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Immunology and Infection

उच्च throughput मात्रात्मक वास्तविक समय आरटी पीसीआर परख प्रकार मैं और तृतीय इंटरफेरॉन उपप्रकार की अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारण के लिए

Published: March 24, 2015 doi: 10.3791/52650
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, 2Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration

Introduction

प्रकार मैं और तृतीय इंटरफेरॉन (IFN) सभी रीढ़ एक में वायरस और अन्य रोगजनक उत्तेजनाओं और पेश करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण हैं। प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा कोशिकाओं का जवाब करने के लिए, IFN 2 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, एक्सप्रेस और छिपाना। ऐसे टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLR), डंक, और रिग-मैं के रूप में सहज प्रतिरक्षा सेंसर, रोगाणु जुड़े आणविक पैटर्न (PAMP) 3,4 का पता लगाने पर प्रकार मैं और तृतीय IFN अभिव्यक्ति प्रेरित। इंसानों में, मैं IFN प्रकार 2,5 जटिल IFNAR1 / IFNAR2 रिसेप्टर को IFN-β, -ω, -κ, और IFN-α के 12 उपप्रकार है, और बाँध शामिल हैं। प्रकार III IFN IFN-λ1, -λ2, और -λ3 में शामिल हैं और IL10RB / IL28RA रिसेप्टर जटिल 2 करने के लिए बाध्य। माइल्ड, प्रकार मैं और तृतीय IFN तो STAT1 / STAT2 heterodimers भर्ती और इंटरफेरॉन प्रेरित जीन (ISG) 6 का प्रतिलेखन आरंभ जो उनके संबंधित रिसेप्टर परिसरों को बाँध। ISG एंटीवायरल और एंटी से, कार्यों की एक विविध रेंज में शामिल कर रहे हैंअनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 7 के सक्रियण के लिए proliferative गतिविधि।

रोगज़नक़ों, बचना नाश, और IFN संकेतन मार्ग के तत्वों का अपहरण करने के लिए विकसित किया है कई तंत्र सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 8 में IFN के महत्व को प्रदर्शित करता है। उदाहरण के लिए, चेचक वायरस एक Yaba-जैसे रोग वायरस मैं और तृतीय IFN प्रोटीन 10 टाइप रोकता है कि एक ग्लाइकोप्रोटीन स्रावित करता है, जबकि मैं 9 IFN टाइप sequesters कि IFNAR1 अनुरूपता साथ एक फंदा रिसेप्टर व्यक्त करता है। मेजबान बचाव में उनकी भूमिका के अलावा, IFN भी कैंसर निगरानी और ऑटो भड़काऊ रोगों की संख्या में फंसा रहे हैं: स्तन कैंसर की कोशिकाओं में IFN अभिव्यक्ति का मुंह बंद करने immunosurveillance 11 प्रतिबंधित, IFN-α के overproduction प्रणालीगत के विकास में एक तंत्र है एक प्रकार का वृक्ष 12, और डंक से गुमराह सक्रियण डंक से जुड़े Vasculopathy में IFN की अत्यधिक मात्रा के कारण प्रणालीगत सूजन की ओर जाता है13। Therapeutically, IFN मल्टिपल स्क्लेरोसिस 14 के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है, इस तरह के बालों सेल ल्यूकेमिया 18 और पुरानी माईलोजेनस ल्यूकेमिया 19 के रूप में इस तरह के एचबीवी 15 और एचसीवी 16,17, और कैंसर जैसे पुराने वायरल संक्रमण। एक विशेष शारीरिक प्रक्रिया में IFN की प्रासंगिकता के बारे में प्रश्न लगातार इस साइटोकाइन परिवार के सर्वव्यापी प्रकृति प्रकट करते हैं।

विशेष रूप से IFN-α उपप्रकार है, अक्सर एक इकाई 20-23, के रूप में नहीं बल्कि एक निकट से संबंधित का समूह है, लेकिन अलग, प्रोटीन के रूप में माना जाता है कि मैं IFN, टाइप करें। हड्डीवाला विकास 24 के दौरान अस्तित्व और IFN-α उपप्रकार सहित कई IFN प्रजातियों के हठ, इन उपप्रकार के कम से कम एक सबसेट विशिष्ट या अद्वितीय कार्य किया है कि पता चलता है। यह IFN अभिव्यक्ति के निर्णायक पैटर्न को समझने और उपप्रकार 17 में से एक या एक से अधिक के विशिष्ट कार्यों को चिह्नित करने में मदद मिलेगी कि संभव है। टी अध्ययन करने की चुनौतीवह अपने साझा अनुक्रम पहचान पर आधारित है कि मैं और तृतीय IFN उपप्रकार टाइप करें: बारह IFN-α उपप्रकार> 50% से 25 का हिस्सा है और IFN-λ उपप्रकार उनके एमिनो एसिड दृश्यों के 81-96% 26 को साझा करें। वर्णित QRT- पीसीआर परख में, आणविक बीकन (एमबी) और बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) फ्लोरोसेंट जांच अत्यधिक समान IFN उप प्रकार के दृश्यों के बीच एकल आधार जोड़ी मतभेद भेदभाव और IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षर के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं। परख के 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप क्रमशः प्रतिलेख प्रतिलिपि संख्या और ΔCq द्वारा विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, मात्रात्मक (प्रतिलेख मानकों) और अर्द्ध मात्रात्मक (गृह व्यवस्था जीन (HKG)) उपायों दोनों शामिल हैं। प्राइमर / जांच (पीआर / पंजाब) सुखाने के माध्यम से संभव स्वचालित मल्टीचैनल pipetting, और लंबी अवधि के भंडारण, द्वारा सुविधा बैच विधानसभा, परख के reproducibility, उपयोगिता, और व्यावहारिकता में वृद्धि, प्लेटों पर सेट।

इस प्रोटोकॉल प्रक्रिया का वर्णन384 अच्छी तरह से QRT- पीसीआर परख प्लेटें मानव IFN उपप्रकार (1 टेबल) को लक्षित अप करने के लिए सत्रह अलग पीआर / पंजाब सेट के साथ (चित्रा 1) तैयार करने के लिए। पीआर / पंजाब शेयर स्रोत प्लेट (चित्रा 2) एक रोबोट multichannel pipettor का उपयोग स्वचालित किया जा सकता है कि एक प्रक्रिया में एक से अधिक 384 अच्छी तरह से परख प्लेटें तैयार करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं काम कर निर्धारित किया है। प्रारंभिक ध्यान मानव IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षर के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल बनाने पर था, वहीं इस विधि के रूप में अच्छी तरह से रीसस मकाक करने के लिए लागू किया गया है। थाली लेआउट थोड़ा अलग हैं और पीआर / पंजाब सेट (तालिका 2) अलग कर रहे हैं, हालांकि, मानव और रीसस प्लेटें बनाने के लिए समग्र तैयारी विधि समान है। प्रोटोकॉल के न्यूनतम संशोधनों के साथ, विधि बारीकी से संबंधित जीन के अन्य समूहों का अध्ययन करने के assays के विकास के लिए अनुमति देने के लिए क्रियान्वित किया जा सकता है।

देखें आंकड़े 1 और नीचे दो

टेबल्स 1 और 2 बेल देखेंओउ

Protocol

मानक सीरियल dilutions 1. तैयारी (चित्रा 3A)

नोट: एक पीआर / पंजाब सेट द्वारा लक्षित दृश्यों से युक्त linearized plasmids के सीरियल कमजोर पड़ने श्रृंखला QRT- पीसीआर परख के लिए मात्रात्मक मानकों के रूप में उपयोग किया जाता है। IFN उपप्रकार के लिए प्रत्येक मानक धारावाहिक कमजोर पड़ने सेट 90 परख प्लेटों को चलाने के लिए पर्याप्त मात्रा में शामिल है। परख के लिए इस्तेमाल मानक कमजोर पड़ने की अवस्था के चार अंक 20-32 (3 टेबल) की एक सीमा से सीटी मूल्यों को कवर करने के लिए चुने गए हैं।

  1. पिघलना, भंवर, और संक्षेप में मानक (50 बजे) और सामन शुक्राणु डीएनए (ssDNA, 10 मिलीग्राम / एमएल) के शेयर समाधान अपकेंद्रित्र।
  2. पानी की 20.3 मिलीलीटर के साथ ssDNA के 51 μl मिश्रण से 17 मानक कमजोर पड़ने सेट के लिए ssDNA / पानी के मिश्रण तैयार करें।
  3. एक मानक कमजोर पड़ने सेट के लिए एक 8-ट्यूब पीसीआर पट्टी लेबल।
    नोट: शेयर समाधान से मानक धारावाहिक dilutions की तैयारी 2-3 घंटा लग जाएगा।
  4. च ssDNA / पानी के मिश्रण के 190 μl बांटनाirst पट्टी में ट्यूब और शेष पांच ट्यूबों के लिए ssDNA / पानी के मिश्रण के 180 μl।
  5. मिश्रण ssDNA / पानी के 190 μl के साथ ट्यूब से 50 बजे मानक स्टॉक से 10 μl स्थानांतरित द्वारा एक 1:20 कमजोर पड़ने प्रदर्शन; जल्दी से भंवर और पीसीआर पट्टी अपकेंद्रित्र।
  6. श्रृंखला में अगले ट्यूब करने के लिए हाल ही में सबसे पतला ट्यूब से 20 μl स्थानांतरित द्वारा 1:10 कमजोर पड़ने प्रदर्शन; जल्दी से भंवर और पीसीआर पट्टी अपकेंद्रित्र।
  7. कमजोर पड़ने श्रृंखला में पिछले ट्यूब दोहराएँ जब तक कदम 1.6 मानक प्राप्त हुआ है।
  8. दोहराएँ प्रत्येक मानक के लिए 1.3-1.7 कदम।

नीचे दी गई तालिका 3 देखें

प्राइमर / जांच (पीआर / पंजाब) और कोई खाका नियंत्रण 2. तैयारी (एनटीसी) कार्य स्टॉक घोला जा सकता है (3B चित्रा)

नोट: प्रत्येक 1.7 मिलीलीटर पीआर / पंजाब शेयर और 30 परख प्लेटें कर देगा शेयर मिश्रण काम कर 128.6 μl कोई खाका नियंत्रण (एनटीसी) काम कर निर्धारित किया है।

  1. पीआर / पंजाब काम कर शेयर घोला जा सकता सेट तैयार करते हैं।
    नई: पीआर / पंजाब सेट तैयार करना और एनटीसी में काम कर रहे शेयर 2-3 घंटा ले जाएगा शेयर समाधान से घोला जा सकता है।
    1. स्टॉक समाधान की तैयारी के लिए अति शुद्ध पानी के साथ 100 माइक्रोन पर प्राइमरों और जांच Resuspend।
    2. सत्रह 2 मिलीलीटर ट्यूब अप करने के लिए लेबल; परख में शामिल प्रत्येक पीआर / पंजाब सेट के लिए एक।
    3. पिघलना, भंवर, और संक्षेप में प्राइमरों (100 माइक्रोन), जांच (100 माइक्रोन), और ssDNA (10 मिलीग्राम / एमएल) शेयर समाधान अपकेंद्रित्र।
    4. 12.5 μl इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग हर ट्यूब ssDNA के 2 μl जोड़ें। , उपयुक्त आगे प्राइमर जोड़ें प्राइमर रिवर्स, और प्रत्येक पीआर / पंजाब शेयर ट्यूब काम कर सेट करने के लिए जांच। रीसस मकाक पीआर / पंजाब सेट के लिए मानव IFN उपप्रकार और 2 टेबल को लक्षित पीआर / पंजाब सेट के लिए 1 टेबल देखें। प्रत्येक पीआर की मात्रा लाने के लिए पानी जोड़ें / पंजाब के 200 μl को शेयर ट्यूब काम कर निर्धारित किया है।
      नोट: जोड़ने के लिए प्राइमरों, जांच की मात्रा, और पानी एक पीआर / पंजाब की अपेक्षित अंतिम प्रतिक्रिया एकाग्रता पर निर्भर करता हैजमी।
  2. एनटीसी काम कर शेयर घोला जा सकता है तैयार।
    1. एनटीसी में काम कर रहे शेयरों के लिए लेबल दो 5-ट्यूब पीसीआर स्ट्रिप्स घोला जा सकता है।
    2. प्रत्येक पीआर / पंजाब के 14.3 μl उचित एनटीसी काम कर शेयर मिश्रण ट्यूब करने के लिए सेट स्थानांतरण। एनटीसी कुओं के लिए पीआर / पंजाब सेट संयोजन के लिए तालिका 4 देखें। एनटीसी काम कर स्टॉक से प्रत्येक के लिए पानी जोड़ें 128.6 μl अंतिम मात्रा लाने के लिए घोला जा सकता है।
    3. भंवर, संक्षेप में अपकेंद्रित्र, और बर्फ पर या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में ट्यूबों की जगह।

नीचे दी गई तालिका 4 देखें

  1. पीआर / पंजाब में काम कर रहे शेयरों सेट पतला।
    1. प्रत्येक पीआर / पंजाब की अंतिम मात्रा लाने के लिए पानी के 1.5 मिलीलीटर जोड़ने, एनटीसी काम कर शेयर घोला जा सकता है के लिए आवश्यक पीआर / पंजाब सेट का एक विभाज्य को निकालने के बाद 1.7 मिलीलीटर शेयर ट्यूब काम कर निर्धारित किया है।
    2. भंवर, संक्षेप में अपकेंद्रित्र, और बर्फ पर या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में ट्यूबों की जगह।
  1. 384 अच्छी तरह से परख प्लेटों के लिए aliquoting के लिए पीआर / पंजाब सेट और एनटीसी घोला जा सकता है के एक 96 अच्छी तरह से स्रोत थाली तैयार है।
    नोट: पीआर / पंजाब कामकाज शेयर घोला जा सकता से स्रोत थाली की तैयारी कम से कम एक घंटा लग जाएगा। प्रत्येक 96 अच्छी तरह से स्रोत थाली छह 384 अच्छी तरह से परख प्लेट (चित्रा -3 सी) बनाने के लिए पर्याप्त है।
    1. संक्षेप में भंवर और पीआर / पंजाब में काम कर रहे शेयरों और एनटीसी में काम कर रहे शेयर घोला जा सकता सेट अपकेंद्रित्र।
    2. एक ठंडा 96 अच्छी तरह से ठंडा ब्लॉक में एक नया 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और प्रत्येक पीआर / पंजाब सेट के लिए कुओं को नामित या एनटीसी कुओं (चित्रा 2 देखें) प्राप्त मिश्रण।
    3. एक 250 μl इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए पानी जोड़ें: हर पीआर के लिए पानी के 66 μl बांटना / पंजाब (लक्ष्य 17 के लिए चार कुओं को छोड़कर) अच्छी तरह से सेट। 4 लक्ष्य 17 कुओं के पानी का 82.5 μl बांटना। अच्छी तरह से हर एनटीसी मिश्रण करने के लिए पानी की 27.5 μl बांटना। सही पीआर / पंजाब 96 अच्छी तरह से थाली के नामित वेल्स को शेयर वर्किंग सेट करें: सही पीआर / पंजाब के 54 μl (लक्ष्य 17 के लिए चार कुओं को छोड़कर) नामित पीआर / पंजाब सेट वेल्स को शेयर वर्किंग सेट बांटना। लक्ष्य 17 पीआर / पंजाब के 67.5 μl बांटना नामित लक्ष्य 17 पीआर / पंजाब सेट वेल्स को शेयर काम कर निर्धारित किया है। नामित वेल्स को सही एनटीसी काम कर शेयर मिश्रण का 22.5 μl जोड़ें।
    4. सामग्री कुओं के तल पर हैं सुनिश्चित करने के लिए 700 XG पर 1 मिनट के लिए चिपकने वाला एक थाली मुहर और सेंट्रीफ्यूज के साथ 96 अच्छी तरह से थाली सील।
    5. एक 96 अच्छी तरह से थाली अनुकूलक का उपयोग कर भंवर मिक्सर में 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और 1000 rpm पर 1 मिनट के लिए मिश्रण। अपकेंद्रित्र 700 x जी पर 5 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से थाली।
    6. एक ही दिन में यदि का उपयोग अन्यथा उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 96 अच्छी तरह से स्रोत थाली स्टोर।
  2. स्वचालित multichannel pipettor का उपयोग करता पीआर / पंजाब जोड़कर 384 अच्छी तरह से परख प्लेटें तैयार करें।
    नोट: 96 अच्छी तरह से स्रोत थाली से छह परख प्लेटों की तैयारी 3-4 घंटा लग जाएगा।
    1. प्लेटें बनाने से पहले, 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा घोंसला पूर्व ठंडा होगा और प्रति मिनट 20-25 लीटर (LPM) के बीच उड़ाने airflow के साथ 80 डिग्री सेल्सियस के लिए 125 डिग्री सेल्सियस के लिए प्लेट बाष्पीकरण और नीचे गर्मी ब्लॉक पूर्व गर्मी।
    2. स्वचालित मल्टीचैनल pipettor पर स्विच और डबल सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करके IFN परख प्लेटें बनाने के लिए प्रोटोकॉल खुला।
    3. मंच सेटअप करने के लिए, मंच स्थिति एक में एक पूरी तरह से भरा हुआ pipet टिप बॉक्स जगह, स्थिति 4 में 96 अच्छी तरह से स्रोत प्लेट और स्थिति के 6 में एक नया 384 अच्छी तरह से थाली प्ले बटन दबाकर रन शुरू करो।
      नोट: एक रन के पूरा होने पर, प्रत्येक अच्छी तरह से पीआर / पंजाब मिश्रण के 5 μl में शामिल होंगे।
      नोट: ssDNA की अंतिम राशि 384 अच्छी तरह से परख थाली के प्रति अच्छी तरह से जोड़ा 0.025 माइक्रोग्राम प्रति है।
    4. धीरे कुओं के तल पर हैं तरल पदार्थ सुनिश्चित करने के लिए एक फ्लैट सतह पर 384 अच्छी तरह से परख थाली नल और एक चिपकने वाला लागूथाली मुहर।
    5. अपकेंद्रित्र 700 x जी पर 1 मिनट के लिए थाली। थाली ड्रायर में 384 अच्छी तरह से परख प्लेट जगह है, चिपकने वाला थाली मुहर निकालें और कुओं से ऊपर सीधे 384 अच्छी तरह से कई गुना स्थिति।
    6. 384 अच्छी तरह से परख प्लेट की सामग्री सूखा, एक नया चिपकने वाला थाली मुहर लागू करते हैं, उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में पन्नी, लेबल, और दुकान में लपेटो।
      नोट: प्लेट्स में कम से कम छह महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
    7. चरणों को दोहराएँ 3.2.3-3.2.6 6 एक्स तक 384 अच्छी तरह से परख प्लेटें तैयार कर रहे हैं या 96 अच्छी तरह से स्रोत थाली में तरल समाप्त हो गया है।
    8. ठंडा घोंसला बंद करें सॉफ्टवेयर को बंद करें, और स्वचालित मल्टीचैनल pipettor का स्विच बंद। थाली ड्रायर बंद करें।

4. लोड हो रहा है और एक 384 अच्छी तरह से परख प्लेट रनिंग

  1. अच्छी तरह से एक HKG, ssDNA, पीसीआर मास्टर मिश्रण है, और पानी के लिए पीआर / पंजाब सेट से मिलकर बनता है जो घोला जा सकता है, दो हाउसकीपिंग जीन (HKG) तैयार करें, (एक सूखे 384 अच्छी तरह से परख थाली में जोड़ा जाएगा नोट: घोला जा सकता है की तैयारी और परख प्लेट लोड हो रहा 1-2 घंटा लग जाएगा। परख थाली चल रहा है कम से कम 2 घंटे का समय लगेगा।
    1. प्रत्येक HKG मिश्रण के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब लेबल।
    2. 84.9 μl पानी के साथ ssDNA (10 मिलीग्राम / एमएल) के 2 μl पतला। पतला ssDNA के 2 μl, पानी की 11.8 μl, मास्टर मिश्रण के 23 μl, और HKG पीआर / पीआर प्रत्येक ट्यूब, भंवर, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र सेट करने के लिए सही 20x की 9.2 μl जोड़ें।
    3. मानव परख के लिए HKG रूप glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) और ubiquitin सी (यूबीसी) का उपयोग करें (सामग्री तालिका देखें)। रीसस परख के लिए HKG के रूप में GAPDH और 18S ribosomal शाही सेना का प्रयोग करें।
      नोट: परख प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया HKG लचीला कर रहे हैं और सेल प्रकार के लिए उपयुक्त जीन को प्रतिबिंबित करना चाहिए परीक्षण किया जा रहा GAPDH, यूबीसी, और 18S आमतौर पर इस्तेमाल किया HKG के उदाहरण हैं;। अन्य HKG अधिक उपयुक्त हो सकता है।
  2. नमूना और स्थिति को तैयारअच्छी तरह से नमूना या सकारात्मक नियंत्रण सीडीएनए, मास्टर मिश्रण है, और पानी से मिलकर बनता है जो घोला जा सकता है, को नियंत्रित किया है, एक सूखे 384 अच्छी तरह से परख थाली करने के लिए जोड़ा जाएगा। नमूना तैयार करने और पर्याप्त मात्रा में सकारात्मक नियंत्रण घोला जा सकता है 21 प्लेट कुओं (चित्रा 3 डी) को वितरित करने के लिए।
    1. सीडीएनए संश्लेषण करने से पहले, एक DNase पाचन कदम के साथ शाही सेना के नमूने तैयार करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन RNase एच (प्रत्येक नमूने के लिए 24 μl की अंतिम मात्रा) के साथ उपचार के बाद शाही सेना के कम से कम 500 एनजी के सीडीएनए संश्लेषण से अग्रिम में नमूने और सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें। उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर तैयार सीडीएनए स्टोर। पिघलना, भंवर, और संक्षिप्त नमूना सीडीएनए अपकेंद्रित्र।
    3. मास्टर मिश्रण के 78.8 μl और प्रत्येक 24 μl नमूना और सकारात्मक नियंत्रण ट्यूब के लिए पानी की 54.8 μl जोड़ें।
    4. संक्षेप में भंवर और ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
  3. मानकों को तैयार है और एनटीसी में अच्छी तरह से, चुनाव घोला जा सकता हैमास्टर मिश्रण और पानी की sisting, एक सूखे 384 अच्छी तरह से परख प्लेट (चित्रा 3 डी) को जोड़ा जाएगा। मानकों को अच्छी तरह से मिश्रण के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मास्टर मिश्रण के 275 μl के लिए पानी की 165 μl जोड़ें। एनटीसी अच्छी तरह से मिश्रण के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मास्टर मिश्रण के 52.5 μl के लिए पानी की 52.5 μl जोड़ें। संक्षेप में भंवर और ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
  4. घोला जा सकता है और नमूने के लदान के लिए एक सूखे 384 अच्छी तरह से परख थाली तैयार है।
    1. 700 x जी पर 1 मिनट के लिए एक सूखे 384 अच्छी तरह से परख 4 डिग्री सेल्सियस से थाली और अपकेंद्रित्र निकालें।
    2. एक ठंडा 384 अच्छी तरह से ठंडा ब्लॉक पर थाली प्लेस चिपकने वाला थाली सील को हटाने और विभिन्न घोला जा सकता है और नमूने (चित्रा 1) pipetted किया जाएगा जहां निर्दिष्ट करने के लिए थाली के कुओं रूपरेखा।
  5. मानक अच्छी तरह मिक्स, मानकों के साथ 384 अच्छी तरह से परख थाली लोड, एनटीसी खैर, नमूने, सकारात्मक नियंत्रण, और HKG मिश्रण (3E चित्रा) मिश्रण। भंवर और संक्षेप में अपकेंद्रित्र सभी समाधान थाली करने के लिए वितरण से पहले।
    1. मानकों के 6 μl अच्छी तरह से 30 μl इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल विंदुक के साथ प्रत्येक मानक अच्छी तरह से करने के लिए मिश्रण बांटना। 12.5 μl इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल विंदुक के साथ अच्छी तरह से नामित करने के लिए सही मानक धारावाहिक कमजोर पड़ने के 1.5 μl बांटना।
    2. एनटीसी के 7.5 μl अच्छी तरह से 30 μl इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल विंदुक के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक एनटीसी के लिए मिश्रण बांटना। 30 μl इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल विंदुक के साथ नामित वेल्स को नमूना के 7.5 μl बांटना। 12.5 μl इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल विंदुक के साथ नामित वेल्स को घोला जा सकता है HKG पीआर / पंजाब के 2.5 μl बांटना।
    3. 30 μl इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल विंदुक के साथ बचे हुए पानी और मास्टर मिश्रण मिश्रण के 7.5 μl के साथ किसी भी खाली कुओं भरें; पानी के 7.5 μl अकेले भी काम करेंगे।
    4. 700 x जी पर 1 मिनट के लिए ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म और सेंट्रीफ्यूज के साथ 384 अच्छी तरह से परख थाली सील। 2600 rpm पर 2 मिनट के लिए भंवर मिक्सर में बंद 384 अच्छी तरह से थाली भंवरऔर एक्स जी 700 पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    5. , QRT- पीसीआर मशीन में बंद 384 अच्छी तरह से परख थाली प्लेस परख लेआउट के लिए टेम्पलेट खोलने और चलाने लगते हैं।
      नोट: परिणाम एक स्प्रेडशीट के रूप में या विश्लेषण के लिए एक पाठ फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है।
    6. परख के लिए निम्नलिखित इष्टतम थर्मल cycler स्थितियों की प्रतिक्रिया का उपयोग करें: मैं) 50 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट, द्वितीय) 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट के लिए, तृतीय) 25 के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, चतुर्थ) 1 मिनट के लिए 59 डिग्री सेल्सियस। दोहराएँ 40 चक्र के लिए तृतीय और चतुर्थ कदम।
    7. एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर में QRT- पीसीआर मंच से कच्चे डेटा निर्यात करें। Linearity के निरीक्षण करने के लिए एक मानक वक्र के रूप में सेट प्रत्येक चार बिंदु मानक प्लॉट। ΔCq की गणना के द्वारा या चार बिंदु मानक घटता 27 के आधार पर प्रतिलिपि संख्या से विश्लेषण करते हैं।

नीचे आंकड़ा 3 देखें

Representative Results

QRT- पीसीआर परख प्रकार की कोशिकाओं और संदर्भों की एक किस्म में प्रकार मैं और तृतीय IFN की अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता का वर्णन किया। उदाहरण के लिए, मानव प्रकार मैं और तृतीय IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षर 6 दाताओं TLR ligands के साथ उत्तेजित से परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) में विश्लेषण किया गया; पाली मैं: सी (25 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), LPS (10 एनजी / एमएल), Imiquimod (10 माइक्रोन), और CPG oligonucleotides (1 माइक्रोन) (चित्रा 4)। डाटा एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया और उनके प्रोटीन अनुक्रम 27 की वंशावली पेड़ के अनुसार घड़ी की व्यवस्था की IFN-α उपप्रकार के साथ रडार चार्ट के रूप में प्रस्तुत किए गए। मानव IFN अभिव्यक्ति के रडार चार्ट को परख डिजाइन में शामिल विश्लेषण के दो अलग अलग तरीकों का उपयोग कर की गणना के लिए एक प्रवेश पैमाने में प्रस्तुत कर रहे हैं: HKG (ΔCq) के लिए सामान्यीकृत निरपेक्ष सीक्यू मूल्य, और कुल शाही सेना के माइक्रोग्राम (g) के अनुसार टेम्पलेट की संख्या को कॉपी । प्रतिलिपि संख्या मूल्यों परिणाम ओ से गणना कर रहे हैं एफए प्रतिलेख के मानक वक्र। डेटा TLR एगोनिस्ट द्वारा हासिल मानव IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षर ligand के विशिष्ट हैं कि पता चलता है।

नीचे आंकड़ा 4 देखें

मानव IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षर के लिए प्रदर्शन के रूप में, प्रकार की अभिव्यक्ति हस्ताक्षर रीसस मकाक में मैं और तृतीय IFN भी विशिष्ट TLR ligand के थे। 3 घंटा (चित्रा 5) के लिए सी (50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), LPS (10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), और Imiquimod (10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल): 3 दाताओं से PBMC पाली मैं के साथ प्रेरित किया गया। बेस लाइन पर unstimulated कोशिकाओं में IFN उप अभिव्यक्ति कम था। सी: IFN- उपप्रकार की एक सीमित संख्या LPS और पाली मैं के जवाब में व्यक्त किया गया। इसके विपरीत, Imiquimod के जवाब में IFN अभिव्यक्ति उच्च था और उप प्रकार अभिव्यक्ति व्यापक था। सभी तीन TLR 28 agonists द्वारा IFN-β और IFN-λ1 की अभिव्यक्ति बढ़ाया गया था।

नीचे आंकड़ा 5 देखें

हमेशा "> चित्र 1
चित्रा 1:। सत्रह पीआर / पंजाब सेट के साथ एक 384 अच्छी तरह से परख प्लेट के लिए लेआउट लक्ष्य संख्या एक पीआर / पंजाब सेट करने के लिए संदर्भित करता है। चार बिंदु मानक घटता (डार्क ग्रे त्रिकोण) कॉलम 1-5 करने के लिए जोड़ रहे हैं। HKG पीआर / पंजाब सेट (सफेद पृष्ठभूमि), कॉलम 6 और 7 के शेष कॉलम को 8-24 जोड़ा सत्रह पीआर / पंजाब सेट में से एक के लिए विशिष्ट हैं। नमूने कॉलम 6-24 (काला तीर) से, पंक्तियों एपी को जोड़ रहे हैं। कॉलम 5 के तल पर दो कुओं (O5, पी -5) केवल पानी और मास्टर मिश्रण प्राप्त करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। सत्रह पीआर / पंजाब सेट के साथ एक 96 अच्छी तरह से स्रोत प्लेट के लिए लेआउट लक्ष्य संख्या एक पीआर / पंजाब को संदर्भित करता हैजमी। एक पीआर / पंजाब सेट कई कुओं में जोड़ा जाता है जब काला तीर का प्रतिनिधित्व करते हैं। एनटीसी घोला जा सकता नामित कुओं (डार्क ग्रे पृष्ठभूमि) को जोड़ रहे हैं। विकर्ण लाइनों के साथ दो कुओं (F3, जी 3) अप्रयुक्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: QRT- पीसीआर परख प्रोटोकॉल में विशेष कदम की योजनाबद्ध एई आरेख प्रोटोकॉल के कुछ भागों का चयन करें।। (ए) चरण 1: मानक धारावाहिक dilutions की तैयारी। (बी) के चरण 2: पीआर / पंजाब और एनटीसी में काम कर रहे शेयर घोला जा सकता है की तैयारी। (सी) 3.1 कदम: पीआर / पंजाब सेट और एनटीसी घोला जा सकता है के एक 96 अच्छी तरह से काम कर रहे शेयरों की थाली तैयार करना। (डी) चरण 4.1-3: 384 अच्छी तरह से परख प्लेट लोड करने के लिए घोला जा सकता है की तैयारी। (Estईपी 4.5: 384 अच्छी तरह से परख प्लेट लोड हो रहा है। आरेख नीचे दायें कोने के लिए छोड़ दिया ऊपर से पढ़ रहे हैं। इंटरफेरॉन (IFN) परख के लिए अभिकर्मकों -20 ओ सी में जमा हो जाती है और बाएँ कॉलम में सूचीबद्ध हैं; प्रोटोकॉल में लाइनों अलग कार्यों। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear में मानव IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षर (PBMC) TLR ligands के साथ प्रेरित किया गया और आरएनए QRT- पीसीआर विश्लेषण के लिए काटा गया था उत्तेजना PBMC के लिए इस्तेमाल किया TLR ligands के जवाब में अलग है। शिखर प्रतिक्रियाओं के ज्यामितीय मतलब है मैं पाली: सी (25 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) 8 घंटा (लाल वर्गों), LPS (10 एनजी / एमएल) में 4 घंटा (हरा त्रिकोण), Imiquimod (10 माइक्रोन) में 16 घंटा में ( बैंगनी हीरे), CPG (1 माइक्रोन) पर16 घंटा (काले हलकों), और 16 घंटा में unstimulated नियंत्रण (नीले हलकों) 6 दाताओं से (बाएं) HKG यूबीसी ΔCq की अभिव्यक्ति के एक समारोह के रूप में प्रवेश 10 के पैमाने में दिखाया गया है या कर रहे हैं शाही सेना के माइक्रोग्राम प्रति प्रति प्रतिलिपि संख्या के रूप में (दाएं) । IFN-α उपप्रकार अमीनो एसिड अनुक्रम समानता की वंशावली साजिश के अनुसार आदेश दिए हैं। यह आंकड़ा मूल इम्यूनोलॉजी और सेल बायोलॉजी 27 में प्रकाशित हुआ था।

चित्रा 5
चित्रा 5:। परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear में रीसस मकाक IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षर (PBMC) (वर्ग, हीरा, और त्रिकोण द्वारा नामित) तीन रीसस मकाक से उत्तेजना PBMC के लिए इस्तेमाल किया TLR ligands के जवाब में अलग पूरे रक्त से अलग थे और सी (50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) या Imiquimod (10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल): lipopolysaccharide (LPS) (10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), पाली मैं के साथ प्रेरित किया। प्रकोष्ठों ope (0 घंटा पर काटा गयाएन आकार) या IFN अभिव्यक्ति की माप के लिए TLR उत्तेजना (बंद आकृतियों के 3 घंटा) के बाद। प्रकार मैं, द्वितीय, और तृतीय IFN की ट्रांसक्रिप्ट स्तर (बाएं) HKG GAPDH ΔCq की अभिव्यक्ति के एक समारोह के रूप में या प्रतिलिपि संख्या / माइक्रोग्राम प्रति आरएनए (दाएं) के रूप में प्रवेश 10 के पैमाने में प्रदर्शित कर रहे हैं। यह आंकड़ा मूल इंटरफेरॉन के जर्नल और cytokine रिसर्च 28 में प्रकाशित हुआ था।

तालिका एक
तालिका 1:। मानव IFN प्राइमर / जांच सेट दृश्यों और प्रतिक्रिया जानकारी इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सारणी 2
तालिका 2:। रीसस मकाक IFN प्राइमर / जांच सेट दृश्यों और प्रतिक्रिया जानकारी इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्लाज्मिड एकाग्रता (एफएम)
एक बी सी डी
IFN-α1 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α2 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α4 2500 250 25 2.5
IFN-α5 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α6 250 25 2.5 0.25
IFN-α7 250 25 2.5 0.25
IFN-α8 250 25 2.5 0.25
IFN-α10 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α14 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α16 250 25 2.5 0.25
IFN-α17 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α21 25 2.5 0.25 0.025
IFN-λ1 25 2.5 0.25 0.025
IFN-λ2 25 2.5 0.25 0.025
IFN-λ3 250 25 2.5 0.25
IFN-β 25 2.5 0.25 0.025
IFN-ω 250 25 2.5 0.25

तालिका 3: मानक कमजोर पड़ने सेट एकाग्रता जानकारी।

IFN पीआर / पंजाब समूह जोड़ा पानी की मात्रा जोड़ा (माले)
एनटीसी 1 IFN-β, -ω, -λ3 85.7
एनटीसी दो IFN-α1, -α5 100.0
एनटीसी 3 IFN-α2 114.3
एनटीसी 4 IFN-α4 114.3
एनटीसी 5 IFN-α7 114.3
एनटीसी 6 IFN-α6, -α8, -α10 85.7
एनटीसी 7 IFN-α14, -α16 100.0
एनटीसी 8 IFN-α17 114.3
एनटीसी 9 IFN-α21, -λ1 100.0
एनटीसी 10 IFN-λ2 114.3

टेबल 4: एनटीसी काम कर शेयर जानकारी घोला जा सकता है।

Discussion

इस रिपोर्ट के डिजाइन, बैच उत्पादन, और एक अनुसंधान प्रयोगशाला स्थापित करने में अत्यधिक समान जीन का एक सेट के प्रतिलेखन को मापने के लिए एक परख का विश्लेषण करने की दिशा में एक दृष्टिकोण का वर्णन है। यहां बताया उच्च throughput QRT- पीसीआर परख IFN- और उपाय - उच्च विशिष्टता के साथ λ उपप्रकार। इस विधि के दो प्रमुख पहलुओं, एक मुताबिक़ जीन परिवार के सदस्यों और पीआर / पंजाब सेट के साथ preloaded विश्वसनीय और लगातार 384 अच्छी तरह से परख प्लेटों के निर्माण के लिए एक उत्पादन मंच के विकास के बीच भेदभाव है कि पीआर / पंजाब सेट की डिजाइन शामिल है। QRT- पीसीआर जांच उनकी विशिष्टता 29 को बढ़ाने की दिशा में एक संरचनात्मक (MB) या रासायनिक (LNA) दृष्टिकोण को शामिल। रीसस परख (तालिका 2) में प्राइमर सेट दोनों के लिए, प्रवर्धन-दुर्दम्य उत्परिवर्तन प्रणाली (हथियारों) आगे विशिष्टता 30 बढ़ाने के लिए प्राइमर दृश्यों में शामिल किया गया था। यह enha को एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों लक्षित करने के लिए आम तौर पर सबसे अच्छा हैप्रकार मैं जीन इंट्रोन्स की कमी IFN क्योंकि एक QRT- पीसीआर प्रतिक्रिया के nce विशिष्टता, यह संभव नहीं था। इसलिए, जीनोमिक डीएनए पीसीआर प्रतिक्रिया में परिलक्षित हो जाएगा, और शाही सेना निकासी के बाद DNase उपचार द्वारा अपमानित किया जाना चाहिए।

पीआर / पंजाब सेट के लिए लक्ष्य क्षेत्र प्रत्येक IFN के लिए परिपक्व पेप्टाइड की कोडिंग क्षेत्रों के लिए प्रतिबंधित किया गया था। क्योंकि IFN-α उपप्रकार, विशेष रूप से परिपक्व पेप्टाइड क्षेत्र के बीच उच्च अनुक्रम समानता के कारण, यह विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए संवेदनशीलता समझौता करने के लिए कभी कभी जरूरी हो गया था। यह विशेष रूप से अन्य IFN-α उपप्रकार के खिलाफ मुकाबले में जब परिपक्व पेप्टाइड प्रतिलेख केवल चार अद्वितीय कुर्सियां ​​है जहां IFN-α17, साथ मामला था। लक्ष्य निर्धारण IFN-α17 जांच करने के लिए विशिष्टता को सीमित, कई उपप्रकार के टेप है कि बाँध प्राइमरों की आवश्यकता है। एक परिणाम के रूप में, पीसीआर प्रतिक्रिया जिससे पीसीआर अभिकर्मकों और Loweri का एक बड़ा प्रतिशत खपत, IFN-α17 के अलावा अन्य उपप्रकार बढ़ाना होगाIFN-α17 के लिए विशेष जांच से प्रतिदीप्ति संकेत के आयाम एनजी। ऐसे IFN के रूप में अत्यधिक समान जीनों के लिए संवेदनशील और विशिष्ट पीआर / पंजाब सेट डिजाइनिंग की दिशा में एक अतिरिक्त चुनौती GenBank डेटाबेस में एनोटेट दृश्यों डिजाइन के समय पर पूर्ण या व्यापक नहीं हो सकता है कि संभावना है। फिर, यह नव एनोटेट दृश्यों को पूरी तरह से डिजाइन की समय डेटाबेस में अनुक्रम के संस्करण के साथ पंक्ति में नहीं है जिसमें IFN-α17 के लिए एक चुनौती थी। पीआर डिजाइनिंग इसलिए, जब / पंजाब गहन अध्ययन नहीं किया गया है कि जीन के लिए सेट है, यह समय समय पर एक लक्ष्य जीन की नवीनतम एनोटेट अनुक्रम जाँच करने के लिए बुद्धिमान है। अंत में, यह जनसंपर्क / पंजाब सेट लिखित लेकिन अनुवाद नहीं किया जा सकता है कि pseudogenes बढ़ाना नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।

पीआर / पंजाब सेट डिजाइनिंग के बाद, अगली चुनौती के सत्रह अलग पीआर / पंजाब की पीसीआर शर्तों के अनुकूलन है एक 384 अच्छी तरह से थाली पर सेट। ट्रांसक्रिप्ट मानकों महत्वपूर्ण हैंएक पीआर / पंजाब सेट की विशिष्टता का परीक्षण और कई अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं का QRT- पीसीआर स्थितियों में तालमेल के लिए आवश्यक हो गया में उग्रवादी। प्रतिलेख मानकों के खिलाफ एक पीआर / पंजाब सेट का परीक्षण कर अपनी क्षमता और संवेदनशीलता स्थापित करता है; अत्यधिक समान pseudogenes व्यक्त कि प्लास्मिड सेट पीआर / पंजाब चुनिंदा कार्यात्मक जीन का प्रतिलेखन कि उपायों को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। प्रतिलेख मानकों को भी एक गृह व्यवस्था जीन (ΔCq) करने के लिए अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण रिश्तेदार के अलावा, विश्लेषण का एक मात्रात्मक साधन (टेप की संख्या) प्रदान करते हैं।

एकाधिक 384 अच्छी तरह से परख प्लेटों में एक 96 अच्छी तरह से स्रोत थाली से रोबोट मल्टीचैनल pipetting के सटीक और अंतर-प्लेट परिणामों की स्थिरता में सुधार। करता प्लेटों में तिरस्कृत अभिकर्मकों सुखाने के रूप में सामन शुक्राणु डीएनए (ssDNA), स्थिर और लंबी अवधि के भंडारण के लिए पीआर / पंजाब सेट को बरकरार रखता है कि एक कैरियर के रूप में प्रयोग किया जाता है। प्लेटें सुखाने भी प्रतिक्रिया की मात्रा कम हो जाती हैबदले में कीमती नमूनों को बरकरार रखता है और महंगा अभिकर्मकों का उपयोग कम हो जाती है, जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए आवश्यक है। इन कदमों के माध्यम से, प्लेटों के बैच अधिक से अधिक छह महीने के लिए सटीक और स्थिरता प्रदान कि इकट्ठा कर रहे हैं।

प्लेट तैयार करने के बाद, गुणवत्ता नियंत्रण उपायों प्लेटों के एक बैच की निरंतरता की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रयोजन के लिए मानकों का एक अतिरिक्त चार सेट एक थाली पर चलाए जा रहे हैं। "5x मानक" थाली प्रदर्शन पटरियों और एक व्यक्ति की थाली के मानकों की तुलना में कर रहे हैं, जो करने के लिए एक डाटा सेट बनाता है। प्रत्येक मानक के दस दस गुना dilutions परख डिजाइन के दौरान इस्तेमाल कर रहे हैं, जबकि अंतरिक्ष विचारों चार अंक प्रत्येक परख थाली पर मानक वक्र के लिए प्रयोग किया जाता है, और 5x मानक प्लेट के लिए कर रहे हैं कि आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, एक सकारात्मक नियंत्रण प्लेट की वैधता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक थाली पर शामिल किया जाना चाहिए।

आमतौर पर, यह जनसंपर्क / पंजाब के एक से छह परख प्लेटें तैयार करने के लिए 3-4 घंटे लग जाते हैंस्रोत देखें प्लेट; यह एक अनुसंधान प्रयोगशाला में एक ही दिन में बारह प्लेटें तैयार करने के लिए संभव है। प्रत्येक मानव IFN उप परख थाली सत्रह पीआर / पंजाब सेट की जाँच और पंद्रह प्रयोगात्मक नमूनों को समायोजित कर सकते हैं, विधानसभा के एक दिन 3060 प्रयोगात्मक डेटा बिंदुओं को उत्पन्न करने की क्षमता के साथ प्लेटों की एक बैच पैदा करता है। QRT- पीसीआर मंच से कच्चे डेटा संसाधित और स्वचालित रूप से एक पहले से डिज़ाइन विश्लेषण टेम्पलेट भरने के लिए एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर में प्रोग्रामिंग लिपियों का उपयोग कर इकट्ठा किया जा सकता है। इस विधि के हाथ पर डेटा प्रविष्टि, जिससे रोकने नकल त्रुटियों को कम करता है और अन्वेषक डेटा विश्लेषण के बजाय डेटा विधानसभा पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है। यहाँ वर्णित है, इस उच्च throughput QRT- पीसीआर परख मानव या रीसस मकाक नमूनों में इंटरफेरॉन उपप्रकार की अभिव्यक्ति को मापने के लिए लागू किया जा सकता है और अन्य प्रजातियों या मुताबिक़ जीन सेट के लिए उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। थाली लेआउट के लचीलेपन उपयोगकर्ता प्राइमर बदलने की अनुमति देता / जांच के जीन दर्जी के लिए सेटएक विशेष सेल प्रकार या मॉडल प्रणाली की ओर ब्याज। यह परख प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल संकेतन तंत्र को स्पष्ट करने के लिए रोगजनकों का अध्ययन सेल संस्कृति मॉडल में या रोग मॉडल के संदर्भ में रोगी के नमूने में IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों को मापने के लिए लागू किया जा सकता है।

Acknowledgments

इस काम CBER / एफडीए NIAID / एनआईएच Interagency करार यी-ऐ-6153-01, एफडीए / CBER अंदर का धन, और एफडीए मेडिकल Countermeasures इनीशिएटिव द्वारा समर्थित किया गया। TCT, MNB, VPM, एलएमएस, और KDK अमेरिका के ऊर्जा Departmen और अमेरिका के बीच एक interagency समझौते के माध्यम से विज्ञान शिक्षा के लिए ओक रिज संस्थान द्वारा प्रशासित बायोलॉजिक्स मूल्यांकन और अनुसंधान के लिए केंद्र पर रिसर्च भागीदारी कार्यक्रम के लिए एक नियुक्ति के द्वारा समर्थित थे खाद्य एवं औषधि प्रशासन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR Tube Strips  Eppendorf (Westbury, NY, USA) E0030 124 286
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5 ul Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-139 *Discontinued
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30 ul Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-137 *Discontinued
12-channel Electronic Pipette, 5-250 ul Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-118 *Discontinued
2.0 ml Micro Centrifuge tube, sterile Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) 229446
8-channel Electronic Pipette, 15-1250 ul Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-115 *Discontinued
Disposable Reagent Reservoirs  VWR International (Radnor, PA, USA) 89094-668 25mL reservoirs with 2 dividers
E-Centrifuge Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) 1090003
Eukaryotic 18S rRNA (18S) Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) Hs99999901_s1 Rhesus HKG Primer/probe set
Fixed Speed Mini Vortexer Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 02-215-360
Gas Permeable Adhesive Plate Seal Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) AB-0580 Disposable plate seal used during the plate preparation process 
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) FBR (Silver Spring, MD, USA) Custom Order Human HKG Primer/probe set
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) Rh02621745_g1 Rhesus HKG Primer/probe set
Hudson Solo automated multichannel pipettor  Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) 800200 Modified with a 384-well cooling nest
Linearized plasmids (IFN genes) Aldevron (Fargo, ND, USA) Custom Order Item 3000, 3580; used for assay standards 
LNA inhibitors Exiqon (Woburn, MA, USA) Custom Order Item 500100
LNA Probes Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) Custom Order Material number VC00023
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5 ul Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-193
Matrix Filtered Pipet Tips, 30 ul Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-196
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1,250 ul Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-160
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ul Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-152
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 4309849
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 4311971 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run 
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet Microsoft (Redmond, WA, USA)  Office 2010 Visual Basic programming language 
MixMate Vortex Mixer Eppendorf (Westbury, NY, USA) 5353 000.014 2 dimensional plate vortex apparatus
Molecular Beacon Probes FBR (Silver Spring, MD, USA) Custom Order
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes Eppendorf (Westbury, NY, USA) Z606634-1EA
Plate Dryer (manifold) Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) Custom Order
Primer sets FBR (Silver Spring, MD, USA) Custom Order
pUC57 plasmid DNA Genescript (Piscataway, NJ, USA) SD1176
Rnase-Free 1.5 ml Microfuge Tubes Life Technologies (Grand Island, NY, USA) AM12400
RNase-free DNase Set (50) Qiagen (Valencia, CA, USA) 79254
RNase H New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) M0297L
RNeasy Mini Kit (250) Qiagen (Valencia, CA, USA) 74106
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) 800350-S
Salmon Sperm DNA Solution Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 15632-011
SoftLinx Version V Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) Custom Order Software for programming pipetting steps
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG Life Technologies (Grand Island, NY, USA) 4352042
ABgene Adhesive Plate Seals   Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) AB0580
Ubiquitin C (UBC) Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) Hs01871556_s1 Human HKG Primer/probe set
Verso cDNA synthesis Kit Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) AB1453B
ViiA 7 Real-Time PCR System Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 4453536
Water-Ultra Pure Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) 351-029-101
Zipvap 384 (plate dryer heating element) Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) 384-109A Plate Dryer

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 97 इंटरफेरॉन अंतर्जात प्रतिरक्षा QRT- पीसीआर परख जांच प्राइमरों स्वचालित pipetting
उच्च throughput मात्रात्मक वास्तविक समय आरटी पीसीआर परख प्रकार मैं और तृतीय इंटरफेरॉन उपप्रकार की अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारण के लिए
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Renn, L. A., Theisen, T. C.,… More

Renn, L. A., Theisen, T. C., Navarro, M. B., Mane, V. P., Schramm, L. M., Kirschman, K. D., Fabozzi, G., Hillyer, P., Puig, M., Verthelyi, D., Rabin, R. L. High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes. J. Vis. Exp. (97), e52650, doi:10.3791/52650 (2015).

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