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Biology

A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em Published: April 25, 2015 doi: 10.3791/52649

Abstract

A expressão gênica e de sua regulamentação são muito importantes para entender o comportamento das células sob condições diferentes. Várias técnicas são usadas hoje em dia para estudar a expressão do gene, mas a maioria são limitados em termos de proporcionar uma visão global da expressão de todo o transcriptoma. Microarranjos de DNA oferecem uma tecnologia de pesquisa rápida e econômica, o que dá uma visão completa da expressão gênica global e têm um vasto número de aplicações, incluindo a identificação de novos genes e fator de transcrição locais, caracterização da atividade transcricional das células e também de ligação ajudar na análise de milhares de genes (numa única experiência). No presente estudo, as condições para a análise do transcriptoma bacteriana desde a colheita de células para análise de DNA microarray foram otimizados. Levando-se em conta o tempo, custos e precisão dos experimentos, esta plataforma de tecnologia revela-se muito útil e universalmente applicabale para estudar transcripto bacterianames. Aqui, vamos realizar a análise de DNA microarray com Streptococcus pneumoniae como um caso de estudo comparando as respostas de transcrição de S. pneumoniae foram cultivados na presença de concentrações variáveis ​​de L-serina no meio. O ARN total foi isolado utilizando um método Macaloid usando um kit de isolamento de ARN e a qualidade do ARN foi verificada usando um kit de controlo de qualidade de ARN. O ADNc foi preparado utilizando transcriptase reversa e as amostras de ADNc foram marcados utilizando um dos dois corantes fluorescentes reactivos a aminas. Caseiros lâminas de microarranjos de DNA foram utilizados para a hibridização das amostras de cDNA marcadas e dados de microarranjos foram analisados ​​usando um quadro de pré-processamento de dados de cDNA microarray (Microprep). Finalmente, Cyber-T foi utilizado para analisar os dados gerados usando Microprep para a identificação de genes expressos diferencialmente estatisticamente significativas. Pacotes de software Além disso, em casa construídas (pimenta, FIVA, divulgar, PROCURADOR, Genome2D) foram utilizados para analisardados.

Introduction

O estudo de todo o conjunto de mRNA abundância (transcriptoma) codificadas pelo genoma de um organismo unicelular ou uma célula eucariótica em um momento específico ou sob uma condição específica, incluindo a superexpressão de genes ou knock-out, é chamado transcriptomics. Transcriptomics nos permite observar em que medida os genes são expressos sob uma condição particular em um ponto X tempo e nos dá informações sobre como fortemente os genes são expressas em relação a uma referência.

Uma micromatriz é uma matriz bidimensional em um substrato sólido (geralmente numa lâmina de vidro ou de silício de película fina de células) que podem ser utilizados para ensaiar grandes quantidades de material biológico utilizando rastreio de alto rendimento, e miniaturizado, de processamento e paralelo multiplexado e detecção métodos. Microarrays vêm em vários tipos, inclusive de DNA microarrays, microarrays de proteína, microarrays peptídicos, microarrays de tecidos, microarrays de anticorpos, microarrays celulares e outros. A DNA microarray ébasicamente, um conjunto de manchas de DNA microscópicos fixo a uma superfície sólida, geralmente de vidro. Microarranjos de DNA são usadas para medir os níveis de expressão de um gene ou um conjunto de genes simultaneamente ao genótipo ou várias regiões de um genoma de 2,3. Picomoles (10 -12 moles) de uma sonda estão presentes no interior de cada ponto de ADN que representa uma sequência de ADN específica, também conhecido como um repórter. As moléculas de mRNA rotulados das amostras são chamados «objectivos». Os fluoróforos são usados ​​para medir a hibridação sonda-alvo e detecção de alvos marcados com fluoróforo determina a abundância relativa de sequências de ácido nucleico no alvo. Um experimento de microarray pode realizar vários testes genéticos em paralelo, porque uma matriz pode conter dezenas de milhares de sondas. O layout de um experimento de microarray simples é mostrado na Figura 1. Recentemente, foi criada em nossas e de outros laboratórios que essas matrizes são reutilizáveis, o que torna esta técnica muito boa relação custo-effective.

Diferentes técnicas de isolamento e purificação de RNA foram desenvolvidos ao longo dos anos, incluindo C-TAB, SDS e métodos GT 4-8. Além disso, vários kits comerciais também estão disponíveis. Para a expressão do gene de ARN de alta qualidade é muito importante. Portanto, os métodos de isolamento de ARN são modificados para obter uma quantidade máxima de ARN. Da mesma forma, os passos para a preparação de ADNc e rotulagem de cDNA são minimizados. Normalização de dados após rastreamento também é feito de forma eficiente, utilizando-casa construída em pacotes de software e ferramentas 9.

O Streptococcus pneumoniae é um agente patogénico humano Gram-positiva que coloniza a nasofaringe e é a causa de infecções múltiplas, tais como pneumonia, sepsis e meningite otite média 10. A bactéria pode utilizar uma ampla variedade de nutrientes necessários para o crescimento e sobrevivência 11,12. Um número de estudos foram realizados sobre ometabolismo do nitrogênio pneumocócica e regulação enfatizando a importância de aminoácidos e seu papel na virulência 13,14. Neste estudo, a resposta do transcriptoma de S. pneumoniae para alterar as concentrações de L-serina, um aminoácido presente em abundância no plasma sanguíneo humano, é descrito, utilizando microarrays de ADN. A resposta do transcriptoma de S. pneumoniae crescida em uma concentração mínima de L-serina (150 uM) foi comparada com a cultivada em uma concentração máxima (10 mM) de serina. Meio quimicamente definido (CDM ou meio mínimo) 15 foi utilizado para este estudo para controlar a concentração de serina. O foco deste estudo é fazer com que esta técnica user-friendly e de fornecer ferramentas diferentes para a normalização e análise de dados. Assim, foram desenvolvidas uma série de ferramentas para análise e interpretação dos dados. FIVA (Functional Information Viewer e Analyzer) fornece uma plataforma para processamento de informações contidas nos conjuntos de genes que têmpadrões de expressão gênica semelhantes e para a construção de perfis funcionais 16. PROCURADOR é um outro pacote de software que facilita a identificação de funções putativas e anotações de genes 17. Ao fazer uso de métodos de agrupamento, DIVULGAR fornece um algoritmo de detecção de local de ligação DNA. Cis -regulatory motivos de genes pode ser projetada usando este algoritmo 18. Genome2D oferece uma plataforma baseada em Windows para visualização e análise de dados de transcriptoma, oferecendo diferentes gamas de cores para caracterizar as alterações nos níveis de expressão de genes em um mapa do genoma 19. O webserver Pepper oferece, além do método de tudo-em-uma análise, uma caixa de ferramentas para mineração para regulons, promotores e ligação do factor de transcrição locais 20. Anotação completa das regiões intergénicas num genoma bacteriano pode ser conseguida utilizando este pacote. Os biólogos podem se beneficiar muito de pimenta, pois oferece-lhes uma plataforma para a concepção de experiências de modo que a informação hipotética pode ser confirmada in vitro 20. Estes pacotes de software de contribuir de forma significativa para a análise de microarray como a maior parte deles estão livremente disponíveis e fazer a normalização de dados e análise muito fiável.

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Protocol

1. Preparação de Mídia e Cultura de Células

  1. Crescer S. pneumoniae D39 estirpe selvagem 21 como descrito anteriormente 11. Inocular células armazenadas a -80 ° C em glicerol a 10% (com razão de 1/100 em tubos de 50 ml estéreis) em 50 ml de meio definido quimicamente (CDM), com um pH final de 6,4 15, mas omitir L-serina a partir do aminoácido mistura.
    Nota: Foram utilizados dois diferentes MDL; uma contendo uma concentração mínima de L-serina (150 uM) e o outro contendo uma concentração máxima de L-serina (10 mM). Esta concentração mínima é, basicamente, a concentração de L-serina em plasma de sangue humano e o objectivo é comparar a expressão de genes de S. pneumoniae estirpe D39 sob estas duas condições.

2. Isolamento de ARN total

  1. Materiais
    1. Use fenol ácido, grau de ARN para o isolamento do ARN total.
    2. Macaloid:
      1. Suspender 2 gramas demacaloid em 100 ml de TE e ferver durante 5 min. Arrefecer até à TA e sonicado até macaloid gels.Centrifuge a solução a 2000 × g durante 5 min à temperatura ambiente, ressuspender em 50 ml de TE, pH 8 e armazenar a 4 ° C.
    3. Soluções:
      1. Trate todas as soluções com pyrocarbonate etílico (DEPC). Adicionar 100 ul DEPC / 100 ml de solução, incubar O / N a 37 ° C e à autoclavagem durante 15 minutos.
  2. Metodologia
    1. Cresça 50 ml de S. cultura de células pneumoniae D39 em tubos de 50 ml a 37 o C (sem agitação) até a fase mid-exponencial (OD ~ 0,3). Culturas de centrifugação a 4 ° C em 10.000 × g durante 2 min. Descarte de mídia e congelar imediatamente os sedimentos celulares em nitrogênio líquido.
    2. Pré-mistura de 300 ul de clorofórmio: IAA (24: 1) e 300 ul de fenol (fenol ácido, grau de ARN). Use 500 ul da fase orgânica no passo 2.2.3.
    3. Prepare a seguinte mistura de antecedência em tubos com tampa de rosca livre RNA: 00,5 g de esferas de vidro, 50 ul de SDS a 10%, 500 ul de fenol / clorofórmio: IAA (tal como preparado no passo 2.2.2), camada macaloid (150-175 uL, não exacto, uma vez que é muito viscoso). Ressuspender as peletes de células em 400 ul de TE (DEPC) e adicionar as células ressuspensas em tubos com tampa de rosca.
    4. Para quebrar as células, colocar os tubos com tampa de rosca em um batedor de talão para 2x 60 pulsos "(" homogeneizar ") com 1 min de intervalo no gelo. Centrifugar as amostras durante 10 min a 10.000 x g (4 ° C).
    5. Transferir a fase superior para um tubo fresco, adicionar 500 ul de clorofórmio: IAA (24: 1) e centrifuga-se durante 5 min a 10.000 x g (4 ° C).
    6. Transferir 500 mL da fase superior para tubos frescos, adicione 2 volumes (1 ml) de lise / tampão de ligação e misture por pipetagem cima e para baixo. Isolar o RNA total usando o kit de isolamento de ARN e a seguir o protocolo recomendado fabricante.

3. Limpeza de RNA

< ol>
  • Para remover a contaminação de ADN do ARN total, adiciona-se 100 ul mistura DNAseI (90 ul de tampão de ADNase e 10 ul DNAseI) e incubar durante 20-30 min a 15-25 ºC.
  • Lavar limpos RNA usando o kit de RNAse. Obter 50 ul de volume de eluído.
  • 4. Análise de ARN

    1. Determinar a concentração de ARN num espectrofotómetro. Determinar a qualidade do RNA usando um ensaio do seguinte modo (Figura 2).
      1. Dilui-se 1 ul de amostra com 50 ul de água com DEPC para obter uma concentração de 20-200 ng / mL.
      2. Use 1 ul da amostra de RNA diluída para verificar a qualidade do Bioanalyzer de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Nota: uma proporção de 23S: 16S de cerca de 2,0 é considerado bom unidade RNA 1 A260 corresponde a 40 ug / ml.. A quantidade recomendada para a rotulagem é de 10-20 mg.

    5. Preparação cDNA e Rotulagem

    ntent "> NOTA: O protocolo foi seguido o seguinte para a preparação de cDNA e rotulagem.

    1. Recozimento
      1. Execute reação recozimento em 300 tubos de PCR ul, mantendo a concentração de RNA total de 10-15 mg para slides caseiros ou 5 mg para slides feitos à empresa. Misturar ARN com 2 ul nonameros aleatórios (1,6 ug / ul) e adicionar água livre de nuclease, se necessário, para manter o volume final da mistura de emparelhamento a 18 ul.
      2. Manter a mistura de hibridização a 70 ° C durante 5 min. Depois disso, a mistura arrefecer até à temperatura ambiente durante 10 min (recozimento) e, se necessário, rodar para baixo as reacções para a parte inferior do tubo. Inserir os tubos de reacção em gelo durante pelo menos 1 min.
    2. Transcrição Reversa
      1. Preparar a mistura de transcriptase reversa da seguinte forma: a mistura de recozimento 18 mL, adicionar 12 mix ul Master (que consiste em 6 mL de buffer 5x First Strand, 3 ul 0,1 M DDT, 1,2 ul 25x-dUTP AA mix / nucleotídeos e 1,8 ul reverter transcriptase (1 ml para slides feitos à empresa). Manter a mistura de reacção durante 2-16 horas a 42 ° C.

    6. Degradação de ARNm e purificação de ADNc

    1. Para degradar o ARNm a partir da mistura de reacção, adicionar 3 mL de NaOH 2,5 M e lugar a 37 ° C durante cerca de 15 min. Seguidamente, adicionar 15 mL de 2M HEPES ácido livre para neutralizar o NaOH.
    2. Purifica-se a mistura de cDNA por PCR usando colunas de limpeza e seguir o protocolo do fabricante.

    7. Medição da Concentração de cDNA

    1. Medir as concentrações de cDNA em um espectrofotómetro. Para continuar com a rotulagem, verificar que a concentração de cDNA é de pelo menos 60 ng / mL (lâminas caseiros) ou 20 ng / mL (lâminas feitas pela empresa).

    8. Rotulagem de cDNA com Amine-reativa Dye e Purificação

    1. Use corante amino-reactivo para rotular o cDNA. Misturar diretamente o cDNA com uma alíquota (5 ul) deamina reactiva do corante.
    2. Incubar a mistura à temperatura ambiente, no escuro, durante 60 a 90 min e proceder directamente a purificação de ADNc marcado com corante. Purifica-se cDNA marcado com corante por PCR usando colunas de limpeza e seguindo o protocolo do fabricante. Elui-se ADNc em 50 ul de tampão de eluição.

    9. Medição de cDNA etiquetado

    1. Utilizar um espectrofotómetro para medir a incorporação de corantes reactivos com aminas para o cDNA. Verificar que a concentração de corantes reactivos a amina é de pelo menos 0,5 pmol / mL num volume total de 50 ul.

    10. homogeneização das amostras Labelled cDNA

    1. Para lâminas caseiros, use todo o cDNA marcado para hibridação com diferença não superior a 30% na concentração de cDNA. Para lâminas feitas pela empresa, use cDNA com não mais do que diferença de 2 vezes na concentração de cDNA.
      Nota: normalmente, é necessária cerca de 300 ng de cDNA para slides feitos à empresa, o que é muito pouco em comparação com o reqquantidade de cDNA uired para slides caseiros.

    11. A hibridação e de lavagem

    1. Use os seguintes reagentes: água desmineralizada, etanol 99%, Tímido tampão (caseiro; com levedura RNA 40 mL). Prepare máximo de 1 ml de tímido.
    2. Aparelhos e soluções de preparação
      1. Ligue concentradores de vácuo e aquecedor, pelo menos, 1 hora antes da secagem. Ligue forno de hibridização, com set point ajustado à temperatura de hibridização correta (por microarranjos de DNA de S. pneumoniae, use 45 ° C). Da mesma forma, o pré-aquecimento cassete hibridação e forno durante 30-60 minutos.
      2. Pré-aqueça tampão TÍMIDO a 68 C durante pelo menos 30 min.
    3. A preparação da amostra (cADN)
      1. Combine quantidades iguais de cDNAs marcados (max 30% de diferença). Seca-se a amostra utilizando os concentradores de vácuo a temperatura elevada (aprox. 40 min) até que o volume é menor do que 7 ul.
    4. Lifter-derrapante
      1. Use levantador deslizamentos limpas.Nota: ± 30 ul podem ser carregados sobre a lâmina.
      2. Limpe o levantador deslizamentos com sabão, a abundância de água da torneira e 100% de etanol. Nota: deslizamentos levantador sujos dar alta fundo.
      3. Air secar o levantador deslizamentos com pistola de ar para soprar as partículas de poeira. Coloque um elevador-derrapante limpo no slide com o revestimento de teflon branco nos lados virados para baixo.
    5. A adição de tampão de hibridação (em cDNA marcado)
      1. Dissolve-se as amostras de corantes secos em 7 ul de H2O e incubar a 94 ° C durante 2 min.
      2. Imediatamente, adicione 35 mL de tampão pré-aquecido TÍMIDO (68 ° C), misture delicadamente e girar a uma velocidade máxima de 1 min para se livrar de precipitados. Pré-aqueça a sonda a 68 C por aproximadamente 5 min até o carregamento.
    6. Deslize-levantador slip-montagem e pré-aquecimento.
      1. Coloque o suporte de hibridação de slides em um calor-block a 50 ° C. Colocar as lâminas de microarranjos de DNA com o levantador-slip on titular hibridação de slides aquecida e preaquecer o slide com levantador-derrapante para um minuto. Executar os seguintes passos tão rapidamente quanto possível.
      2. Adicionar 40 ul da amostra alvo com a extremidade da lâmina. Permita que o fluido flua entre as superfícies de vidro por força de capilaridade. Execute todas pipetagem devagar e com cuidado.
      3. Mantenha as lâminas com levantador-slip horizontal em todos os momentos e mover-se lentamente para se certificar de que o levantador-slip não se mexeu.
      4. Tirar a cassete de hibridação pré-aquecido para fora do forno de hibridação e fechar a máquina. Papel-filtro lugar embebido com 3 ml 2x SSC (citrato de soro fisiológico normal) na cassete hibridação.
      5. Delicadamente, coloque o suporte de slides a hibridação com slides da cassete de hibridização. Feche a gaveta de hibridação e colocar no forno de hibridização novamente (por cerca de 16-18 horas).
    7. Lavagem de slides
      1. Prepare frescos lavagens buffers I, II e III (750 ml por etapa de lavagem). Para 500 ml lavar-buffer I, usar 2 x SSC / SDS 0,5%. Para 500 ml de lavar-lustreer II, usar 1 x SSC / SDS a 0,25%. Para 500 ml de tampão de lavagem-III, usar 1 x SSC / SDS a 0,1% (opcional)
      2. Coloque as lavagens buffers a 30 ° C (para ter certeza de SDS é dissolvido).
      3. Submergir as lâminas tão rapidamente quanto possível, mas muito suavemente, num tubo Falcon de 50 mL cheio com tampão de lavagem até que o vidro repousa sobre o fundo cónico do tubo.
      4. Depois de alguns segundos, quando as pias levantador-derrapante para o fundo do tubo, retire o slide com uma pinça sem riscar a matriz e colocar no rack da estação de lavagem. Continuar com a lavagem sem intervalo de tempo.
      5. Lavam-se as lâminas durante 5 min em 500 ml de tampão de lavagem-I (numa estação de lavagem). Dê-lhe uma segunda lavagem por 20-30 min em 500 ml de lavar-buffer II (em uma estação de lavagem). Da mesma forma, lavar as lâminas durante 5 min em 500 ml de tampão de lavagem-III (opcional) (numa estação de lavagem).
      6. Secam-se as lâminas durante 2 min a 2000 rpm.

    12. Análise de Microarray

    1. Digitalizar imagenscom os respectivos comprimentos de onda em scanner e salvar em uma pasta "Jove Project".
    2. Use software para analisar os arquivos digitalizados, inicialmente, como descrito anteriormente 22. Depois de executar este programa, selecione a guia "Abrir imagem" para carregar o arquivo de imagem vermelho (-.550) como "Vermelho" e arquivo de imagem verde (-.635) como "Green". Faça o upload do arquivo gal (.gal) com lista de matriz S. pneumoniae no arquivo de imagem, selecionando "lista de matriz Load" guia 22.
      Nota: esta lista de matriz constituído por 48 redes, em cada grade havia 16 linhas e 15 colunas. Cada ponto na grade representa um único gene e informações pontuais incluindo nome gene é adicionado através de um arquivo de descrição de local. Os números no local são dadas a partir da esquerda para a direita e de cima para baixo.
    3. Depois de encontrar cuidadosamente as grades, selecione a guia "Find Array, encontrar blocos, Alinhe Features" para alinhar os pontos. Depois de alinhar todos os recursos, analisar a imagem, selecionando o "Analisando" tab. Criar um novo arquivo de ter resultados, histograma e gráfico de dispersão. Salve este arquivo a partir do separador "resultados salvar como" como um arquivo .gpr para análise posterior.
    4. Realize uma maior normalização e tratamento de dados com in-house desenvolvido pacote de software Microprep como descrito 9.
    5. Use repetições biológicas independentes para dados microarray de DNA que são trocados-dye. Realizar implementação CyberT de uma variante de t-test1 e calcular as taxas de descoberta de falsas (FDR), como descrito 9.
    6. Para genes expressos diferencialmente, ter p <0,001 e FDR <0,05 como um padrão.
    7. Faça o upload de dados de microarrays de DNA na página submissão NCBI para obter um GEO (Gene Expression Omnibus) o número de acesso.

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    Representative Results

    ARN, o isolamento e análise de cDNA

    L-serina é um dos aminoácidos essenciais e a sua concentração no plasma sanguíneo humano varia de 60-150 uM em crianças e adultos. O seu papel na biossíntese de purinas e pirimidinas destaca a sua importância no metabolismo e é um precursor de várias aminoácidos (glicina, cisteína e triptofano). Para estudar o impacto da L-serina em todo o transcriptoma de S. pneumoniae D39 estirpe de tipo selvagem, a análise de microarray da estirpe D39 cultivadas em MDL com um mínimo de concentração (150 uM) de L-serina contra que cresceu em uma concentração máxima (10 mM) no mesmo meio foi realizada. Em primeiro lugar, o RNA total a partir de células cultivadas em ambas as concentrações foi isolado. As concentrações de RNA das amostras são dadas na Tabela 1. A qualidade do RNA total foi examinada utilizando o ensaio de controlo de qualidade. O ARN foi tratado com ADNase I antes de realizar esteensaio para remover o ADN genómico possível Figura 2 mostra a qualidade do RNA.; pista L representa a escada, pistas 1 e 2 representam o ARN a partir de 150 um serina e as pistas 3 e 4 representam o ARN a partir de 10 mM de serina. A presença de duas bandas claras correspondentes às duas subunidades de RNA indicou a boa qualidade do RNA e a próxima etapa do método pode ser realizada.

    Depois de medir a qualidade do ARN, a síntese de cDNA foi realizada. O ADNc foi formada usando nanômetros aleatórios e enzima transcriptase reversa. As concentrações das amostras de cDNA estão apresentados na Tabela 1. Este ADNc foi marcada com corantes reactivos a amina e as concentrações do ADNc marcado e etiquetas de corante são dadas na Tabela 1. Após a marcação, as amostras foram misturadas em conformidade e, em seguida, hibridizadas. Após a lavagem, as lâminas foram digitalizadas usando o scanner, e análise foi realizada utilizando Gene Pix software Pro. A Figura 3 mostra a dispersãoanálise enredo da relação corantes amino-reactivo. Após a análise inicial, os dados foram posteriormente analisados ​​usando o pacote de software PicroPrep (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 para reduzir o ruído e Cyber-T foi utilizado para a análise final. A Tabela 2 resume os resultados dos estudos de microarranjos após a aplicação dos critérios de ≥ 2,0 dobrar diferença e valor p <0,001. Um certo número de genes foram expressas diferencialmente na presença de L-serina mínimo em comparação com o valor máximo (Tabela 2).

    Figura 1
    Figura 1. Uma visão geral da tecnologia de microarranjo de DNA. O ARN é isolado a partir do controlo e das amostras-alvo e cDNA marcado é então hibridado.

    Figura 2
    Figura 2.Verificação da qualidade do RNA isolado a partir de S. pneumoniae D39 células cultivadas na presença do mínimo (150 uM) e máximo (10 mM), as concentrações de serina. Pista L representa o tamanho escada enquanto que a pista 1 e 2 representam as amostras de RNA isoladas a partir de células crescidas na presença de uma concentração mínima de serina. Da mesma forma, pista 3 e 4 representam amostras de RNA isoladas a partir de células crescidas na presença de concentração máxima serina. As bandas representam a 23S e 16S rRNA. A presença de apenas duas bandas mostra que não existe contaminação ADNg e ARN é de boa qualidade.

    Figura 3
    Figura 3. Comparação de matriz de dispersão de uma mistura de amostra. Cada ponto no gráfico representa o valor médio de expressão (log2) de um gene de uma experiência com um corante sobre o eixo y e corante 2 no eixo-x.

    Amostra RNA Sample Descrição A concentração de RNA (ng / mL) concentração de cDNA (ng / mL) CDNA etiquetado (ng / mL) DyLight-550 (pmol / uL) DyLight-650 (pmol / uL) Esquema de hibridação
    S1 R1 D39 de tipo selvagem cultivada em MDL + Mínimo L-serina 2057 255 225 0,8 R1 + R3
    R2 D39 de tipo selvagem cultivada em MDL + Mínimo L-serina 2566 201 179 1.2 R2 + R4
    S2 R3 D39 de tipo selvagem cultivadas em MDL + L-serina máximo 2831 292 276 2.3
    R4 D39 de tipo selvagem cultivada em MDL + Maximum L-serina 1867 172 150 1

    Tabela 1. Esquema de hibridação das amostras utilizadas na análise de microarray.

    </ Tr>
    Gene um Função b C Rácio
    SPD0600 DivIB proteína divisão celular 4
    SPD0445 Fosfoglicerato quinase 3,5
    SPD0646 Proteína hipotética 3.4
    SPD0873 Proteína hipotética 3.3
    SPD1223 Proteína hipotética 3.3
    SPD0980 Pyrophosphokinase ribose-fosfato 2.8
    SPD1628 Xanthine fosforibosiltransferase 2,7
    SPD1011 Glicerato quinase 2.4
    SPD0645 Proteína hipotética 2.3
    SPD0564 Proteína hipotética 2.2
    SPD0641 Manose-6-fosfato isomerase, classe I, mana 2.1
    SPD1333 Proteína hipotética 2.1
    SPD1384 Cátions proteína família efluxo 2.1
    SPD1432 UDP-glucose 4-epimerase, Galé-1 2.1
    SPD1866 -N-acetil-glucosamina-6-fosfato deacetylase, Naga 2.1 SPD0104 Proteína do domínio LysM 2
    SPD0140 ABC transporter, proteína de ligação de ATP 2
    SPD0261 A aminopeptidase C, PepC 2
    SPD1350 Proteína hipotética 2
    SPD1822 Ribossomal grande subunidade pseudouridina sintase, proteína RluD subfamília 2
    SPD0453 Tipo I sistema de restrição-modificação, S subunidade -2
    SPD0459 Calor GrpE proteína de choque -2
    SPD1006 Adeniltransferasa glicose-1-fosfato -2
    SPD1799 Sensor de histidina quinase putativa -2.1
    SPD0387 Beta-hydroxyacyl- (acil-transportador-proteína) desidratase fabz -2.2
    SPD1494 Sugar ABC transporter, proteína permease -2.2
    SPD0974 Classe I amidotransferase glutamina, putativo -2.4
    SPD1600 Fosforibosiltransferase Antranilato -2.5
    SPD1472 Isoleucil-tRNA sintetase -2.6
    SPD0681 Proteína hipotética -2.7
    SPD0501 Antiterminator Transcrição, Lict -3.4

    Tabela 2. Lista de genes regulados na comparação transcriptoma de S. pneumoniae D39 estirpe selvagem cultivada em CDM 15 com uma concentração mínima de L-serina e MDL 15 com a concentração máxima de L-serina. Um número de genes referem-se a marcas de D39 do locus. Anotação b D39 / TIGR4 anotação 21. C Rácio representa a dobra aumento / diminuição da expressão de genes no CDM-máxima, em comparação com CDM-mínimo (sinal de menos indica regulação baixa).

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    Discussion

    Nós descrevemos um protocolo de fácil utilização que pode ser aplicado para realizar a análise de toda transcriptoma de bactérias. O ponto-chave sobre esta técnica particular é que a condição sob a qual as células são colhidas irão variar. Após a colheita de células e o isolamento de ARN, esta técnica torna-se igual para todos os tipos de amostras bacterianas e segue passos exactamente idênticas e, por conseguinte, pode ser aplicado a qualquer tipo de cultura bacteriana. O protocolo é muito simples e conveniente e começa a partir de isolamento RNA. Nosso protocolo de isolamento de ARN (usando um Macaloid e kit de isolamento de ARN) é eficaz de tempo em comparação com fenol-clorofórmio e métodos convencionais Trizol. No passo seguinte, a preparação de ADNc com a enzima transcriptase III é realizada. Em seguida, a rotulagem de cDNA é realizado por primeiro mistura de ADNc com corantes reactivos a amina, e depois purificando o cDNA marcado. A rotulagem também é simples e não leva muito tempo que as amostras devem ser incubados por cerca de 1hr no escuro. Todos estes passos podem ser realizados em qualquer laboratório padrão, pois não exige qualquer equipamento especializado. Um scanner de microarray é necessário para digitalizar slides. Para a digitalização de slides e análise, o programa GenePix Pro é usado, que é um programa muito simples e fácil de usar 22.

    Depois de fazer todas as experiências, a análise foi realizada utilizando MicroPrep e CyberT. O pacote MicroPrep, é composto por três módulos, ou seja, PrePreP, preparação e PostPreP 9. Este quadro de pré-processamento de dados reduz o tempo para a normalização dos dados e também reduz a quantidade de dados descartados. A facilidade com que o software pode ser utilizado torna possível que o pesquisador se ter uma compreensão dos dados de microarranjo de DNA em tempo mínimo. Leva apenas alguns minutos para converter os dados do sinal brutos em dados de alta qualidade para processamento adicional após análise de imagens de slides é feito. Uma análise mais aprofundada sobre o conjunto de genes regulados no microarray pode ser feito usando diferentes pacotes de software in-house. Eles incluem pimenta 20, FIVA 16, DIVULGAR 18, 17 e PROCURADOR Genome2D 19. Essas ferramentas baseadas em Windows e pacotes de software são de fácil utilização e fornecer uma visão profunda dos dados durante uma investigação mais aprofundada. Estes pacotes de software tornam muito fácil e acessível para os pesquisadores a utilizar esta tecnologia como os dados se torna muito mais significativa e relevante.

    Os corantes utilizados em microarrays são conhecidos por serem muito susceptíveis a um efeito de ozono, em que os corantes tornar-se instável na presença de ozono e a intensidade do sinal é tão baixo que não pode ser reconhecido pelo scanner. Corantes reactivos com aminas que são menos sensíveis ao efeito do ozono são utilizados para marcar ADNc. A solução para o ozônio e efeito fará com que esta tecnologia ainda melhor.

    Uma lista de genes foi criado que estavam cima ou regulados negativamente na presença do mínimo de L-sorine concentração, em comparação com o valor máximo (Tabela 2). Os genes regulados positivamente podem ser classificados de acordo com a função do seu produto. Sete deles codificam proteínas hipotéticas, quatro estão envolvidos no transporte e metabolismo de hidratos de carbono, uma proteína DivIB divisão celular, e certos genes de transporte de aminoácidos e de metabolismo. De igual modo, há também certos genes que são regulados negativamente em nossa condição testada. Um LicT regulador transcricional BglG-família, alguns genes de hidratos de carbono e alguns genes específicos de aminoácidos encontram-se entre os genes regulados negativamente. A GrpE proteína de choque térmico também está entre os mais regulada para baixo. Portanto, este estudo fornece uma visão completa dos genes diferencialmente expressos nas condições testadas. Após análise dos resultados, por vezes, a verificação dos resultados é necessário. Isto pode ser feito quer por qPCR ou ensaios β-galactosidase utilizando fusões de lacZ do promotor.

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    Disclosures

    Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

    Acknowledgments

    Agradecemos a Anne de Jong e Siger Holsappel para obter ajuda com o DNA microarrays produção slide. O apoio da Anne de Jong para análise bioinformática também é apreciado. Agradecemos também a Jelle Slager para a revisão do papel. Muhammad Afzal e Irfan Manzoor são suportados pela Universidade GC, Faisalabad, Paquistão sob o programa de desenvolvimento do corpo docente da HEC Paquistão.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acid phenol SigmaAldrich P4682
    Roche RNA isolation kit Roche Applied Science 11828665001
    Glass beads 105015
    Chloroform Boom 92013505.1000.
    IAA 106630
    Nanodrop Nanodrop ND-100
    Agilent BioAnalyser Agilent G2940CA
    Superscript III Life technologies Invitrogen 18080044
    AA-dUTP Life technologies Invitrogen AM8439
    DDT Life technologies Invitrogen 18080044
    First Strand buffer Life technologies Invitrogen 18080044
    NaOH SigmaAldrich S8045-1KG
    HEPES SigmaAldrich H4034-500G
    DyLight-550 Thermoscientiffic 62262
    DyLight-650 Thermoscientiffic 62265
    SHY Buffer SigmaAldrich H7033-125ML
    Speedvac cooler Eppendorf RUGNE3140 Speedvac concentrator plus
    Hybridization oven Grant Boekel Iso-20
    Lifter-slips Erie Scientific 25x60I-M-5439
    Wipe KIMTECH
    SDS SigmaAldrich L3771-100g
    SSC SigmaAldrich W302600-1KG-K
    Genpix autoloader 4200A1 MSD analytical technologies Microarray scanner
    Sodium bicarbonate SigmaAldrich 104766

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Biologia Molecular Edição 98 microarranjos de DNA expressão gênica transcriptomics bioinformática análise de dados o pneumococo L-serina
    A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em
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    Afzal, M., Manzoor, I., Kuipers, O.More

    Afzal, M., Manzoor, I., Kuipers, O. P. A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (98), e52649, doi:10.3791/52649 (2015).

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