadir dos moscas macho a cada tubo de acoplamiento (que contiene una sola mosca femenino) utilizando un aspirador. Asegúrese de que los dos hombres son de diferentes tratamientos (anestesia ocontrol) y que uno tiene tinción intestinal para que sea posible diferenciarlos unos de otros, y tenga en cuenta que masculina está manchado.
- Si se produce la cópula, registrar el estado del macho que se acopla (ya sea de color o no - de color). Si los ensayos tienen una duración de 2 horas, asumen la hembra no se acoplará.
Nota: 2 horas es adecuado para estas especies, pero aparte de Drosophila puede necesitar más o menos tiempo.
3. Individual Masculino ensayos de apareamiento
- Para los ensayos individuales masculinos, repita Protocolo 2 con dos cambios:
- En el paso 2.3 no guarde los hombres en los alimentos de color.
- En el paso 2.7, añadir un solo macho a cada vial.
- En el paso 2.8, registrar el tiempo se añade la marcha para el vial, el tiempo de los apareamiento comienza y la hora del apareamiento terminado deben ser registrados. A partir de estos valores, calcular el éxito de apareamiento, la latencia y duración.
Análisis 4. Datos
- Utilice paquete estadístico adecuado para analisis. Si los datos son normales y sólo tienen dos tratamientos, utilizar pruebas t o equivalente Modelo Lineal Generalizado (GLM). Durante dos experimentos masculinos, utilizar pruebas binomiales o un GLM binomio que están disponibles en cualquier paquete básico de estadísticas.
Nota: Para obtener los datos de ejemplo, todos los análisis se llevaron a cabo en R versión 3.0.3 19. - Compruebe los datos de latencia de apareamiento y duración de apareamiento de normalidad, por el trazado de histogramas de frecuencia de latencia y duración para cada tratamiento 20, y el uso de una prueba de normalidad como de Shapiro-Wilk. Si no es normal, transformarlo, o utilizar las estadísticas equivalentes no paramétricas 20.
Nota: Para los datos del ejemplo de los experimentos individuales masculinos registran transformación cumplía con los requisitos de la normalidad y la igualdad de las diferencias. - Si los datos pueden ser normalizada, utilice pruebas t para examinar las diferencias entre la latencia de apareamiento y la duración de los ensayos individuales de apareamiento masculino cuando se utilizan dos tratamientos 21. Si se utilizan varios tratamientos,intentar un análisis de varianza (ANOVA) 20. Si los datos no se pueden normalizar, trate de pruebas no paramétricas equivalentes 21.
- Utilice pruebas binomiales para la prueba de un efecto de cualquiera de colorante de alimentos o de CO 2 anestesia en el éxito de apareamiento de los machos que compiten 20. Si se utilizan varios tratamientos, como es el caso con los datos de ejemplo, utilizar un GLM con estructura de error binomial 21.
- Para los dos ensayos masculinos en los datos de ejemplo, utilice GLM con estructuras de error binomial. Uno GLM examinó color como variable de respuesta (a color = 0 e incoloros = 1) con las especies, estado de gas, y el tratamiento de gas equipada como explicativas variables.One GLM examinado CO 2 como variable de respuesta (gaseados = 0 y no gaseados- = 1) con las especies, estado de color, y el tratamiento de gases instaladas. En cada caso, producir el modelo de máxima, y llevar a cabo la simplificación modelo basado en AIC 20.
Representative Results
Dos ensayos de apareamiento masculino - El efecto del CO 2 anestesia en la conducta de apareamiento
El mejor modelo encontrado para explicar la variación en el efecto de CO 2 anestesia contenía especies como un factor (con D. pseudoobscura y D. subobscura fusionado ya que no mostraron diferencias entre sí). En D. pseudoobscura y D. subobscura no hubo un efecto significativo de CO 2 anestesia en el éxito de apareamiento en dos pruebas masculinas (Z 1589 = 0,087, P = 0,931). Para D. melanogaster, machos expuestos a CO 2 anestesia tuvieron éxito en el apareamiento significativamente menor (Z1,589 = 2,467, P = 0,014). También hubo una interacción significativa entre las especies y tratamiento (χ 2 1589 = 6,83, P = 0,009) con un mayor efecto ser visto cuando D. melanogaster fueron expuestos a gas en la colección o 1 día antes de los ensayos (Tabla 1). Sin embarer, D. machos melanogaster expuestas a CO 2 dos días antes de la prueba experimental no mostró un efecto de CO 2.
Dos ensayos de apareamiento masculino - El efecto de coloración intestinal en la conducta de apareamiento
Modelo simplificación no mostró efectos significativos de colorante de alimentos se encuentra en cualquiera de las tres especies (P> 0,1). Cuando el tratamiento o el estado de gas se incluyeron en el análisis también estos no fueron significativos (P> 0,1). Las proporciones de apareamientos exitosos para moscas de colores a través de los tratamientos se muestran en la Tabla 2. La diferencia de coloración entre las moscas mantiene en color y la comida sin color se puede ver en la Figura 1. La intensidad de la coloración de alimentos intestinal fue mayor en D. pseudoobscura y D. subobscura que en D. melanogaster.
Ensayos de apareamiento individuales - El efecto del uso de CO 2 anestesia en mcomportamiento CIONES
No hubo diferencia en la latencia de apareamiento para cualquiera de las tres especies cuando se utilizó CO 2 anestesia para recoger recientemente surgido adultos. Un efecto se encontró para la duración de apareamiento en D. subobscura cuando se expuso a CO 2 dos días antes de los ensayos de apareamiento (Figuras 2 y 3, Tabla 2).
Figura 1. Fotografía que muestra viales de color y no color Mosca de Alimentos (A) y la Fortaleza de Intestinal coloración en Male D. Subobscura (B).
Figura 2. La media y el 95% intervalos de confianza para Cópula Latencia para las tres especies investigado en ensayos individuales masculinos, cuando los machos eran Anestesiard (barras claras) o no anestesiados (barras oscuras) cuando se cobran como vírgenes antes de la madurez sexual.
Figura 3. La media y el 95% intervalos de confianza para la cópula Duración de las tres especies investigado en ensayos individuales masculinos, cuando los machos fueron anestesiados (barras claras) o no Anestesiados (barras oscuras) cuando se cobran como vírgenes antes de la madurez sexual.
| Tratamiento | Especies | Ensayos No. | No. moscas de color que se aparearon | p-valor | No. moscas gaseados que se aparearon | p-valor |
| Colección de CO 2 | D. mel | 73 | 36 | 1 | 27 | 0.0344 |
| D. pse | 79 | 41 | 0.8221 | 44 | 0.3682 | |
| D. sub | 71 | 40 | 0.3425 | 33 | 0.6353 | |
| Expuestos a CO 2 18 horas antes | D. mel | 57 | 28 | 1 | 19 | 0.0163 |
| D. pse | 65 | 32 | 1 | 31 | 0.8043 | |
| D. sub | 68 | 38 | 0.3961 | 35 | 0.9036 | |
| Expuestos a CO 2 2 días. | D. mel | 56 | 19 | 0.0222 | 32 | 0.3497 |
| D. pse | 70 | 32 | 0.5504 | 33 | 0.7202 | |
| D. sub | 56 | 29 | 0.8939 | 26 | 0,6889 </ Td> |
Tabla 1. Los resultados de dos experimentos Hombre Choice para todas las especies y tratamientos examinados.
| Especies | Rasgo | df | t-valor | p-valor |
| D. melanogaster | Estado latente | 58 | 1,379 | 0,174 |
| Duración | 58 | 1,243 | 0,221 | |
| D. pseudoobscura | Estado latente | 109 | 0,419 | 0,676 |
| Duración | 109 | 0,436 | 0,664 | |
| D. subobscura | Estado latente | 83 | 0,098 | 0,922 |
| Duración | 83 | 1,767 | 0,081 |
Tabla 2. Los resultados de experimentos de apareamiento individuales examinar el efecto de la colección de CO 2 anestesia en la latencia de acoplamiento y duración. Las pruebas se llevaron a cabo en tres especies de Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura y D. subobscura).
Discussion
Estos datos muestran que el impacto de la anestesia CO 2 es inconsistente entre especies, con dos de las tres especies que muestran poco impacto. Nuestros resultados sugieren etiquetado con colorante de alimentos tuvo un menor impacto en el éxito de apareamiento masculino de CO 2 anestesia para D. melanogaster. Estos experimentos demuestran que los colorantes de alimentos se pueden utilizar fácilmente y barato para las moscas de la etiqueta para ensayos de apareamiento que involucran múltiples machos.
De las especies de Drosophila tres modelos examinados, solamente D. melanogaster mostró un efecto del CO 2 anestesia en el rendimiento de apareamiento en una situación de competencia. En contraste, ninguna de las especies mostró un efecto de la colección en el gas en los ensayos de apareamiento individuales en términos de latencia de apareamiento, contrariamente a los resultados previos para D. melanogaster 5. Por tanto, el efecto de la competencia podría destacar aptitud efectos más sutiles de la anestesia de CO 2, que sólo son detectablesen situaciones donde hay competencia entre machos. La exposición a la recolección temprana y un día antes del juicio, tienen un efecto negativo en la capacidad de los machos de D. melanogaster para obtener un apareamiento. Exposición dos días antes del juicio, sin embargo, no mostró ningún efecto. Tanto D. pseudoobscura y D. subobscura no mostró ningún efecto de la exposición al gas en ninguno de los ensayos. Una explicación es que D. melanogaster era vulnerable a la exposición temprana a CO 2, ya que debe ser recogido antes en la vida (0-6 horas de edad) que las otras especies para asegurar los machos son vírgenes. Por lo tanto masculina D. melanogaster de esta edad puede ser más sensible como la cutícula de la mosca todavía se está endureciendo, en comparación con las otras especies que han tenido más tiempo para su cutícula a endurecerse. En general, esto apoya la idea de que los efectos del CO 2 anestesia son especies específicas y los investigadores deben probar adecuadamente el efecto en sus especies objetivo. Currently, la mayoría de los trabajos sobre el efecto del CO 2 anestesia se ha realizado en Drosophila melanogaster 5,11,22 y por lo tanto pueden no ser apropiados para aplicar a otras especies relacionadas.
El método no invasivo alternativa presentada para diferenciar las moscas es colorante alimenticio. Los resultados sugieren que este tratamiento no tuvo efecto en el otro lado de todas las especies examinadas. Sin embargo, aunque su uso ha sido satisfactoria en el suministro de un marcador barato y fácilmente visible para distinguir entre los individuos debe tenerse en cuenta que el colorante era más fácil de distinguir en D. pseudoobscura y D. subobscura que en D. melanogaster. Anterior autores han utilizado varios colores (rojo, verde y azul) 4,6. Encontramos coloración azul que es el más fácil de distinguir en todas las especies, en particular D. pseudoobscura y D. subobscura. El uso de varios colores que potencialmente permitir experimentos más complejos con muchos flie marcados individualmentes. Sin embargo, las pruebas preliminares de diferentes tintes son esenciales, ya que algunos colorantes alimentarios no pueden colorear las moscas, posiblemente, ser digerido cuando se consume. Otros colorantes pueden tener efectos tóxicos y reducir la supervivencia de las moscas, y deben evitarse 14). Métodos de coloración de alimentos alternativos que utilizan las manchas más caras también se han utilizado para examinar la integridad intestinal para D. melanogaster 23. Estos pueden ser una alternativa, aunque más caro, método de teñido 23.
El método de tintura es tan rápido como el CO 2 recorte de alas como las moscas se pueden almacenar en la comida teñido de la colección. La absorción de la comida fue rápida (~ 3 h), de modo de almacenamiento de O / N en la comida de color también sería suficiente para marcar moscas, tal como se utiliza en otros estudios 6. Sin embargo, la duración de la coloración es relativamente corto (~ 4 - 5 horas) en comparación con el recorte ala (permanente) o polvo fluorescente marcado (10 - 12 días), 24. Como especie Drosophilavarían en apariencia, diferentes tintes serán más o menos eficaces para las diferentes especies, y como algunas cepas (por ejemplo, los mutantes knock-out) pueden ser vulnerables a los cambios en la dieta, cualquier uso de tinte requiere una prueba preliminar de su eficacia sobre todo si ya La exposición prolongada a los tintes pueden ser tóxicos 14. En contraste con el estudio de Kalaw et al. 14, no encontramos una mortalidad significativa después del almacenamiento durante varios días en los alimentos de colores para D. melanogaster (3 días), D. pseudoobscura (5 días), o D. subobscura (7 días), probablemente debido a la diferencia de colorante utilizado.
El paso crítico para el uso con éxito de la técnica de tinte es el paso 1.5, la validación de que el colorante elegido funciona bien con la especie y la cepa que se utiliza. Una técnica alternativa implica la aplicación de polvo de color hacia el exterior de la mosca antes de su uso en experimentos de campo 24. Este método ha sido utilizado para el seguimiento de individuos en el campo debido to la duración de marcado y la facilidad de los medios de marcado moscas 24. Aunque no hemos probado explícitamente este método en los ensayos de apareamiento, sería importante examinar los efectos que el polvo podría tener sobre los sentidos importantes en el apareamiento, particularmente en Drosophila 25, 26. En las especies, sin embargo, donde el teñido intestinal no es posible, estos métodos podrían ser adecuados.
En conclusión, se encontró que en dos de las tres especies estudiadas (D. pseudoobscura y D. subobscura) no hubo ningún efecto encontrado de cualquiera de CO 2 anestesia o colorante de alimentos en la capacidad de apareamiento de los machos. Para D. melanogaster un efecto negativo de CO 2 anestesia fue detectado, pero colorante de alimentos no afectó el éxito de apareamiento de esta especie. En general, el método del colorante proporciona un método no invasivo sencillo y barato para la identificación de individuo Drosophila que es equivalente o mejor que los métodos que requieren CO 2 anestesia. Ellaes probable que este método funciona a través de una variedad de especies.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Alex Hitchen y Meg stand por su ayuda con los ensayos de apareamiento. Este trabajo fue apoyado por NERC subvención NE / H015604 / 1 al TP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
| Fine mesh | Any haberdashery | - | Fine curtain mesh is suitable |
| 1 ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
| Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
| Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
| Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | - | Other dye colours and brands can have variable results. |
| CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
| Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
| Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |
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