Abstract
の3'UTR中の機能要素の発光識別（3'LIFE）は、照会の3'UTRの何百もの配列内の特定のmiRNAの標的の迅速な同定を可能にします。標的の同定は、miRNAが標的との機能的読み出しを与え、翻訳出力を測定することによって、mRNAレベルでの結合を検出するデュアルルシフェラーゼアッセイに基づいています。 3'LIFEが可能でコスト効率のゲノムワイドな画面を作り、非独占バッファーと試薬、および公的に利用可能なレポーターライブラリを使用しています。 3'LIFEは、標準的な実験室の設定のいずれかで行うか、液体処理ロボットや他の高スループットの計測器を使用してスケールアップすることができます。私たちは人間の96ウェルプレート中でクローニングの3'UTR、および2つのテストのmiRNAのデータセットを使用してのアプローチを例示し、及びmiR-10B-7Cてみましょう 。我々は、96ウェルフォーマットにおいてDNAの調製、トランスフェクション、細胞培養およびルシフェラーゼアッセイを行い、データのためのツールを提供する方法を示し分析。結論3'LIFEで体系的、迅速、高い再現性であり、かつ高い信頼性目標を識別します。
Introduction
この方法の全体的な目標は、検出し、正確に高スループットでマイクロRNA（miRNAの）ターゲットをマッピングすることです。 miRNAは、長さが約22ヌクレオチドの内因性の非コードRNAです。転写および処理に続いて、成熟miRNAは、タンパク質複合体中に組み込まれる（RISC）、複雑なRNA誘導サイレンシングと呼ばれます。各miRNAは、翻訳抑制またはmRNA切断1のいずれかで得られた、主にメッセンジャーRNAの3 '非翻訳領域（3'UTRを）（mRNAを）に位置要素を標的とするためにRISCを誘導します。 miRNAは、標準的なワトソン - クリックしてGに基づいて、標的部位を認識する：Uは、塩基対形成をウォブルし、本質的に縮重している、複数のミスマッチ塩基対を含有し、領域を膨らみました。多くのmiRNAが広く、彼らは生物学的役割の多様な範囲を再生する人間2,3に植物から保存されています。後生動物ではmiRNAは、細胞運命の決定4、発生のタイミング5を含む複数の生物学的プロセスに影響を与えることができます6,7を示します。誤発現のmiRNAは、標的遺伝子の機能のみに基づいて細胞の挙動に大きな影響を持つことができ、異常な遺伝子調節をもたらすことができます。このように、miRNAは、神経変性8,9、糖尿病10及び11を含む癌疾患の広範囲に連結されています。バイオインフォマティクスとウェットベンチアプローチは各miRNAは、ハイスループットまたはゲノムワイドアプローチは潜在的な相互作用のこの大きなプールをプローブするために必要であることを示している、別個のmRNA 12-14の千数百人を標的にすることが可能であり得ることを示唆しています。
標的遺伝子を同定することは機構的に定義するmiRNAの機能の重要なコンポーネントであり、そうするために研究者が大規模に目標を明らかにすることができなければなりません。いくつかのアプローチは、バイオインフォマティクスの予測アルゴリズムを含む、miRNAの標的を同定するためのハイスループットシークエンシングが開発されていますターゲットとするmRNA、およびレポーターに基づくアッセイの。これらのアプローチのそれぞれが固有の長所と短所を持っています。 miRNAのターゲティングは、配列特異性によって案内されることを考えると、最も特にmiRNAのヌクレオチド2~6の、いくつかのアルゴリズムは、多くの生物のゲノム全体のmiRNA標的を予測するために開発されてきた（シード領域と呼ばれます）。これらのアルゴリズムは、検証済みのmiRNA標的の観察された塩基対形成のモチーフを使用して訓練し、頻繁にこのような厳しいシードのペアリング、サイトの保全、および/ または熱力学的安定性15などのパラメータを利用しています。これらのフィルタは唯一の信頼度の高いターゲットに十分な相補性を有する推定多数のターゲットを絞り込みながら、彼らは、最近の証拠は16-24普及している示唆している種特異的および非標準のmiRNA標的部位を、除外することができます。また、これらの予測は、このような代替ポリアデニル化などのmiRNA標的部位を除外mRNAプロセシングのための仕組み、に取ることはありません25、26 RNA 編集 、RNAのメチル化27、及び協同的結合。このように、高い偽陽性および偽陰性率は、多くのアルゴリズム22,24,28のために報告されています。これらのアルゴリズムは、その後の実験的検証のための候補miRNAの標的を同定するのに有用であるが、これらの高いエラー率が系統的miRNA標的の検出のためのバイオインフォマティクスアプローチの有効性を制限します。
体系的に与えられたmiRNAの間の相互作用および潜在的標的と3'UTRを探索するために、我々はの3'UTR（3'LIFE）24での機能要素の蛍光同定と呼ばれるハイスループットアッセイを開発しました。このアッセイは、直接的な相互作用およびデュアルルシフェラーゼレポーターシステムを使用してクエリのmiRNAによる試験3'UTRの翻訳抑制。この系において、目的の遺伝子の3'UTRは、ホタルルシフェラーゼ（Fluc細胞）レポーターリーディングフレームの下流にクローニングされます。レポーター短所tructは、HEK293T細胞内のクエリのmiRNAで共トランスフェクトされます。 miRNAのターゲティングは、試験Fluc細胞:: 3'UTRレポーターおよび第非特異的ウミシイタケルシフェラーゼレポーターの間の相対的な変化を測定することによって決定されます。重要なのは、ルシフェラーゼアッセイは、レポーターの翻訳出力に影響を与える機能のmiRNA / mRNAの相互作用を検出します。このことは、これは3'UTR基づく規制の独立したタンパク質の存在量のmRNAの分解や翻訳抑制の違いだけでなく、変化を迂回するには、そのようなRT-qPCRのやウェスタンブロットなどのmiRNA調節を検出する従来の方法に比べて重要な利点です。
ルシフェラーゼアッセイは、広く、それらの相対的な単純性と感度の直接のmiRNAの標的を検証するために利用されている、まだハイスループットスクリーニングにおけるそれらの使用は、高い消耗品試薬に関連するコスト、公共の情報源からの3'UTRライブラリーの欠如、および存在しないことによって制限されています標準化されたルシフェラーゼのprotのocols、複数のデータセット全体での機能抑制を比較する際に困難をもたらします。 3'LIFEアッセイの使用を容易にするために、我々は定期的に更新して展開され3'UTRライブラリを作成、実験デザイン、非商業的なトランスフェクション24、ルシフェラーゼ試薬29の利用の簡素化に重点を置いて、を介して利用できました公共プラスミドリポジトリ30。
3'LIFEアッセイのスケーラビリティは、バイオインフォマティクス同定された遺伝子の方の画面にバイアスをかけることなく、与えられたmiRNAによって標的化するための大きな3'UTRライブラリーのスクリーニングを可能にします。標準的な予測の相互作用を試験することに加えて、この体系的なアプローチは、非標準および/または種特異的な相互作用を介して駆動される新規標的の同定を可能にします。重要なことは、タンパク質の産生を対象miRNAの効果は、一般的に控えめな翻訳抑制15,31 <をもたらすことが理解されています/ SUP>、miRNA調節の主な役割は、タンパク質の出力を微調整し、遺伝子発現の異常なレベルから保護し、細胞の特定のプログラム32,33にロバスト性を提供することであることを示唆しています。 3'LIFE画面における負のmiRNA / mRNAの相互作用の本質的に多数と組み合わせルシフェラーゼアッセイの感度は、多数の遺伝子に標的化miRNAの微妙な効果の検出を可能にし、その遺伝子ネットワークの複数のコンポーネントの識別与えられたmiRNA 24によって規制されています。
ここでは、3'LIFEプロトコルを記述し、275人の3'UTRを（ 図1）のパネルに対して2つの十分に特徴付けられたmiRNA、 のmiR-10Bおよびlet-7cとをスクリーニングすることによって、それが実現可能だ実証します。
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Protocol
1.細胞培養（トランスフェクション前に24〜48時間）
- トランスフェクション前の種子に対して24〜48時間、96ウェルプレートの数に基づいて、HEK293T細胞の十分な量は、トランスフェクトされます。
注：一貫性のあるトランスフェクションのために、十分な密度でプレート細胞は急速な分裂を優先するように、まだトランスフェクションの時点で以上70〜90％の集密度になりません。 - 各96ウェルプレートは、（リザーバとマルチチャンネルピ ペットの使用を考慮するためにウェルあたり75,000細胞、およびプレートあたり120ウェル）9×10 6個の細胞を必要とします。 HEK293細胞（典型的には〜20時間）の倍加時間を計算し、そしてトランスフェクションの時点で少なくとも9×10 6個の細胞を得るために適切な数の細胞を播種。新しいプレートを再シードするために残りの細胞の〜10％、〜90％の集密度に増殖させた場合、145ミリメートルの円形培養プレートは、典型的には、3の96ウェルトランスフェクションのために十分です。
トランスフェクションの前に2.準備
_content ">注：これらの試薬の準備に時間がかかる可能性があるため、ステップ2.0から2.2のバッファとプラスミドDNAの調製は、トランスフェクション前に日に行われるべきです。- 3'LIFEアッセイと互換性のある人間の3'UTRクローンは、公開プラスミドリポジトリ30を介して使用できます。手動または液体ハンドリングロボットとDNAプラスミドを精製します。トランスフェクショングレードのアルカリ溶解ミニプレップ96ウェルキットを使用し、製造元の指示に従ってください。よく〜100 ng /μLであたりに精製されたベクトルを再懸濁します。
注：プラスミド濃度は40 ng /μLで下回った場合に不十分なルシフェラーゼシグナルが発生します。 - pLIFE-miRNAは、図1（b）24でパイプラインを使用して、30またはクローンベクトル得ます。各miRNAとブランク対照プラスミド500 ngの/μlの濃度でベクトルを再懸濁します。
- ヌクレオバッファ条件の感度のために、次のことを確認（細胞およびプラスミドを含む）をトランスフェクトされた材料の総体積は、96ウェルのトランスフェクションプレートの各ウェル内の全液体の10％を超えません。これを達成するために、少なくとも500 ngの/μlの濃度でpLIFE-のmiRNAプラスミドストックを集中。
- 10Xホタルルシフェラーゼ緩衝剤（ 表1）、および最大6ヶ月間貯蔵することができる1×ウミシイタケルシフェラーゼ緩衝剤（ 表2）を 、準備。
注：ホタルルシフェラーゼバッファ内のDTTは、単回使用のアリコートで-20 O℃で溶液中に保存する必要があります。
3.トランスフェクションの直前に、以下の項目を準備します
- PBS、1.5％HEPES、pHが7.0を含むトランスフェクションバッファーを準備します。それはトランスフェクション効率が顕著に低下することなく、4℃で最大1ヶ月まで保存することができるが、これは新鮮な準備をします。バッファおよびプラスミドDNAのボリュームを処方する際に、suの各96ウェルプレート120の反応を想定fficientlyピペッティングし、液体リザーバとマルチチャンネルピペットを用いて、失われたボリュームのエラーを占めています。小分け18ウェルトランスフェクションバッファーあたりμL（120ウェル/ 96ウェルプレート=プレート当たり2.16ミリリットル）、脇に置き。
注：細胞のエレクトロポレーション装置は、細胞をトランスフェクトするために使用されるバッファの条件に非常に敏感です。準備バッファは機器の安定した性能を保証します精度。具体的にそのバッファをマイクロ遠心チューブ、96ウェルプレート、リザーバ、及び電極板で覆われていない残っている時間を最小にすることによって、バッファの蒸発を防止するためのアッセイを実行する際に特に注意を払わなければなりません。 - 次のコントロールのための準備4つのウェル、無pLIFE-3'UTR（ルシフェラーゼアッセイのバックグラウンドを測定するために）、pLIFE-SV40 3'UTR（負のターゲットコントロール）、miRNAの＃1の陽性対照、miRNAの＃2のポジティブコントロール。
注：これらのベクターは、30一般に公開されています。あるいは、以前に検証対象陽性対照として使用することができます。 - 暖かい媒体、37℃にトリプシン（0.25％）。
- DMEM、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、200μlを添加し、トランスフェクション後の使用のために37℃のインキュベーターに入れました。
- サポートソフトウェアに続くすべての細胞のエレクトロポレーション装置の電源をオンにします。 HEK293T細胞およびPBS / HEPES緩衝液のためのパルス符号FF120を使用してください。
プラスミドDNAおよび細胞混合物の4準備
注：以下のプロトコルは、2つのmiRNA（miRNA-＃1とmiRNA-＃2）で画面のための1つの実験では3の96ウェルプレートをトランスフェクトする場合を想定しています。各プレートは、pLIFE-3'UTRプラスミドの同じ96ウェルプレートに対応することになる、とpLIFE-miRNAをブランク、pLIFE-miRNA-＃1、またはpLIFE-miRNA-＃2で3回処理します。
- 各miRNAのためpLIFE-のmiRNA +トランスフェクションバッファーの3銘柄を準備します。このストックは、それぞれの全体積の50％（10μL）を考慮すべきですよく、120ウェルを掛けました。このように、各株式は1.08ミリリットルバッファ+ 120μlのプラスミドDNA（pLIFE-のmiRNA）が含まれている必要があります。
- 、メディアを溶出PBSで穏やかに洗浄し、37℃で5分間〜5ミリリットル0.25％トリプシンで処理することにより、145ミリメートル培養プレートから細胞を除去します。 5分間300×gでメディア、及びペレット細胞の等量トリプシンを中和。
- （セル密度及びセルカウンタの正確な距離に応じて）〜5〜10ミリリットル培地でトリプシン/メディア、ペレットを再懸濁を削除します。
- 細胞カウンターを用いて細胞数を計測します。 95％生存可能であり、マシンの正確な範囲内>細胞であることを確認してください。
注：不正確な細胞数は、非常に高い細胞濃度（> 6.0X 10 6 / ml）を起因し得ます。細胞比、および/または減少するトランスフェクション効率を：あまりにも多くの細胞をトランスフェクトすると、大幅にプラスミドを減少させることによって標的とするmiRNAの効率を減少させることができます。 - アリコートを3本のチューブそれぞれが細胞rに対応する、9×10 6個の細胞を含みます1 96ウェルプレートのトランスフェクションのためequired。 3分間300×gで細胞をスピン。
- メディアを取り出します。トランスフェクション効率に影響を与える可能性が余分なメディアとしてペレットの最小限の乱れで可能な限り多くのメディアを削除してください。
- 再懸濁し、1.2ミリリットルのトランスフェクション·バッファ/ miRNAのプラスミド混合物中の細胞、脇に置き。
- 以下は、トランスフェクション緩衝液中のpLIFE-3'UTRプラスミドの詳細な再懸濁を繰り返します。これは96ウェルプレートで発生したように、すべての回でプレートを覆うことにより、バッファの蒸発を避けるために注意してください。
- （[ピペットエラーを考慮するために] [トランスフェクションあたり] 9μL* 3 [プレート] * 1.2）マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルPCRプレートの各ウェルに32.4μlのトランスフェクション·バッファを移動します。
- 各ウェルに3.6μlのミニプレップpLIFE-3'UTRプラスミド（〜100 ngの/μl）を加え、十分に混合します。
- ピペットで96ウェルトランスフェクションプレートとカバーの各ウェルに、この混合物の10μlの。
- リザーバーに最初のセル/バッファ/ pLIFE-miRNAのプラスミド混合物の1.2ミリリットルを移動します。よく混ぜます。
- すでに10μlのトランスフェクション·バッファ/ pLIFE-3'UTRを含む最初の96ウェルトランスフェクションプレートにこの混合物の10μlのを追加します。上下に数回ピペッティングしてよく混ぜます。
注：バッファー中の細胞の懸濁液が等しいさえ確保キュベットを通る電流を完全に通過し、トランスフェクション効率を最大化します。 - 細胞のエレクトロポレーション装置に96ウェルトランスフェクションプレートを配置し、トランスフェクションを開始します。
- トランスフェクションが完了すると、96ウェルのトランスフェクションプレートの各ウェルに96ウェル培養プレートから予め温めた培地100μlを添加し、よく混合します。 96ウェル培養プレートにそれぞれから100μlの移動。
- 細胞は、Wの側面に凝集する傾向があるように、ウェルの中央に垂直に位置するピペットを用いて培養プレートに細胞を混ぜますエルない限り、適切に混合しました。
- 残りの二つのプレートのための5.1から5.5を繰り返します。
- 96ウェルのトランスフェクションプレートを清掃
- 96ウェルプレートを、トランスフェクション実験の間の核酸のキャリーオーバーを確実にないように、70％EtOHで洗浄することにより再利用することができます。完全に電極ストリップ上の過剰のEtOHを拭く（下側）と培養フードで完全に乾燥にトランスフェクションプレートを可能にすることにより、その後、各ウェルを埋めるためにスプレーボトルを使用して、2つの70％エタノール洗浄を行います。
注：私たちは、2μgのpmaxGFPで12ウェルをトランスフェクトすることにより、キャリーオーバーDNA汚染のためにテストした70％EtOHで単一の洗浄、無プラスミドDNAを有する第二のトランスフェクションに続いて、HEK293T細胞に各プラスミド。この極めて高いプラスミド濃度、非常に明るい記者、および単一の洗浄で、12の反復トランスフェクションのいずれにおいても観察可能な蛍光はありませんでした。
- 96ウェルプレートを、トランスフェクション実験の間の核酸のキャリーオーバーを確実にないように、70％EtOHで洗浄することにより再利用することができます。完全に電極ストリップ上の過剰のEtOHを拭く（下側）と培養フードで完全に乾燥にトランスフェクションプレートを可能にすることにより、その後、各ウェルを埋めるためにスプレーボトルを使用して、2つの70％エタノール洗浄を行います。
- デュアルlucif続いて37℃で48〜72時間、培養細胞、アッセイを消去します。
ルシフェラーゼアッセイのための6の細胞溶解物の調製
- 4部の水、タンク内の受動溶解緩衝液5×1部を溶解緩衝液を希釈します。 26μL/ウェル、20〜余分なボリュームを追加すると、タンク内の損失を考慮して計算します。
注意：バッファが-20ºCで保存され、非常に粘稠であることができ、従って、先行5×緩衝液は室温に接近することを可能に分注精度を向上させます。 - 蛍光顕微鏡を用いて、トランスフェクション効率のために、各ウェルを分析します。効率的にトランスフェクトしなかったウェル中の矛盾（> 90％のトランスフェクション効率）に注意してください、または過密やメディア枯渇を示すRFPを低レベルで発現しています。分析からこれらのウェルを削除します。
- 完全に細胞が剥離する原因となる、あまりにも急速に溶出しないように注意して、細胞から培地を除去します。
注：残りのメディアがexperime全体の値の溶解物と原因変動を希釈しますNTS。 - 各ウェルに溶解緩衝液26μLを追加し、〜20〜30分間、低/中程度の速度でプレートシェーカー/ロッカーの場所。 、ルシフェラーゼバッファを準備するために、この時間を使って洗浄し、プライムルミノメーター（複数可）、および不透明な測定プレートに溶解物を移します。
7.デュアルルシフェラーゼアッセイ
注：複数のプレートが1ルミノメーターに順次測定されている場合は、すぐにそれぞれのプレートで使用する前に、pH調整に続いて、これらの試薬を添加すること、ATPおよび基質以外のすべてでバッファマスターミックスを作成します。 ATPと基質が経時的に分解することができます。これらの試薬は、バッファ内にある時間の量の一貫性は、複数のプレート間の一貫性が向上します。
- 1×ルシフェラーゼ緩衝液（ 表1）を準備します。
- 基板は、光感受性であり得るように、アルミ箔でホタルおよびウミシイタケ·バッファを含む2つのチューブ（典型的には15/50 ml遠心チューブ）をラップします。
- 1Xホタルルシフェラーゼバッファを準備します。 5ミリリットルのH 2 0への最終的な1倍濃度に、最後のEGTAを添加すること、各1mlの5の10倍ホタルルシフェラーゼ試薬を追加します。
- ホタルバッファ1×10ミリリットルに0.025グラムのATPを追加します。数回転倒混和します。すべての回で氷の上にATPをしてください。 ATPは劣化しますので、複数のプレートを順次測定する場合、バッファは各追加のプレートのためのこの段階で、新鮮な始まりを行わなければなりません。
- バッファは、pH値に基づいて、黄色がかった色に変わります100甲虫ルシフェリン（基質）の100μlを（ 表1）を追加します。
- 1×ウミシイタケルシフェラーゼバッファ再構成：96ウェルプレート当たり、1 " ウミシイタケバッファ 」の一部10ミリリットル。
- BSA100μlの（44 mg / mlのストック）を追加します。
- 10mLのアリコートの中に複数のプレート、別個のマスターミックスをスクリーニングする場合。
- バッファするセレンテラジンの100μlを添加する（以前は100倍の濃で等分し、格納されています。）
<LI>ホタルNaOHおよびHClを用いて5.0に1× ウミシイタケバッファに続く、8.0に緩衝液1XのpHを調整します。
注：各バッファの活動、およびホタルルシフェラーゼ活性をクエンチするウミシイタケバッファの能力は、pHに大きく依存します。一貫性のある結果を得るには、このステップでは非常に正確です。 - ルミノメータープライミングに適応するように10.5ミリリットルに（1、96ウェルプレートに対応する）は、各バッファの容量を持参してください。
- Tであることウェルを選択ested（すべてのウェルがデフォルトです）。
- （説明のための29を参照）10秒の測定時間で、5秒に設定する「測定前の遅延」を拡張します。
- キャピラリーの洗浄工程：水3回、エタノール3回、水3回、ドライ3倍。バックバッファチューブに一度廃棄物への首相の緩衝液、その後プライム二回目は、混合を確実にします。右キャピラリーにウミシイタケ続いて左キャピラリー、第一及びそれプライムホタルバッファを注入します。
注：複数のプレートを読み取ることができ、同じに保存されたデータは、照度計のプログラムがクラッシュする場所を複数のプレートの読み取りに問題が発生する可能性がありますが、ファイルを、優れています。測定間のすべてのデータを保存し、保存が可能である前に、プログラムがクラッシュした場合のスクリーンショットを取るようにしてください。
- 古いバッファを交換します新しいと、新しいプレートを開始する前に、新たな緩衝液を用いて少なくとも2倍プライムに確認しています。
8.データ解析
- から入手できる-と"多分析3'LIFE」 -エクセルの表「単板分析3'LIFE」を利用www.mangonelab.comを 。スプレッドシート- 「単板分析3'LIFE」へのmiRNA＃1、負の状態に対応する位置に照度計の出力ファイルからホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ測定のための生データをコピーし、miRNAの＃2。
- スプレッドシートは自動的にホタル/ ウミシイタケ比を計算し、適切な陰性対照に各miRNAを正規化し、各プレートを横断抑制値を正規化します。
注：このスプレッドシートは自動的に、低ルシフェラーゼシグナルでウェルを識別著しく抑圧井戸を強調表示し、repressiの対策を提供しますプレート全体を横切る上。統計分析の詳細な説明のための24を参照してください。- テストした各miRNAのための＃1を複製するために対応する位置に - "多分析3'LIFE「スプレッドシートに対応するセルに、「正規化RI指数」ボックスから値をコピーします。別の日に実行されたすべての生物学的複製のために繰り返します。
- 必要に応じて、それぞれ、列BとDでの遺伝子名とターゲット予測ステータスを挿入します。
- スプレッドシートは自動的にすべてのプレートの平均値を計算することができます。ヒートマップ（ 図2）のように96ウェルフォーマットでデータを確認します。ファイルには、リスト形式のデータ（ 図2）を配置します。
NOTE：抑圧度が推定されるmiRNAの標的を同定するために使用される尺度です。様々なストリンジェンシーのパラメーターは、個々の好みに基づいて、使用することができます。平均して、私たちは0の抑制指数下記そうヒットを検討してください。8およびt検定（P -値<0.05）によって統計学的に有意。 図3に示すように、これらの基準に基づいて、潜在的な標的は、赤色で強調表示されます。
- スプレッドシートは自動的にすべてのプレートの平均値を計算することができます。ヒートマップ（ 図2）のように96ウェルフォーマットでデータを確認します。ファイルには、リスト形式のデータ（ 図2）を配置します。
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Representative Results
照度計の出力ファイルには、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の両方の生の測定値が含まれています。と- MangoneラボのWebサイト（から入手可能な「3'LIFE多分析」スプレッドシート-この生の形式は、「単板分析3'LIFE」と互換性がありwww.mangonelab.com ）。単板解析スプレッドシートを自動的にホタル/ ウミシイタケ比を計算し、適切な陰性対照を各miRNAを正規化し、各プレートを横切っ抑圧値を正規化します。このスプレッドシートは自動的に低ウミシイタケルシフェラーゼシグナルでウェルを特定し、陰性対照と比較して抑制を示す井戸を強調表示され、全体のプレート（ 図2）全体で抑制の手段を提供します。統計分析の詳細な説明のための24を参照してください。
複数の複製を分析することができますD「多分析」スプレッドシートを使用。各反復は、並べて比較し、データの統計的尺度は、自動的に（ 図3）が算出されます。 「正規化弾圧」列の複製を比較することに加えて、ユーザは、「miRNAの＃1 / miRNAの＃2」列の下に2種のmiRNAの間の抑制を比較することができます。この措置は、各反復のために各miRNAのための抑制指標を分割します。この措置は、（陰性対照で例えば異常に高いまたは低い測定値図3、行A9を参照してください、担当者＃3）ルシフェラーゼアッセイから誤った値を示し、抑制指数が実質的な抑制を示さない場合が井戸、それは行うことができますmiRNAの間に有意差を示します。この測定は、miRNA標的を示すために直接使用することはできないが、それは単独のmiRNA再誘導するように帰属されていないデータを異常値、問題のウェル、またはパターンを同定するのに有用ですgulation。
抑圧インデックス（RI）は、より低い値がより高い相対的弾圧に対応して、推定上のmiRNA標的を呼び出すために使用されます。推定標的を呼び出すための閾値は、研究者によって必要とされるストリンジェンシーのレベルに基づいているが、統計的に有意なp値（P <0.05）を表示するの3'UTRとRIを組み合わせることが、高い信頼性目標は（ 図2行B8参照と表示され、 B12）。
図1：3'LIFEアッセイ（A）。 3'LIFEアッセイで使用されるゲートウェイと互換性のベクター。上： ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（Rlucを）を対照として非特異SV40 pAの3'UTRに融合している間にルシフェラーゼ遺伝子（Fluc細胞）が、試験3'UTRに融合されます。下：RFP-のmiRNA-イントロンベクター - プローブプレmiRNA、プラス〜400そのゲノム遺伝子座内のヌクレオチドは、（内因性のmiRNAの処理を再現するために）、DsRed2の蛍光色素との共発現を可能にするために、イントロン内にクローン化されます。両方のベクターが公的 に入手可能である（ザイラーら 、2013）。 （B）3'LIFEアッセイのフローチャートです。 （C）3'LIFEパイプライン：miRNAのベクターを96ウェルプレートでHEK293細胞に同時トランスフェクトされているの有無にかかわらず、試験3'UTRを含むデュアルルシフェラーゼベクター。 miRNAおよび善意の 3'UTR標的との間の相互作用は、（実験プレートにオレンジ色のスポットにより例示される）特定のウェル中での相対的な発光を低下させるであろう。
図2：3'LIFEアッセイで生成されたデータのサンプル 。各プローブは、miRNAは（1-4を複製する）四重に試験します。色は赤、抑制レベルを表します強いのmiRNA / 3'UTRの相互作用を示す色。すべての複製を黄色の矢印下要約プレートに示す高品質の推定標的を生成するために平均化されます。白いボックスは、コントロールを表す、低トランスフェクション効率でトランスフェクションまたはウェルに失敗しました。
図3：3'LIFEのスプレッドシートを使用して生成相互作用のサブセットの要約データを表す表抑制値は、図2のソフトウェアのようですが、それぞれの相互作用のための標準偏差、標準誤差とZスコアを計算します。統計学的に有意な相互作用は赤でマークされています。最後の4行は、他の1つのmiRNAの相対的な抑制を示し、2つの異なるmiRNAの間の抑制を比較するために、二次指標として使用されます。スプレッドシートはからダウンロードすることができますwww.mangonelab.com
表1：ストックホタルルシフェラーゼ試薬：グリシルグリシンの10×ストック溶液を、KはPO 4、MgSO 4をX、DTT及びEGTAを別々に調製し、再構成をバッファリングする前に保存することができます。 100Xビートルルシフェリン（ホタルルシフェラーゼの基質）は、ストアすることができます7.134ミリリットルのH 2 0（25ミリモル）に50 mgのルシフェリンを溶解することにより、D。 -80ºCでチューブやストアに溶解ビートルルシフェリンのアリコート105μL/プレート。プロメガ技術サポートあたり、これは> 6ヶ月間安定であるべきであるが、光感受性であり得ます。注：EGTAは、中性pHの溶液中に入ることはありません。それが完全に溶解するまでゆっくりとEGTAに水酸化ナトリウムを追加します。*最後の緩衝液に添加する試薬を直前にルシフェラーゼアッセイに
| ウミシイタケルシフェラーゼ緩衝試薬 | 最終濃度（1×） |
| 塩化ナトリウム | 1.1 M |
| のNa 2 EDTA | 2.2 mMの |
| KH 2 PO 4 | 0.22 M |
| のNaN 3 | 1.3 mMの |
| BSA * | 0.44 mg / mlの |
| セレンテラジン* | 2.5＆＃956; M |
表2：ストックウミシイタケルシフェラーゼ緩衝剤 BSAおよびセレンテラジンを除く全ての試薬 は1倍濃度で混合し、室温で保存することができます。セレンテラジンは、酸性化メタノールに溶解し、プレート毎に小分けすることができます。 5 mMの（<3のpH）の最終濃度にHClを添加することにより、メタノールを酸性化。 2.36ミリリットルで250μgのセレンテラジン酸性化メタノール（250μM）のアリコート105 UL /プレートを溶かします。混合物は、少なくとも6ヶ月間安定であるが、光感受性であり得ます。 *試薬は、ルシフェラーゼアッセイの直前にバッファーに加えます。
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Discussion
3'LIFEアッセイは、高スループットでの3'UTR中の機能のmiRNAのターゲットを識別します。このアッセイは、実験的に興味のあるmiRNAのための推定上の多数のターゲットを特定したい研究者のために有用です。アッセイがmiRNAの標的の機能的尺度を提供し、単一のmiRNAに対する3'UTR ::シングルレポーターのバイナリテストが自信を持って取り組むことができるという点で、3'LIFEアッセイは、3'UTR駆動制御のために照会するための強力なアプローチであります個々の遺伝子のターゲティング状態。このアプローチを検証するために、我々は275の3'UTRのパネルをスクリーニングし、2種のmiRNAに対して、 聞かせ-7C及びmiR-10bは 、このライブラリ内の10検証済みの標的遺伝子が含まれています。これら10個の遺伝子のうち8人は弾圧24を示しました。我々はまた、未検証のバイオインフォマティクス予測ターゲットの重要な濃縮、そして私たちのトップヒットのうち、正規のシード要素を含む予期せぬの3'UTRを観察し、SUG3'LIFEは善意のmiRNA標的を同定することが可能であることをgesting。
ハイスループットスクリーニングの感度の重要な指標は、偽陽性および偽陰性率です。このアッセイの偽陽性率は、ヒットを検証するために追加の代替的なアプローチを用いて評価する必要があるが、10の陽性対照の8は、20％の偽陰性率を示唆し、私達の証明の原理画面出品弾圧に含まれています。しかし、多くの技術は、異なる細胞の文脈におけるmiRNAの標的を同定するために使用され、トランス作用因子によって3'UTR処理および調節が非常に組織特異的であることが知られています。例えば、の3'UTRの大部分は、成熟mRNA中の3'UTRの長さを制御する複数のポリアデニル化部位を含みます。多くの場合、近位のポリアデニル化部位の使用は、組織特異的であり、miRNA標的部位を除外してもよいです。また、協同組合のmiRNA標的、競争のwi第RNA結合タンパク質、およびmRNAの二次構造は、すべての影響3'LIFEの能力は、特定の組織におけるmiRNAの標的を検出することができます。このため、3'LIFEアッセイによる標的の検出は、絶対誤差率の評価を複雑に、アッセイが行われる細胞の状況に基づいて変化してもよいです。このプロトコルは、HEK293T細胞のために最適化されているが、研究者は、特定の生物学的コンテキストでアッセイを行うことを望む場合、代わりの細胞株を使用することができます。しかし、各細胞株のトランスフェクション効率および細胞生存の最適化は、複数のバッファ状態、パルスコード、および細胞数を用いて最適化されなければなりません。最適化スキームの例は、ウォルターら 24で見ることができます。
このプロトコルは、96ウェルフォーマットで最適化され、一定の高スループット器具の使用を指定されています。機関96のために必要な機器を持っていないことを場合ヌクレオ型ウェル、代替的なトランスフェクション試薬であれば、トランスフェクション効率が高いままであるように、3'LIFEアッセイを行うために使用することができます。さらに、ルシフェラーゼアッセイは3'LIFEアッセイの最も時間のかかる面です。このように、複数の照度計の使用は、高スループットスクリーニングのために推奨されます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferin | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
| Trypsin | T2600000 | ||
| Consumables | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| Instruments | |||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
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