Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3'LIFE

Published: May 25, 2015 doi: 10.3791/52647
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2, 1,2
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Biodesign Institute, Arizona State University

Abstract

פלורסנט זיהוי של אלמנטים פונקציונליים ב3'UTRs (3'LIFE) מאפשר זיהוי המהיר של מטרות של miRNAs הספציפי בתוך מערך של מאות 3'UTRs שאילתא. זיהוי יעד מבוסס על assay הכפול לוציפראז, אשר מזהה מחייב ברמת ה- mRNA על ידי מדידת תפוקת translational, נותנת קריאת נתונים פונקציונליות של מירנה מיקוד. 3'LIFE משתמש מאגרים שאינן קניינית וריאגנטים, וספריות כתב זמינות בפומבי, מה שהופך את מסכי הגנום אפשרי וחסכוני. ניתן לבצע 3'LIFE או במעבדה הגדרה סטנדרטית או לשנותם באמצעות רובוטים טיפול נוזליים ומכשור תפוקה גבוהה אחר. אנו מדגימים את הגישה באמצעות בסיס הנתונים של 3'UTRs האנושי משובט ב96-גם צלחות, ושני miRNAs בדיקה, לתת-7C וmiR-10b. אנו מדגימים כיצד לבצע הכנת DNA, transfection, תרבות תא ומבחני בלוציפראז בפורמט 96-היטב, ולספק כלים לנתוניםניתוח. לסיכום 3'LIFE הוא מאוד לשחזור, מהיר, שיטתי, ומזהה מטרות ביטחון גבוהות.

Introduction

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לזהות ולמפות בדיוק microRNA מטרות (מירנה) בתפוקה גבוהה. MiRNAs הוא RNAs קידוד שאינו אנדוגני ~ 22 נוקלאוטידים באורך. בעקבות שעתוק ועיבוד, miRNAs הבוגר משולבים בקומפלקס חלבון הנקרא RNA מושרה השתקה מורכב (RISC). כל מירנה מנחה את RISC למקד אלמנטים הממוקמים בעיקר באזורי 3'untranslated (3'UTRs) של RNAs שליח (mRNAs), וכתוצאה מכך גם דיכוי תרגום או מחשוף mRNA 1. מירנה להכיר אתרי יעד המבוססים על ווטסון-קריק הסטנדרטי וG: U לנענע זיווג בסיס, והם מנוונים בטבע, המכיל זוגות בסיסים תואמים מרובים ובלטה אזורים. miRNAs רבים נשמר באופן רחב מצמחים לבני האדם 2,3, שבו הם משחקים במגוון רחב של תפקידים ביולוגיים. בmetazoans miRNAs יכול להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל החלטות גורל תא 4, עיתוי התפתחותי 5 6,7. misexpression מירנה יכול גם לגרום לויסות הגנים חריגה, אשר יכולה להיות השפעה מהותית על מבוססת אך ורק על התפקוד של גני מטרת התנהגות תא. ככזה, miRNAs צמוד למגוון רחב של מחלות, כולל ניוון מוחיים 8,9, סוכרת וסרטן 10 11. Bioinformatic וגישות רטוב ספסל מצביעים על כך שכל מירנה עשויה להיות מסוגל מיקוד מאות עד אלפי mRNAs הברור 12-14, מצביע על כך שתפוקה גבוהה או הגנום גישות רחבות נדרשות לחקור בריכה גדולה זו של אינטראקציות פוטנציאליות.

זיהוי גני המטרה הוא מרכיב קריטי בתפקוד מירנה מכניסטי הגדרה, וכדי לעשות זאת חוקרים חייבים להיות מסוגלים לחשוף מטרות בקנה מידה גדולה. כמה גישות פותחו כדי לזהות מטרות מירנה, כולל אלגוריתמי תחזית bioinformatic, רצף תפוקה גבוההשל ממוקד mRNAs, וכתב מבחני מבוסס. כל הגישות הללו עוצמות וחולשות הגלומות. בהתחשב בכך שמיקוד מירנה מונחה על ידי סגוליות רצף, בעיקר של נוקלאוטידים 2-6 של מירנה (שמכונה אזור הזרע), כמה אלגוריתמים פותחו לחזות מטרות מירנה לאורך הגנום של אורגניזמים רבים. אלגוריתמים אלה מאומנים באמצעות המוטיבים בסיס שיוך הנצפים של מטרות מירנה תוקף, ולעתים קרובות לנצל פרמטרים כגון זיווג מחמיר זרע, שימור אתר, ו / או יציבות התרמודינמית 15. בעוד מסננים אלה לחדד מספר רב של מטרות המשוערות עם השלמה מספיק למטרות ביטחון בלבד גבוהות, הם עלולים שלא לכלול מיני אתרים ספציפיים ואינם קנוני מירנה יעד, שהראיות האחרונות עולה נפוצות 16-24. יתר על כן, תחזיות אלו אינן לוקחות בחשבון את מנגנוני עיבוד mRNA שלא לכלול אתרי יעד מירנה, כגון polyadenylation החלופי25, עריכת RNA 26, מתילציה RNA 27, ומחייב שיתוף פעולה. ככזה, שיעורים חיוביים ושקר שקר שליליים גבוהים דווחו לאלגוריתמים רבים 22,24,28. בעוד אלגוריתמים אלה הם שימושיים כדי לזהות מטרות מירנה מועמד לאימות ניסיוני שלאחר מכן, שיעורי שגיאה הגבוהים אלה מגבילים את היעילות של גישות bioinformatic לאיתור יעד מירנה שיטתית.

לחקור באופן שיטתי לאינטראקציות בין מירנה נתון ו3'UTRs פוטנציאלי הממוקד פיתחנו assay תפוקה גבוהה נקרא פלורסנט זיהוי של אלמנטים פונקציונליים ב3'UTRs (3'LIFE) 24. צעדים זה assay אינטראקציות ישירות ודיכוי translational של 3'UTR הבדיקה על ידי שאילתא מירנה באמצעות מערכת כתב בלוציפראז כפולה. במערכת זו, 3'UTR של גן של עניין הוא משובט במורד הזרם של מסגרת קריאת גחלילית בלוציפראז (fluc) כתב. חסרונות הכתבtruct הוא cotransfected עם שאילתא מירנה בתאי HEK293T. מיקוד מירנה נקבע על ידי מדידת השינוי ביחס בין fluc המבחן :: כתב 3'UTR וכתב בלוציפראז Renilla אינו ספציפי שני. חשוב לציין, מבחני בלוציפראז לזהות אינטראקציות מירנה / mRNA תפקודיים המשפיעות על תפוקת translational של הכתב. זהו יתרון מרכזי על פני שיטות מסורתיות כדי לזהות רגולציה מירנה, כגון RT-qPCR וכתמים מערביים, שבזו עוקפת הבדלים בשפלת mRNA ודיכוי translational, כמו גם שינויים בשפע חלבון עצמאי של רגולציה מבוססת 3'UTR.

מבחני בלוציפראז משמשים באופן נרחב כדי לאמת מטרות מירנה ישירות בגלל פשטותם היחסית וברגישות, עדיין השימוש בם במסכי תפוקה גבוהה הוא מוגבל על ידי עלויות גבוהות כרוכות בחומרים כימיים מתכלים, חוסר ספריות 3'UTR ממקורות ציבוריים, והעדר של prot לוציפראז הסטנדרטיocols, שהוביל לקשיים בהשוואת דיכוי פונקציונלי על פני מערכי נתונים מרובים. כדי להקל על השימוש של assay 3'LIFE, יש לנו דגש על פישוט של עיצוב ניסיוני, שימוש בחומרים כימי transfection 24 ולוציפראז לא מסחרי 29, יצירת ספריית 3'UTR המתעדכנת באופן קבוע ומורחבת, והוא זמין ב מאגר פלסמיד ציבור 30.

יכולת הרחבה של assay 3'LIFE מאפשרת הקרנה של ספריית 3'UTR גדולה למיקוד על ידי מירנה ניתנת ללא הטיית המסך לכיוון הגנים שזוהו bioinformatically. בנוסף לבדיקת אינטראקציות הקנונית וחזו, גישה שיטתית זו מאפשרת זיהוי מטרות רומן מונעות באמצעות אינטראקציות הלא-הקנונים ו / או מינים ספציפיות. חשוב לציין, את ההשפעה של מירנה מיקוד על ייצור חלבון הוא הבין בדרך כלל לגרום לדיכוי translational הצנוע 15,31 </ Sup>, המצביע על כך תפקיד עיקרי של הרגולציה מירנה הוא לכוונן תפוקת חלבון, להגן מפני רמות חריגות של ביטוי גנים, ומספק חוסן לתא תוכניות ספציפיות 32,33. הרגישות של assay בלוציפראז בשילוב עם המספר הגדול מיסודו של אינטראקציות מירנה / mRNA שליליים במסך 3'LIFE מאפשרת זיהוי של השפעות עדינות של מירנה מיקוד על מספר גדול של גנים, וזיהוי של מרכיבים רבים של רשתות גנים ש מוסדרים על ידי מירנה נתנה 24.

כאן אנו מתארים את פרוטוקול 3'LIFE, ולהפגין זה היתכנות על ידי הקרנת שני miRNAs המאופיין היטב, miR-10b ולתת-7C נגד פנל של 275 3'UTRs האנושי (איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים (24-48 שעות לפני transfection)

  1. 24-48 שעות לפני זרע transfection כמות מספקת של תאי HEK293T מבוססים על מספר 96-גם הצלחות שtransfected.
    הערה: לtransfections העקבי, תאי צלחת בצפיפות מספיק להעדיף חלוקה מהירה, עדיין לא יהיה יותר מ 70-90% confluency בזמן transfection.
  2. כל צלחת 96-היטב דורשת 9 x 10 6 תאים (75,000 תאים לכל היטב, ו -120 בארות לכל צלחת לחשבון לשימוש של מאגר ופיפטה רבה). לחשב את זמן ההכפלה של תאי HEK293 (בדרך כלל ~ 20 שעות), וזרעים את המספר המתאים של תאים להשיג לפחות 9 x 10 6 תאים בזמן של transfection. צלחת תרבות המעגלית 145 מ"מ היא בדרך כלל מספיק עבור 3 transfections 96-גם כאשר גדלו ל~ confluency 90%, עם ~ 10% מתאים שנותר לreseed צלחת חדשה.

2. הכנה לפני transfection

_content "> הערה: הכנת המאגרים ופלסמיד דנ"א בשלב 2.0-2.2 צריכה להתבצע בימים שקדם לtransfection מאז הכנת ריאגנטים אלה עשויה להיות זמן רב.

  1. שיבוטים 3'UTR אנושיים התואמים את assay 3'LIFE זמינים דרך מאגר פלסמיד ציבור 30. לטהר פלסמיד דנ"א ידני או עם רובוטים טיפול נוזליים. השתמש ערכת 96-גם מיני-הכנת תמוגה אלקליין הכיתה transfection ולעקוב אחר ההוראות של היצרן. Resuspend הווקטורים המטוהרים ל~ 100 ng / μl בכל טוב.
    הערה: אות לוציפראז אין מספיק תגרום אם ריכוז פלסמיד נופל מתחת ל -40 ng / μl.
  2. השג את pLIFE-מירנה וקטורי 30 או שיבוט באמצעות הצינור באיור 24 ב 1. Resuspend הווקטורים בריכוז של 500 ng / μl עבור כל מירנה ופלסמידים שליטה בלנק.
  3. בשל הרגישות של תנאי חיץ nucleofection, להבטיח שהנפח הכולל של חומרי transfected (כוללים תאים ופלסמידים) אינו עולה על 10% מהנוזל הכולל בכל טוב של צלחת transfection 96-היטב. כדי להשיג זאת, לרכז את מניית פלסמיד pLIFE-מירנה בריכוז של לפחות 500 ng / μl.
  4. הכן 10x ריאגנטים גחלילית בלוציפראז חיץ (טבלת 1), וריאגנטים 1x Renilla לוציפראז החיץ (טבלה 2), שבו ניתן לאחסן עד 6 חודשים.
    הערה: DTT במאגר לוציפראז הגחלילית חייבת להיות מאוחסנת בפתרון ב -20 מעלות צלסיוס בaliquots שימוש היחיד.

3. להכין פריטים הבאים מייד לפני transfection

  1. הכן חיץ transfection המכיל PBS, 1.5% HEPES, pH 7.0. הכן את זה טרי, למרות שהיא עשויה להיות מאוחסנת במשך עד חודש 1 ב 4 ° C, ללא ירידות בולטות ביעילות transfection. בגיבוש כרכי חיץ ופלסמיד דנ"א, להניח 120 תגובות לכל צלחת 96-גם לsufficiently חשבון לשגיאות בפיפטה ונפח איבד באמצעות מאגרים נוזליים וטפטפות רבת ערוצים. Aliquot 18 μl לחיץ transfection היטב (120 בארות / 96-גם צלחת = 2.16 מיליליטר לכל צלחת), ומניח בצד.
    הערה: המכשיר הסלולרי electroporation הוא מאוד רגיש לתנאי החיץ משמשים לtransfect תאים. דיוק כאשר מאגרי הכנה יבטיחו ביצועים של הציוד עקביים. יש להקפיד במיוחד בעת ביצוע assay כדי למנוע אידוי של מאגרים, במיוחד על ידי צמצום זמן החיץ שנותר נחשף בצינורות microcentrifuge, 96-גם צלחות, מאגרים, וצלחות אלקטרודה.
  2. השמורה ארבע בארות לפקדים הבאים, לא pLIFE-3'UTR (למדוד רקע של assay בלוציפראז), pLIFE-SV40 3'UTR (שליטת יעד שלילית), שליטה חיובית למירנה מס '1, שליטה חיובית ל# 2 מירנה.
    הערה: וקטורים אלה זמינים 30 בפומבי. לחלופין, כל יעד תוקף בעבריכול לשמש כביקורת חיובית.
  3. תקשורת חמה, טריפסין (0.25%) ל -37 מעלות צלזיוס.
  4. היטב בכל 96-גם צלחת תרבית תאים, להוסיף 200 μl של DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פן / סטרפטוקוקוס, והניח בחממה 37 ° C לשימוש הבאים transfection.
  5. הפעל את כל התקני electroporation התא ואחריו את התוכנה התומכת. השתמש FF120 קוד הדופק לתאי HEK293T וחיץ PBS / HEPES.

4. הכנת פלסמיד דנ"א ותערובת תאים

הערה: הפרוטוקול הבא משערת transfecting שלוש צלחות 96-היטב בניסוי אחד למסך עם שני miRNAs (miRNA- # 1 וmiRNA- # 2). כל צלחת תהיה מתאים לאותה הצלחת 96-היטב של פלסמידים pLIFE-3'UTR, ולהתייחס אליהם שלוש פעמים עם pLIFE-miRNA- # pLIFE-מירנה-ריק, 1, או pLIFE-miRNA- # 2.

  1. הכן 3 מניות של חיץ transfection pLIFE-מירנה + לכל מירנה. המניה זה אמורה להסביר 50% (10 μl) של נפח הכולל של כלטוב, כשהוא מוכפל ב120 בארות. לפיכך, כל מניה צריכה להכיל 1.08 מיליליטר החיץ + 120 DNA μl פלסמיד (pLIFE-מירנה).
  2. הסרת תאים מצלחת תרבות 145 מ"מ על ידי משחררי תקשורת, שטיפה בעדינות עם PBS, וטיפול עם טריפסין ~ 5 מיליליטר 0.25% במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לנטרל טריפסין עם נפח שווה של תקשורת, ותאים גלולה ב XG 300 במשך 5 דקות.
  3. הסר טריפסין / תקשורת, וגלולה גלולה ב~ 5-10 מיליליטר תקשורת (תלוי בצפיפות תאים ומגוון מדויק של דלפק תא).
  4. ספירת תאים באמצעות דלפק תא. ודא שתאים> 95% קיימא ובטווח מדויק של מכונה.
    הערה: ספירת תאים לא מדויקת יכולה לנבוע מריכוזי תא גבוהים מאוד (> 6.0x 10 6 מיליליטר /). יותר מדי תאי transfecting באופן דרסטי יכולים להפחית את היעילות של מירנה מיקוד על ידי הפחתת פלסמיד: יחס תא ו / או הפחתת יעילות transfection.
  5. שלושה צינורות Aliquot כל 9 x 10 6 תאים המכילים, מתאים לתאי r equired לtransfection של צלחת אחת 96-היטב. ספין תאים ב XG 300 במשך 3 דקות.
  6. הסר תקשורת. הקפד להסיר כמה שיותר תקשורת אפשרי עם הפרעה מינימאלית של גלולה כאמצעי תקשורת עודפת יכול להשפיע יעילות transfection.
  7. תאי Resuspend במאגר 1.2 מיליליטר transfection / תערובת פלסמיד מירנה, ומניחים בצד.
  8. בעקבות הצעדים resuspension פירוט של פלסמיד pLIFE-3'UTR במאגר transfection. כפי שזה מתרחש ב 96 צלחות גם, לטפל כדי למנוע אידוי של חיץ על ידי כיסוי צלחות בכל העת.
    1. בעזרת פיפטה רבה, להעביר 32.4 μl חיץ transfection לבאר כל צלחת 96 גם PCR (9 μl [לכל transfection] * 3 [צלחות] * 1.2 [לדין וחשבון על שגיאת פיפטה]).
    2. להוסיף 3.6 μl (~ 100 ng / μl) של פלסמיד pLIFE-3'UTR-הכין מיני היטב כל אחד ומערבבים היטב.
    3. פיפטה 10 μl של תערובת זו לבאר כל צלחת transfection 96-היטב וכיסוי.

התחת = "jove_title"> 5. Transfection

  1. הזז 1.2 מיליליטר של התא / חיץ / תערובת פלסמיד pLIFE-מירנה הראשונה למאגר. מערבבים היטב.
  2. הוסף 10 μl של תערובת זו לתוך צלחת transfection 96-גם הראשונה כבר מכילה 10 חיץ transfection μl / pLIFE-3'UTR. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים.
    הערה: השעיה שווה של תאים במאגר תבטיח גם והמעבר יסודי של הזרם החשמלי דרך קובט ומקסם את יעילות transfection.
  3. מניחים צלחת transfection 96-גם על מכשיר electroporation התא וליזום transfection.
  4. ברגע שtransfection הוא מלא, להוסיף מדיה מחוממת מראש 100 μl מצלחת תרבות 96-היטב היטב בכל צלחת transfection 96-היטב ומערבבים היטב. הזז 100 μl מכל טוב לצלחת תרבות 96-היטב.
  5. מערבבים תאים בצלחת תרבות עם פיפטה במאונך במרכז הבאר, כמו תאים נוטים לצבור בצד well אלא אם כן מעורב כראוי.
  6. חזור על 5.1-5.5 לשתי צלחות שנותרו.
  7. צלחת transfection 96-גם ניקוי
    1. ניתן למחזר צלחות transfection 96-גם על ידי שטיפה עם EtOH 70% כדי להבטיח שאין לשאת מעל של חומצות גרעין בין ניסויים. לבצע שתי שטיפות EtOH 70% באמצעות בקבוק תרסיס גם למלא לחלוטין כל, ואחרי ניגוב EtOH העודף על רצועות אלקטרודה (צד תחתון) ומאפשר צלחות transfection להתייבש לחלוטין בשכונה התרבות.
      הערה: בדקנו עבור לשאת על זיהום הדנ"א על ​​ידי transfecting 12 בארות עם 2 מיקרוגרם pmaxGFP פלסמיד כל לתאי HEK293T, ואחרי שטיפה אחת עם 70% EtOH, וtransfection שני ללא פלסמיד דנ"א. עם ריכוז זה גבוה מאוד פלסמיד, כתב בהיר מאוד, ולשטוף בודד, לא הייתה הקרינה נצפית בכל 12 transfections לשכפל.
  8. תרבות תאים במשך 48-72 שעות על 37 מעלות צלזיוס, ואחריו lucif הכפוללמחוק assay.

6. תא lysate הכנה ללוציפראז Assay

  1. לדלל חיץ תמוגה עם מים 4 חלקים, חלק 1 5x חיץ תמוגה פסיבי במאגר. לחשב 26 μl / טוב, והוסיף ~ 20 כרכים נוספים כדי להסביר הפסד במאגר.
    הערה: הצפת מאוחסנת ב -20 מעלות צלזיוס והוא יכול להיות צמיג מאוד, כך שלפני מאפשר החיץ 5x להתקרב טמפרטורת חדר יהיה לשפר את דיוק pipetting.
  2. לנתח כל טוב ליעילות transfection באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה חוסר עקביות כל בבארות שלא transfect יעילות (> 90% יעילות transfection), או מביעים רמות נמוכות של RFP מעיד על תשישות צפיפות או תקשורת. הסר בארות אלה מהניתוח.
  3. להסיר לחלוטין את התקשורת מהתאים, נזהר שלא elute מהר מדי שיגרום לתאים לנתק.
    הערה: תקשורת נותרה תהיה לדלל את תנודות lysate והסיבה בערכים על פני experimeNTS.
  4. להוסיף 26 μl של חיץ תמוגה היטב כל אחד, ומקום על שייקר / נדנדה צלחת במהירות נמוכה / בינונית ל~ 20-30 דקות. השתמש זה זמן להכין מאגרי לוציפראז, לשטוף וראש luminometer (ים), ולהעביר את lysate לצלחות מדידה אטומות.

7. הכפול לוציפראז Assay

הערה: אם צלחות מרובות נמדדות ברצף על luminometer אחד, ליצור תערובות אדון חיץ עם הכל חוץ ATP ומצעים, הוספת חומרים כימיים אלה ואחרי התאמת pH מייד לפני שימוש בכל צלחת. ATP ומצעים עשויים לבזות לאורך זמן; עקביות בכמות זמן ריאגנטים אלה נמצאים במאגר תשפר עקביות לאורך צלחות מרובות.

  1. הכן מאגרי לוציפראז 1x (טבלה 1):
    1. לעטוף שני צינורות (בדרך כלל 15/50 מיליליטר צינורות צנטריפוגה) המכילים את הגחלילית ומאגרי Renilla עם רדיד אלומיניום, כמו מצעים עשויים להיות רגיש לאור.
    2. הכן חיץ לוציפראז גחלילית 1x. הוסף 1 מיליליטר של כל חמישה 10x ריאגנטים גחלילית בלוציפראז, הוספת EGTA האחרון, עד 5 מיליליטר H 2 0 לריכוז 1x סופי.
      1. להוסיף 0.025 ATP גרם ל 10 מיליליטר 1x חיץ גחלילית. מערבבים על ידי היפוך כמה פעמים. שמור ATP על קרח בכל העת. ATP יהיה לבזות, כך שאם מדידה ברצף צלחת יותר מפעם אחת, חיץ חייב להיעשות תחילת טריות בשלב זה עבור כל צלחת נוספת.
      2. להוסיף luciferin של 100 חיפושית (מצע) (טבלה 1) 100 μl הצפת צריכה לשנות לצבע צהבהב המבוסס על ה- pH.
    3. הכינון מחדש 1x Renilla חיץ לוציפראז: לכל צלחת 96-היטב, aliquot 10 מיליליטר של 1 "Renilla חיץ".
      1. להוסיף של BSA 100 μl (44 מ"ג / מיליליטר מניות).
      2. אם הקרנת צלחת יותר מפעם אחת, תערובת הורים נפרדת ל -10 מיליליטר aliquots.
      3. להוסיף למאגר של coelenterazine 100 μl (aliquoted בעבר ומאוחסן בקונצרט כלשהו 100x.)
      4. <li> התאם את ה- pH של 1x גחלילית חיץ 8.0, ואחריו חיץ 1x Renilla 5.0 באמצעות NaOH וHCl.
      הערה: הפעילות של כל חיץ, ואת היכולת של חיץ Renilla כדי להרוות את פעילות לוציפראז גחלילית תלויה מאוד בpH. לקבלת תוצאות עקביות להיות מאוד מדויק בשלב זה.
    4. תביא נפח של כל מאגר (המקביל לצלחת 1 96-היטב) 10.5 מיליליטר כדי להתאים לתחולו luminometer.
  2. העבר את lysate לצלחות הלבנות אטומות: בשלב זה התאים צריכים להיות במאגר תמוגה ל~ 20 דקות. קח 25 μl מכל הטוב בעזרת פיפטה רבה, כדי להיות בטוח pipet למעלה ולמטה ביסודיות כדי לשבור את הגושים של תאים וhomogenize lysate.
  3. הכן את luminometer. הפעל את luminometer ובחר את הפרוטוקול בתיקיית DLR, שנקרא "DLR עם שתי זריקות". פורמטים אחרים אינם תואמים לצינור ניתוח נתונים (להלן).
    1. בחר את הבארות להיות לאested (כל הבארות היא ברירת המחדל).
    2. להאריך את "העיכוב לפני המדידה" הגדרה 5 שניות, עם זמן מדידה 10 שניות (ראה 29 להסבר).
    3. צעדי נימים לשטוף: 3x מים, 3x EtOH, 3x מים, 3x היבש. מאגרי ראש פעם אחת לפסולת, ופעם שנייה אז ראש בחזרה לצינורות החיץ כדי להבטיח ערבוב. להזריק את חיץ הגחלילית הראשונה וראשו בנימים עזבו, ואחריו Renilla בנימים תקין.
  4. ליזום assay בלוציפראז. כל צלחת צריכה לקחת ~ 48 דקות לקריאה. לאחר השלמת לשמור את הקובץ ראשון, ולאחר מכן לחזור על הצעדים לשטוף ולכבות את luminometer.
    הערה: ניתן לקרוא צלחות מרובות והנתונים המאוחסנים באותו קובץ Excel, לעומת זאת סוגיות ניתן נתקלה עם צלחת מרובה קוראת בי תכנית luminometer תתרסק. הקפד לשמור את כל הנתונים בין מדידות ולקחת צילומי מסך אם תכנית קורסת לפני להציל אפשרי.
    1. החלף מאגרים ישניםעם חדש, להיות בטוח לראש לפחות פעמיים עם מאגרים חדשים לפני שמתחיל את הצלחת החדשה.

ניתוח נתונים 8.

  1. לנצל טבלאות אקסל "3'LIFE - ניתוח צלחת אחת" ו- "3'LIFE - ניתוח multiplate" זמין מwww.mangonelab.com. העתק נתונים גולמיים לגחלילית ולוציפראז Renilla מדידות מקובץ פלט luminometer המקומות המתאימים למצב השלילי, מירנה המס '1, ומירנה מס' 2 ל" 3'LIFE - ניתוח צלחת אחת "לגיליון אלקטרוני.
  2. הגיליון האלקטרוני באופן אוטומטי לחשב גחלילית / יחס Renilla ולנרמל כל מירנה לשליטה השלילית המתאימה, ולנרמל את ערכי דיכוי על פני כל צלחת.
    הערה: גיליון אלקטרוני זה יזהה באופן אוטומטי בארות עם אות בלוציפראז נמוכה, לסמן בארות מודחקות באופן משמעותי, ולספק אמצעים של repressiעל פני כל הצלחת. ראה 24 להסבר מפורט של ניתוח סטטיסטי.
    1. העתק את הערכים מהתיבה "מנורמל RI המדד", לתאים מקבילים ב-- הגיליון האלקטרוני "3'LIFE ניתוח multiplate" במיקום המתאים לשכפל # 1 עבור כל מירנה נבדקה. חזור לכל משכפל הביולוגי שבוצע בימים שונים.
  3. אם תרצה, להכניס את שמות הגן ומצב חיזוי היעד בעמודות B ו- D, בהתאמה.
    1. לאפשר הגיליון האלקטרוני כדי לחשב את הממוצע של כל הצלחת באופן אוטומטי. שים לב לנתונים בפורמט 96 גם מפת חום (איור 2). הקובץ גם מארגן את הנתונים בתבנית רשימה (איור 2).
      הערה: מדד הדיכוי הוא המדד המשמש לזיהוי מטרות מירנה משוערת. ניתן להשתמש בפרמטרים שונים החמרה, המבוססים על העדפות אישיות. בממוצע אנו רואים סיכוי להיטים להלן מדד דיכוי של 0.8 ומשמעותיים מבחינה סטטיסטית על ידי מבחן t (-value p <0.05). כפי שניתן לראות באיור 3 מטרות פוטנציאליות על סמך קריטריונים אלה יהיו מודגשים באדום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קובץ פלט luminometer מכיל מדידות גלם לשני חלבוני לוציפראז הגחלילית וRenilla. פורמט גלם זה תואם עם "3'LIFE - ניתוח צלחת אחת" ו- "3'LIFE - ניתוח multiplate" גיליונות אלקטרוניים זמין מאתר האינטרנט של המעבדה Mangone (www.mangonelab.com). הגיליון האלקטרוני ניתוח צלחת אחת המחשב באופן אוטומטי גחלילית / יחס Renilla, מנרמל כל מירנה לשליטה השלילית המתאימה, ומנרמל ערכי דיכוי על פני כל צלחת. גיליון אלקטרוני זה מזהה באופן אוטומטי בארות עם אות בלוציפראז Renilla נמוכה, מדגיש כי התערוכה בארות דיכוי בהשוואה לביקורת השלילית, ומספק אמצעים של דיכוי על פני כל הצלחת (איור 2). ראה 24 להסבר מפורט של ניתוח סטטיסטי.

משכפל מרובה ניתן לנתחד באמצעות הגיליון האלקטרוני "ניתוח multiplate". כל לשכפל בהשוואה זה לצד זה, ואמצעים סטטיסטיים של הנתונים באופן אוטומטי מחושבים (איור 3). בנוסף להשוואת משכפל עם עמודות "הדחקה מנורמלת", המשתמש יכול להשוות בין שני דיכוי miRNAs תחת "# מירנה 1 # 2 / מירנה" עמודות. צעד זה מחלק מדד הדיכוי לכל מירנה לכל לשכפל. צעד זה יכול להצביע על ערכים שגויים מassay בלוציפראז (לדוגמא חריגה קריאה גבוהה או נמוכה עם הביקורת השלילית, ראה איור 3, שורת A9, נציג # 3), ובו בארות מדד הדיכוי לא יכול להצביע על דיכוי משמעותי, אבל זה עושה תערוכה הבדלים משמעותיים בין miRNAs. בעוד מדד זה לא ניתן להשתמש ישירות כדי לציין יעד מירנה, הוא שימושי לזיהוי חריגים, בארות בעייתיות, או דפוסים בנתונים שאינם מיוחסים אך ורק לכוון את מירנה מחדשgulation.

הדחקת המדד (RI) היא נהגה לקרוא יעד מירנה משוער, עם ערכים נמוכים יותר מתאים לדיכוי יחסי גבוה. הסף לקוראים מטרות המשוערות מבוסס על רמת החומרה הנדרשת על ידי החוקר, אבל שילוב של RI עם 3'UTRs המציג p-ערכים מובהקים סטטיסטי (p <0.05) יציין מטרות ביטחון גבוה (ראו איור 2 שורות B8 ו B12).

איור 1
איור 1: 3'LIFE Assay (). וקטורי שער תואמים בשימוש assay 3'LIFE. למעלה: הגן בלוציפראז (FLuc) הוא התמזגה ל3'UTR הבדיקה, ואילו הגן בלוציפראז Renilla (RLuc) הוא התמזגו לSV40 הרשות 3'UTR נוקבים כמו שליטה. תחתון: וקטור RFP- מירנה-אינטרון - הבדיקה טרום מירנה, בתוספת ~ 400נוקלאוטידים בתוך המוקד הגנומי שלו (לשחזר עיבוד מירנה אנדוגני), הוא משובט בתוך אינטרון לאפשר שיתוף הביטוי שלה עם fluorochrome DSRed2. שני הווקטורים זמינים בפומבי (סיילר et al., 2013). תרשים זרימה של assay 3'LIFE (B). (ג) 3'LIFE צינור: הווקטור הכפול לוציפראז מכיל 3'UTR הבדיקה עם או בלי וקטורי מירנה לתוך HEK293 תאים ב96-גם צלחות שיתוף transfected. האינטראקציה בין מירנה ויעד 3'UTR תום לב תוריד את הארה היחסית בבארות ספציפיות (שהודגמה על ידי הנקודה הכתומה בצלחת הניסוי).

איור 2
איור 2: דוגמא של נתונים שהופקו עם assay 3'LIFE. כל בדיקה מירנה נבדקה ארבע פעמים (משכפל 1-4). צבעים מייצגים רמות דיכוי, עם אדוםצבעים מצביעים על מירנה / אינטראקציה 3'UTR חזקה. כל משכפל הם ממוצעים לייצר מטרות המשוערות באיכות גבוהה מוצגות בצלחת הסיכום מתחת לחץ הצהוב. קופסא לבנה מייצגת בקרות, נכשלה transfections או בארות עם יעילות transfection נמוכה.

איור 3
איור 3:. טבלה המייצגת נתוני סיכום של קבוצת משנה של אינטראקציות הופקו באמצעות הגיליון האלקטרוני 3'LIFE ערכי ההדחקה הם כמו באיור 2. תוכנת מחשבת סטיית תקן, סטיית התקן וZ-ציון לכל אינטראקציה. סטטיסטית אינטראקציות משמעותיות מסומנות באדום. ארבע השורות האחרונות מראות דיכוי יחסי של אחד מירנה לאחרת, ומשמשת כמדד המשני כדי להשוות בין שני דיכוי miRNAs שונה. הגיליון האלקטרוני ניתן להוריד מwww.mangonelab.com

ריאגנטים חיץ לוציפראז גחלילית ריכוז סופי (1x) Glycylglycine 25 מ"מ K x 4 PO (pH 7.8) 15 מ"מ MgSO 4 15 מ"מ DTT (חנות ב4º) 1 מ"מ EGTA 4 מ"מ ATP * 2 מ"מ luciferin החיפושית * 250 מיקרומטר

ריאגנטים גחלילית בלוציפראז מלאי: טבלת 1: 10x פתרונות מאגר Glycylglycine, K x 4 PO, MgSO 4, יכולים להיות מוכנים DTT וEGTA בנפרד ומאוחסן לפני חיץ הכינון מחדש. 100x החיפושית Luciferin (מצע לוציפראז גחלילית) יכול להיות חנותד על ידי המסת luciferin 50 מ"ג בH 7.134 מיליליטר 2: 0 (25 מ"מ). 105 μl / צלחת Aliquot של luciferin המומס החיפושית לתוך צינורות ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. לתמיכה טכנית Promega, זה צריך להיות יציב ל> 6 חודשים, אבל יכול להיות רגיש לאור. הערה: EGTA לא ייכנס לפתרון ב- pH הניטרלי. לאט לאט להוסיף NaOH לEGTA עד שהוא נמס לגמרי. * ריאגנטים הוסיפו למאגר סופי מייד לפני assay בלוציפראז

ריאגנטים חיץ לוציפראז Renilla ריכוז סופי (1x)
NaCl 1.1 מ '
Na 2 EDTA 2.2 מ"מ
KH 2 PO 4 .22 M
NaN 3 1.3 מ"מ
BSA * .44 מ"ג / מיליליטר
Coelenterazine * 2.5 & #956; M

טבלת 2: ריאגנטים חיץ לוציפראז מלאי Renilla כל ריאגנטים מלבד BSA וcoelenterazine יכולים להיות מעורבים בריכוז 1x ומאוחסנים בטמפרטורת חדר. Coelenterazine יכול להיות מומס במתנול acidified וaliquoted לכל צלחת. להפוך לחומצת מתנול ידי הוספת HCl לריכוז סופי של 5 מ"מ (<3 pH). ממיסים 250 מיקרוגרם בcoelenterazine 2.36 מיליליטר aliquot מתנול acidified (250 מיקרומטר) 105 UL / צלחת. התערובת יציבה במשך לפחות 6 חודשים, אך עשוי להיות רגיש לאור. * ריאגנטים הוסיפו למאגר מייד לפני assay בלוציפראז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Assay 3'LIFE מזהה מטרות מירנה תפקודיות ב3'UTRs בתפוקה גבוהה. assay זה שימושי לחוקרים המבקשים לזהות באופן ניסיוני במספר רב של מטרות המשוערות למירנה עניין שלהם. Assay 3'LIFE הוא גישה רבת עוצמה לשאילתא לרגולציה מונעת 3'UTR, שבassay מספק מדד תפקודי של מיקוד מירנה, והבדיקות בינארי של כתב אחד :: 3'UTR נגד מירנה יחידה בביטחון יכול לטפל ב מצב המיקוד של גנים בודדים. כדי לאמת גישה זו, אנו הוקרנו פנל של 275 3'UTRs ונגד שני miRNAs, בואו-7C וmiR-10b, וכללנו 10 גני מטרת תוקף בעבר בספרייה זו. שמונה מתוך עשרת גנים אלה הציגו דיכוי 24. אנחנו גם נצפו העשרה משמעותית של מטרות חזו bioinformatically שפגו תוקפיו, ולא צפוי 3'UTRs המכילים אלמנטי זרע הקנונים בין הלהיטים העליונים שלנו, שוגgesting 3'LIFE שמסוגלת לזהות מטרות מירנה בתום לב.

אינדיקטור מרכזי של הרגישות של מסכי תפוקה גבוהה הוא השיעורים שליליים חיוביים ושקר שקר. בעוד השיעור החיובי הכוזב של assay זה צריך להיות מוערך באמצעות גישות חלופיות נוספות כדי לאמת את הלהיטים, שמונה עשר הבקרות החיוביות כלולים בדיכוי המסך שלנו ההוכחה של העיקרון הציג, המצביע על שיעור שלילי כוזב של 20%. עם זאת, טכניקות רבות המשמשות לזיהוי מטרות מירנה בהקשרים שונים סלולריים, ועיבוד 3'UTR ורגולציה על ידי גורמי טרנס משחק ידוע להיות מאוד רקמה ספציפית. לדוגמא, רוב 3'UTRs לכלול אתרי polyadenylation מרובים, השולטים על אורכו של 3'UTR בmRNA הבוגר. במקרים רבים השימוש באתרי polyadenylation הפרוקסימלי הוא רקמה ספציפית, ועלולים שלא לכלול אתרי יעד מירנה. בנוסף, מיקוד מירנה שיתופי, Wi תחרותחלבונים ה מחייב RNA, ומבנה המשני mRNA עשויות כל ההשפעה על היכולת של 3'LIFE כדי לזהות מטרות מירנה ברקמות ספציפיות. מסיבה זו, זיהוי של מטרות על ידי assay 3'LIFE עשוי להשתנות בהתאם להקשר הסלולרי שבassay מבוצע, מסבך את ההערכה של שיעורי שגיאה מוחלטים. פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור תאי HEK293T, אך ניתן להשתמש שורות תאים חלופיות אם החוקר מבקש לבצע את assay בהקשר ביולוגי ספציפי. עם זאת, אופטימיזציה של יעילות transfection והישרדות תא אחד עם קו תא תצטרך להיות מותאמת באמצעות מספר תנאי חיץ, קודי דופק, ומספר התאים. ניתן למצוא דוגמא לתכנית אופטימיזציה בWolter et al. 24.

פרוטוקול זה כבר מותאם בפורמט 96-היטב ומציין את השימוש במכשור תפוקה גבוהה מסוים. במקרה שהמוסד לא מחזיק את הציוד הנדרש עבור 96"טוב nucleofection, יכול לשמש ריאגנטים transfection חלופיים לבצע assay 3'LIFE, כל עוד יעילות transfection נותרת גבוהה. בנוסף, assay בלוציפראז הוא ההיבט הזמן רב ביותר של assay 3'LIFE. ככזה, השימוש בluminometers מרובה מומלץ למסכי תפוקה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
glycylglycine Sigma G1127-25G
Kx PO4 Sigma P2222
EGTA Sigma E3889
ATP Sigma FLAAS
DTT Sigma D0632
MgSO4 Sigma M7506
CoA Sigma C4282
luciferin Sigma L9504
NaCl Sigma S7653
Na2EDTA Sigma E0399
K H2 P O4 Sigma 1551139
BSA Sigma A2153
NaN3 Sigma S2002
Coelenterazine Sigma C3230
PBS/HEPES Corning 21-040-CV
DMEM Sigma D5546
FBS Sigma F2442
Pennicilin/Streptomicin Sigma P4333
Trypsin T2600000
Consumables
MaxiPrep Kit Promega A2392
96-well miniprep plate Pall 8032
96-well shuttle plates Lonza V4SP-2096
5x Lysis Buffer Promega E1941 
Instruments
96-well GloMax Plate Reader Promega E9032
Biomech FX Liquid Handler Robot Beckmann A31842
4D-Nucleofector Core Unit Lonza AAF-1001
96-well Shuttle System Lonza AAM-1001
Cell Counter Countess Invitrogen C10227

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  2. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
  3. Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
  4. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
  5. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  6. Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
  7. Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
  8. Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
  9. Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
  10. Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
  11. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
  12. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  13. Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
  14. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  16. Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
  17. Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
  18. Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
  19. Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
  20. Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
  21. Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
  22. Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
  23. Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
  24. Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
  25. Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3'UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
  26. Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
  27. Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
  28. Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
  29. Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
  30. Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
  31. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
  32. Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
  33. Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 99 מיקרו-רנ"א assay בלוציפראז אזור מתורגם 3 " תפוקה גבוהה transfection ויסות הגנים לאחר תעתיק סרטן
זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wolter, J. M., Kotagama, K., Babb,… More

Wolter, J. M., Kotagama, K., Babb, C. S., Mangone, M. Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay. J. Vis. Exp. (99), e52647, doi:10.3791/52647 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter