Abstract
التعبير الجيني وتنظيمه مهمة جدا لفهم سلوك الخلايا تحت ظروف مختلفة. وتستخدم تقنيات مختلفة في الوقت الحاضر لدراسة التعبير الجيني، ولكن معظم تقتصر من حيث توفير صورة شاملة للتعبير عن Transcriptome على كله. ميكروأرس DNA تقدم تكنولوجيا البحث السريعة والاقتصادية، والذي يعطي لمحة كاملة عن التعبير الجيني العالمي ولها عدد كبير من التطبيقات بما في ذلك تحديد جينات جديدة وعامل النسخ المواقع، وتوصيف النشاط النسخي من الخلايا، وكذلك ملزمة مساعدة في تحليل آلاف من الجينات (في تجربة واحدة). في هذه الدراسة، وقد تم تحسين الظروف لتحليل Transcriptome على البكتيريا من حصاد الخلايا لتحليل ميكروأري الحمض النووي. مع الأخذ بعين الاعتبار الوقت والتكاليف ودقة من التجارب، هذا النظام التكنولوجي يبرهن على أن تكون مفيدة جدا وapplicabale عالميا لدراسة transcripto بكتيريازارة التربية والعلم. هنا، ونحن أداء تحليل ميكروأري الحمض النووي مع العقدية الرئوية بمثابة دراسة حالة عن طريق مقارنة استجابات النسخي من S. الرئوية نمت في وجود تركيزات متفاوتة-L سيرين في المتوسط. تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام طريقة Macaloid باستخدام عدة عزل الحمض النووي الريبي ونوعية RNA تم فحص باستخدام عدة RNA فحص الجودة. تم إعداد [كدنا باستخدام الناسخ العكسي وصفت العينات [كدنا باستخدام واحدة من اثنين من الأمينات رد الفعل الأصباغ الفلورية. واستخدمت محلية الصنع DNA الشرائح ميكروأري لالتهجين من العينات [كدنا] وصفت والبيانات ميكروأري تم تحليلها باستخدام إطار ما قبل معالجة البيانات ميكروأري [كدنا] (Microprep). وأخيرا، تم استخدام كاميرا Cyber-T لتحليل البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام Microprep لتحديد الجينات ذات دلالة إحصائية أعرب تفاضلي. حزم البرمجيات وعلاوة على ذلك، الذي بني في المنزل (الفلفل، FIVA، كشف، والمدعي العام وGenome2D) استخدمت لتحليلالبيانات.
Introduction
دراسة مجموعة كاملة من مرنا وفرة (Transcriptome على) المشفرة بواسطة الجينوم للكائنات وحيدة الخلية أو الخلايا حقيقية النواة في وقت محدد أو تحت شرط معين، بما في ذلك overexpression الجينات أو تدق التدريجي، ويسمى transcriptomics. Transcriptomics يسمح لنا أن نلاحظ أن ما يتم التعبير عن الجينات مدى تحت شرط معين في وقت نقطة X ويعطينا معلومات حول كيفية بقوة يتم التعبير عن الجينات نسبي إلى مرجع.
وميكروأري هو صفيف ثنائي الأبعاد على ركيزة صلبة (عادة شريحة زجاجية أو السيليكون الخلايا الرقيقة) التي يمكن استخدامها لفحص كميات كبيرة من المواد البيولوجية باستخدام فحص عالية الإنتاجية، والمنمنمة، وتجهيز المضاعفة والموازي والكشف الأساليب. ميكروأرس تأتي في أنواع مختلفة، بما في ذلك الحمض النووي ميكروأرس، ميكروأرس البروتين، ميكروأرس الببتيد، ميكروأرس الأنسجة، ميكروأرس الأجسام المضادة، ميكروأرس الخلوية وغيرها. وميكروأري الحمض النووي هوفي الأساس تجميع النقاط DNA المجهرية ثابتة على سطح صلب، عادة الزجاج. وتستخدم ميكروأرس الحمض النووي لقياس مستويات التعبير عن الجينات أو مجموعة من الجينات في وقت واحد أو في التركيب الوراثي مناطق متعددة من جينوم 2،3. Picomoles (10 -12 الشامات) من تحقيق موجودة في كل بقعة DNA الذي يمثل تسلسل الحمض النووي محددة، والمعروف أيضا كمراسلة. ويطلق على الجزيئات مرنا وصفت من عينات "أهداف". وتستخدم Fluorophores لقياس التهجين والكشف عن أهداف المسمى fluorophore التحقيق المستهدفة يحدد الوفرة النسبية للتسلسل الحمض النووي في الهدف. تجربة ميكروأري يمكن أن تنجز اختبارات جينية متعددة في نفس الوقت لأن مجموعة قد تحتوي على عشرات الآلاف من تحقيقات. يظهر تخطيط من تجربة ميكروأري بسيطة في الشكل 1. وفي الآونة الأخيرة، وقد تم تأسيسها في منطقتنا ومختبرات أخرى أن هذه المصفوفات قابلة لإعادة الاستخدام، الأمر الذي يجعل هذه التقنية تماما من حيث التكلفة فعاليهه.
وقد تم تطوير تقنيات عزل الحمض النووي الريبي وتنقية مختلفة على مر السنين بما في ذلك C-TAB، SDS وطرق GT 4-8. وعلاوة على ذلك، عدة مجموعات تجارية وتتوفر أيضا. للتعبير الجينات جودة عالية RNA مهم جدا. لذلك، يتم تعديل طرق عزل الحمض النووي الريبي للحصول على الكمية القصوى من الحمض النووي الريبي. وبالمثل، يتم الحد من الخطوات لإعداد [كدنا ووسم [كدنا]. يتم تنفيذ تطبيع البيانات بعد المسح أيضا بكفاءة عن طريق استخدام في المنزل بنيت حزم البرامج والأدوات 9.
العقدية الرئوية هو الممرض البشري الجرام الإيجابي الذي يستعمر البلعوم الأنفي وهو سبب إصابات متعددة مثل الالتهاب الرئوي وتعفن الدم، التهاب الأذن الوسطى والتهاب السحايا 10. بكتيريا يمكن الاستفادة تشكيلة واسعة من العناصر الغذائية اللازمة لنمو وبقاء 11،12. وقد أجريت عدد من الدراسات علىالأيض النيتروجين المكورات الرئوية والتنظيم مؤكدا على أهمية الأحماض الأمينية ودورها في الفوعة 13،14. في هذه الدراسة، واستجابة transcriptomic من S. الرئوية إلى تغيير تركيزات L-سيرين، وهو من الأحماض الأمينية موجودة بوفرة في بلازما الدم البشري، وأفادت باستخدام ميكروأرس الحمض النووي. رد transcriptomic من S. تم مقارنة الرئوية نمت في الحد الأدنى للتركيز L-سيرين (150 ميكرومتر) إلى أن تزرع في الحد الأقصى للتركيز (10 ملم) من سيرين. تم استخدام المتوسط محددة كيميائيا (CDM أو الحد الأدنى من المتوسط) 15 لهذه الدراسة للسيطرة على تركيز سيرين. محور هذه الدراسة هو جعل هذه التقنية سهلة الاستخدام وتوفير أدوات مختلفة للتطبيع البيانات وتحليلها. ولذلك، تم وضع عدد من الأدوات لتحليل وتفسير البيانات. FIVA (معلومات وظيفية عارض ومحلل) يوفر منبرا لمعالجة المعلومات الواردة في مجموعات من الجينات لهامماثلة أنماط التعبير الجيني وبناء التشكيلات الوظيفية 16. المدعي العام هو حزمة برامج أخرى تسهل تحديد المهام المفترضة وشروحه من الجينات 17. من خلال الاستفادة من طرق التجميع، كشف، يوفر ملزمة خوارزمية كشف الموقع DNA. الزخارف رابطة الدول المستقلة -regulatory من الجينات يمكن المتوقع باستخدام هذه الخوارزمية 18. تقدم Genome2D منصة يستند إلى Windows عن التصور وتحليل البيانات من خلال تقديم Transcriptome على نطاقات مختلفة الألوان لوصف التغيرات في مستويات التعبير الجيني على خريطة الجينوم 19. ويقدم خادم الفلفل، بالإضافة إلى أسلوب التحليل واحدة في كل و، مجموعة أدوات للتعدين لregulons والمروجين وعامل النسخ ملزمة المواقع 20. لا يمكن أن يتحقق الشرح الكامل من المناطق بين في الجينوم البكتيري باستخدام هذه الحزمة. يستطيع علماء الأحياء تستفيد كثيرا من الفلفل، حيث أنها توفر لهم منصة لتصميم التجربةالصورة بحيث يمكن تأكيد المعلومات المفترضة في المختبر 20. هذه حزم البرمجيات تساهم بشكل كبير في التحليل ميكروأري لأن معظمهم متاحة بحرية وجعل تطبيع البيانات وتحليلها موثوقة جدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام، والثقافة خلية
- تنمو S. الرئوية D39 من نوع السلالة البرية 21 كما هو موضح سابقا (11). تطعيم الخلايا المخزنة في -80 درجة مئوية في 10٪ الجلسرين (مع نسبة 1/100 في 50 مل أنابيب معقمة) في 50 مل محددة الصفات كيميائيا متوسط (CDM) مع الرقم الهيدروجيني النهائية من 6.4 15، ولكن حذف L-سيرين من الأحماض الأمينية الخليط.
ملاحظة: تم استخدام اثنين الإيداع النقدي مختلفة؛ واحدة تحتوي على الحد الأدنى من تركيز L-سيرين (150 ميكرومتر) والأخرى التي تحتوي على تركيز أعلى من L-سيرين (10 ملم). الحد الأدنى هذا التركيز هو في الأساس تركيز L-سيرين في بلازما الدم البشري والهدف من ذلك هو لمقارنة التعبير الجيني من S. الرئوية سلالة D39 تحت هذين الشرطين.
2. عزل مجموع RNA
- المواد
- استخدام الفينول حامض، RNA الصف لعزل الحمض النووي الريبي مجموع.
- Macaloid:
- تعليق 2 غرام منmacaloid في 100 مل TE وتغلى لمدة 5 دقائق. بارد لRT ويصوتن حتى macaloid gels.Centrifuge الحل في 2،000 × ز لمدة 5 دقائق على RT، resuspend في 50 مل TE درجة الحموضة 8 وتخزينها في 4 ° C.
- الحلول:
- علاج جميع الحلول مع pyrocarbonate اثيل (DEPC). إضافة 100 ميكرولتر DEPC / 100 مل من محلول، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية والأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة.
- منهجية
- تنمو 50 مل من S. زراعة الخلايا الرئوية D39 في 50 مل أنابيب في 37 درجة مئوية (لا الهز) حتى مرحلة منتصف الأسي (OD ~ 0.3). ثقافات أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية على 10،000 × ز لمدة 2 دقيقة. تجاهل وسائل الإعلام وعلى الفور تجميد الكريات خلية في النيتروجين السائل.
- بريمكس 300 ميكرولتر الكلوروفورم: IAA (24: 1) و 300 ميكرولتر الفينول (الفينول حامض، RNA الصف). استخدام 500 ميكرولتر من المرحلة العضوية في الخطوة 2.2.3.
- تحضير خليط التالية مقدما في أنابيب المسمار الحد الأقصى خالية من RNA: 0.5 ز الخرز الزجاجي، 50 ميكرولتر 10٪ SDS، 500 ميكرولتر الفينول / الكلوروفورم: IAA (كما أعدت في الخطوة 2.2.2)، طبقة macaloid (150-175 ميكرولتر، وليس بالضبط هو لزج جدا). Resuspend وكريات خلية في 400 ميكرولتر TE (DEPC) وإضافة الخلايا معلق في أنابيب المسمار الحد الأقصى.
- لكسر الخلايا، وضع أنابيب المسمار الحد الأقصى في الخافق حبة ل2X 60 "البقول ('التجانس') مع 1 دقيقة الفاصلة على الجليد. الطرد المركزي عينات لمدة 10 دقيقة في 10،000 × ز (4 ° C).
- نقل المرحلة العليا لأنبوب جديد، إضافة 500 ميكرولتر الكلوروفورم: IAA (24: 1) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 10،000 × ز (4 ° C).
- نقل 500 ميكرولتر من المرحلة العليا لأنابيب جديدة، إضافة 2 مجلدات (1 مل) من تحلل / العازلة ملزمة ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. عزل الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام العزلة عدة RNA وتابع الصانع بروتوكول الموصى بها.
3. تنظيف RNA
< رأ>4. تحليل RNA
- تحديد تركيز الحمض النووي الريبي في معمل. تحديد نوعية RNA باستخدام الفحص على النحو التالي (الشكل 2).
- تمييع 1 ميكرولتر من العينة مع 50 ميكرولتر من المياه DEPC للحصول على تركيز 20-200 نانوغرام / ميكرولتر.
- استخدام 1 ميكرولتر عينة الحمض النووي الريبي المخفف للتأكد من جودة على Bioanalyser وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- ملاحظة: يعتبر 16S حوالي 2.0 جيدة 1 A260 حدة RNA يتوافق مع 40 ميكروغرام / مل: نسبة 23S. والكمية الموصى بها لوصفها هو 10-20 ميكروغرام.
5. إعداد [كدنا ووسمها
ntent "> ملاحظة: وأعقب البروتوكول التالي لإعداد [كدنا ووضع العلامات.- الصلب
- أداء رد فعل الصلب في 300 أنابيب PCR ميكرولتر، والحفاظ على تركيز الحمض النووي الريبي مجموع 10-15 ميكروغرام للشرائح محلية الصنع أو 5 ميكروغرام للشرائح من صنع الشركة. مزيج RNA مع 2 nonamers عشوائية ميكرولتر (1.6 ميكروغرام / ميكرولتر) وإضافة الماء nuclease خالية إذا لزم الأمر للحفاظ على الحجم النهائي من الخليط الصلب إلى 18 ميكرولتر.
- حافظ على الخليط الصلب عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، يبرد الخليط إلى RT لمدة 10 دقيقة (الصلب) وإذا لزم الأمر، وتدور أسفل ردود الفعل على الجزء السفلي من الأنبوب. وضع أنابيب رد فعل على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل.
- النسخ العكسي
- تحضير مزيج الناسخ العكسي على النحو التالي: إلى 18 ميكرولتر مزيج الصلب، إضافة 12 ميكرولتر مزيج ماستر (تتألف من 6 ميكرولتر 5X ستراند الأولى العازلة، 3 ميكرولتر 0.1 M DDT، 1.2 ميكرولتر 25X AA-dUTP / النوكليوتيدات مزيج و 1.8 ميكرولتر عكس رranscriptase (1 ميكرولتر للشرائح من صنع شركة). الحفاظ على مزيج رد فعل لل2-16 ساعة على 42 ° C.
6. تدهور مرنا وتنقية [كدنا]
- للحط من مرنا من خليط التفاعل، إضافة 3 ميكرولتر من 2.5 M هيدروكسيد الصوديوم ومكان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وفي وقت لاحق، إضافة 15 ميكرولتر من 2M HEPES حمض الحرة لتحييد هيدروكسيد الصوديوم.
- تنقية خليط [كدنا] باستخدام PCR الأعمدة التنظيف واتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
7. قياس تركيز [كدنا]
- قياس تركيزات [كدنا على معمل. لمتابعة وضع العلامات، والتحقق من أن تركيز [كدنا هو لا يقل عن 60 نانوغرام / ميكرولتر (شرائح محلية الصنع) أو 20 نانوغرام / ميكرولتر (شرائح من صنع شركة).
8. وضع البطاقات التعريفية على [كدنا مع أمين التفاعلي صبغ وتنقية
- استخدام-أمين صبغ رد الفعل لتسمية [كدنا]. مزيج مباشرة [كدنا] مع قسامة واحد (5 ميكرولتر) منAMINE-رد الفعل صبغ.
- احتضان الخليط في RT، في الظلام، ل60 الى 90 دقيقة والانتقال مباشرة إلى تنقية المسمى صبغ [كدنا]. تنقية المسمى صبغ [كدنا] باستخدام PCR الأعمدة تنظيف وبعد بروتوكول الشركة المصنعة. أزل [كدنا] في 50 ميكرولتر من شطف العازلة.
9. قياس صفتها كدنا]
- استخدام معمل لقياس دمج الأصباغ على رد الفعل أمين في كدنا]. تحقق من أن تركيز الأصباغ على رد الفعل أمين هو 0.5 على الأقل بمول / ميكرولتر في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر.
10. خلط العينات صفتها كدنا]
- للشرائح محلية الصنع، واستخدام كل كدنا] المسمى لتهجين مع الفرق لا يزيد عن 30٪ في تركيز [كدنا]. للشرائح من صنع الشركة، استخدام كدنا] مع لا يزيد الفارق الزمني 2 أضعاف في تركيز [كدنا].
ملاحظة: عادة، هناك حاجة إلى حوالي 300 نانوغرام من [كدنا للشرائح من صنع الشركة، والتي هي قليلة جدا بالمقارنة مع مساuired كمية [كدنا للشرائح محلية الصنع.
11. التهجين وغسل
- استخدام الكواشف التالية: المياه ديمي، والإيثانول 99٪، خجولة العازلة (محلية الصنع، مع 40 ميكرولتر الخميرة RNA). إعداد القصوى 1 مل من خجول.
- أجهزة وحلول إعداد
- التبديل على مركزات فراغ وسخان لا يقل عن 1 ساعة قبل التجفيف. تشغيل الفرن التهجين، مع مجموعة نقطة تعديلها لدرجة الحرارة التهجين الصحيحة (لميكروأرس الحمض النووي S. الرئوية، استخدم 45 ° C). وبالمثل، سخن كاسيت التهجين والفرن لمدة 30-60 دقيقة.
- سخن عازلة خجولة في 68 مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- إعداد نموذج (المسمى [كدنا])
- الجمع بين كميات متساوية من cDNAs المسمى (بحد أقصى 30٪ الفرق). تجفيف العينة باستخدام مركزات فراغ في درجة حرارة عالية (حوالي 40 دقيقة) حتى حجم أصغر من 7 ميكرولتر.
- رافع الانزلاق
- استخدام نظيفة رافع-زلات.ملاحظة: ± 30 ميكرولتر يمكن تحميل على الشريحة.
- تنظيف رافع-زلات بالصابون، والكثير من ماء الصنبور والإيثانول بنسبة 100٪. ملاحظة: زلات رافع القذرة تعطي خلفية عالية.
- الهواء الجاف ورافع-زلات مع مسدس الهواء لتفجير بعيدا جزيئات الغبار. وضع نظيفة رافع الانزلاق على الشريحة مع بطانة تفلون بيضاء على الجانبين لأسفل.
- مضيفا عازلة التهجين (لالمسمى [كدنا])
- حل عينات صبغ المجففة في 7 ميكرولتر H 2 O واحتضان عند 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- على الفور، إضافة 35 ميكرولتر مسخن عازلة خجولة (68 ° C)، مزيج بلطف وتدور في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة للتخلص من الرواسب. سخن التحقيق في 68 مئوية لمدة حوالي 5 دقائق حتى التحميل.
- الشريحة رافع الانزلاق التجمع والتسخين.
- ضع حامل الشرائح التهجين على نار كتلة في 50 مئوية. وضع الشرائح ميكروأري الحمض النووي مع رافع الانزلاق على ساخنة حامل الشرائح التهجين وصيسخن الشريحة مع رافع الانزلاق لمدة دقيقة. نفذ الخطوات المقبلة في أسرع وقت ممكن.
- إضافة 40 ميكرولتر من الهدف العينة إلى نهاية الشريحة. تسمح للسائل بالتدفق بين الواجهات الزجاجية بالقوة الشعرية. أداء جميع pipetting لببطء وبعناية.
- الحفاظ على الشرائح مع رافع الانزلاق الأفقي في جميع الأوقات والتحرك ببطء للتأكد من أن رافع الانزلاق لم يتحرك.
- تأخذ درجة حرارة ما قبل التهجين الكاسيت من الفرن التهجين وإغلاق الجهاز. مكان مرشح ورقة غارقة مع 3 مل 2X SSC (القياسية المالحة سيترات) في كاسيت التهجين.
- وضع بلطف حامل الشرائح التهجين مع الشرائح في الكاسيت التهجين. إغلاق كاسيت التهجين وضعت في التهجين الفرن مرة أخرى (لمدة 16-18 ساعة).
- غسل الشريحة
- إعداد غسيل مخازن جديدة I، II و III (750 مل لكل خطوة غسل). 500 مل غسل العازلة I، استخدم 2 × SSC / 0.5٪ SDS. 500 مل غسل برتقاليإيه II، استخدم 1 × SSC / 0.25٪ SDS. 500 مل غسل العازلة III، استخدم 1 × SSC / 0.1٪ SDS (اختياري)
- ضع-مخازن غسل عند 30 درجة مئوية (للتأكد من حل SDS).
- غمر الشرائح في أسرع وقت ممكن، ولكن بلطف جدا، في أنبوب الصقر مليئة 50 مل غسل عازلة أنا حتى تقع الزجاج على الجزء السفلي مخروطي الشكل من الأنبوب.
- بعد بضع ثوان، وعندما المصارف رافع الانزلاق إلى أسفل الأنبوب، واخراج الشريحة مع ملاقط دون خدش مجموعة ووضعها في رف من محطة غسيل. تواصل مع الغسيل مع عدم وجود فجوة زمنية.
- تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في 500 مل غسل العازلة I (في محطة الغسيل). إعطائها يغسل الثاني لمدة 20-30 دقيقة في 500 مل غسل العازلة II (في محطة الغسيل). وبالمثل، وغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في 500 مل غسل العازلة III (اختياري) (في محطة الغسيل).
- تجف الشرائح لمدة 2 دقيقة في 2،000 دورة في الدقيقة.
12. تحليل ميكروأري
- مسح الصورمع موجات منها في الماسح الضوئي وحفظها في مجلد "مشروع جوف]".
- استخدام البرمجيات لتحليل الملفات الممسوحة ضوئيا في البداية كما هو موضح سابقا 22. بعد تشغيل هذا البرنامج، حدد "فتح صورة" علامة التبويب لتحميل ملف الصورة الحمراء (-.550) بأنها "الأحمر" وملف الصورة الأخضر (-.635) كما "الخضراء". تحميل الملف غال (.gal) وجود S. الرئوية قائمة مجموعة على ملف الصورة عن طريق اختيار "تحميل قائمة صفيف" التبويب 22.
ملاحظة: تألفت هذه القائمة مجموعة من 48 الشبكات، على كل شبكة كانت هناك 16 الصفوف والأعمدة 15. كل بقعة على الشبكة تمثل جين واحد ويتم إضافة معلومات بقعة بما في ذلك اسم الجين من خلال ملف وصف الفور. ونظرا للأعداد بقعة من اليسار إلى اليمين ومن أعلى إلى أسفل. - بعد اكتشاف بعناية الشبكات، حدد علامة التبويب "البحث عن صفيف، البحث كتل، محاذاة ميزات" لمحاذاة البقع. بعد التوفيق بين جميع الميزات وتحليل الصورة عن طريق اختيار "تحليل" تيالف باء. إنشاء ملف جديد بعد النتائج، الرسم البياني، ومبعثر المؤامرة. حفظ هذا الملف من علامة التبويب "حفظ نتائج" كملف .gpr لمزيد من التحليل.
- أداء مزيد من التطبيع ومعالجة البيانات مع وضعها في المنزل حزمة برامج Microprep كما هو موضح 9.
- استخدام مكررات البيولوجية مستقلة للبيانات ميكروأري الحمض النووي التي هي من تبادلت صباغة. أداء تنفيذ CyberT من البديل من تي TEST1 وحساب معدلات اكتشاف كاذبة (FDRS) كما هو موضح 9.
- عن الجينات وأعرب تفاضلي، واتخاذ p <0.001 وفرانكلين روزفلت <0.05 كمعيار.
- تحميل البيانات ميكروأري DNA على الصفحة تقديم NCBI للحصول على GEO (التعبير الجيني الجامع) رقم الانضمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA، العزلة [كدنا وتحليل
L-سيرين هي واحدة من الأحماض الأمينية الأساسية وتركيزها في بلازما الدم البشري يختلف 60-150 ميكرومتر في الأطفال والبالغين. دورها في التركيب الحيوي من البيورينات والبريميدينات يبرز أهميته في عملية التمثيل الغذائي وأنه هو مقدمة لعدة الأحماض الأمينية (الجلايسين، السيستين والتربتوفان). لدراسة تأثير L-سيرين على Transcriptome على كامل من S. تم إجراء الرئوية D39 من نوع السلالة البرية، وتحليل ميكروأري من سلالة D39 تزرع في آلية التنمية النظيفة مع الحد الأدنى من تركيز (150 ميكرومتر) من L-سيرين ضد أن تزرع في الحد الأقصى للتركيز (10 ملم) في نفس المتوسطة. أولا وقبل كل شيء، كان الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المزروعة في إطار كل من تركيزات معزولة. ونظرا للتركيزات من عينات الحمض النووي الريبي في الجدول 1. تم فحص نوعية الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الفحص فحص الجودة. عولج RNA مع الدناز I قبل تنفيذ هذافحص لإزالة الحمض النووي الجيني الممكن يبين الشكل 2 نوعية RNA؛ حارة L يمثل سلم، والممرات 1 و 2 تمثل RNA من 150μM سيرين والحارات 3 و 4 تمثيل الحمض النووي الريبي من 10 ملي سيرين. وجود شريطين واضحة المقابلة لمفارز RNA اثنين أشار نوعية جيدة من RNA والخطوة التالية من التجربة يمكن أن يؤديها.
بعد قياس جودة RNA، وقد تم كدنا] التوليف. تم تشكيل كدنا] باستخدام nanomers عشوائي وإنزيم النسخ العكسي. ونظرا للتركيزات من العينات [كدنا في الجدول 1. وقد وصفت هذه كدنا] مع الأصباغ على رد الفعل أمين ونظرا لتركيز [كدنا] وصفت والعلامات صبغ في الجدول 1. وبعد وضع العلامات، وكانت مختلطة العينات وفقا لذلك ومن ثم المهجنة. بعد الغسيل، تم مسحها الشرائح باستخدام الماسح الضوئي، وأجري التحليل باستخدام الجينات بيكس برو البرمجيات. ويبين الشكل 3 مبعثرتحليل مؤامرة من نسبة الأصباغ أمين رد الفعل. بعد التحليل الأولي، تم تحليل البيانات باستخدام مزيد من حزمة البرامج PicroPrep (PrePrep، الإعدادية، PostPrep) 9 للحد من الضوضاء وسايبر-T كانت تستخدم لتحليل النهائي. ويلخص الجدول (2) ونتائج الدراسات ميكروأري بعد تطبيق معايير ≥ 2.0 أضعاف الفرق وص -value <0.001. وقد أعرب عدد من الجينات بشكل مختلف في وجود الحد الأدنى من L-سيرين بالمقارنة مع الحد الأقصى (الجدول 2).
الشكل 1. نظرة عامة على ميكروأري الحمض النووي التكنولوجيا. RNA معزول من السيطرة والعينات المستهدفة وصفت وتهجين [كدنا ذلك الحين.
الشكل 2. فحص الجودة من الحمض النووي الريبي معزولة من S. الخلايا الرئوية D39 نمت في وجود الحد الأدنى (150 ميكرومتر) والحد الأقصى (10 ملم) تركيزات سيرين. لين L يمثل الحجم سلم حين حارة 1 و 2 تمثل عينات الحمض النووي الريبي معزولة عن الخلايا المزروعة في وجود الحد الأدنى تركيز سيرين. وبالمثل، حارة 3 و 4 تمثل عينات الحمض النووي الريبي معزولة عن الخلايا المزروعة في وجود أقصى تركيز سيرين. العصابات تمثل 23S 16S والرنا الريباسي. وجود اثنين فقط من العصابات يظهر أنه لا يوجد تلوث gDNA وRNA هو من نوعية جيدة.
الشكل 3. صفيف مقارنة مؤامرة مبعثر من خليط العينة. كل بقعة في المؤامرة تمثل يعني قيمة التعبير (log2) من الجين في تجربة مع صبغ 1 على المحور الصادي وصبغ 2 على محور س.
| عينة | RNA عينة | وصف | تركيز الحمض النووي الريبي (نانوغرام / ميكرولتر) | تركيز [كدنا] (نانوغرام / ميكرولتر) | صفتها كدنا] (نانوغرام / ميكرولتر) | DyLight-550 (بمول / ميكرولتر) | DyLight-650 (بمول / ميكرولتر) | مخطط التهجين |
| S1 | R1 | D39 من النوع البري المزروع في آلية التنمية النظيفة + الدنيا L-سيرين | 2057 | 255 | 225 | 0.8 | R1 + R3 | |
| R2 | D39 من النوع البري المزروع في آلية التنمية النظيفة + الدنيا L-سيرين | 2566 | 201 | 179 | 1.2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | D39 من النوع البري نمت في آلية التنمية النظيفة + القصوى L-سيرين | 2831 | 292 | 276 | 2.3 | ||
| R4 | D39 من النوع البري المزروع في آلية التنمية النظيفة + ماكسimum L-سيرين | 1867 | 172 | 150 | 1 |
الجدول 1. نظام التهجين من العينات المستخدمة في تحليل ميكروأري.
| الجين | وظيفة ب | نسبة ج | |||
| SPD0600 | البروتين انقسام الخلايا DivIB | 4 | |||
| SPD0445 | فسفوغليسرات كيناز | 3.5 | |||
| SPD0646 | البروتين افتراضية | 3.4 | |||
| SPD0873 | البروتين افتراضية | 3.3 | |||
| SPD1223 | البروتين افتراضية | 3.3 | |||
| SPD0980 | بيروفسفوكيناز الريبوز-الفوسفات 2.8 | ||||
| SPD1628 | زانثين ناقلة الفسفوريبوزيل | 2.7 | |||
| SPD1011 | غليسيرات كيناز | 2.4 | |||
| SPD0645 | البروتين افتراضية | 2.3 | |||
| SPD0564 | البروتين افتراضية | 2.2 | |||
| SPD0641 | المانوز-6-فوسفات مصاوغة، الصف الأول، مانا | 2.1 | |||
| SPD1333 | البروتين افتراضية | 2.1 | |||
| SPD1384 | الموجبة البروتين الأسرة هروب رأس المال | 2.1 | |||
| SPD1432 | UDP الجلوكوز 4-إيبيميراز، غيل-1 | 2.1 | |||
| SPD1866 | N-acetylglucosamine-6-فوسفات deacetylase، النجا | 2.1 | SPD0104 | البروتين مجال LysM | 2 |
| SPD0140 | نقل ABC، والبروتين ATP ملزم | 2 | |||
| SPD0261 | أمينوببتيداز C، PepC | 2 | |||
| SPD1350 | البروتين افتراضية | 2 | |||
| SPD1822 | الريباسي الوحيدات كبيرة سودويوريدين سينسيز، والبروتين RluD فصيلة | 2 | |||
| SPD0453 | النوع الأول نظام تقييد للتعديل، S فرعية | -2 | |||
| SPD0459 | الحرارة بروتين الصدمة GRPE | -2 | |||
| SPD1006 | الجلوكوز-1-الفوسفات adenylyltransferase | -2 | |||
| SPD1799 | استشعار الحامض الاميني كيناز، المفترضة | -2.1 | </ tr>|||
| SPD0387 | بيتا hydroxyacyl- (أسيل الناقل البروتين) نازعة الماء FabZ | -2.2 | |||
| SPD1494 | نقل السكر ABC، والبروتين بيرمياز | -2.2 | |||
| SPD0974 | الصف الأول الجلوتامين amidotransferase، المفترضة | -2.4 | |||
| SPD1600 | ناقلة الفسفوريبوزيل Anthranilate | -2.5 | |||
| SPD1472 | Isoleucyl-الحمض الريبي النووي النقال مخلقة | -2.6 | |||
| SPD0681 | البروتين افتراضية | -2.7 | |||
| SPD0501 | antiterminator النسخ، ومحطة حاويات اللاذقية الدولية | -3.4 |
الجدول 2. قائمة من الجينات تنظم في المقارنة Transcriptome على من S. الرئوية سلالة D39 من النوع البري نمت في CDM 15 مع الحد الأدنى من تركيز L-سيرين وCDM 15 مع أقصى تركيز L-سيرين. أعداد جين الرجوع إلى علامات D39 مكان. ب D39 الشرح / TIGR4 الشرح 21. وتمثل نسبة ج حظيرة زيادة / نقصان في التعبير عن الجينات في CDM-أقصى بالمقارنة مع CDM-الحد الأدنى (علامة ناقص يشير downregulation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن تصف بروتوكول سهلة الاستخدام التي يمكن تطبيقها لإجراء تحليل Transcriptome على كله من البكتيريا. والنقطة الأساسية حول هذه التقنية معينة هي أن حالة التي يتم بموجبها حصاد الخلايا سوف تختلف. بعد حصاد الخلايا والحمض النووي الريبي العزلة، تصبح هذه التقنية المتساوية لجميع أنواع العينات البكتيرية وتتبع الخطوات متطابقة تماما، وبالتالي، يمكن تطبيقها على أي نوع من الثقافة البكتيرية. بروتوكول بسيط جدا ومريحة ويبدأ من العزلة RNA. لدينا بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي (باستخدام Macaloid وRNA العزلة عدة) هو بالمقارنة مع التقليدية الفينول كلوروفورم وطرق Trizol الفعال للوقت. في الخطوة التالية، يتم تنفيذ إعداد [كدنا مع الناسخ III الانزيم. وبعد ذلك، يتم وضع العلامات من [كدنا عن طريق خلط الأول من [كدنا مع الأصباغ أمين رد الفعل، ومن ثم تنقية [كدنا المسمى. وضع العلامات أيضا بسيطة ولا تأخذ الكثير من الوقت كما تحتاج عينات لالمحتضنة لنحو 1ساعة في الظلام. كل هذه الخطوات التي يمكن القيام بها في أي مختبر القياسية لأنها لا تتطلب أية معدات متخصصة. وهناك حاجة إلى الماسح الضوئي ميكروأري لمسح الشرائح. لمسح الشرائح والتحليل، يتم استخدام برنامج GenePix برو، والذي هو عبارة عن برنامج بسيط جدا وسهل الاستعمال 22.
بعد القيام بجميع التجارب، تم إجراء التحليل باستخدام MicroPrep وCyberT. حزمة MicroPrep، يتكون من ثلاث وحدات، أي PrePreP، الإعدادية وPostPreP 9. هذا الإطار قبل معالجة البيانات يقلل من الوقت لتطبيع البيانات وأيضا يقلل من كمية البيانات التخلص منها. السهولة التي يمكن استخدام البرنامج يجعل من الممكن للباحث أن يكون لها فهم البيانات ميكروأري الحمض النووي في الحد الأدنى من الوقت. يستغرق سوى بضع دقائق لتحويل البيانات الخام إلى إشارة بيانات عالية الجودة لمزيد من المعالجة بعد ويتم تحليل الصور الشرائح. المزيد من التحليل على مجموعة من الجينات تنظم في ميكرoarray يمكن أن يتم ذلك باستخدام مختلف حزم البرمجيات في المنزل. وهي تشمل الفلفل 20، FIVA 16، كشف، 18، 17 المدعي العام وGenome2D 19. هذه الأدوات المستندة إلى Windows وحزم البرمجيات هي سهلة الاستخدام وتوفر رؤية متعمقة للبيانات أثناء إجراء مزيد من التحقيقات. هذه حزم البرمجيات تجعل من السهل جدا ومفيد للباحثين للاستفادة من هذه التقنية كما تصبح البيانات أكثر وضوحا بكثير وذات الصلة.
من المعروف أن الأصباغ المستخدمة في ميكروأرس أن تكون عرضة لتأثير الأوزون، حيث تصبح غير مستقرة الأصباغ في وجود الأوزون وقوة الإشارة منخفض بحيث لا يمكن التعرف عليه بواسطة الماسح الضوئي. وتستخدم الأصباغ على رد الفعل أمين التي هي أقل حساسية لتأثير الأوزون لتسمية [كدنا]. والحل لطبقة الأوزون تأثير جعل هذه التكنولوجيا حتى أفضل.
تم إنشاء قائمة من الجينات التي كانت حتى- أو downregulated في وجود الحد الأدنى من L-سرتركيز المعهد الوطني للإحصاء بالمقارنة مع الحد الأقصى (الجدول 2). الجينات upregulated يمكن تصنيفها وفقا لوظيفة المنتج بهم. سبعة منهم ترميز البروتينات افتراضية، ويشارك أربعة في النقل الكربوهيدرات والتمثيل الغذائي، وهو بروتين انقسام الخلايا DivIB، والأحماض الأمينية والنقل والتمثيل الغذائي جينات معينة. وبالمثل، هناك أيضا بعض الجينات التي يتم downregulated لدينا في حالة اختبار. وBglG الأسرة محطة حاويات اللاذقية الدولية منظم النسخي، بعض الجينات الكربوهيدرات وبعض الجينات حمض أميني معين من بين الجينات downregulated. A حرارة صدمة بروتين GRPE هو أيضا بين تلك التي تنظمها أسفل. لذلك، توفر هذه الدراسة لمحة كاملة من الجينات وأعرب تفاضلي وفقا للشروط التي تم اختبارها. بعد تحليل النتائج، وأحيانا التحقق من نتائج ضروري. هذا يمكن أن يتم إما عن طريق QPCR أو المقايسات β غالاكتوزيداز باستخدام اندماج lacZ المروج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر آن دي يونج وسيجير القابضة Holsappel للمساعدة في إنتاج الشرائح ميكروأرس الحمض النووي. كما تقدر دعم آن دي يونج لتحليل المعلوماتية الحيوية. كما نشكر جيلي Slager لمراجعة ورقة. معتمدة محمد أفضال وعرفان منصور من جامعة GC، فيصل آباد، باكستان في إطار برنامج تطوير أعضاء هيئة التدريس من HEC باكستان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).
