Abstract
功能元件发光鉴定3'UTRs（3'LIFE）允许数百查询3'UTRs的一个阵列内快速识别特定的miRNA的目标。目标识别是基于双荧光素酶测定法，其检测在mRNA水平通过测量平移输出，给人的miRNA靶向功能的读出绑定。 3'LIFE使用非专用的缓冲液和试剂，并公开提供记者库，使得全基因组屏幕可行和成本效益。 3'LIFE可以执行无论是在标准实验室环境或扩大了使用的液体处理机器人和其他高通量检测仪器。我们示出了使用克隆在96孔板人类3'UTRs和两个测试miRNA的数据集的方法， 让-7C和miR-10b中 。我们展示了如何执行DNA制备，转染，细胞培养和萤光素酶测定在96-孔格式，并提供工具用于数据分析。总之3'LIFE是高度可重复的，快速的，系统的，并确定高可信度的目标。
Introduction
该方法的总体目标是检测并精确地映射微小RNA（miRNA）的目标高通量。 miRNA是内源性非编码RNA〜22个核苷酸长度。以下转录和加工，成熟miRNA在蛋白质复合物掺入称为诱导的沉默复合物（RISC）的RNA。每个miRNA引导RISC靶向主要位于信使RNA的3'非翻译区（3'UTRs）（的mRNA）分子，从而在任一翻译抑制或mRNA切割1。 miRNA的认识到基于标准的Watson-Crick和G靶位点：U摆动碱基配对，并在退化性质，包含多个错配碱基对和凸出的区域。许多miRNA的大致从植物保守到人类2,3，在那里他们发挥生物学作用的多元化。在后生动物miRNA能够影响多个生物过程，包括细胞命运决定4，发育时间5 6,7。 miRNA的异常表达也可以导致异常的基因调控，其可以具有关于只对靶基因的功能基于细胞行为实质性影响。这样，微RNA被链接到一个宽范围的疾病，包括神经变性8,9，糖尿病10和癌症11。生物信息学和湿式工作台的方法表明，每个miRNA可以是能够靶向数百至数千不同的mRNA 12-14，表明高通量或全基因组的方法是必需的，以探测该大潜在的相互作用的池。
鉴定的靶基因是机械地限定的miRNA功能的重要组成部分，并且这样做的研究人员必须能够揭示大规模目标。几种方法已经被开发，以确定miRNA靶，包括生物信息学预测算法，高通量测序有针对性的mRNA，并根据记者分析。每一种方法都有固有的长处和短处。给出了miRNA的定位是通过序列特异性的指导下，最显着的核苷酸与miRNA的2-6的（称为点火区），若干算法已经被开发，以在整个许多生物的基因组中预测的miRNA靶。这些算法使用证实的miRNA靶的观察到的碱基配对图案培训，并经常利用的参数，如严格种子配对，现场保护，和/或热力学稳定性15。而这些滤波器缩小大量具有足够互补性的推定的目标，以仅高置信指标，它们可以排除种间特异性和非规范miRNA靶位点，其中最近的证据表明有广泛16-24。此外，这些预测没有考虑到mRNA加工的行为排除miRNA靶位点，如替代多聚腺苷酸账户机制25，RNA编辑26，RNA甲基化27，并协同结合。因此，较高的假阳性和假阴性率已经报道了很多算法22,24,28。虽然这些算法是有用的，以确定用于随后的实验验证候选miRNA靶，这些高错误率限制的生物信息学方法进行系统的miRNA靶标检测的功效。
为了系统地探测和给定的miRNA之间的相互作用可能有针对性3'UTRs我们已经开发了一个名为发光标识功能元素在3'UTRs（3'LIFE）24高通量检测。此测定法测量的直接相互作用，并测试3'UTR的通过使用双荧光素酶报告系统的查询的miRNA翻译抑制。在这个系统中，感兴趣的基因的3'UTR克隆萤火虫荧光素酶（fluc）记者阅读框架的下游。记者利弊truct被共转染在HEK293T细胞中的查询的miRNA。 miRNA的定位是通过测量测试fluc :: 3'UTR记者和一个第二非特异性海肾萤光素酶报道之间的相对变化来确定。重要的是，荧光素酶检测检测影响记者的平移功能输出的miRNA / mRNA的相互作用。这是优于传统方法的关键优势检测miRNA调节，如RT-qPCR的和Western印迹，在这绕过在mRNA降解和翻译抑制的差异，以及在蛋白质丰度的独立的3'UTR基于调节的变化。
萤光素酶测定法被广泛应用，以验证由于其相对简单和灵敏度，但它们在高通量筛选使用直接miRNA靶是通过用消耗品的试剂相关的高费用的限制，缺乏从公共来源3'UTR库，以及没有标准化的荧光素酶PROTocols，导致难以在多个数据集进行比较的功能抑制。为了方便使用3'LIFE分析，我们已经将重点放在了实验设计，利用非商业转24和 荧光素酶试剂29的简化，创造了3'UTR库定期更新和扩展，并且可通过公共质粒库30。
在3'LIFE检测的可扩展性使大3'UTR库筛选而不向偏置确定生物信息学的基因屏幕由给定miRNA的靶。除了测试规范和预测的相互作用，这种系统的方法允许通过非规范和/或物种特异性相互作用驱动的新靶标鉴定。重要的是，miRNA的对蛋白生产靶向的影响一般理解为导致适度翻译抑制15,31 </ SUP>，表明miRNA调节的一个主要作用是微调蛋白输出，防止基因表达的异常水平，并提供鲁棒性与细胞的具体方案32,33。萤光素酶测定法结合固有大量在3'LIFE屏幕负的miRNA / mRNA的相互作用的灵敏度允许检测的miRNA的靶上的大量基因的微妙的影响，和基因网络的多个组件的识别那由给定的miRNA 24进行调节。
在这里，我们描述了3'LIFE协议，并证明它的可行性通过筛选2良好表征的miRNA中，miR-10b和让-7c的对275人的3'UTRs（ 图1）一个面板。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.细胞培养（24-48小时之前转染）
- 24-48小时在转染前种子基于96孔平板的个数HEK293T细胞的足量转染。
注：对于一致转染中，板的细胞在足够的密度以有利于快速分裂，但不超过70-90％汇合在转染时。 - 每个96孔板需要9×10 6个细胞（每孔75000细胞，并每板120的孔占使用贮存器和多道移液器的）。计算HEK293细胞（通常为〜20小时）的倍增时间，和种子细胞的适当数量的在转染时，以获得至少9×10 6个细胞。 A 145 mm圆柱培养板通常是足够3 96孔转染，当发展到〜90％汇合，剩余补种一个新的板块细胞〜10％。
2.准备在转染
_content“>注意：应该在天转染前进行在步骤2.0-2.2的缓冲液和质粒DNA的制备，因为这些试剂的制剂可以是耗时的。- 都可以通过一个公共的质粒库的30个人的3'UTR克隆是与3'LIFE测定兼容。手动或使用液体处理机器人纯化DNA质粒。用转染级碱裂解小量制备96孔套件，并按照制造商的说明。悬浮纯化向量〜100毫微克/微升每孔。
注：没有足够的荧光素酶信号将导致如果质粒浓度低于40毫微克/微升。 - 获得使用图1B 24管道中的pLIFE-miRNA的载体30或克隆。重悬的载体，在500毫微克/微升的每个miRNA与空白对照质粒的浓度。
- 由于的核转缓冲条件的敏感性，确保染材料（包括细胞和质粒）的总体积不会在96孔转染板的每个孔超过总液体的10％。为了实现这一点，浓缩pLIFE体miRNA质粒库存至少500毫微克/微升的浓度。
- 制备10倍萤火虫萤光素酶缓冲液的试剂（ 见表1），和1×Renilla荧光素酶缓冲试剂（ 表2），其可存储长达6个月。
注：在DTT萤火虫荧光素酶缓冲区必须要在单次使用分装-20℃保存在溶液中。
3.准备下列项目紧接转
- 制备含有PBS的转染缓冲液，1.5％的HEPES，pH值7.0。准备这个新鲜的，虽然它可能会在4℃下保存长达1个月而不染效率明显下降。在制定和缓冲区质粒DNA卷，承担120反应为每个96孔板苏fficiently占的移液量和使用液体水库和多道移液器丢失的错误。分装，每孔转缓冲区18微升（120孔/ 96孔板=每盘2.16毫升），并预留。
注：细胞电穿孔装置是用于转染细胞中的缓冲液条件极其敏感。当精度准备缓冲区将确保设备的稳定性能。执行检测，以防止缓冲器的蒸发，特别是通过减少该缓冲器是左露出在微量离心管中，96孔板，水库和电极板的时候，额外必须小心。 - 储备四口井以下控制，无pLIFE-3'UTR（测量荧光素酶测定的背景），pLIFE-SV40 3'UTR（负目标控制），阳性对照的miRNA＃1，阳性对照的miRNA＃2。
注：这些载体公开提供30。另外，任何先前验证目标可以用作阳性对照。 - 暖媒体，胰蛋白酶（0.25％）至37℃。
- 到96孔细胞培养板各孔中，加入200微升DMEM补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素，并放置在转染后37℃培养箱中使用。
- 打开所有细胞电设备之后的配套软件。采用脉冲代码为FF120 HEK293T细胞和PBS / HEPES缓冲液。
4.制备质粒DNA和细胞混合物
注意：下面的协议假定转染三个96孔平板在一个实验中对于具有两个微RNA（miRNA-＃1和miRNA-＃2）的画面。每块板将对应于相同的96孔平板的pLIFE-3'UTR质粒，并进行处理三次pLIFE-miRNA的空白，pLIFE-miRNA-＃1，或pLIFE-miRNA-＃2。
- 准备3股pLIFE-miRNA的转染+缓冲每个miRNA。此库存应占每个总体积的50％（10微升）好了，再乘以120口井。因此，每个股票应该包含1.08毫升缓冲区+ 120微升质粒DNA（pLIFE-miRNA）的。
- 通过洗脱介质，用PBS轻轻洗涤，并用〜5毫升0.25％胰蛋白酶，在37℃处理5分钟，除去自145 100mm培养板上的细胞。中和胰蛋白酶用等体积的介质，并沉淀细胞，在300×g离心5分钟。
- 5-10毫升媒体（视细胞密度和细胞计数准确范围）中删除〜胰蛋白酶/媒体和重新悬浮颗粒。
- 计数使用细胞计数器细胞。确保细胞> 95％存活，并在机器的准确范围。
注：不准确的细胞计数可导致非常高的细胞浓度（> 6.0×10 6 /毫升）。转染太多细胞可显着降低的miRNA的效率，减少质粒靶向：细胞比率和/或降低转染效率。 - 等分三个管各含9×10 6个细胞中，对应于细胞řequired一个96孔板的转染。旋转细胞在300×g离心3分钟。
- 取出介质。一定要删除尽可能多的媒体尽可能与颗粒的最小干扰为多余的介质会影响转染效率。
- 悬浮细胞1.2毫升转缓冲/ miRNA的质粒的混合物，并预留。
- 以下步骤pLIFE-3'UTR质粒转染缓冲细节悬浮。由于这发生在96孔板，注意避免缓冲区蒸发通过覆盖板在所有时间。
- 使用多通道移液管，将32.4微升转染缓冲液到96孔PCR板的每个孔（9微升[每转] * 3 [板材] * 1.2 [占吸管错误]）。
- 加入3.6微升迷你坦然pLIFE-3'UTR质粒（〜100纳克/微升），以每口井调匀。
- 移取10微升该混合物到96孔转染板和盖的每个孔中。
- 移动1.2毫升第一个单元格/缓冲/ pLIFE-miRNA的质粒混合物进入水库。拌匀。
- 加入10微升这种混合物进入已含有10微升转染缓冲/ pLIFE-3'UTR第96孔转板。移液器向上和向下几次拌匀。
注：细胞在缓冲的等悬浮将确保甚至和电流的通过试管彻底通道和最大化转染效率。 - 将96孔转板细胞电设备上，并开始转染。
- 一旦转染完成后，从96孔培养板中添加100微升预热媒体向96孔转染板的每个孔中并充分混合。移动100微升每孔放入96孔培养板。
- 混合的细胞在培养板吸移管垂直放置在井的中心，因为细胞将趋向于聚集在瓦特的侧面ELL除非适当地混合。
- 对其余的两个板重复5.1-5.5。
- 清洁96孔转板
- 96孔转染板可以回收洗涤用70％乙醇，以确保没有结转的实验之间的核酸。执行使用喷雾瓶完全填充每个孔，接着擦拭过量乙醇上的电极条带（底部侧），并允许在培养罩的转板完全干燥两个70％乙醇洗涤。
注意：我们已通过转染的12个孔用2微克pmaxGFP质粒每个入HEK293T细胞测试结转DNA污染，接着用70％EtOH中的单次洗涤，并用无质粒DNA中的第二次转染。有了这个极高浓度的质粒，极其明亮记者，和单一的洗，有任何的重复12转染的没有观察到荧光。
- 96孔转染板可以回收洗涤用70％乙醇，以确保没有结转的实验之间的核酸。执行使用喷雾瓶完全填充每个孔，接着擦拭过量乙醇上的电极条带（底部侧），并允许在培养罩的转板完全干燥两个70％乙醇洗涤。
- 培养细胞48-72小时，在37℃，随后双重荧光素酶擦除检测。
6.细胞裂解液准备萤光素酶检测
- 稀释裂解缓冲液与4份水，1份5倍于一个储存器被动裂解缓冲液。计算26微升/孔，加入约20多卷，占在水库损失。
注：缓冲储存在-20ºC并且可以以允许5×缓冲接近室温将提高注精度非常粘稠，因此之前。 - 每口井用荧光显微镜转染效率分析。注水井中的任何不一致未转染效率（> 90％的转染效率），或者是表达RFP表示超员或媒体疲惫的低水平。从分析中删除这些井。
- 从细胞中完全删除媒体，小心不要洗脱过快，这将导致细胞分离。
注：剩余媒体会稀释跨越experime值和裂解波动原因NTS。 - 加入26微升的裂解液以每口井，并放置在板振动筛/摇杆在低/中转速〜20-30分钟。利用这段时间准备萤光素酶缓冲液，洗净和总理光度计（S），并转移裂解液不透明测量板。
7.双萤光素酶检测
注：如果多个板块被测量顺序在一个光度计，创建缓冲区预混的一切，除了ATP和底物，加入这些试剂然后调节pH值应立即用每块板后再使用。 ATP和底物可能随时间降解;在时间这些试剂是在缓冲器量的一致性将改善在多个板的一致性。
- 制备1×萤光素酶缓冲液（ 见表1）：
- 裹两管（通常15/50毫升离心管）含萤火虫和海肾缓冲器，铝箔，作为底物可能是光敏感。
- 准备1X萤火虫荧光素酶的缓冲。加入1毫升每五个10×萤火虫萤光素酶试剂，加入EGTA最后，到5ml H 2 O至最终1倍浓度。
- 添加0.025克ATP至10ml 1X萤火虫缓冲。颠倒几次混合。保持的ATP在冰上在任何时候。 ATP会降低，因此，如果测量多个板块顺序，缓冲区必须为每个附加板这一步作出新的开始。
- 加入100微升100甲虫萤光素（底）（ 表1）缓冲应该改变的基础上pH值黄色。
- 1×Renilla荧光素酶缓冲液重建：每96孔板，等份加入10ml 1“ 的Renilla缓冲”。
- 加入100微升BSA（44毫克/毫升的股票）。
- 如果筛查多个板块，单独预混成10毫升分装。
- 加入100微升腔肠素中缓冲的（预先等分并储存在100倍浓度）
<李>调整pH值的1x萤火虫缓冲至8.0，随后1倍的Renilla缓冲至5.0用NaOH和HCl。
注意：每个缓冲器的活性，和海肾缓冲区以猝灭萤火虫萤光素酶活性的能力高度依赖于pH值。为一致的结果是非常精确的在此步骤。 - 带来每个缓冲区（对应于1 96孔板）的体积至10.5 ml至适应光度计灌注。
- 选择井为t相关捐资（所有的孔是默认值）。
- 扩展'延迟测量之前“设置为5秒，用10秒的测量时间（见29为解释）。
- 毛细管洗涤步骤：水3倍，3倍乙醇，水3倍，3倍干燥。总理缓冲区一旦进入垃圾，然后黄金第二次回缓冲管，以确保混合。第一和素它注入萤火虫缓冲器中的左毛细管，随后海鳃在右毛细管。
注意：多个板可读取并存储在相同的数据excel文件，然而问题可以与多个板遇到读取其中光度计程序会崩溃。一定要保存所有的数据测量之间并采取截图，如果程序崩溃之前保存是可能的。
- 更换旧的缓冲区新的，是一定要贷至少两次与新的缓冲区开始新的板块之前。
8.数据分析
- 利用Excel表格“3'LIFE -单盘分析”和“3'LIFE -多片分析”，可从www.mangonelab.com 。原始数据从光度计输出文件萤火虫和Renilla荧光素酶测定复制到对应于所述负状态，miRNA的＃1和miRNA＃2进入“3'LIFE -单平板分析”位置的电子表格。
- 该电子表格会自动计算萤火虫/ 海肾比和规范每个miRNA到相应的阴性对照，并在每个板压制正常化值。
注：此表会自动识别井低荧光素酶信号，彰显显著压抑的水井，并提供repressi措施上在整个板。进行统计分析的详细解释见24。- 对应于复制＃1测试每个miRNA的位置 - “多片分析3'LIFE”电子表格从“归RI指数”框中的值复制，到相应的单元格。重复在不同的日子进行的所有生物复制。
- 如果需要的话，插入在列B和D中的基因名称和目标预测状态，分别。
- 允许电子表格来自动计算所有板的平均值。观察在96孔格式作为热图（ 图2）中的数据。该文件还排在列表格式的数据（ 图2）。
注：压制索引是用于识别推定的miRNA靶的量度。不同严格性参数都可以使用，根据个人喜好。平均而言，我们认为低于0压制指数可能命中。图8和用t检验（P -值<0.05）统计学显著。 如图基于这些标准3的潜在目标将以红色突出显示。
- 允许电子表格来自动计算所有板的平均值。观察在96孔格式作为热图（ 图2）中的数据。该文件还排在列表格式的数据（ 图2）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
光度计的输出文件包含原始测量为萤火虫和Renilla荧光素酶的蛋白质。这种原始的格式与“3'LIFE -单盘分析”兼容，“3'LIFE -多片分析”表格可从Mangone实验室网站（ www.mangonelab.com ）。单板分析表格自动计算萤火虫/ 海肾比，标准化每个miRNA到相应的阴性对照，并在每个板压制标准化值。此电子表格自动识别井低Renilla荧光素酶信号，凸显井表现出抑制相比阴性对照，并提供了压制整个板的措施（ 图2）。进行统计分析的详细解释见24。
多次重复可以分析d。使用的“多片分析”电子表格。每个重复比较并排，并且该数据的统计测量值自动计算（ 图3）。除了比较重复与“归一压制”列，用户可以在“miRNA的＃1 / miRNA的＃2”的列比较两个微RNA之间压制。这一措施对于划分每个miRNA每个重复的压制指数。这一措施可指示从荧光素酶检测错误值（例如异常高或低的读数与阴性对照，参见图3，排A9，代表＃3），和油井中的压制索引可能不表示实质压制，但这样做展出的miRNA之间显著的差异。虽然这一措施可以不直接用来指示一个miRNA靶标，它是用于识别未完全归因于直接的miRNA重新数据离群，有问题的井，或图案有用gulation。
所述压制指数（RI）用于调用一个假定miRNA靶，以对应于更高的相对抑制较低值。用于调用推定靶的阈值是基于由所述研究者需要严格性水平，但对RI与显示统计学显著p值（P <0.05）3'UTRs组合将指示高置信度的目标（ 见图2排B8和B12）。
图1：3'LIFE测定（A）。 在3'LIFE实验中使用网关兼容载体。顶部：荧光素酶基因（FLuc）熔合到测试3'UTR，而Renilla荧光素酶基因（与Rluc）被融合到非特异性的SV40 pA的3'UTR作为对照。底部：本RFP-的miRNA - 内含子载体 - 预先的miRNA的探针，加〜400在其基因组基因座的核苷酸（复述源miRNA加工），被克隆的内含子内，以允许其共表达与的DsRed2荧光。这两种载体是公开可用的（塞勒等人 ，2013年）。 （ 二）流程图3'LIFE测定。 （C）的 3'LIFE管道：含有试验3'UTR具有或不具有所述miRNA的载体的双荧光素酶载体共转染到HEK293细胞在96孔板中。 miRNA的和善意的 3'UTR目标之间的相互作用将降低在特定的井相对发光（由橙色斑点在实验板为例）。
图2：3'LIFE试验中产生的数据样本 。每个探头的miRNA在测试一式四份（复制1-4）。颜色代表镇压水平，以红颜色指示强的miRNA / 3'UTR的相互作用。所有重复的平均值，以产生下面的黄色箭头摘要板显示高品质的假定目标。白框代表控制，失败或转染井转染效率低。
图3：表表示使用3'LIFE电子表格产生相互作用的子集的摘要数据的压抑值如在图2中的软件计算标准偏差，标准误差和z得分为每个交互。统计学显著的相互作用以红色标记。最后四个行表示一个miRNA的其他相对压制，并且被用作次级指示器到两个不同的miRNA之间比较压制。电子表格可以从以下网站下载www.mangonelab.com
表1：股票萤火虫荧光素酶试剂：10X股票甘氨酰甘氨酸的解决方案，; K X PO 4，硫酸镁，DTT和EGTA可以单独准备并储存前缓冲重建。 100X甲虫荧光素（萤火虫荧光素酶底物）可以存储ð在7.134毫升H 2 0（25毫米）将50毫克的荧光素。分装105微升/板溶解甲壳虫荧光素进入管和储存在-80ºC。每Promega公司的技术支持，这应该是稳定> 6个月，但可能是光敏感。注：EGTA不会进入中性pH溶液。慢慢紧接萤光素酶测定中添加氢氧化钠至EGTA，直到它完全溶解。*加入到最终缓冲液试剂
| 海肾荧光素酶试剂缓冲 | 终浓度（1X） |
| 氯化钠 | 1.1M的 |
| 的Na 2 EDTA | 2.2毫米 |
| 磷酸二氢钾 | 0.22 M |
| NaN的3 | 1.3毫米 |
| BSA * | 0.44毫克/毫升 |
| 腔肠* | 2.5＆＃956，M |
表2：库存Renilla荧光素酶缓冲试剂除外BSA和腔肠素的试剂可以以1倍浓度被混合并在室温下储存。腔肠素可以溶解在酸化的甲醇和每板等分。通过加入HCl至5mM的（<3的pH）最终浓度酸化甲醇。溶于2.36毫升酸化甲醇（250μM）等分105微升/板250微克腔肠。该混合物是稳定的，在至少6个月，也可以是光敏感。 *试剂添加荧光素酶试验之前立即缓冲。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
所述3'LIFE测定标识在高通量3'UTRs官能miRNA靶。此法对研究者谁希望通过实验找出了大量的假定目标他们感兴趣的miRNA的有用。该3'LIFE测定法是有效的方法，以查询3'UTR从动调节，在该测定法提供了一个功能度量的miRNA靶向的，以及一个单一的记者的二进制测试:: 3'UTR针对单一的miRNA可以自信地解决各个基因的靶向状态。为了验证这种方法，我们筛选了275 3'UTRs一个面板和针对两种miRNA的， 让-7C和miR-10b和包括10这个库中先前验证靶基因。这十个八个基因压制展出24。我们还观察到一个显著富集未经确认的生物信息学预测目标，以及包含在我们的排名靠前的典型元素种子不可预知的3'UTRs，SUGgesting这3'LIFE能够识别真正的 miRNA的目标。
高通量筛选灵敏度的一个关键指标是假阳性和假阴性率。虽然这需要检测的假阳性率使用额外的替代方法，以验证命中进行评估，包括在证明型的原则，我们的屏幕表现出压抑的十个阳性对照八，这表明20％的假阴性率。然而，许多技术被用于识别在不同的细胞环境中的miRNA靶，和3'UTR处理和调节由反式作用因子是已知的特定高度组织。例如，大多数3'UTRs的包含多个多聚腺苷酸化位点，其中控制3'UTR在成熟mRNA的长度。在许多情况下，使用的近端多聚腺苷酸化位点是特定的组织，并且可以排除miRNA靶位点。此外，合作miRNA的目标，竞争无线第RNA结合蛋白和mRNA二级结构可以全部冲击3'LIFE的能力来检测miRNA靶在特定组织。正因为如此，由3'LIFE测定目标的检测可以基于在该测定法进行的细胞环境的不同而变化，复杂化绝对误差率的评估。此协议为HEK293T细胞进行了优化，但如果研究者希望在特定的生物环境进行测定的替代细胞系都可以使用。然而，转染效率和细胞存活与每个细胞系的优化将必须使用多个缓冲条件，脉冲代码和细胞数进行优化。的优化方案的一个例子可在 沃尔特等 24中找到。
此协议已被优化在96-孔格式，并指定使用某些高通量检测仪器。在这种情况下，该机构不具有所需的96的设备- 嗯核转，备选的转染试剂，可以用于执行3'LIFE测定法，只要转染效率仍然很高。此外，荧光素酶分析是3'LIFE测定的最耗时的方面。因此，使用多个光度计的推荐用于高通量筛选。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferin | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
| Trypsin | T2600000 | ||
| Consumables | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| Instruments | |||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3'UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
