Abstract
Genexpressie en de regulering zijn zeer belangrijk voor het gedrag van cellen onder verschillende omstandigheden is. Verschillende technieken worden tegenwoordig gebruikt om genexpressie te bestuderen, maar de meeste zijn beperkt in termen van het verschaffen van een overzicht van de expressie van de gehele transcriptoom. DNA microarrays bieden een snelle en economisch onderzoek technologie, die een volledig overzicht van de wereldwijde genexpressie geeft en hebben een groot aantal toepassingen, waaronder de identificatie van nieuwe genen en transcriptiefactorbindingsplaatsen, karakterisering van transcriptionele activiteit van de cellen en ook helpen bij het analyseren van duizenden genen (in een experiment). In de huidige studie, hebben de voorwaarden voor bacteriële transcriptoomanalyse van cel oogst aan DNA microarray-analyse geoptimaliseerd. Rekening houdend met de tijd, kosten en nauwkeurigheid van de proeven, dit technologieplatform blijkt zeer nuttig en universeel applicabale voor het bestuderen bacteriële transcripto zijnmes. Hier hebben we DNA microarray-analyse met Streptococcus pneumoniae als case-studie uit te voeren door het vergelijken van de transcriptionele respons van S. pneumoniae gekweekt in aanwezigheid van verschillende concentraties L-serine in het medium. Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van een Malcaloïde methode waarbij een RNA isolatie kit en kwaliteit van RNA werd gecontroleerd met behulp van een RNA kwaliteitscontrole kit. cDNA werd bereid met behulp van reverse transcriptase en het cDNA monsters werden gelabeld via een twee amine-reactieve fluorescerende kleurstoffen. Zelfgemaakte DNA microarray glaasjes werden gebruikt voor hybridisatie van de gelabelde cDNA monsters en microarray data werden geanalyseerd met behulp van een cDNA microarray data voorverwerking raamwerk (Microprep). Tenslotte Cyber-T werd gebruikt om de gegenereerde met Microprep ter identificatie van statistisch significant differentieel tot expressie gebrachte genen te analyseren. Bovendien, in-house gebouwd softwarepakketten (peper, FIVA, openbaren, MINISTERIE, Genome2D) werden gebruikt om te analyserengegevens.
Introduction
De studie van de hele set van mRNA overvloed (transcriptome) gecodeerd door het genoom van een eencellig organisme of een eukaryote cel op een bepaald tijdstip of in een bepaalde staat, inclusief genoverexpressie of knock-out, heet transcriptomics. Transcriptomics kunnen we waarnemen in hoeverre genen tot expressie gebracht onder een bepaalde voorwaarde op het tijdstip X en geeft ons informatie over hoe sterk de genen opzichte van een referentie worden uitgedrukt.
Een microarray is een tweedimensionale array op een vast substraat (meestal een glasplaatje of silicium dunne-film cel) die kunnen worden gebruikt om grote hoeveelheden biologisch materiaal analyse met behulp van high-throughput screening, en geminiaturiseerde multiplex en parallelle verwerking en detectie methoden. Microarrays zijn er in verschillende soorten, met inbegrip van DNA-microarrays, eiwit-microarrays, peptide microarrays, tissue microarrays, antilichaam microarrays, cellulaire microarrays en anderen. Een DNA microarrayin feite een samenstel van microscopische DNA spots bevestigd aan een vast oppervlak, gewoonlijk glas. DNA microarrays worden gebruikt om de expressieniveaus van een gen of een reeks van genen simultaan meten of meerdere gebieden genotype van een genoom 2,3. Picomolen (10 -12 mol) van een probe aanwezig in elke DNA plek die een specifieke DNA sequentie, ook bekend als een reporter voorstelt. De gemerkte mRNA-moleculen van de monsters worden 'targets. Fluoroforen worden gebruikt voor probe-target hybridisatie en detectie van fluorofoor-gelabelde doelwitten meet het relatieve abundantie van nucleïnezuursequenties in het doel. Een microarray experiment kan meerdere genetische tests parallel bereiken omdat een reeks tienduizenden probes bevatten. De indeling van een simpele microarray experiment wordt getoond in figuur 1. Recent werd opgericht in onze en andere laboratoria die deze arrays zijn herbruikbaar, die deze techniek zeer kosteneffectief maakt effective.
Verschillende RNA-isolatie en zuivering technieken zijn ontwikkeld door de jaren heen, waaronder C-TAB, SDS en GT methoden 4-8. Verder verschillende commerciële kits beschikbaar. Genexpressie hoge kwaliteit RNA is zeer belangrijk. Daarom worden het RNA isolatiemethoden gemodificeerd om een maximumhoeveelheid van RNA krijgen. Ook de stappen voor cDNA bereiding en het kenmerken van cDNA geminimaliseerd. Normalisering van de gegevens nadat het scannen is ook efficiënt uitgevoerd door het gebruik van in-huis gebouwd softwarepakketten en gereedschappen 9.
Streptococcus pneumoniae is een Gram-positieve menselijke pathogeen die de nasofarynx koloniseert en is de oorzaak van meervoudige infecties zoals pneumonie, sepsis, otitis media en meningitis 10. De bacterie kan een grote verscheidenheid van de voor groei en overleving 11,12 voedingsstoffen gebruiken. Een aantal studies zijn uitgevoerd op de uitgevoerdepneumokokken stikstof metabolisme en regelgeving benadrukken van het belang van aminozuren en hun rol in virulentie 13,14. In deze studie, de transcriptomische reactie van S. pneumoniae veranderende concentraties van L-serine, een aminozuur overvloedig aanwezig is in het menselijk bloedplasma wordt gemeld met behulp van DNA microarrays. De transcriptomische reactie van S. pneumoniae gekweekt in een minimale concentratie van L-serine (150 uM) werd vergeleken met die gekweekt in een maximale concentratie (10 mM) van serine. Chemisch gedefinieerd medium (CDM of minimaal medium) 15 werd gebruikt voor dit onderzoek om de concentratie van serine regelen. De focus van deze studie is om deze techniek gebruiksvriendelijk te maken en verschillende gereedschappen voor data normalisatie en analyses. Daarom is een aantal instrumenten ontwikkeld voor analyse en interpretatie van de gegevens. FIVA (functionele informatie Viewer en Analyzer) biedt een platform voor het verwerken van de informatie in clusters van genen metgelijkaardige genexpressie patronen en voor de aanleg van functionele profielen 16. MINISTERIE is een ander softwarepakket dat de identificatie van mogelijke functies en annotaties van genen 17 vergemakkelijkt. Door gebruik van clustering methoden, beschrijven levert een DNA bindingsplaats algoritme. Cis van regelgevende motieven van genen kan worden geprojecteerd door dit algoritme 18. Genome2D biedt een Windows gebaseerd platform voor visualisatie en analyse van transcriptoom gegevens door het aanbieden van verschillende kleur varieert met de veranderingen in genexpressie niveaus karakteriseren op een genoomkaart 19. De peper webserver biedt, in aanvulling op de alles-in-één analysemethode, een toolbox voor de mijnbouw voor regulonen, promotors en transcriptiefactorbindingsplaatsen 20. Volledige annotatie van intergene gebieden in een bacterieel genoom kan worden bereikt door dit pakket. Biologen kunnen veel baat hebben bij Pepper als het biedt hen een platform voor het ontwerpen van experiments zodat de veronderstelde informatie kan worden bevestigd in vitro 20. Deze softwarepakketten belangrijke bijdrage leveren aan de microarray-analyse als de meeste van hen zijn vrij verkrijgbaar en maken de gegevens normalisering en analyse zeer betrouwbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Media en Cultuur van de Cel
- Groeien S. pneumoniae D39 wild-type stam 21 zoals eerder 11 beschreven. Inoculeer cellen opgeslagen bij -80 ° C in 10% glycerol (met 1/100 verhouding in 50 ml steriele buizen) in 50 ml chemisch gedefinieerd medium (CDM) met een uiteindelijke pH van 6,4 15, maar laat L-serine uit het aminozuur mengsel.
Opmerking: twee verschillende CDM's werden gebruikt; een met een minimale concentratie van L-serine (150 uM) en de andere met een maximale concentratie van L-serine (10 mM). Deze minimale concentratie feite de concentratie van L-serine in menselijk bloedplasma en het doel is om de genexpressie van S. vergelijken pneumoniae D39 stam onder deze twee voorwaarden.
2. Isolatie van Totaal RNA
- Materieel
- Gebruik zuur fenol, RNA cijfer voor het isoleren van totaal RNA.
- Macaloïde:
- Schorten 2 gramMalcaloïde in 100 ml TE en koken gedurende 5 min. Koel af tot kamertemperatuur en ultrasone trillingen tot Malcaloïde gels.Centrifuge de oplossing bij 2000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur, resuspendeer in 50 ml TE pH 8 en bewaar bij 4 ° C.
- Oplossingen:
- Behandel alle oplossingen met diethylpyrocarbonaat (DEPC). Voeg 100 ul DEPC / 100 ml oplossing, incubeer O / N bij 37 ° C en autoclaaf gedurende 15 min.
- Methodologie
- Grow 50 ml van S. pneumoniae D39 celcultuur in 50 ml buisjes bij 37 o C (zonder schudden) tot medio exponentiële fase (OD ~ 0.3). Centrifugeer kweken bij 4 ° C op 10.000 x g gedurende 2 min. Gooi media en de celpellets in vloeibare stikstof onmiddellijk bevriezen.
- Premix 300 pl chloroform: IAA (24: 1) en 300 gl fenol (zuur fenol, RNA kwaliteit). Gebruik 500 pi van de organische fase in stap 2.2.3.
- Bereid het volgende mengsel vooraf-RNA vrij schroefdop buizen: 00,5 g glasparels, 50 gl 10% SDS, 500 pl fenol / chloroform: IAA (zoals bereid in stap 2.2.2), Malcaloïde laag (150-175 gl, niet precies zoals het is zeer viskeus). Resuspendeer de cel pellets in 400 ul TE (DEPC) en voeg de geresuspendeerd cellen in de schroefdop buizen.
- Om de cellen te breken, plaatst u de schroefdop buizen in een kraal klopper voor 2x 60 "pulsen ('massa te homo-') met 1 min interval op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende 10 min bij 10.000 x g (4 ° C).
- Breng de bovenste fase naar een nieuwe buis, voeg 500 pl chloroform: IAA (24: 1) en centrifugeer 5 min bij 10.000 x g (4 ° C).
- Breng 500 pi van de bovenste fase verse buizen, voeg 2 volumina (1 ml) lysis / bindingsbuffer en meng door en neer te pipetteren. Isoleer totaal RNA met behulp van de RNA-isolatie kit en volg de fabrikant aanbevolen protocol.
3. RNA Cleanup
< ol>4. Analyse van RNA
- Bepaal de concentratie van RNA op een spectrofotometer. Bepaal de kwaliteit van RNA met gebruik van een test als volgt (figuur 2).
- Verdun 1 pl monster met 50 pl DEPC water tot een concentratie van 20-200 ng / ul krijgen.
- Met 1 pl verdund RNA monster kwaliteitscontrole van de Bioanalyser volgens de instructies van de fabrikant.
- Opmerking: een verhouding van 23S: 16S van ongeveer 2,0 wordt beschouwd als goed 1 A260 eenheid RNA komt overeen met 40 ug / ml.. Een aanbevolen hoeveelheid voor etikettering is 10-20 ug.
5. cDNA Voorbereiding en etikettering
ntent "> NB: Het volgende protocol werd gevolgd voor cDNA voorbereiding en etikettering.- Gloeien
- Voeren gloeien reactie in 300 ul PCR-buisjes, het houden van de concentratie van totaal RNA 10-15 ug voor zelfgemaakte dia's of 5 ug voor-bedrijf maakte dia's. Meng RNA met 2 pl willekeurige nonameren (1,6 ug / ul) en voeg nuclease-vrij water indien nodig om het eindvolume van het gloeien mengsel houden 18 pl.
- Houd het gloeien mengsel bij 70 ° C gedurende 5 min. Daarna afkoelen van het mengsel tot kamertemperatuur gedurende 10 min (annealing) en indien nodig, het afsluiten van de reacties op de bodem van de buis. Plaats de reageerbuisjes op ijs gedurende ten minste 1 min.
- Reverse Transcriptie
- Bereid de reverse transcriptase mix als volgt: tot 18 pi gloeien mix, voeg 12 ul Master mix (bestaande uit 6 pi 5x First Strand buffer, 3 pi 0,1 M DDT, 1,2 ul 25x AA-dUTP / nucleotide mix en 1,8 ul reverse transcriptase (1 pl voor-bedrijf maakte dia's). Houd het reactiemengsel gedurende 2-16 uur bij 42 ° C.
6. Degradatie van mRNA en zuivering van cDNA
- Om het mRNA afbreken van het reactiemengsel, voeg 3 pl 2,5 M NaOH en plaats bij 37 ° C gedurende ongeveer 15 minuten. Voeg vervolgens 15 ul van 2M hepes vrij zuur te neutraliseren de NaOH.
- Zuiver het cDNA mengsel met behulp van PCR clean-up kolommen en volgt het protocol van de fabrikant.
7. Meting van cDNA Concentratie
- Meet cDNA concentraties op een spectrofotometer. Om door te gaan met de etikettering, controleer of de concentratie van cDNA is ten minste 60 ng / ul (zelfgemaakte dia's) of 20 ng / ul (-bedrijf maakte dia's).
8. Etikettering van cDNA met Amine-reactieve kleurstof en Zuivering
- Met amine-reactieve kleurstof naar de cDNA labelen. De cDNA direct te mengen met een monster (5 pl) vanamine-reactieve kleurstof.
- Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 tot 90 min en direct verder zuivering van kleurstof gemerkte cDNA. Zuiver kleurstof gemerkte cDNA met behulp van PCR clean-up kolommen en volgens het protocol van de fabrikant. Elueer cDNA in 50 pl elutiebuffer.
9. Meting van gelabelde cDNA
- Gebruik een spectrofotometer de opname van amine-reactieve kleurstoffen in de cDNA meten. Controleer dat de concentratie van amine-reactieve kleurstoffen ten minste 0,5 pmol / ul in een totaal volume van 50 ul.
10. Het mengen van gelabelde cDNA Monsters
- Voor zelfgemaakte dia's, gebruik maken van alle gelabelde cDNA voor hybridisatie met niet meer dan 30% verschil in cDNA concentratie. Voor bedrijf maakte slides gebruikt cDNA met niet meer dan 2-voudig verschil in cDNA concentratie.
Opmerking: normaal, wordt ongeveer 300 ng cDNA noodzakelijk voor bedrijf maakte slides, die zeer weinig in vergelijking met de required hoeveelheid cDNA voor zelfgemaakte dia's.
11. Hybridisatie en Wassen
- Gebruik de volgende reagentia: demi water, ethanol 99%, SHY Buffer (zelfgemaakte; met 40 pi gist RNA). Bereid maximaal 1 ml van SHY.
- Apparaten en oplossingen voorbereiding
- Schakel vacuüm concentrators en verwarming minstens 1 uur vóór het drogen. Schakel hybridisatie oven, met instelpunt ingesteld op de juiste hybridisatietemperatuur (S. pneumoniae DNA microarrays, gebruik 45 ° C). Evenzo voorverwarmen hybridisatie cassette en oven gedurende 30-60 min.
- Verwarm SHY buffer bij 68 ° C gedurende ten minste 30 min.
- Monstervoorbereiding (gelabelde cDNA)
- Combineer gelijke hoeveelheden van gelabelde cDNA's (max 30% verschil). Droog het monster met behulp van het vacuüm concentrators bij hoge temperatuur (ca. 40 min.) Tot het volume kleiner is dan 7 pl.
- Lifter-slip
- Gebruik schone lifter-enten.Opmerking: ± 30 pi op de slede worden geplaatst.
- Reinig de lifter-slips met zeep, veel kraanwater en 100% ethanol. Opmerking: Dirty lifter slips geven hoge achtergrond.
- Lucht drogen de lifter-slips met luchtpistool stofdeeltjes weg te blazen. Leg een schone lifter-slip op de dia met de witte teflon bekleding aan de zijkanten naar beneden.
- Het toevoegen hybridisatiebuffer (aan gemerkt cDNA)
- Los het droge kleurstof monsters in 7 pi H2O en incubeer bij 94 ° C gedurende 2 min.
- Onmiddellijk, voeg 35 ul voorverwarmd SHY buffer (68 ° C), meng voorzichtig en draaien op maximale snelheid gedurende 1 minuut om zich te ontdoen van neerslagen. Verwarm de sonde op 68 C gedurende ongeveer 5 min tot het laden.
- Schuif-lifter-slip montage en voorverwarming.
- Plaats de hybridisatie dia houder op een warmte-blok bij 50 ° C. Plaats DNA microarray dia's met de lifter-slip op de verwarmde hybridisatie dia houder en popwarmen van de dia met lifter-slip voor een minuut. Voer de volgende stappen zo snel mogelijk.
- Voeg 40 ul van het monster doelstelling om het einde van de schuif. Laat het fluïdum tussen de glasvlakken door capillaire kracht. Voer alle pipetteren langzaam en voorzichtig.
- Houd de dia's met lifter-slip horizontaal te allen tijde en beweeg langzaam om ervoor te zorgen dat de lifter-slip bewoog niet.
- Neem de voorverwarmde hybridisatie cassette uit de hybridisatie oven en sluit de machine. Plaats filter-papier gedrenkt met 3 ml 2x SSC (standaard zoutoplossing citraat) in de hybridisatie cassette.
- Plaats voorzichtig de hybridisatie dia houder met dia's in de hybridisatie cassette. Sluit de hybridisatie cassette en zet in de hybridisatie oven weer (voor ongeveer 16-18 uur).
- Dia wassen
- Bereid verse wash-buffers I, II en III (750 ml per wasbeurt stap). Voor 500 ml wassen-buffer I, gebruik 2 x SSC / 0,5% SDS. Voor 500 ml wassen-buffER II, gebruik 1 x SSC / 0.25% SDS. Voor 500 ml wassen-buffer III, gebruik 1 x SSC / 0,1% SDS (optioneel)
- Plaats de wash-buffers op 30 ° C (om er zeker van SDS is opgelost).
- Dompel de objectglaasjes zo snel mogelijk, maar zeer zacht, in een Falcon-buis gevuld met 50 ml wasbuffer I tot het glas rust op de conische bodem van de buis.
- Na een paar seconden, wanneer de lifter-slip zinkt naar de bodem van de buis, neem de glijbaan met een pincet zonder krassen de array en zet in het rek van het wassen station. Ga verder met het wassen met geen tijd kloof.
- Was de dia's voor 5 min in 500 ml was-buffer I (in een wasstation). Geef het een tweede wasbeurt voor 20-30 min in 500 ml wassen-buffer II (in een wassen station). Evenzo was de objectglaasjes gedurende 5 min in 500 ml was-buffer III (optioneel) (in een wasstation).
- Droog de objectglaasjes gedurende 2 minuten bij 2000 rpm.
12. microarray-analyse
- Scan beeldenmet respectieve golflengten in de scanner en op te slaan in een map "Jove Project".
- Gebruik software om de gescande bestanden in eerste instantie te analyseren zoals eerder beschreven 22. Na het uitvoeren van deze software, selecteert u het tabblad "Afbeelding openen" om het beeld rood dossier (-.550) laden als "Red" en groen image-bestand (-.635) als "Groene". Upload de gal bestand (.gal) met S. pneumoniae scala lijst op image-bestand door te kiezen voor "Load Array List" tab 22.
Let op: deze array lijst bestond uit 48 roosters, op elk rooster waren er 16 rijen en 15 kolommen. Elke plek op de grid staat voor een bepaald gen en spot informatie, waaronder gen naam wordt toegevoegd door middel van een plek beschrijving bestand. De spot nummers worden gegeven van links naar rechts en van boven naar beneden. - Na zorgvuldig het spotten van de roosters, selecteert u het tabblad "Zoek Array, zoeken Blokken, Lijn Eigenschappen" om de plekken te lijnen. Na het uitlijnen van alle functies, het analyseren van de afbeelding door de optie "Analyseren" teen b. Maak een nieuw bestand met de resultaten, histogram en scatter plot. Sla dit bestand op het tabblad "resultaten opslaan als" als een .gpr bestand voor verdere analyse.
- Voeren verdere normalisatie en verwerking van gegevens met in-house ontwikkelde Microprep software pakket zoals beschreven 9.
- Gebruik onafhankelijke biologische herhalingen voor DNA microarray gegevens die-dye verwisseld zijn. Voer CyberT uitvoering van een variant van t-test1 en bereken valse ontdekking rates (FDRs) zoals beschreven 9.
- Voor differentieel geëxpresseerde genen, neem p <0,001 en FDR <0,05 als standaard.
- Upload DNA microarray data op NCBI indiening pagina naar een GEO (Gene Expression Omnibus) toetreding nummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA, cDNA isolaties en analyses
L-serine is een van de essentiële aminozuren en zijn concentratie in humaan bloedplasma varieert 60-150 uM bij kinderen en volwassenen. Haar rol in de biosynthese van purines en pyrimidines benadrukt het belang metabolisme en is een voorloper van diverse aminozuren (glycine, cysteïne en tryptofaan). Om het effect van L-serine op de gehele transcriptoom van S. bestuderen pneumoniae D39 wildtype, microarray analyse van D39-stam gekweekt in CDM met een minimale concentratie (150 uM) L-serine tegen deze gekweekt in een maximale concentratie (10 mM) in hetzelfde medium werd uitgevoerd. Allereerst totaal RNA uit cellen onder beide concentraties gekweekt werd geïsoleerd. De concentraties van de RNA-monsters zijn in tabel 1. De kwaliteit totaal RNA werd onderzocht met de kwaliteitscontrole assay. RNA werd behandeld met DNase I alvorens dezetest om de mogelijke genomisch DNA te verwijderen Figuur 2 toont de kwaliteit van RNA.; rijstrook L de ladder, lanen 1 en 2 vertegenwoordigen RNA van 150 pm serine en lanen 3 en 4 geven de RNA van 10 mM serine. De aanwezigheid van twee duidelijke band van de twee RNA subeenheden gaf de goede kwaliteit van RNA en de volgende stap van het experiment kan worden uitgevoerd.
Na meting van de kwaliteit van RNA, cDNA-synthese werd uitgevoerd. cDNA werd gevormd met gebruikmaking van willekeurige nanomers en reverse transcriptase enzym. De concentraties van de cDNA monsters zijn in tabel 1. Dit cDNA werd gelabeld met amine-reactieve kleurstoffen en de concentraties van het gelabelde cDNA en kleurstof labels zijn in tabel 1. Na het merken werden monsters daarvan gemengd en vervolgens gehybridiseerd. Na wassen, werden objectglaasjes gescand met de scanner en analyse werd uitgevoerd met Gene Pix Pro software. Figuur 3 toont de spreidingplot analyse van de amine-reactieve kleurstoffen ratio. Na de eerste analyse werd gegevens verder geanalyseerd met de PicroPrep softwarepakket (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 ruis en Cyber-T verminderen werd gebruikt voor de uiteindelijke analyse. Tabel 2 vat de resultaten van de microarray studies na toepassing van de criteria van ≥ 2,0 voudig verschil en p-waarde <0,001. Een aantal genen differentieel tot expressie in aanwezigheid van minimale L-serine in vergelijking met de maximale (tabel 2).
Figuur 1. Een overzicht van DNA microarray technologie. RNA wordt geïsoleerd van de controle en het doel monsters en gelabeld cDNA wordt vervolgens gehybridiseerd.
Figuur 2.Kwaliteitscontrole van RNA geïsoleerd uit S. pneumoniae D39 cellen gekweekt in aanwezigheid van minimum (150 uM) en maximum (10 mM) serine concentraties. Lane L de grootte-ladder terwijl laan 1 en 2 stellen RNA monsters geïsoleerd uit cellen gekweekt in aanwezigheid van minimale serine concentratie. Evenzo, laan 3 en 4 vertegenwoordigen RNA monsters geïsoleerd uit cellen gekweekt in aanwezigheid van serine maximale concentratie. De banden vertegenwoordigen het 23S en 16S rRNA. De aanwezigheid van slechts twee groepen blijkt dat er geen gDNA vervuiling en RNA van goede kwaliteit.
Figuur 3. Array vergelijking spreidingsdiagram van een monster mengsel. Elke plaats in de grafiek geeft de gemiddelde expressie waarde (log2) van een gen in een experiment met kleurstof 1 op de y-as en kleurstof 2 op de x-as.
| Monster | RNA Sample | Beschrijving | RNA-concentratie (ng / ul) | cDNA-concentratie (ng / ul) | Gelabelde cDNA (ng / ul) | DyLight-550 (pmol / pl) | DyLight-650 (pmol / pl) | Hybridisatie regeling |
| S1 | R1 | D39 wild-type gegroeid in CDM + Minimum L-serine | 2057 | 255 | 225 | 0.8 | R1 + R3 | |
| R2 | D39 wild-type gegroeid in CDM + Minimum L-serine | 2566 | 201 | 179 | 1.2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | D39 wild-type gegroeid in CDM + Maximale L-serine | 2831 | 292 | 276 | 2.3 | ||
| R4 | D39 wild-type gegroeid in CDM + Maxmale L-serine | 1867 | 172 | 150 | 1 |
Tabel 1. Hybridisatie schema van de gebruikte materialen in de microarray analyse monsters.
| Gen een | Functie b | Verhouding c | |||
| SPD0600 | Celdeling eiwit DivIB | 4 | |||
| SPD0445 | Fosfoglyceraatkinase | 3,5 | |||
| SPD0646 | Hypothetisch eiwit | 3.4 | |||
| SPD0873 | Hypothetisch eiwit | 3.3 | |||
| SPD1223 | Hypothetisch eiwit | 3.3 | |||
| SPD0980 | Ribose-fosfaat pyrophosphokinase 2.8 | ||||
| SPD1628 | Xanthine fosforibosyltranferase | 2.7 | |||
| SPD1011 | Glyceraat kinase | 2.4 | |||
| SPD0645 | Hypothetisch eiwit | 2.3 | |||
| SPD0564 | Hypothetisch eiwit | 2.2 | |||
| SPD0641 | Mannose-6-fosfaat isomerase, klasse I, ManA | 2.1 | |||
| SPD1333 | Hypothetisch eiwit | 2.1 | |||
| SPD1384 | Catie efflux familie eiwit | 2.1 | |||
| SPD1432 | UDP-glucose 4-epimerase, Gale-1 | 2.1 | |||
| SPD1866 | N-acetylglucosamine-6-fosfaat deacetylase NAGA | 2.1 | SPD0104 | LysM domeineiwit | 2 |
| SPD0140 | ABC transporter, ATP-bindend eiwit | 2 | |||
| SPD0261 | Aminopeptidase C, PEPC | 2 | |||
| SPD1350 | Hypothetisch eiwit | 2 | |||
| SPD1822 | Ribosomale grote subeenheid pseudouridine synthase, RluD onderfamilie eiwit | 2 | |||
| SPD0453 | Type I restrictie-modificatie systeem, S subeenheid | -2 | |||
| SPD0459 | Hitteschokeiwit GrpE | -2 | |||
| SPD1006 | Glucose-1-fosfaat adenylyltransferase | -2 | |||
| SPD1799 | Sensor histidine kinase, putatieve | -2.1 | </ Tr>|||
| SPD0387 | Beta-hydroxyacyl- (acyl-carrier-eiwit) dehydratase Fabz | -2.2 | |||
| SPD1494 | Sugar ABC transporter, permease eiwit | -2.2 | |||
| SPD0974 | Klasse I glutamine amidotransferase, vermeende | -2.4 | |||
| SPD1600 | Anthranilaat fosforibosyltranferase | -2.5 | |||
| SPD1472 | Isoleucyl-tRNA synthetase | -2,6 | |||
| SPD0681 | Hypothetisch eiwit | -2.7 | |||
| SPD0501 | Transcriptie antiterminator, LICT | -3.4 |
Tabel 2. Lijst van genen geregeld in de transcriptome vergelijking van S. pneumoniae stam D39 wild-type geteeld in CDM 15 met minimale concentratie van L-serine en CDM met 15 maximale concentratie van L-serine. Een gen verwijzen naar D39 locus labels. B D39 annotatie / TIGR4 annotatie 21. C-verhouding is de voudige toename / afname van de expressie van genen in CDM-maximum in vergelijking met CDM-minimum (min-teken geeft downregulatie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een gebruiksvriendelijke protocol dat kan worden toegepast om hele transcriptoom bacteriën voeren. Het belangrijkste punt van deze bijzondere techniek is dat de voorwaarde waaronder de cellen geoogst variëren. Na het oogsten van de cellen en RNA-isolatie, deze techniek wordt gelijk voor alle soorten van bacteriële monsters en volgt exact identiek stappen en derhalve kan worden toegepast op elk type bacteriekweek. Het protocol is erg eenvoudig en handig en begint vanaf RNA isolatie. De RNA-isolatie protocol (met een Malcaloïde en RNA isolatie kit) tijd-effectief vergeleken met conventionele fenol-chloroform en Trizol methoden. In de volgende stap wordt de voorbereiding van cDNA met transcriptase III enzym uitgevoerd. Vervolgens wordt het kenmerken van cDNA door eerst mengen van cDNA met amine-reactieve kleurstoffen, en vervolgens zuiveren van het gemerkte cDNA. Het etiket is eenvoudig en niet veel tijd als de monsters moeten worden gedurende ongeveer 1uur in het donker. Al deze stappen kunnen in elke standaard laboratorium worden uitgevoerd zoals deze geen gespecialiseerde apparatuur vereisen. Een microarray scanner nodig om dia scannen. Voor het scannen en analyseren glijbaan wordt de GenePix Pro-programma gebruikt, dat is een zeer eenvoudig en gebruiksvriendelijk programma 22.
Na het doen van alle experimenten, werd de analyse uitgevoerd met behulp van Microprep en CyberT. De Microprep pakket, bestaat uit drie modules, dwz PrePreP, prep en PostPreP 9. Deze gegevens voorverwerking kader vermindert de tijd voor normalisatie van gegevens en vermindert ook de hoeveelheid gegevens weggegooid. Het gemak waarmee de software kan worden gebruikt maakt het mogelijk voor de onderzoeker om een begrip van de DNA microarray gegevens in minimale tijd. Het duurt slechts een paar minuten naar het ruwe signaal gegevens in hoogwaardige data om te zetten voor verdere verwerking na het slide-analyse wordt gedaan. Nadere analyse van de pool van genen geregeld in de microarray kan worden gedaan met behulp van verschillende in-house software pakketten. Zij omvatten peper 20, FIVA 16, OPENBAAR 18, officier van justitie 17 en Genome2D 19. Deze Windows-gebaseerde tools en software pakketten zijn gebruiksvriendelijk en bieden diep inzicht in de gegevens die in de loop van verder onderzoek. Deze software pakketten maken het zeer eenvoudig en handig voor de onderzoekers om deze technologie te gebruiken als de data wordt veel meer betekenis en relevant.
De kleurstoffen gebruikt in microarrays bekend gevoelig voor een ozon-effect, waarbij de kleurstoffen onstabiel in aanwezigheid van ozon en signaalsterkte is zo laag dat het niet kan worden herkend door de scanner worden. Amine-reactieve kleurstoffen die minder gevoelig zijn voor de ozon-effect worden gebruikt om cDNA te labelen. De oplossing voor ozon-effect zal deze technologie nog beter te maken.
Een lijst is gemaakt van genen die op- of neerwaarts gereguleerd werden in aanwezigheid van de minimale L-serine concentratie vergeleken met de maximale (tabel 2). De opgereguleerd genen kunnen worden ingedeeld volgens hun functie product. Zeven daarvan coderen hypothetische eiwitten, vier vervoersbedrijven koolhydraten en metabolisme, een celdeling eiwit DivIB en bepaalde aminozuren transport en metabolisme genen. Evenzo zijn er ook bepaalde genen die neerwaarts gereguleerd in onze testen conditie. Een BglG-familie transcriptionele regulator LICT, sommige koolhydraten genen en enkele aminozuur-specifieke genen behoren tot de downregulated genen. Een heat-shock eiwit GrpE is bij de downgereguleerde degenen. Daarom wordt in deze studie geeft een compleet overzicht van de genen die differentieel tot expressie onder de geteste omstandigheden. Na analyse van de resultaten, soms verificatie van de resultaten noodzakelijk. Dit kan gebeuren door qPCR of β-galactosidase assays met lacZ promoter fusies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Anne de Jong en Siger Holsappel voor hulp bij het DNA microarrays dia productie. Ondersteuning Anne de Jong's voor bio-analyse wordt ook gewaardeerd. We danken ook Jelle Slager voor de herziening van het papier. Mohammed Afzal en Irfan Manzoor worden ondersteund door de GC University, Faisalabad, Pakistan onder de faculteit ontwikkelingsprogramma van HEC Pakistan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).
