Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En hurtig og pålidelig Pipeline for bakteriel Transkriptomet Analyse Case study: Serin-afhængig genregulering i Published: April 25, 2015 doi: 10.3791/52649

Abstract

Genekspression og reguleringen er meget vigtigt at forstå opførslen af ​​celler under forskellige betingelser. Forskellige teknikker anvendes i dag til at studere genekspression, men de fleste er begrænset i forhold til at give et samlet billede af ekspressionen af ​​det hele transkriptomet. DNA microarrays tilbyder en hurtig og økonomisk forskning teknologi, som giver fuldt overblik over global genekspression og har et utal af applikationer, herunder identifikation af nye gener og transkriptionsfaktor bindingssteder, karakterisering af transkriptionsaktivitet af cellerne og også hjælpe med at analysere tusindvis af gener (i et enkelt eksperiment). I den foreliggende undersøgelse, er betingelserne for bakteriel transkriptom analyse fra cellehøst til DNA microarray analyse blevet optimeret. Under hensyntagen til den tid, omkostninger og præcision af forsøgene, denne teknologi platform viser sig at være meget nyttigt og universelt applicabale for at studere bakteriel transcriptomes. Her udfører vi DNA microarray analyse med Streptococcus pneumoniae som case-studie ved at sammenligne de transkriptionelle svarene fra S. pneumoniae dyrket i nærvær af varierende L-serin koncentrationer i mediet. Totalt RNA blev isoleret ved anvendelse af en Macaloid fremgangsmåde under anvendelse af en RNA isolation kit og kvaliteten af ​​RNA blev kontrolleret ved anvendelse af en RNA kvalitetskontrol kit. cDNA blev fremstillet under anvendelse af revers transkriptase og cDNA prøverne blev mærket ved hjælp af en af ​​to aminreaktive fluorescerende farvestoffer. Hjemmelavet Mikromatrice Objektglassene blev anvendt til hybridisering af de mærkede cDNA prøver og microarray data blev analyseret ved hjælp af en ramme cDNA microarray data forbehandling (Microprep). Endelig blev Cyber-T bruges til at analysere de data, der genereres ved hjælp Microprep til identifikation af statistisk signifikante differentielt udtrykte gener. Desuden internt bygget softwarepakker (peber, FIVA, afsløre, anklager, Genome2D) blev anvendt til at analyseredata.

Introduction

Studiet af hele sættet af mRNA overflod (transkriptom) kodet af genomet af en encellet organisme eller en eukaryot celle på et bestemt tidspunkt eller under en specifik tilstand, herunder gen overekspression eller knock-out, kaldes transcriptomics. Transcriptomics tillader os at observere, i hvilket omfang gener udtrykkes under en bestemt tilstand på et tidspunkt X og giver os information om, hvor kraftigt de gener udtrykkes i forhold til en reference.

En mikroarray er en todimensionalt array på et fast substrat (normalt et objektglas eller silicium tyndfilm celle), der kan anvendes til at analysere store mængder af biologisk materiale ved hjælp af high-throughput screening, og miniaturiserede, multiplekset og parallel behandling og påvisning metoder. Microarrays kommer i forskellige typer, herunder DNA-microarrays, protein microarrays, peptid microarrays, væv microarrays, antistof microarrays, cellulære mikroarrays og andre. En DNA microarray erdybest set en samling af mikroskopiske DNA pletter fastgjort til en fast overflade, normalt glas. DNA microarrays anvendes til at måle ekspressionsniveauerne af et gen eller et sæt gener samtidigt eller til genotype flere områder af et genom 2,3. Picomol (10 -12 mol) af en probe er til stede i hver DNA-stedet, der repræsenterer en specifik DNA-sekvens, også kendt som en reporter. De mærkede mRNA molekyler fra prøverne kaldes »maal«. Fluorophorer anvendes til at måle probe-target-hybridisering og påvisning af fluoroforen-mærkede mål bestemmer den relative overflod af nukleinsyresekvenser i målet. En microarray eksperiment kan udrette flere genetiske tests parallelt fordi et array kan indeholde titusinder af prober. Layoutet af en simpel microarray eksperiment er vist i figur 1. For nylig blev det fastslået i vores og andre laboratorier, at disse arrays kan genbruges, hvilket gør denne teknik helt omkostningseffektive virkningsfulde.

Forskellige RNA isolation og rensning teknikker er blevet udviklet gennem årene, herunder C-TAB, SDS og GT metoder 4-8. Endvidere flere kommercielle kits er også tilgængelige. For genekspression høj kvalitet RNA er meget vigtig. Derfor er RNA isoleringsmetoder modificeret til at få en maksimal mængde af RNA. Tilsvarende er trinene til cDNA-fremstilling og mærkning af cDNA minimeres. Normalisering af data efter scanning udføres også effektivt ved hjælp af in-house bygget softwarepakker og værktøjer 9.

Streptococcus pneumoniae er en Gram-positive humane patogen, der koloniserer nasopharynx og er årsag til flere infektioner, såsom lungebetændelse, sepsis, otitis media og meningitis 10. Bakterien kan udnytte en lang række af de næringsstoffer, der kræves for vækst og overlevelse 11,12. Et antal undersøgelser er blevet udført påpneumokok nitrogenmetabolisme og regulering understreger betydningen af aminosyrer og deres rolle i virulens 13,14. I denne undersøgelse transkriptom reaktion S. pneumoniae skiftende koncentrationer af L-serin, en aminosyre rigeligt til stede i humant blodplasma, rapporteres under anvendelse af DNA microarrays. Den transkriptom reaktion S. pneumoniae dyrket i en minimal koncentration af L-serin (150 uM) blev sammenlignet med den dyrkes i en maksimal koncentration (10 mM) af serin. Kemisk defineret medium (CDM eller minimal medium) 15 blev anvendt til denne undersøgelse for at kontrollere koncentrationen af serin. Fokus i denne undersøgelse er at gøre denne teknik brugervenlige og give forskellige værktøjer til data normalisering og analyse. Derfor blev en række værktøjer udviklet til analyse og data fortolkning. FIVA (Funktionel Information Viewer og Analyzer) giver en platform for behandling af oplysninger i klynger af gener medlignende genekspressionsmønstre og til konstruktion af funktionelle profiler 16. Anklager en anden softwarepakke, der gør det lettere at identificere formodede funktioner og anmærkninger af gener 17. Ved at gøre brug af klyngedannelse metoder, beskriver en DNA-bindingssted detektionsalgoritme. Cis reguleringsmyndigheder motiver af gener kan projiceres ved hjælp af denne algoritme 18. Genome2D tilbyder en Windows-baseret platform til visualisering og analyse af transkriptom data ved at tilbyde forskellige farveområder at karakterisere ændringer i genekspression niveauer på et genom kort 19. Peber webserver tilbyder, ud over den alt-i-en analysemetode, en værktøjskasse for minedrift for reguloneme, investorer og transskriptionsfaktorbindingssteder 20. Fuld annotation af intergeniske regioner i et bakteriegenom kan opnås ved hjælp af denne pakke. Biologer kan i høj grad drage fordel af peber, fordi den giver dem en platform for at designe eksperiments så hypotese oplysninger kan bekræftes in vitro 20. Disse softwarepakker bidrage væsentligt til microarray analyse, da de fleste af dem er frit tilgængelige og gøre data normalisering og analyse meget pålidelige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af Media, og Cell Culture

  1. Grow S. pneumoniae D39 vildtypestamme 21 som tidligere beskrevet 11. Podes celler opbevaret ved -80 ° C i 10% glycerol (med 1/100 forhold i 50 ml sterile rør) i 50 ml kemisk defineret medium (CDM) med en endelig pH på 6,4 15, men udelader L-serin fra aminosyren blanding.
    Bemærk: to forskellige CDM blev anvendt; der indeholder en minimal koncentration af L-serin (150 uM), og den anden indeholder en maksimal koncentration af L-serin (10 mM). Dette minimale koncentration er dybest set koncentrationen af L-serin i humant blodplasma, og målet er at sammenligne genekspressionen af S. pneumoniae D39 stamme under disse to betingelser.

2. Isolering af Total RNA

  1. Materialer
    1. Brug syre phenol, RNA kvalitet til isolering af total RNA.
    2. Macaloid:
      1. Suspender 2 gramMacaloid i 100 ml TE og koges i 5 min. Afkøl til stuetemperatur og sonikeres indtil Macaloid gels.Centrifuge opløsningen ved 2.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, resuspenderes i 50 ml TE pH 8 og opbevares ved 4 ° C.
    3. Løsninger:
      1. Behandl alle løsninger med diethylpyrocarbonat (DEPC). Tilsæt 100 pi DEPC / 100 ml opløsning, inkuberes O / N ved 37 ° C og autoklaven i 15 min.
  2. Metode
    1. Grow 50 ml S. pneumoniae D39 cellekultur i 50 ml rør ved 37 ° C (ingen ryste) indtil midten af eksponentiel fase (OD ~ 0,3). Centrifuger kulturer ved 4 ° C på 10.000 x g i 2 min. Kassér medier og straks fryse cellepellets i flydende nitrogen.
    2. Premix 300 pi chloroform: IAA (24: 1) og 300 pi phenol (syre phenol, RNA-kvalitet). Brug 500 pi af den organiske fase i trin 2.2.3.
    3. Forbered følgende blanding på forhånd i RNA-fri skruelåg rør: 0.5 G glasperler, 50 pi 10% SDS, 500 pi phenol / chloroform: IAA (som fremstillet i trin 2.2.2), Macaloid lag (150-175 pi, ikke nøjagtigt som det er meget viskos). Resuspender cellepellets i 400 pi TE (DEPC) og tilsæt resuspenderede celler i skruelåg rør.
    4. For at bryde cellerne, placere skruelåg rør i en perle tæppebanker for 2x 60 "impulser (" homogenisere ") med 1 min interval på is. Centrifuger prøverne i 10 minutter ved 10.000 x g (4 ° C).
    5. Den øverste fase overføres til et frisk rør, tilsættes 500 pi chloroform: IAA (24: 1) og centrifugeres i 5 minutter ved 10.000 x g (4 ° C).
    6. Overfør 500 pi af den øvre fase til friske rør, tilsættes 2 volumener (1 ml) af lysis / bindingspuffer og blandes ved pipettering op og ned. Isoler total RNA ved hjælp af RNA isolation kit og følge producentens anbefalede protokol.

3. RNA Oprydning

< ol>
  • For at fjerne forurening af DNA fra total RNA, tilsættes 100 pi DNAseI mix (90 pi DNAse buffer og 10 pi DNAseI) og inkuberes i 20-30 minutter ved 15-25 ºC.
  • Wash renset RNA ved hjælp af RNAse kit. Opnå 50 pi elueret volumen.
  • 4. Analyse af RNA

    1. Bestemme koncentrationen af ​​RNA på et spektrofotometer. Bestemme kvaliteten af RNA ved anvendelse af et assay som følger (figur 2).
      1. Fortynd 1 pi prøve med 50 pi DEPC vand for at få en koncentration på 20-200 ng / pl.
      2. Brug 1 pi fortyndet RNA prøve at tjekke kvaliteten på Bioanalyser i henhold til producentens anvisninger.
    2. Bemærk: forholdet 23S: 16S på omkring 2,0 anses for god 1 A260 enhed RNA svarer til 40 ug / ml.. En anbefalede mængde til mærkning er 10-20 ug.

    5. cDNA Forberedelse og mærkning

    ntent "> BEMÆRK: Følgende protokol blev fulgt for cDNA forberedelse og mærkning.

    1. Annealing
      1. Udfør annealing reaktion i 300 pi PCR-rør, at holde koncentrationen af ​​total RNA 10-15 ug til hjemmelavede dias eller 5 ug til virksomhedens fremstillet slides. Bland RNA med 2 pi Tilfældige nonamerer (1,6 pg / pl) og tilsæt nuclease-frit vand, hvis nødvendigt for at holde den endelige volumen af ​​annealing blandingen til 18 pi.
      2. Hold annealing blandingen ved 70 ° C i 5 minutter. Efter at afkøle blandingen til stuetemperatur i 10 min (annealing), og om nødvendigt dreje ned reaktionerne til bunden af ​​røret. Placer reaktionsrørene på is i mindst 1 min.
    2. Reverse Transcription
      1. Forbered revers transkriptase mix på følgende måde: til 18 pi annealing mix, tilsæt 12 pi Master mix (bestående af 6 pi 5x First Strand buffer, 3 pi 0,1 M DDT, 1,2 pi 25x AA-dUTP / nukleotid mix og 1,8 pi vende transcriptase (1 pi til firma-made slides). Hold reaktionsblandingen for 2-16 timer ved 42 ° C.

    6. Nedbrydning af mRNA og oprensning af cDNA

    1. At nedbryde mRNA fra reaktionsblandingen, tilsættes 3 pi 2,5 M NaOH og sted ved 37 ° C i ca. 15 min. Derefter tilsættes 15 pi 2M HEPES fri syre for at neutralisere NaOH.
    2. Renses cDNA blanding ved anvendelse af PCR oprydning søjler og følge producentens protokol.

    7. Måling af cDNA Koncentration

    1. Mål cDNA-koncentrationer på et spektrofotometer. Hvis du vil fortsætte med mærkning, kontrollere, at koncentrationen af ​​cDNA er mindst 60 ng / ul (hjemmelavede slides) eller 20 ng / ul (virksomhedsspecifikke lavet slides).

    8. Mærkning af cDNA med aminreaktiv Dye og oprensning

    1. Brug amin-reaktivt farvestof til at mærke cDNA. Direkte blande cDNA med en alikvot (5 pi) afamin-reaktivt farvestof.
    2. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i mørke i 60 til 90 minutter og fortsætte direkte til oprensning af farvestof-mærket cDNA. Oprens farvestof-mærket cDNA ved anvendelse af PCR clean-up søjler og efter fabrikantens protokol. Eluer cDNA i 50 pi elueringspuffer.

    9. Måling af Labelled cDNA

    1. Brug et spektrofotometer til at måle inkorporeringen af ​​amin-reaktive farvestoffer i cDNA'et. Kontroller, at koncentrationen af ​​amin-reaktive farvestoffer er mindst 0,5 pmol / pl i et totalt volumen på 50 pi.

    10. Blanding af Labelled cDNA Prøver

    1. For hjemmelavede dias, bruge alle de mærkede cDNA for hybridisering med ikke mere end 30% forskel i cDNA koncentration. For virksomheden fremstillede dias, skal du bruge cDNA med højst 2 gange forskel i cDNA koncentration.
      Bemærk: Normalt er der behov for omkring 300 ng cDNA for virksomhedens fremstillet slides, hvilket er meget lidt sammenlignet med reqgendannes for mængden af ​​cDNA for hjemmelavede slides.

    11. hybridisering og vask

    1. Brug følgende reagenser: demi vand, ethanol 99%, sky Buffer (hjemmelavet, med 40 pi gær RNA). Forbered maksimalt 1 ml sky.
    2. Apparater og løsninger forberedelse
      1. Tænd vakuum koncentratorer og varmelegeme mindst 1 time før tørring. Tænd hybridiseringsovn med setpunktet indstilles til den korrekte hybridiseringstemperatur (for S. pneumoniae DNA microarrays bruge 45 ° C). Tilsvarende forvarme hybridisering kassette og ovn i 30-60 min.
      2. Forvarm SHY buffer ved 68 C i mindst 30 minutter.
    3. Prøvefremstilling (mærket cDNA)
      1. Kombiner lige store mængder mærkede cDNA'er (max 30% forskel). Tør prøven ved hjælp af vakuum koncentratorer ved høj temp (ca.. 40 min), indtil mængden er mindre end 7 pi.
    4. Lifter-slip
      1. Brug rene lifter-sedler.Bemærk: ± 30 pi kan indlæses på objektglasset.
      2. Rengør løfteren-sedler med sæbe, masser af postevand og 100% ethanol. Bemærk: Dirty lifter glider give høj baggrund.
      3. Air tørre løfteren-sedler med luft pistol til at blæse væk støvpartikler. Placer en ren løfter-slip på diaset med den hvide teflon foring i siderne nedad.
    5. Tilføjelse hybridiseringsbuffer (til mærket cDNA)
      1. Opløses de tørrede farveprøver i 7 pi H2O og inkuberes ved 94 ° C i 2 min.
      2. Straks, tilsættes 35 pi forvarmet SHY buffer (68 ° C), bland forsigtigt og centrifugering ved maksimal hastighed i 1 min for at slippe af bundfald. Forvarm sonden ved 68 C i ca. 5 min indtil lastning.
    6. Slide-løfteren-kilesamling og forvarmning.
      1. Placer hybridisering slide holder på en varme-blok ved 50 ˚C. Placer Mikromatrice slides med løfteren-slip på den opvarmede hybridisering slide holder og pgenopvarme slide med løfteren-slip i et minut. Udfør de næste skridt så hurtigt som muligt.
      2. Tilføj 40 pi målstikprøven til udgangen af ​​slæden. Lad væsken at strømme mellem de glasoverflader ved kapillær kraft. Udfør alle pipettering langsomt og forsigtigt.
      3. Hold dias med løfteren-slip vandret på alle tidspunkter og bevæge sig langsomt for at sikre, at løfteren-slip ikke bevæge sig.
      4. Tag det foropvarmede hybridisering kassette ud af hybridiseringsovn og lukke maskinen. Placer filtrerpapir vædet med 3 ml 2x SSC (standard saltvand citrat) i hybridisering kassette.
      5. Forsigtigt placere hybridisering slide indehaveren med dias i hybridisering kassette. Luk hybridisering kassetten og sætte i hybridiseringsovn igen (for omkring 16-18 timer).
    7. Slide vask
      1. Forbered frisk vask-buffere I, II og III (750 ml per vask trin). For 500 ml vaske-buffer I, bruge 2 x SSC / 0,5% SDS. For 500 ml vaske-buffER II, bruge 1 x SSC / 0,25% SDS. For 500 ml vaske-buffer III, bruge 1 x SSC / 0,1% SDS (valgfrit)
      2. Placer vask-buffere ved 30 ° C (for at være sikker på SDS er opløst).
      3. Nedsænkes slides så hurtigt som muligt, men meget forsigtigt i en Falcon-rør fyldt med 50 ml vaskebuffer I indtil glasset hviler på den koniske bund af røret.
      4. Efter nogle få sekunder, når løfteren-slip synker til bunden af ​​røret, tag dias med en pincet uden at ridse array og sat i rack af vask station. Fortsæt med vask med ingen tid hul.
      5. Vask slides i 5 minutter i 500 ml vaske-buffer I (i en vask station). Giv det en anden vask til 20-30 min i 500 ml vaske-buffer II (i en vask station). Tilsvarende vaske dias i 5 min i 500 ml vaske-buffer III (ekstraudstyr) (i en vask station).
      6. Tør slides i 2 minutter ved 2.000 rpm.

    12. microarray analyse

    1. Scan billedermed respektive bølgelængder i scanner og gemme i en mappe "Jove Project".
    2. Brug software til at analysere de scannede filer oprindeligt som beskrevet tidligere 22. Efter denne software køres, skal du vælge "Åbn billede" fanen for at indlæse fil det røde billede (-.550) som "Rød" og grøn billedfil (-.635) som "Grøn". Upload gal fil (.gal) med S. pneumoniae-array liste på billedfil ved at vælge "Load Array List" fanen 22.
      Bemærk: dette array liste bestod af 48 net, på hver tavle var der 16 rækker og 15 kolonner. Hver plet på nettet udgør et enkelt gen og information spot herunder gen navn tilsættes gennem en plet beskrivelsesfil. De spot tal er angivet fra venstre mod højre og top til bund.
    3. Efter omhyggeligt spotting nettene, skal du vælge fanebladet "Find Array, Find Blocks, Juster funktioner" for at justere pletter. Efter at tilpasse alle de funktioner, analysere billedet ved at vælge "Analyse" tAB. Opret en ny fil med resultater, histogram og scatter plot. Gem filen fra fanen "Gem resultaterne som" som en .gpr fil til yderligere analyse.
    4. Udfør yderligere normalisering og behandling af data med egenudviklede Microprep softwarepakke som beskrevet 9.
    5. Brug uafhængige biologiske gentagelser for Mikromatrice data, som farvestof-byttes. Udfør CyberT gennemførelse af en variant af t-test1 og beregne falsk opdagelse satser (FDRs) som beskrevet 9.
    6. For differentielt udtrykte gener, tage p <0,001 og FDR <0,05 som en standard.
    7. Upload Mikromatrice data på NCBI indsendelse side for at få en GEO (Gene Expression Omnibus) tiltrædelse nummer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    RNA, cDNA isolationer og analyse

    L-serin er en af ​​de essentielle aminosyrer og dets koncentration i humant blodplasma varierer fra 60 til 150 um i børn og voksne. Dens rolle i biosyntesen af ​​puriner og pyrimidiner fremhæver dens betydning i stofskiftet, og det er en forløber for adskillige aminosyrer (glycin, cystein og tryptophan). For at undersøge virkningen af L-serin på hele transkriptomet S. pneumoniae D39 vildtypestamme, microarray analyse af D39-stamme dyrket i CDM med en minimal koncentration (150 uM) af L-serin mod denne dyrkes i en maksimal koncentration (10 mM) i det samme medium blev udført. Først og fremmest, totalt RNA fra celler dyrket under begge koncentrationer blev isoleret. Koncentrationerne af RNA-prøver er angivet i tabel 1. Kvaliteten af total RNA blev undersøgt ved anvendelse af kvalitetskontrol assay. RNA blev behandlet med DNase I før denneassay for at fjerne eventuel genomisk DNA Figur 2 viser kvaliteten af RNA.; lane L betegner stigen, bane 1 og 2 repræsenterer RNA fra 150 um serin og banerne 3 og 4 repræsenterer RNA fra 10 mM serin. Tilstedeværelsen af ​​to klare bånd svarende til de to RNA subunits indikerede god kvalitet af RNA og det næste trin i eksperimentet kunne udføres.

    Efter måling af kvaliteten af ​​RNA, blev cDNA syntese udført. cDNA blev dannet ved hjælp af tilfældige nanomers og revers transkriptase enzym. Koncentrationerne af cDNA prøverne er angivet i tabel 1. Dette cDNA blev mærket med amin-reaktive farvestoffer, og koncentrationerne af det mærkede cDNA og farvestof etiketter er givet i tabel 1. Efter mærkning blev prøver blandet i overensstemmelse hermed og derefter hybridiseret. Efter vask blev objektglassene scannes ved hjælp af scanneren, og analyse blev udført under anvendelse af Gene Pix Pro-softwaren. Figur 3 viser scatterplot analyse af amin-reaktive farvestoffer ratio. Efter første analyse blev data yderligere analyseret ved hjælp af PicroPrep softwarepakke (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 for at reducere støj og Cyber-T blev anvendt til den endelige analyse. Tabel 2 opsummerer resultaterne af microarray undersøgelser efter anvendelse af kriterierne på ≥ 2,0 fold forskel og p-værdi <0,001. En række gener blev differentielt udtrykt i nærvær af mindst L-serin i forhold til det maksimale (tabel 2).

    Figur 1
    Figur 1. En oversigt over Mikromatrice teknologi. RNA isoleres fra kontrollen og målet prøver og mærkede cDNA hybridiseres derefter.

    Figur 2
    Figur 2.Kvalitetskontrol af RNA isoleret fra S. pneumoniae D39-celler dyrket i nærvær af minimum (150 uM) og maksimal (10 mM) serin koncentrationer. Lane L repræsenterer størrelsen-stigen henviser bane 1 og 2 repræsenterer RNA-prøver isoleret fra celler dyrket i nærvær af mindst serin koncentration. Tilsvarende repræsenterer RNA-prøver isoleret fra celler dyrket i nærvær af maksimalt serin koncentration bane 3 og 4. Båndene repræsenterer 23S og 16S rRNA. Tilstedeværelsen af ​​kun to bånd viser, at der ikke er nogen gDNA kontaminering og RNA er af god kvalitet.

    Figur 3
    Figur 3. Array sammenligning scatter plot af en prøveblanding. Hver plet i plottet repræsenterer middelværdien udtrykket værdi (log2) af et gen i et eksperiment med farvestof 1 på y-aksen og farvestof 2 på x-aksen.

    Prøve RNA-prøve Beskrivelse RNA-koncentrationen (ng / pl) cDNA koncentration (ng / pl) Mærket cDNA (ng / pl) DyLight-550 (pmol / pl) DyLight-650 (pmol / pl) Hybridization ordning
    S1 R1 D39 vildtype dyrket i CDM + Minimum L-serin 2057 255 225 0,8 R1 + R3
    R2 D39 vildtype dyrket i CDM + Minimum L-serin 2566 201 179 1.2 R2 + R4
    S2 R3 D39 vildtype-dyrket i CDM + Maksimal L-serin 2831 292 276 2.3
    R4 D39 vildtype-dyrket i CDM + Maximum L-serin 1867 172 150 1

    Tabel 1. Hybridisering ordning af de anvendte i microarray analyse prøver.

    </ Tr>
    Gene en Funktion B Ratio c
    SPD0600 Celledeling protein DivIB 4
    SPD0445 Phosphoglyceratkinase 3,5
    SPD0646 Hypotetisk protein 3.4
    SPD0873 Hypotetisk protein 3.3
    SPD1223 Hypotetisk protein 3.3
    SPD0980 Ribose-phosphat pyrophosphokinase 2.8
    SPD1628 Xanthin phosphoribosyltransferase 2.7
    SPD1011 Glycerat kinase 2.4
    SPD0645 Hypotetisk protein 2.3
    SPD0564 Hypotetisk protein 2.2
    SPD0641 Mannose-6-phosphat-isomerase, klasse I, mana 2.1
    SPD1333 Hypotetisk protein 2.1
    SPD1384 Cation efflux familie protein 2.1
    SPD1432 UDP-glucose 4-epimerase, GalE-1 2.1
    SPD1866 N-acetylglucosamin-6-phosphat deacetylase, Naga 2.1 SPD0104 LysM-domæne-protein 2
    SPD0140 ABC transporter, ATP-bindende protein 2
    SPD0261 Aminopeptidase C, PEPC 2
    SPD1350 Hypotetisk protein 2
    SPD1822 Ribosomal stor underenhed pseudouridine synthase, RluD underfamilien protein 2
    SPD0453 Type I-restriktionsmodifikationsenzym modifikation systemet, S-underenhed -2
    SPD0459 Heat shock protein GrpE -2
    SPD1006 Glucose-1-phosphat adenylyltransferase -2
    SPD1799 Sensor histidin kinase, formodede -2.1
    SPD0387 Beta-hydroxyacyl- (acyl-bærer-protein) dehydratase fabZ -2.2
    SPD1494 Sugar ABC transportør, permease protein -2.2
    SPD0974 Klasse I glutamin amidotransferase, formodede -2,4
    SPD1600 Anthranilat phosphoribosyltransferase -2.5
    SPD1472 Isoleucyl-tRNA-syntetase -2,6
    SPD0681 Hypotetisk protein -2,7
    SPD0501 Transskription antiterminator, LICT -3,4

    Tabel 2. Oversigt over gener reguleres i transkriptom sammenligning af S. pneumoniae stamme D39 vildtype dyrkes i CDM 15 med minimal koncentration af L-serin og CDM 15 med maksimal koncentration af L-serin. Et gen numrene henviser til D39 locus tags b. D39 anmærkning / TIGR4 annotation 21 c. Ratio repræsenterer den fold stigning / fald i ekspressionen af gener i CDM-maksimum i forhold til CDM-minimum (minustegn angiver nedregulering).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Vi beskriver en brugervenlig protokol, der kan anvendes til at udføre hele transkriptom analyse af bakterier. Det centrale punkt om denne særlige teknik er, at en situation, hvor cellerne høstes vil variere. Efter høst af celler og RNA-isolering, bliver denne teknik ens for alle typer af bakterielle prøver og følger nøjagtigt identiske trin og derfor kan anvendes til enhver type bakteriekultur. Protokollen er meget enkel og praktisk og starter fra RNA-isolering. Vores RNA isolation protokol (ved hjælp af en Macaloid og RNA isolation kit) er tid effektiv sammenlignet med konventionelle phenol-chloroform og TRIZOL metoder. I det næste trin er fremstilling af cDNA med transkriptase III enzym udføres. Dernæst mærkning af cDNA gøres ved først blanding af cDNA med amin-reaktive farvestoffer, og derpå oprensning af mærket cDNA. Mærkningen er også enkel og tager ikke meget tid som prøverne skal inkuberes i ca. 1HR i mørke. Alle disse trin kan udføres i en hvilken som helst standard laboratorium som det ikke kræver nogen specialiseret udstyr. En microarray scanner er nødvendig for at scanne dias. For slide scanning og analyse, er GenePix Pro program, der bruges, hvilket er en meget enkel og brugervenlig program 22.

    Efter gør alle forsøg blev analyse udført under anvendelse MicroPrep og CyberT. Den MicroPrep pakke består af tre moduler, dvs. PrePreP, prep og PostPreP 9. Denne ramme data forbehandling reducerer den tid til normalisering af data og også reducerer mængden af ​​kasserede data. Den lethed, som kan bruges softwaren gør det muligt for forskeren at have en forståelse af DNA microarray data i minimum tid. Det tager kun et par minutter til at konvertere råsignalet data i høj kvalitet af data til videre behandling efter slide billedanalyse er gjort. Yderligere analyse på puljen af ​​gener reguleret i MICRoarray kan gøres ved hjælp af forskellige in-house softwarepakker. De omfatter PEPPER 20, FIVA 16, beskriver 18, anklagere 17 og Genome2D 19. Disse Windows-baserede værktøjer og softwarepakker er brugervenlige og giver dyb indsigt i data under yderligere undersøgelse. Disse softwarepakker gør det meget nemt og praktisk for forskerne at udnytte denne teknologi som data bliver meget mere meningsfuld og relevant.

    De farvestoffer, der anvendes i microarrays er kendt for at være modtagelige for en ozon-effekt, hvor farvestofferne bliver ustabile ved tilstedeværelse af ozon og signalstyrken er så lav, at det ikke kan genkendes af scanneren. Amin-reaktive farvestoffer, som er mindre følsomme over for ozon-effekt til at mærke cDNA. Løsningen på ozon-effekt vil gøre denne teknologi endnu bedre.

    En liste blev skabt af gener, der var op- eller nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​den minimale L-SerIne koncentration i forhold til maksimum (tabel 2). De opreguleres gener kan kategoriseres efter deres produkts funktion. Syv af dem koder hypotetiske proteiner, fire er involveret i kulhydrat transport og metabolisme, en celledeling protein DivIB, og visse aminosyrer transport og metabolisme gener. Tilsvarende er der også visse gener, der er nedreguleret i vores testet tilstand. En BglG-familie transkriptionel regulator LICT, nogle kulhydrat-gener og nogle aminosyre-specifikke gener er blandt de nedreguleres gener. En varme-shock protein GrpE er også blandt de ned-regulerede dem. Derfor er denne undersøgelse giver et komplet overblik over generne differentielt udtrykte under de testede betingelser. Efter analyse af resultaterne, er det nødvendigt til tider kontrol af resultaterne. Dette kan enten ske ved qPCR eller β-galactosidase assays under anvendelse af lacZ-promotoren fusionerne.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Vi takker Anne de Jong og Siger Holsappel efter hjælp til DNA mikroarrays slide produktion. Anne de Jong støtte til bioinformatik analyse også værdsat. Vi takker også Jelle Slager for at gennemgå papiret. Muhammad Afzal og Irfan Manzoor understøttes af GC University, Faisalabad, Pakistan under fakultetet udviklingsprogram for HEC Pakistan.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acid phenol SigmaAldrich P4682
    Roche RNA isolation kit Roche Applied Science 11828665001
    Glass beads 105015
    Chloroform Boom 92013505.1000.
    IAA 106630
    Nanodrop Nanodrop ND-100
    Agilent BioAnalyser Agilent G2940CA
    Superscript III Life technologies Invitrogen 18080044
    AA-dUTP Life technologies Invitrogen AM8439
    DDT Life technologies Invitrogen 18080044
    First Strand buffer Life technologies Invitrogen 18080044
    NaOH SigmaAldrich S8045-1KG
    HEPES SigmaAldrich H4034-500G
    DyLight-550 Thermoscientiffic 62262
    DyLight-650 Thermoscientiffic 62265
    SHY Buffer SigmaAldrich H7033-125ML
    Speedvac cooler Eppendorf RUGNE3140 Speedvac concentrator plus
    Hybridization oven Grant Boekel Iso-20
    Lifter-slips Erie Scientific 25x60I-M-5439
    Wipe KIMTECH
    SDS SigmaAldrich L3771-100g
    SSC SigmaAldrich W302600-1KG-K
    Genpix autoloader 4200A1 MSD analytical technologies Microarray scanner
    Sodium bicarbonate SigmaAldrich 104766

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
    2. Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
    3. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
    4. Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
    5. Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
    6. Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
    7. Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
    8. Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
    9. Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
    10. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
    11. Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
    12. Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
    13. Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
    14. Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
    15. Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
    16. Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
    17. Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
    18. Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
    19. Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
    20. De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
    21. Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
    22. Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).

    Tags

    Molecular Biology DNA microarrays genekspression transcriptomics bioinformatik dataanalyse pneumokokker L-serin
    En hurtig og pålidelig Pipeline for bakteriel Transkriptomet Analyse Case study: Serin-afhængig genregulering i<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Afzal, M., Manzoor, I., Kuipers, O.More

    Afzal, M., Manzoor, I., Kuipers, O. P. A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (98), e52649, doi:10.3791/52649 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter