Abstract
ביטוי גנים והרגולציה שלה הם מאוד חשובים להבין את התנהגותם של תאים בתנאים שונים. טכניקות שונות משמשות כיום ללמוד ביטוי גנים, אך רובם מוגבלים במונחים של מתן תמונה כוללת של הביטוי לכל transcriptome. מערכי DNA מציעים טכנולוגית מחקר מהירה וכלכלית, אשר נותנת סקירה מלאה של ביטוי גנים הגלובלי ויש להם מספר עצום של יישומים, כולל זיהוי של גנים חדשים וגורם שעתוק מחייבים אתרים, אפיון של פעילות תעתיק של התאים וגם לעזור בניתוח אלפים של גנים (בניסוי יחיד). במחקר הנוכחי, את התנאים לניתוח transcriptome חיידקים מקציר תא לניתוח מערך DNA כבר מותאמים. אם ניקח בחשבון את הזמן, עלויות ודיוק של הניסויים, פלטפורמה טכנולוגית זו מוכיחה להיות שימושי מאוד ואוניברסלי applicabale ללימוד transcripto חיידקיםmes. כאן, אנו מבצעים ניתוח מערך DNA עם pneumoniae Streptococcus כמקרה מבחן-ידי השוואת תגובות תעתיק של ס ' pneumoniae גדל בנוכחות ריכוזים שונים L-סרין במדיום. RNA סה"כ היה מבודד באמצעות שיטת Macaloid באמצעות ערכת בידוד RNA והאיכות של RNA נבדק על ידי שימוש בערכת בדיקת איכות RNA. cDNA הוכן באמצעות transcriptase ההפוך ודגימות cDNA תויגו באמצעות אחת משני צבעי ניאון אמין-reactive. שקופיות מערך DNA תוצרת בית שמשו לכלאה של דגימות cDNA המסומנים ונתונים microarray נותחו באמצעות מסגרת עיבוד מראש נתונים microarray cDNA (Microprep). לבסוף, Cyber-T שימש כדי לנתח את הנתונים שנוצרו באמצעות Microprep לזיהוי גנים הביעו באופן דיפרנציאלי משמעותיים מבחינה סטטיסטית. חבילות תוכנה כמו כן, נבנו בבית (פלפל, FIVA, לחשוף, התובע, Genome2D) שמשו כדי לנתחנתונים.
Introduction
המחקר של המערך השלם של mRNA שפע (transcriptome) מקודד על ידי הגנום של האורגניזם חד-תאי או תא האיקריוטים בזמן מסוים או במצב מסוים, ובכלל זה ביטוי יתר של גן או נוק-אאוט, נקרא transcriptomics. Transcriptomics מאפשר לנו להתבונן למה גני המידה באים לידי ביטוי במצב מסוים בנקודת זמן X ונותן לנו מידע על כמה חזק גנים באים לידי ביטוי ביחס להתייחסות.
Microarray הוא מערך דו-ממדי על מצע מוצק (בדרך כלל שקופיות זכוכית או תא סרט דק סיליקון) שיכול לשמש לassay כמויות גדולות של חומר ביולוגי באמצעות הקרנת תפוקה גבוהה, וממוזער, עיבוד מרובב ומקביל וזיהוי שיטות. Microarrays בא בסוגים שונים, כולל DNA-microarrays, microarrays חלבון, microarrays פפטיד, microarrays רקמות, microarrays נוגדן, microarrays הסלולרי ואחרים. מערך DNA הואבעצם הרכבה של כתמים מיקרוסקופיים DNA קבוע למשטח מוצק, בדרך כלל זכוכית. מערכי DNA משמשים למדידת רמות הביטוי של גן או קבוצת גנים בו זמנית או לגנוטיפ אזורים מרובים של הגנום 2,3. Picomoles (10 -12 שומות) של חללית נמצא בתוך כל מקום DNA שמייצג רצף DNA ספציפי, הידוע גם בכתב. מולקולות mRNA שכותרתו מהדגימות נקראות 'יעדים'. Fluorophores משמשות למדידת הכלאת בדיקה-יעד וזיהוי של מטרות שכותרתו fluorophore קובע את השפע היחסי של רצפי חומצות גרעין ביעד. ניסוי microarray יכול להשיג בדיקות גנטיות מרובות במקביל כי מערך עשוי להכיל עשרות אלפי בדיקות. הפריסה של ניסוי microarray פשוט מוצגת באיור 1. לאחרונה, הוקם במעבדות האחרות שלנו ושהמערכים אלה הם לשימוש חוזר, מה שהופך את עלות effectiv די בטכניקה זודואר.
טכניקות בידוד RNA וטיהור שונות פותחו לאורך השנים כולל C-TAB, SDS ושיטות GT 4-8. יתר על כן, כמה ערכות מסחריות זמינות גם. לביטוי גני RNA באיכות גבוהה הוא חשוב מאוד. לכן, שיטות בידוד RNA הן שונה כדי לקבל כמות המרבית של RNA. באופן דומה, הצעדים להכנת cDNA וסימון של cDNA הם מזעריים. נורמליזציה של נתונים לאחר הסריקה מבוצעת גם ביעילות על ידי שימוש בחבילות תוכנה ב- בית שנבנה וכלים 9.
pneumoniae Streptococcus הוא הפתוגן אנושי גרם-חיובי שcolonizes לוע האף והוא הגורם לזיהומים רבים כגון דלקת ריאות, אלח דם, דלקת אוזן תיכונה ודלקת קרום המוח 10. החיידק יכול לנצל את מגוון רחב של החומרים המזינים הדרושים לצמיחה והישרדות 11,12. מספר המחקרים בוצעו עלחילוף חומרים דלקת ריאות חנקן ורגולציה המדגישים את החשיבות של חומצות אמינו ותפקידם בארסיות 13,14. במחקר זה, תגובת transcriptomic של ס ' pneumoniae לשינוי ריכוזים של L-סרין, חומצת אמינו בשפע קיים בפלזמת הדם האנושית, הוא דיווח באמצעות מערכי DNA. תגובת transcriptomic של ס ' pneumoniae גדל בריכוז מינימאלי של L-סרין (150 מיקרומטר) הושווה שלגדל בריכוז מרבי (10 מ"מ) של סרין. בינוני הגדרה כימית (CDM או בינוני מינימאלי) 15 שימש למחקר זה כדי לשלוט בריכוז של סרין. המוקד של מחקר זה הוא להפוך ידידותי למשתמש בטכניקה זו ולספק כלים שונים לנורמליזציה נתונים וניתוח. לכן, מספר הכלים שפותחו לצורך הניתוח ופרשנות הנתונים. FIVA (מידע Viewer פונקציונלי וAnalyzer) מספק פלטפורמה לעיבוד המידע הכלול באשכולות של גנים שישדפוסים דומים ביטוי גנים ולבניית פרופילים תפקודיים 16. התובע הוא חבילת תוכנה אחרת המאפשרת זיהוי של פונקציות והסברים של גנים 17 משוערים. על ידי עשיית שימוש של שיטות קיבוץ באשכולות, לחשוף מספק אלגוריתם זיהוי אתר הקישור DNA. המוטיבים רגולטורית הסיס של גנים יכולים להיות מוקרנים באמצעות אלגוריתם זה 18. Genome2D מציע פלטפורמה מבוססת Windows להדמיה וניתוח של נתונים transcriptome על ידי הצעת טווחי צבע שונים כדי לאפיין את השינויים ברמות ביטוי גנים על מפת הגנום 19. שרת האינטרנט של הפלפל מציע, בנוסף לשיטת ניתוח all-in-one, ארגז כלים לכרייה לregulons, יזמים וגורם שעתוק מחייב אתרים 20. ביאור מלא של אזורים חוץ-בגנום של חיידקים יכול להיות מושגת על ידי שימוש בחבילה זו. ביולוגים יכולים להפיק תועלת רבה מפלפל כפי שהוא מציע להם במה לעיצוב ניסויs כך שהמידע המשוער ניתן לאשר במבחנה 20. חבילות תוכנה אלה תורמים באופן משמעותי לניתוח microarray כמו רובם זמינים באופן חופשי ולעשות נורמליזציה נתונים וניתוח אמינה מאוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדיה, ותרבית תאים
- לגדול S. זן pneumoniae D39 wild-type 21 כפי שתואר לעיל 11. לחסן תאים מאוחסנים ב -80 o C בגליצרול 10% (עם יחס 1/100 בצינורות 50 מיליליטר סטרילי) ב 50 מיליליטר כימי מוגדר בינוני (CDM) עם pH סופי של 6.4 15, אבל להשמיט L-סרין מחומצת אמינו תערובת.
הערה: שני CDMS שונה שימש; אחד המכיל ריכוז מינימאלי של L-סרין (150 מיקרומטר) ואחר המכיל ריכוז מרבי של L-סרין (10 מ"מ). ריכוז מינימאלי זה בעצם הריכוז של L-סרין בפלזמת דם אדם והמטרה היא להשוות את ביטוי הגנים של ס ' זן D39 pneumoniae תחת שני תנאים אלה.
2. בידוד של RNA סה"כ
- חומרים
- השתמש בפנול חומצה, כיתה RNA לבידוד של רנ"א הכל.
- Macaloid:
- להשעות 2 גרםmacaloid ב100 מיליליטר TE ולהרתיח במשך 5 דקות. מגניב RT וsonicate עד gels.Centrifuge macaloid הפתרון ב2,000 × גרם במשך 5 דקות בRT, resuspend ב 50 מיליליטר TE pH 8 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
- פתרונות:
- פנק את כל הפתרונות עם pyrocarbonate diethyl (DEPC). הוספת 100 DEPC μl / 100 מיליליטר פתרון, דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס וחיטוי במשך 15 דקות.
- מתודולוגיה
- לגדול 50 מיליליטר של ס ' תרבות pneumoniae D39 תא בצינורות 50 מיליליטר ב 37 o C (לא רועד) עד שלב אמצע מעריכי (OD ~ 0.3). תרבויות צנטריפוגות ב 4 ° C על 10,000 × גרם במשך 2 דקות. בטל תקשורת ולהקפיא באופן מיידי את כדורי התא בחנקן נוזלי.
- כלורופורם Premix 300 μl: רשות העתיקות (24: 1) ו- 300 פנול μl (פנול חומצה, הכיתה RNA). השתמש 500 μl של השלב האורגני בשלב 2.2.3.
- מכין את התערובת הבאה מראש בצינורות הברגה כובע ללא RNA: 0.5 חרוזי זכוכית גרם, 50 μl 10% SDS, 500 פנול μl / כלורופורם: רשות העתיקות (כפי שהוכן בשלב 2.2.2), שכבת macaloid (150-175 μl, לא מדויק כפי שהוא צמיג מאוד). Resuspend את כדורי תא ב400 μl TE (DEPC) ולהוסיף תאי resuspended לתוך צינורות הברגה הכובע.
- כדי לשבור את התאים, למקם את צינורות בורג יתר במקצף חרוז פולסים 2x 60 "('Homogenize') עם מרווח 1 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות עבור 10 דקות ב g 10,000 × (4 מעלות צלזיוס).
- מעביר את השלב העליון לצינור טרי, להוסיף 500 כלורופורם μl: רשות העתיקות (24: 1) וצנטריפוגות במשך 5 דקות בg 10,000 × (4 ° C).
- העבר את 500 μl של השלב העליון לצינורות טריים, להוסיף 2 כרכים (1 מיליליטר) של תמוגה / מאגר מחייב ומערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. לבודד RNA הכולל שימוש בערכת בידוד RNA ובצע את יצרן פרוטוקול מומלץ.
ניקוי 3. RNA
< ol>4. ניתוח של RNA
- קבע את הריכוז של RNA בספקטרופוטומטר. לקבוע את האיכות של RNA באמצעות assay כדלקמן (איור 2).
- לדלל 1 μl של מדגם עם 50 μl מים DEPC כדי לקבל ריכוז של 20-200 ng / μl.
- השתמש במדגם RNA המדולל μl 1 כדי לבדוק את האיכות על Bioanalyser לפי הוראות היצרן.
- הערה: יחס של 23S: 16S של כ 2.0 נחשב טוב RNA יחידת A260 1 מתאים עד 40 מיקרוגרם / מיליליטר.. כמות מומלצת לתיוג היא 10-20 מיקרוגרם.
5. cDNA הכנה ותוויות
ntent "> הערה: הפרוטוקול הבא אחרי להכנת cDNA ותיוג.- רִכּוּך
- בצע תגובת חישול ב300 צינורות PCR μl, שמירה על הריכוז בסך הכל RNA 10-15 מיקרוגרם לשקופיות תוצרת בית או 5 מיקרוגרם לשקופיות מתוצרת חברה. מערבבים RNA עם 2 nonamers μl אקראי (1.6 מיקרוגרם / μl) ולהוסיף מים nuclease חינם במידת צורך כדי לשמור על הנפח הסופי של תערובת חישול עד 18 μl.
- שמור את תערובת חישול ב 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אחרי זה, להתקרר לתערובת RT במשך 10 דקות (חישול) ובמידת הצורך, לסובב את התגובות לחלק התחתון של הצינור. מניחים את צינורות תגובה על קרח דק 'לפחות 1.
- שעתוק לאחור
- מכין את תערובת transcriptase ההפוכה כדלקמן: לתערובת חישול 18 μl, להוסיף 12 תמהיל μl מאסטר (בהיקף של 6 μl חיץ 5x הראשון סטרנד, 3 μl 0.1 M DDT, 1.2 μl 25x AA-dUTP / תערובת נוקלאוטיד ו -1.8 μl להפוך transcriptase (μl 1 לשקופיות מתוצרת חברה). שמור את תערובת התגובה ל2-16 שעות על 42 מעלות צלזיוס.
6. השפלה של mRNA וטיהור של cDNA
- להשפיל mRNA מתערובת התגובה, להוסיף 3 μl של 2.5 M NaOH ומקום על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על. בהמשך לכך, להוסיף 15 μl של 2M HEPES חומצה חופשית כדי לנטרל את NaOH.
- לטהר את תערובת cDNA באמצעות עמודות לנקות PCR ועיקבו אחרי הפרוטוקול של היצרן.
7. מדידת ריכוז cDNA
- למדוד ריכוזי cDNA בספקטרופוטומטר. כדי להמשיך בתיוג, לבדוק שהריכוז של cDNA הוא לפחות 60 ng / μl (שקופיות תוצרת בית) או 20 ng / μl (שקופיות מתוצרת חברה).
8. תוויות של cDNA עם אמין-reactive דיי וטיהור
- השתמש בצבע אמין-reactive לתייג cDNA. ישירות לערבב cDNA עם aliquot אחד (5 μl) שלאמין-reactive צבע.
- דגירה את התערובת על RT, בחושך, 60 עד 90 דקות ולהמשיך ישירות לטיהור cDNA שכותרתו צבע. לטהר cDNA שכותרתו צבע על ידי שימוש בעמודות לנקות PCR והבא הפרוטוקול של היצרן. Elute cDNA ב -50 μl של חיץ elution.
9. מדידה של Labelled cDNA
- השתמש ספקטרופוטומטר למדוד את השילוב של צבעים האמינים-reactive לcDNA. בדוק שהריכוז של צבעים האמינים-reactive הוא לפחות 0.5 pmol / μl בהיקף כולל של 50 μl.
10. ערבוב של דוגמאות Labelled cDNA
- לשקופיות תוצרת בית, להשתמש בכל cDNA המסומן להכלאה עם הבדל לא יותר מ -30% בריכוז cDNA. לשקופיות מתוצרת חברה, להשתמש cDNA עם לא יותר מהבדל של פי 2 בריכוז cDNA.
הערה: בדרך כלל, כ -300 ng של cDNA נחוץ לשקופיות מתוצרת חברה, שהוא קטן מאוד בהשוואה לrequired סכום של cDNA לשקופיות תוצרת בית.
11. הכלאה וכביסה
- השתמש בחומרים כימיים הבאים: המים demi, אתנול 99%, הצפת SHY (תוצרת בית; עם השמרים RNA 40 μl). הכן 1 מיליליטר מרבי של SHY.
- הכנת מכשירים ופתרונות
- לעבור על ריכוז ואקום ושעה לפחות 1 מחמם לפני הייבוש. לעבור על תנור הכלאה, עם נקודת סט המותאמת לטמפרטורת הכלאה הנכונה (למערכי DNA S. pneumoniae, להשתמש 45 ° C). באופן דומה, מחממים קלטת הכלאה ותנור במשך 30-60 דקות.
- מחממים חיץ SHY 68 צלזיוס למשך לפחות 30 דקות.
- לדוגמא הכנה (שכותרתו cDNA)
- לשלב כמויות שווה של cDNAs שכותרתו (הבדל של 30% לכל היותר). ייבש את הדגימה באמצעות ריכוז האבק בטמפ 'הגבוה (כ. 40 דקות) עד הנפח קטן מ -7 μl.
- מרים החלקה
- השתמש מרים-התלושים נקיים.הערה: ± ניתן לטעון 30 μl בשקופית.
- נקה את המרים-התלושים עם סבון, שפע של מים ברז ו 100% אתנול. הערה: תלושי מרים Dirty לתת רקע גבוה.
- אוויר יבש מרים-התלושים עם אקדח אוויר ללפוצץ חלקיקי אבק. הנח מרים החלקה נקייה בשקופית עם בטנת הטפלון הלבנה בצדדים כלפי מטה.
- הוספת מאגר הכלאה (לcDNA המסומן)
- ממיסים את דגימות צבע המיובשים ב -7 μl H 2 O ולדגור על 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- מייד, להוסיף 35 μl חיץ שחומם מראש SHY (68 ° C), מערבב בעדינות וספין במהירות המרבית דקות 1 להיפטר ממשקעים. מחממים את החללית על 68 צלזיוס למשך כ 5 דקות עד שטעינה.
- Slide-מרים החלקה הרכבה וחימום מוקדם.
- הנח את מחזיק שקופיות הכלאה על חום-בלוק בגיל 50 ג. הנח שקופיות מערך DNA עם מרים החלקה על מחזיק שקופיות הכלאה המחומם וpלחמם את השקופית עם מרים החלקה לרגע. בצע את השלבים הבאים מהר ככל האפשר.
- הוסף 40 μl של יעד המדגם לסוף השקופית. לאפשר לנוזל לזרום בין משטחי הזכוכית בכוח נימים. לבצע את כל pipetting לאט ובזהירות.
- שמור את השקופיות עם אופקי מרים החלקה בכל העת ולנוע באיטיות כדי לוודא שמרים החלקה לא זזה.
- קח את קלטת ההכלאה מראש חימם מהתנור ההכלאה ולסגור את המכונה. מסנן נייר מקום ספוג עם 3 מיליליטר 2x SSC (ציטראט מלוח הסטנדרטי) בקלטת ההכלאה.
- מניח בעדינות את מחזיק שקופיות הכלאה עם מגלשות בקלטת ההכלאה. סגור את קלטת ההכלאה ולשים בתנור ההכלאה שוב (כ 16-18 שעות).
- שטיפת שקופיות
- הכן לשטוף מאגרים טריים I, II ו- III (750 מ"ל לכל שלב לשטוף). עבור 500 מיליליטר לשטוף חיץ אני, להשתמש 2 x SSC / 0.5% SDS. ל500 מ"ל לשטוף-חובבאה השני, להשתמש 1 x SSC / 0.25% SDS. עבור 500 מיליליטר לשטוף חיץ III, להשתמש 1 x SSC / 0.1% SDS (אופציונאלי)
- מניחים את השטיפה-המאגרים ליום 30 במעלות צלזיוס (כדי להיות בטוח SDS נמס).
- להטביע את השקופיות מהר ככל האפשר, אבל בעדינות רבה, בצינור בז מלא 50 מיליליטר לשטוף חיץ אני עד הזכוכית מונחת על תחתית חרוטי של הצינור.
- אחרי כמה שניות, כאשר כיורים מרים החלקה לחלק התחתון של הצינור, להוציא את השקופית עם פינצטה מבלי לשרוט את המערך ולשים במעמד של תחנת השטיפה. המשך עם הכביסה ללא פער זמן.
- שטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב500 מ"ל לשטוף חיץ אני (בתחנת שטיפה). נותן לו לשטוף את השני במשך 20-30 דקות ב500 מ"ל לשטוף חיץ השני (בתחנת שטיפה). באופן דומה, לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות ב500 מ"ל לשטוף חיץ III (אופציונאלי) (בתחנת שטיפה).
- ייבש את השקופיות 2 דקות ב2,000 סל"ד.
12. Microarray ניתוח
- סריקת תמונותעם אורכי גל המתאימים בסורק ולשמור בתיקייה "יופיטר פרויקט".
- השתמש בתוכנה כדי לנתח את הקבצים הסרוקים בתחילה כפי שתואר לעיל 22. לאחר הפעלת תוכנה זו, בחר בכרטיסייה "פתחה תמונה" כדי לטעון את קובץ תמונה האדומה (-.550) כמו "אדום" וקובץ תמונה ירוק (-.635) כ "ירוק". להעלות את קובץ גל (.gal) יש רשימת מערך S. pneumoniae בקובץ תמונה על ידי בחירה "רשימת מערך טעינה" כרטיסייה 22.
הערה: רשימה זו כללה מערך של 48 רשתות, בכל רשת היו 16 שורות ועמודות 15. כל נקודה על הרשת מייצגת גן יחיד ומידע נקודה כולל את שם גן מוסף באמצעות קובץ נקודת תיאור. מקבלים משמאל מספרי הנקודה לימין ומלמעלה למטה. - אחרי שהבחין בזהירות את הרשתות, הכרטיסייה בחר "מצא את המערך, מצא בלוקים, יישר תכונות" כדי ליישר את הכתמים. לאחר יישור כל התכונות, לנתח את התמונה על ידי בחירת t "ניתוח"ab. צור קובץ חדש שיש תוצאות, היסטוגרמה ועלילת פיזור. שמור קובץ זה מכרטיסייה "תוצאות שמור בשם" כקובץ .gpr לניתוח נוסף.
- לבצע נורמליזציה ועיבוד של נתונים נוספים עם חבילת תוכנת Microprep פותחה ב-בית כמתואר 9.
- השתמש משכפל ביולוגי עצמאי לנתוני מערך DNA שהם החליפו-צבע. לבצע יישום CyberT של גרסה של t-test1 ולחשב שיעורי שווא גילוי (FDRs) כפי שתוארו 9.
- לגנים הביעו באופן דיפרנציאלי, לקחת p <0.001 וFDR <0.05 כסטנדרט.
- העלה נתונים מערך DNA בעמוד הגשת צמח השדה כדי לקבל מספר GEO (אומניבוס ביטוי גנים) הצטרפות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA, בידודי cDNA וניתוח
L-סרין הוא אחד מחומצות אמינו החיוניות וריכוזו בפלזמת דם אדם משתנה 60-150 מיקרומטר בילדים ומבוגרים. תפקידה בביוסינתזה של purines וpyrimidines מדגיש את חשיבותה בחילוף חומרים והוא מבשר על כמה חומצות אמינו (גליצין, ציסטאין וטריפטופן). כדי לחקור את ההשפעה של L-סרין על כל transcriptome של ס ' זן פראי סוג pneumoniae D39, ניתוח microarray של זן D39 גדל בCDM עם ריכוז מינימאלי (150 מיקרומטר) של L-סרין נגד שגדל בריכוז מרבי (10 מ"מ) באותו המדיום בוצע. קודם כל, RNA הכולל מהתאים שגודלו תחת שני הריכוזים היה מבודד. הריכוזים של דגימות RNA מוצגים בטבלת 1. האיכות של רנ"א הכל נבדקה באמצעות assay בדיקת איכות. טופל RNA עם DNase אני לפני הביצוע הזהassay כדי להסיר את הדנ"א הגנומי האפשרי איור 2 מראה את האיכות של RNA.; L נתיב מייצג את הסולם, מסלולי 1 ו -2 מייצגים RNA מסרין 150μM ומסלולי 3 ו -4 מייצגים RNA מ -10 סרין מ"מ. נוכחותם של שתי להקות ברורות המתאימות לשתי תת-יחידות RNA הצביעה על איכות טובה של RNA ויכול להתבצע השלב הבא של הניסוי.
לאחר מדידת האיכות של RNA, cDNA הסינתזה נעשתה. cDNA נוצר על ידי השימוש בnanomers אקראי ואנזים reverse transcriptase. הריכוזים של דגימות cDNA מוצגים בטבלת 1. CDNA זה שכותרתו עם צבעים האמינים-reactive והריכוזים של cDNA המסומן ותוויות צבע מוצגים בטבלה 1. לאחר תיוג, דגימות היו מעורבות בהתאם, ואז הכלאה. לאחר כביסה, שקופיות נסרקו באמצעות הסורק, וניתוח בוצע באמצעות תוכנת Pro Gene Pix. איור 3 מציגה את הפיזורניתוח עלילה של יחס צבעים האמין-reactive. לאחר ניתוח ראשוני, הנתונים נותחו נוסף באמצעות חבילת תוכנת PicroPrep (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 כדי להפחית את הרעש וCyber-T שימש לניתוח סופי. טבלה 2 מסכמת את התוצאות של מחקרי microarray לאחר החלת הקריטריונים של ≥ 2.0 לקפל הבדל ו-value p <0.001. מספר גנים באו לידי הביטוי באופן דיפרנציאלי בנוכחות L-סרין המינימאלי בהשוואה למקסימום (הטבלה 2).
איור 1. סקירה כללית של מערך DNA טכנולוגיה. RNA מבודד מהשליטה ודגימות היעד וכותרתו cDNA הוא הכלאה ואז.
איור 2. בדיקת איכות של RNA מבודד מS. תאי D39 pneumoniae גדלו בנוכחות מינימאלית (150 מיקרומטר) ומקסימום (10 מ"מ) ריכוזי סרין. L ליין מייצג את הגודל-הסולם ואילו מסלול 1 ו -2 מייצגים דגימות RNA מבודדות מהתאים שגודלו בנוכחות ריכוז סרין מינימום. באופן דומה, מסלול 3 ו -4 מייצגים דגימות RNA מבודדות מהתאים שגודלו בנוכחות ריכוז סרין המרבי. הלהקות מייצגות את 23S ו16S rRNA. הנוכחות של רק שתי להקות מראה כי אין זיהום gDNA ו- RNA הוא באיכות טובה.
עלילת איור 3. מערך פיזור השוואה של תערובת מדגם. כל נקודה בעלילה מייצגת את הערך מתכוון ביטוי (log2) של גן בניסוי עם צבע 1 על ציר y וצבע 2 על ציר x.
| לדוגמא | לדוגמא RNA | תיאור | ריכוז RNA (ng / μl) | ריכוז cDNA (ng / μl) | cDNA מדביק לו תווית (ng / μl) | DyLight-550 (pmol / μl) | DyLight-650 (pmol / μl) | תכנית הכלאה |
| S1 | R1 | wild-type D39 גדל בCDM + מזערי L-סרין | 2,057 | 255 | 225 | 0.8 | R1 + R3 | |
| R2 | wild-type D39 גדל בCDM + מזערי L-סרין | 2,566 | 201 | 179 | 1.2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | D39 wild-type גדל בCDM + L-סרין המרבי | 2,831 | 292 | 276 | 2.3 | ||
| R4 | D39 wild-type גדל בCDM + מקסמרב L-סרין | 1,867 | 172 | 150 | 1 |
טבלת 1. תכנית הכלאה של הדגימות המשמשות בניתוח microarray.
| גן | פונקציה ב | יחס ג | |||
| SPD0600 | DivIB חלבון חלוקת תא | 4 | |||
| SPD0445 | kinase Phosphoglycerate | 3.5 | |||
| SPD0646 | חלבון היפותטי | 3.4 | |||
| SPD0873 | חלבון היפותטי | 3.3 | |||
| SPD1223 | חלבון היפותטי | 3.3 | |||
| SPD0980 | pyrophosphokinase ריבוז-פוספט 2.8 | ||||
| SPD1628 | phosphoribosyltransferase Xanthine | 2.7 | |||
| SPD1011 | kinase Glycerate | 2.4 | |||
| SPD0645 | חלבון היפותטי | 2.3 | |||
| SPD0564 | חלבון היפותטי | 2.2 | |||
| SPD0641 | מנוז-6-פוספט איזומראז, אני כיתה, מאנה | 2.1 | |||
| SPD1333 | חלבון היפותטי | 2.1 | |||
| SPD1384 | חלבון משפחה בזרימת קטיון | 2.1 | |||
| SPD1432 | UDP גלוקוז 4 epimerase-, גייל-1 | 2.1 | |||
| SPD1866 | N-acetylglucosamine-6-פוספט deacetylase, נאגה | 2.1 | SPD0104 | חלבון תחום LysM | 2 |
| SPD0140 | טרנספורטר ABC, חלבון ATP מחייב | 2 | |||
| SPD0261 | Aminopeptidase C, PepC | 2 | |||
| SPD1350 | חלבון היפותטי | 2 | |||
| SPD1822 | synthase pseudouridine מקטע גדול ריבוזומלי, חלבון תת משפחת RluD | 2 | |||
| SPD0453 | מערכת הגבלה-שינוי הסוג I, מקטע S | -2 | |||
| SPD0459 | GrpE חלבון הלם חום | -2 | |||
| SPD1006 | adenylyltransferase גלוקוז-1-פוספט | -2 | |||
| SPD1799 | kinase היסטידין חיישן, המשוערת | -2.1 | </ Tr>|||
| SPD0387 | (Acyl-ספק-חלבון) Beta-hydroxyacyl- dehydratase FabZ | -2.2 | |||
| SPD1494 | טרנספורטר הסוכר ABC, חלבון permease | -2.2 | |||
| SPD0974 | amidotransferase גלוטמין אני בכיתה, המשוערת | -2.4 | |||
| SPD1600 | phosphoribosyltransferase Anthranilate | -2.5 | |||
| SPD1472 | synthetase Isoleucyl-tRNA | -2.6 | |||
| SPD0681 | חלבון היפותטי | -2.7 | |||
| SPD0501 | antiterminator תמלול, Lict | -3.4 |
רשימת טבלה 2. גנים מוסדרים בהשוואת transcriptome של ס ' D39 זן pneumoniae wild-type גדל בCD15 M עם ריכוז מינימאלי של L-סרין ו -15 CDM עם ריכוז מרבי של L-סרין. מספרי ג'ין מתייחס לתגי לוקוס D39. ביאור D39 b / TIGR4 ביאור 21. יחס ג מייצג את הגידול / קיטון של פי הביטוי של גנים בCDM-מרבי בהשוואה לCDM-מינימום (סימן מינוס מצביע downregulation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים פרוטוקול ידידותי למשתמש שניתן ליישם כדי לבצע ניתוח transcriptome שלם של חיידקים. נקודת המפתח על הטכניקה המסוימת הזה היא שהמצב לפיו התאים נקצרים ישתנה. לאחר קצירת תאי הבידוד ו- RNA, טכניקה זו הופכת להיות שווה לכל סוגי דגימות חיידקים ופועלת בהתאם לשלבים זהים לחלוטין ולכן, יכולה להיות מיושמת על כל סוג של תרבות חיידקים. הפרוטוקול הוא מאוד פשוט ונוח ומתחיל מבידוד RNA. פרוטוקול בידוד RNA שלנו (באמצעות Macaloid וערכת בידוד RNA) הוא זמן יעיל בהשוואה לפנול, כלורופורם קונבנציונלי ושיטות Trizol. בשלב הבא, הכנת cDNA עם transcriptase III אנזים מתבצעת. בשלב הבא, תיוג של cDNA נעשה על ידי הערבוב הראשון של cDNA עם צבעים האמינים-reactive, ולאחר מכן לטהר את cDNA המסומן. התיוג הוא גם פשוט ולא לוקח הרבה זמן כמו הדגימות צריכה להיות טופחו במשך כ 1שעה בחושך. ניתן לבצע את כל הפעולות הבאות בכל מעבדה סטנדרטית כפי שהוא אינו דורש שום ציוד מיוחד. יש צורך בסורק microarray כדי לסרוק שקופיות. לסריקת שקופיות וניתוח, משמשת תכנית Pro GenePix, שהיא תכנית מאוד פשוטה וידידותי למשתמש 22.
אחרי שעשיתי את כל הניסויים, ניתוח בוצע באמצעות MicroPrep וCyberT. חבילת MicroPrep, מורכבת משלושה מודולים, כלומר, PrePreP, הכנה ו -9 PostPreP. מסגרת לעיבוד נתונים מראש זו מפחיתה את הזמן לנורמליזציה של נתונים וגם מפחיתה את כמות הנתונים שהושלכו. הקלות שבה ניתן להשתמש בתוכנה מאפשרת לחוקר שיש הבנה של נתוני מערך DNA במינימום הזמן. זה לוקח רק כמה דקות כדי להמיר את הנתונים הגולמיים לאות נתונים באיכות גבוהה לעיבוד נוסף לאחר ניתוח תמונת השקופיות נעשה. ניתוח נוסף בברכה של גנים המוסדרים בmicroarray ניתן לעשות זאת באמצעות חבילות ב-הבית שונות תוכנה. הם כוללים 20 פלפל, FIVA 16, לחשוף 18, תובע 17 וGenome2D 19. כלים וחבילות תוכנה מבוססי Windows אלה הם ידידותי למשתמש ולספק תובנות עמוקות לתוך נתונים במהלך חקירה נוספת. חבילות תוכנה אלה הופכים אותה מאוד קלים ונוחים לחוקרים לנצל טכנולוגיה זו כנתונים הופך להיות הרבה יותר משמעותי ורלוונטי.
הצבעים בשימוש בmicroarrays ידועים להיות רגיש לאוזון-השפעה, שבו הצבעים להפוך לבלתי יציבים בנוכחות של אוזון ועוצמת אות הוא כל כך נמוך שזה לא יכול להיות מוכר על ידי הסורק. צבעים אמינים-reactive שהם פחות רגישים לאוזון-ההשפעה משמשים תווית cDNA. הפתרון לאוזון-השפעה יהיה להפוך את הטכנולוגיה הזו אפילו טובה יותר.
רשימה נוצרה מהגנים שהיו למעלה או downregulated בנוכחות L-ser המינימליריכוז ine לעומת המרבי (הטבלה 2). ניתן לסווג גנים שהוגברו על פי הפונקציה של המוצר שלהם. שבעה מהם מקודדים חלבונים היפותטיים, ארבעה מעורבים בהובלת פחמימות וחילוף חומרים, חלבון חלוקת תא DivIB, וגני תחבורת חומצת אמינו ואת חילוף חומרים מסוימים. בדומה לכך, יש גם גנים מסוימים הdownregulated במצב נבדק. LicT BglG-משפחת רגולטור תעתיק, גנים מסוימים של פחמימות וכמה גני חומצת אמינו ספציפי הם בין גני downregulated. GrpE חלבון חום-הלם הוא גם בין אלה למטה מוסדרים. לכן, מחקר זה מספק סקירה של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי בהתאם לתנאים שנבדקו מלאה. לאחר ניתוח התוצאות, לפעמים אימות של התוצאות היא הכרחית. זה יכול להיעשות גם על ידי qPCR או מבחני β-galactosidase באמצעות שילובי אמרגן lacZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים אן דה יונג וSiger Holsappel לעזרה עם הפקת שקופיות מערכי DNA. תמיכתה של אנה דה יונג לניתוח ביואינפורמטיקה גם מוערכת. אנו מודים גם Jelle Slager לבחינת הנייר. מוחמד אפזאל ואירפאן Manzoor נתמך על ידי אוניברסיטת GC, Faisalabad, פקיסטן במסגרת תכנית פיתוח סגל של HEC פקיסטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).
