Introduction
Typ I och III interferoner (IFN) är kritiska i immunsvaret mot virus och andra patogena stimuli och förekommer i alla ryggradsdjur en. Immun och icke-immunceller uttrycker och utsöndrar, samt svara på, IFN 2. Medfödda immun sensorer, såsom avgifts liknande receptorer (TLR), STING och RIG-I, framkalla typ I och III IFN uttryck vid detektering av patogener associerade molekylära mönster (Pamp) 3,4. Hos människor, typ I IFN inkluderar IFN-β, -ω, -κ och 12 subtyper av IFN-α, och binder till IFNAR1 / IFNAR2 receptorkomplexet 2,5. Typ III IFN inkluderar IFN-λ1, -λ2 och -λ3 och binda till IL10RB / IL28RA receptorkomplexet 2. Klassiskt, typ I och III IFN binder till sina respektive receptorkomplex som sedan rekrytera STAT1 / STAT2 heterodimerer och initierar transkription av interferon stimulerade gener (ISG) 6. ISG är involverade i en rad olika funktioner, från antiviral och antiproliferativ aktivitet till aktivering av det adaptiva immunsvaret 7.
De många mekanismer patogener har utvecklats för att kringgå, gräva och kapa delar av IFN signalväg visar vikten av IFN i det medfödda immunsvaret 8. Till exempel, uttrycker vacciniavirus ett lockbete receptor med IFNAR1 homologi som binder typ I IFN 9 medan en Yaba-liknande sjukdomsvirus utsöndrar ett glykoprotein som hämmar typ I och III IFN proteiner 10. Förutom deras roll i värdförsvar, är IFN också inblandade i cancer övervakning och ett antal auto-inflammatoriska sjukdomar: tysta IFN uttryck i bröstcancerceller begränsar immunosurveillance 11, är överproduktion av IFN-α en mekanism i utvecklingen av systemisk lupus erythematosus 12, och vandrande aktivering av STING leder till systemisk inflammation som orsakas av stora mängder av IFN i STING-associerad vaskulopati13. Terapeutiskt IFN används för att behandla multipel skleros 14, kroniska virusinfektioner, såsom HBV 15 och HCV 16,17, och cancrar såsom hårcellsleukemi 18 och kronisk myelogen leukemi 19. Frågor om relevansen av IFN i en viss fysiologisk process avslöjar ständigt karaktär som allestädes närvarande denna cytokin familjen.
Typ I IFN, speciellt IFN-α subtyper, anses ofta som en enhet 20-23, snarare än som en grupp av närbesläktade, men distinkt, proteiner. Förekomsten och ihållande flera IFN arter inklusive IFN-α subtyper, hela ryggradsdjurens evolution 24 antyder att åtminstone en delmängd av dessa subtyper har specifika eller unika funktioner. Det är möjligt att definiera mönster av IFN uttrycket kommer dechiffrera och hjälpa karakterisera specifika funktioner av en eller flera av de undertyper 17. Utmaningen att studera than typ I och III IFN-subtyper är baserat på deras gemensamma sekvensidentitet: de tolv IFN-α subtyper delar> 50% 25 och IFN-λ subtyper delar 81-96% 26 av deras aminosyrasekvenser. I den beskrivna QRT-PCR-analys, molekylär beacon (MB) och låst nukleinsyra (LNA) fluorescerande prober diskriminera enstaka basparsskillnader mellan de i hög grad liknande IFN subtypsekvenser och möjliggöra karakteriseringen av IFN expressions signatur. Analysen har 384-brunnar formatet inkluderar både kvantitativa (avskrift standarder) och semi-kvantitativa (hushållning gener (HKG)) åtgärder, vilket möjliggör analys av avskrift antal kopior och ΔCq respektive. Batch montering, underlättas av automatiserad flerkanalig pipettering, och långtidslagring, möjligt genom torkning primern / proben (Pr / Pb) sätter på plattorna, förbättra reproducerbarhet, nytta, och praktiska analysen.
Detta protokoll beskriver processenför att förbereda 384-väl QRT-PCR analysplattor (Figur 1) med upp till sjutton olika Pr / Pb-apparater riktar humana IFN subtyper (Tabell 1). Pr / Pb ställa arbets lager källplattor (Figur 2) används för att framställa flera 384-väl analysplattor i en process som kan automatiseras med hjälp av en robot flerkanalspipett. Medan den initiala fokus på att skapa ett protokoll för att studera mänskliga IFN uttryck signaturer, har denna metod tillämpats på rhesusmacaques också. Även plåt layouter är något annorlunda och Pr / Pb-apparater (Tabell 2) är distinkta, är det övergripande förberedelse metod för att skapa mänskliga och rhesus plattor identiska. Med minimala modifieringar av protokollet, kan metoden exekveras för att möjliggöra utveckling av analyser för att studera andra grupper av närbesläktade gener.
Se figur 1 och 2 nedan
Se tabellerna 1 och 2 BelAJ
Protocol
1. Beredning av standardseriespäd (Figur 3A)
OBS: Seriespädningsserie av arise plasmider som innehåller de sekvenser som omfattas av en Pr / Pb set används som kvantitativa standarder för QRT-PCR-analys. Varje standard seriespäduppsättning för IFN subtyper innehåller tillräckligt med volym för att köra 90 analysplattor. De fyra punkterna i standardspädningskurvan som används för analysen är valda för att täcka Ct-värden från ett intervall av 20 till 32 (tabell 3).
- Tina, och centrifugera vortex kort standarden (50 PM) och laxsperm DNA (ssDNA, 10 mg / ml) stamlösningar.
- Förbered ssDNA / vatten mix för de 17 standardutspädnings uppsättningar genom att blanda 51 pl ssDNA med 20,3 ml vatten.
- Märk en 8-tube PCR band för en standardspäduppsättning.
OBS: Framställning av standard serieutspädningar från stamlösningarna kommer att ta 2-3 timmar. - Fördela 190 pl av ssDNA / vattenblandning till fIRST röret i remsan och 180 pl ssDNA / vattenblandning till de fem återstående rören.
- Utför 1:20 genom att överföra 10 ni från 50 pM standard lager till röret med 190 pl av ssDNA / vatten, blanda; virvel och snabbt centrifugera PCR remsan.
- Utför en 1:10 spädning genom att överföra 20 | il från den senast utspädda röret till nästa rör i serien; virvel och snabbt centrifugera PCR remsan.
- Upprepa steg 1.6 till sista röret i utspädningsserien har fått standarden.
- Upprepa steg 1,3-1,7 för varje standard.
Se Tabell 3 nedan
2. Beredning av Primer / Probe (Pr / Pb) och No Mall Control (NTC) Working Stock Mixes (Figur 3B)
OBS: Varje 1,7 ml Pr / Pb ställa arbets lager och 128,6 pl Nej Mall Kontroll (NTC) som arbetar lager mix kommer att göra 30 analysplattor.
- Förbered Pr / Pb ställa arbetande lager mixar.
INTEE: Framställning av Pr / Pb set och NTC arbetar lager blandar från stamlösningar kommer att ta 2-3 timmar.- Resuspendera primers och prober på 100 iM med ultrarent vatten för beredning av stamlösningar.
- Märk upp till sjutton 2 ml rör; en för varje Pr / Pb uppsättning inkluderade i analysen.
- Tina, och centrifugera vortex kort primers (100 iM), sonder (100 iM) och ssDNA (10 mg / ml) stamlösningar.
- Tillsätt 2 pl ssDNA till varje rör med hjälp av 12,5 l elektroniska flerkanalspipett. Lägg lämplig främre primer, bakåt primer och sond till varje Pr / Pb ställa arbetsaktieröret. Se tabell 1 för Pr / Pb-apparater riktar mänskliga IFN subtyper och tabell 2 för rhesus makak Pr / Pb-apparater. Tillsätt vatten så att volymen för varje Pr / Pb ställa arbets lager röret till 200 ^.
OBS: Volymen av primers, sond, och vatten för att lägga beror på den erforderliga reaktions koncentrationen av ett Pr / Pb finalinställd.
- Förbered NTC arbetande lager mixar.
- Etikett två 5-tube PCR remsor för NTC arbets bestånden blandar.
- Överför 14.3 il av varje Pr / Pb inställd för rätt NTC arbetsaktie mix röret. Se tabell 4 för Pr / Pb set kombinationer för NTC brunnar. Tillsätt vatten till var och en av NTC arbets lager blandar för att få den slutliga volymen till 128,6 l.
- Vortex, kort centrifug, och placera rören i mörker på is eller vid -20 ° C för långtidsförvaring.
Se tabell 4 nedan
- Späd Pr / Pb ställa arbetande lager.
- Efter avlägsnande av en alikvot av Pr / Pb-apparater som krävs för NTC arbetar aktie mixar, till 1,5 ml vatten för att få den slutliga volymen av varje Pr / Pb ställa arbets lager röret till 1,7 ml.
- Vortex, kort centrifugering, och placera rören i mörker på is eller vid -20 ° C för längre tids lagring sikt.
- Förbered en 96-väl källplatta av Pr / Pb-apparater och NTC Blandningar alikvotering till 384 brunnar analysplattor.
OBS: Förberedelse av källplattan från Pr / Pb fungerar aktie mixar tar mindre än 1 timme. Varje 96-väl källplatta är nog att göra sex 384-well analysplattor (Figur 3C).- Vortex och kort centrifugera Pr / Pb ställa arbets aktier och NTC arbetar aktie mixar.
- Placera en ny 96-brunnar i en kyld 96-väl kylblock och utse brunnarna för varje Pr / Pb set eller NTC blanda brunnarna erhåller (se figur 2).
- Tillsätt vatten till 96-brunnar med hjälp av en 250 ^ elektronisk flerkanalspipett: Fördela 66 l vatten till varje Pr / Pb satt väl (förutom de fyra brunnar för Target 17). Dispensera 82,5 | il vatten till 4 Target 17 brunnar. Fördela 27,5 l vatten till varje NTC blanda väl. Lägg in rätt Pr / Pb inställd arbets lager till de utsedda brunnarna i 96-brunnar: Fördela 54 pl av rätt Pr / Pb inställd arbets lager till de utsedda Pr / Pb set brunnar (förutom de fyra brunnar för Target 17). Fördela 67.5 il av Target 17 Pr / Pb inställd arbets lager till de utsedda Target 17 Pr / Pb set brunnar. Lägg 22,5 pl av rätt NTC arbets lager mix till de utsedda brunnarna.
- Täta 96-brunnar med en adhesiv platta tätning och centrifugera i 1 min vid 700 xg för att säkerställa att innehållet är på botten av brunnarna.
- Placera 96-brunnar i virvelblandaren med hjälp av en 96-brunnars plattadapter och blanda under 1 min vid 1000 rpm. Centrifugera 96-brunnar under 5 min vid 700 x g.
- Förvara 96 brunnar källplattan i mörker vid 4 ° C om att använda i samma dag, annars lagra vid -20 ° C fram till användning.
- Förbered 384-väl analysplattor genom att lägga till Pr / Pb sätter använder automatiserade flerkanalspipett.
OBS: Framställning av sex analysplattor från 96-brunnars-källplatta tar 3-4 h.- Före göra plåtar, för-kyla det kylande boet till 4 ° C och i förväg värma plattindunstare till 125 ° C och det nedre värmeblocket till 80 ° C med luftflöde blåser mellan 20-25 liter per minut (LPM).
- Slå på den automatiserade flerkanalspipett och öppna protokoll för att göra IFN analysplattor genom att dubbelklicka på ikonen programvaran.
- För att ställa plattformen, placera en helt full pipettspetsen låda i plattformsläge 1, den 96-väl källplatta i position 4, och en ny 384-brunnar i position 6. Börja körningen genom att trycka på play-knappen.
OBS: Efter avslutad en körning, varje brunn innehåller 5 pl Pr / Pb mix.
OBS: Det slutliga beloppet av ssDNA sattes per brunn av 384 brunnar analysplatta är 0,025 ug. - Knacka försiktigt på 384 brunnar analysplatta på en plan yta för att säkerställa vätskor är i botten av brunnarna och applicera ett limplatttätningen.
- Centrifugera plattan under 1 min vid 700 x g. Avlägsna klisterplattan tätningen, placera 384 brunnar analysplatta i plattan torktumlare och placera 384-väl grenrör direkt ovanför brunnarna.
- När 384-väl analysplattans innehållet torrt, applicera en ny klisterplatta tätning, linda in i folie, etikett, och förvara i mörker vid 4 ° C fram till användning.
OBS: Plattorna kan lagras vid 4 ° C i minst sex månader. - Upprepa steg 3.2.3-3.2.6 fram till 6 x 384 brunnar analysplattor bereds eller vätskan i 96-väl källplatta är slut.
- Stäng av kylnings boet, stänger programvaran, och stäng av automatiserade flerkanalspipett. Stäng av plattan torktumlare.
4. Ladda och köra ett 384-väl Assay Plate
- Förbered två hushållning gen (HKG) väl mixar, som består av Pr / Pb set för en HKG, ssDNA, PCR Master Mix, och vatten, som ska läggas till en torkad 384 brunnar analysplatta (
- Märk ett 1,5 ml rör för varje HKG mix.
- Späd 2 il ssDNA (10 mg / ml) med 84,9 | il vatten. Tillsätt 2 pl av den utspädda ssDNA, 11.8 il vatten, 23 pl huvudblandning och 9.2 l av rätt 20x HKG Pr / Pr inställd på varje rör, virvel, och kort centrifug.
- Använd glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) och ubikitin C (UBC) som HKG för det humana analysen (se Material tabell). Använd GAPDH och 18S ribosomalt RNA som HKG för rhesus-analysen.
OBS: HKG används för att utföra analysen är flexibla och bör återspegla de gener som är lämpliga för den celltyp som testas GAPDH, UBC, och 18S är exempel på vanligt förekommande HKG;. andra HKG kan vara mer lämpligt.
- Förbered provet och positive styra väl mixar, som består av provet eller positiv kontroll cDNA, Master Mix och vatten, som ska läggas till en torkad 384 brunnar analysplatta. Förbered provet och de positiva kontrollblandningar i tillräckligt mängd för att dispensera till 21-plattbrunnar (Figur 3D).
- Före cDNA-syntes, följ tillverkarens instruktioner för att förbereda RNA-prover med ett DNas matsmältningen steg.
- Förbered proverna och positiv kontroll i förväg från cDNA-syntesen av åtminstone 500 ng RNA, följt av behandling med RNas H (slutvolym av 24 ul för varje prov) genom att följa tillverkarens instruktioner. Förvara beredd cDNA vid -20 ° C fram till användning. Tina, och centrifugera vortex kort prov cDNA.
- Lägg 78,8 pl huvudblandning och 54.8 l vatten till varje prov 24 pl och positiv kontroll röret.
- Vortexa och kort centrifugera rören.
- Förbered de normer och NTC väl blandar, conbestående av huvudblandning och vatten, som skall sättas till en torkad 384-brunnars analysplatta (Figur 3D). För de standarder väl blanda, tillsätt 165 l vatten till 275 pl huvudblandning i en 1,5 ml rör. För NTC väl blanda, tillsätt 52,5 l vatten till 52.5 pl huvudblandning i en 1,5 ml rör. Vortexa och kort centrifugera rören.
- Förbered en torkad 384 brunnar analysplatta för laddning av mixar och prover.
- Ta bort en torkad 384 brunnar analysplatta från 4 ° C och centrifugera i 1 minut vid 700 x g.
- Placera plattan på en kyld 384 brunnar kylblock, ta bort den självhäftande plattan tätningen och beskriva de brunnar i plattan att utse var de olika mixar och prover kommer att pipetteras (Figur 1).
- Fyll på 384 brunnar analysplatta med standard väl mix, standarder, NTC väl blanda, prover, positiv kontroll och HKG mix (figur 3E). Vortex och kort centrifugera alla lösningar innan dispense till plattan.
- Fördela 6 pl av standarderna väl blanda till varje standard väl med 30 pl elektroniska flerkanalspipett. Fördela 1,5 ^ rätt standard serieutspädning till den utsedda väl med 12,5 l elektroniska flerkanalspipett.
- Fördela 7.5 pl NTC väl blanda till varje NTC väl med 30 pl elektroniska flerkanalspipett. Fördela 7.5 il av provet till de utsedda brunnarna med 30 pl elektroniska flerkanalspipett. Fördela 2.5 il av HKG Pr / Pb blandar till de utsedda brunnarna med 12,5 l elektroniska flerkanalspipett.
- Fyll alla tomma brunnar med 7,5 pl av överblivna vattnet och master mix blandning med 30 pl elektroniska multikanalpipett; 7.5 l vatten enbart kommer också att arbeta.
- Täta 384-brunnars analysplatta med den optiska limfilm och centrifugera i 1 min vid 700 x g. Vortexa den förseglade 384-brunnars platta i virvelblandare under 2 min vid 2600 rpmoch centrifugera under 5 min vid 700 x g.
- Placera den förseglade 384-brunnars analysplatta i QRT-PCR-maskin, öppna mallen för analysen layout och påbörja körningen.
OBS: Resultat kan exporteras som ett kalkylblad eller som en textfil för analys. - Använd följande optimala termocyklern reaktionsbetingelser för analysen: i) 50 ° C under 2 min, ii) 95 ° C under 10 min, iii) 95 ° C under 25 s, iv) 59 ° C under 1 min. Upprepa steg III och IV i 40 cykler.
- Exportera rådata från QRT-PCR-plattformen till ett kalkylprogram programvara. Rita varje 4 poäng standard inställd som en standardkurva för att observera linjäritet. Utför analys genom att beräkna ΔCq eller antal kopior utifrån de fyra punktstandardkurvor 27.
Se Figur 3 Nedan
Representative Results
Den QRT-PCR-analysen som beskrivs kan implementeras för att analysera uttrycksmönstret för typ I och III IFN i en mängd olika celltyper och sammanhang. Till exempel var mänsklig typ I och III IFN uttrycks signaturer analyseras i perifera mononukleära blodceller (PBMC) från 6 donatorer stimulerade med TLR ligander; poly-I: C (25 ^ g / ml), LPS (10 ng / ml), imiquimod (10 | iM), och CpG-oligonukleotider (1 pM) (figur 4). Data analyserades med hjälp av ett kalkylprogram programvara och presenteras som radardiagram med IFN-α subtyper arrangerade medurs enligt den fylogenetiskt träd av deras proteinsekvens 27. Radar sjökort av mänsklig IFN uttryck presenteras i en logaritmisk skala beräknas med hjälp av två olika analysmetoder införlivas i analys designen: absolut Cq värdet normaliserat till HKG (ΔCq), och kopiera antal mall per mikrogram (ng) av total-RNA . Kopiera siffervärden beräknas från resultaten o fa avskrift standardkurva. Data visar att mänskliga IFN uttrycks signaturer framkallade av TLR-agonister är ligandspecifik.
Se Figur 4 Nedan
Som visats för de mänskliga IFN uttrycks signaturer, uttrycks underskrifter av typ I och III IFN i rhesusmacaques var också TLR ligandspecifik. PBMC från tre donatorer stimulerades med poly-I: C (50 ^ g / ml), LPS (10 pg / ml), och imiquimod (10 | ig / ml) under 3 h (figur 5). IFN subtyp uttryck i ostimulerade celler vid baslinjen var låg. Ett begränsat antal IFN subtyper uttrycktes som svar på LPS och poly I: C. Däremot IFN uttryck som svar på imiquimod var hög och subtyp uttrycket var bred. Uttryck av IFN-β och IFN-λ1 har förbättrats genom alla tre TLR agonister 28.
Se Figur 5 Nedan
alltid ">
Figur 1:. Layouten för en 384-väl analysplatta med sjutton Pr / Pb-apparater målnummer hänvisar till en Pr / Pb set. De fyra punktstandardkurvor (mörkgrå triangel) läggs till kolumnerna 1-5. De HKG Pr / Pb uppsättningar (vit bakgrund) läggs till kolumnerna 6 och 7. De återstående kolumnerna, 8-24, är specifika för en av de sjutton Pr / Pb-apparater. Prover läggs till rader AP, från kolonnerna 6-24 (svarta pilar). De två brunnar (O5, P5) längst ner på kolumn 5 får endast vatten och Master Mix. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Layouten för en 96-håls källplatta med sjutton Pr / Pb-apparater Mål nummer hänvisar till en Pr / Pbinställd. Svarta pilar representerar då en Pr / Pb set läggs till flera brunnar. NTC mixar läggs till de utsedda brunnarna (mörkgrå bakgrund). De två brunnar (F3, G3) med diagonala linjer är oanvända. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk specifika steg i QRT-PCR analysprotokoll AE diagrammet väljer delar av protokollet.. (A) Steg 1: Beredning av standardseriespäd. (B) Steg 2: Framställning av Pr / Pb och NTC arbetar aktie mixar. (C) Steg 3.1: Beredning av en 96-väl fungerande lager platta av Pr / Pb-apparater och NTC mixar. (D) Steg 4,1-3: Beredning av blandningar för laddar 384 brunnar analysplatta. (E) Step 4,5: Fylla på 384-väl analysplatta. Diagram läses från övre vänstra till nedre högra hörnet. Reagens för interferon (IFN) -analys lagras vid -20 ° C och listas i den vänstra kolumnen; linjer separata åtgärder i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Den humana IFN uttrycket signatur i perifera mononukleära blodceller (PBMC) skiljer sig i svar på TLR ligander som används för stimulering PBMC stimulerades med TLR ligander och RNA skördades för QRT-PCR-analys.. Det geometriska medelvärdet av de maximala svar på poly-I: C (25 | ig / ml) vid 8 h (röda fyrkanter), LPS (10 ng / ml) vid 4 h (gröna trianglar), imiquimod (10 | iM) vid 16 h ( lila diamanter), CpG (1 ^ M) vid16 tim (svarta cirklar) och ostimulerade kontroll vid 16 h (blå cirklar) från 6 donatorer visas i loggen 10 skala som en funktion av uttryck av HKG UBC ΔCq (vänster) eller som antal kopior per pg av RNA (höger) . IFN-α-subtyper är ordnade efter det fylogenetiska plot av aminosyrasekvenslikhet. Denna siffra publicerades ursprungligen i immunologi och cellbiologi 27.
Figur 5:. Den rhesus makak IFN uttrycks signatur i perifera mononukleära blodceller (PBMC) skiljer sig i svar på TLR ligander som används för stimulering PBMC från tre rhesusmacaques (utsetts av torget, diamant, och triangel) isolerades från helblod och stimulerade med lipopolysackarid (LPS) (10 | ig / ml), poly-I: C (50 | ig / ml) eller imiquimod (10 pg / ml). Celler skördades vid 0 h (opan former) eller efter 3 h av TLR stimulering (slutna former) för mätning av IFN uttryck. Transkriptnivåer av typ I, II och III IFN visas i loggen 10 skala som en funktion av uttryck av HKG GAPDH ΔCq (vänster) eller som antal kopior / pg-RNA (höger). Denna siffra publicerades ursprungligen i Journal of interferon och cytokin Research 28.
Tabell 1:. Humant IFN grundfärg / probe set sekvenser och reaktionsinformations Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 2:. Rhesus makak IFN grundfärg / probe set sekvenser och reaktionsinformations Klicka här för att se en större version av denna tabell.
| Plasmid koncentration (fM) | ||||
| EN | B | C | D | |
| IFN-α1 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α2 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α4 | 2500 | 250 | 25 | 2,5 |
| IFN-α5 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α6 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α7 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α8 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α10 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α14 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α16 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α17 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α21 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-λ1 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-λ2 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-λ3 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-β | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-ω | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
Tabell 3: Standardinformation späd inställda koncentrationen.
| IFN Pr / Pb Ställer läggas | Vattenvolymen sätts (ml) | |
| NTC 1 | IFN-β, -ω, -λ3 | 85,7 |
| NTC 2 | IFN-α1, -α5 | 100,0 |
| NTC 3 | IFN-α2 | 114,3 |
| NTC 4 | IFN-α4 | 114,3 |
| NTC 5 | IFN-α7 | 114,3 |
| NTC 6 | IFN-α6, -α8, -α10 | 85,7 |
| NTC 7 | IFN-α14, -α16 | 100,0 |
| NTC 8 | IFN-α17 | 114,3 |
| NTC 9 | IFN-α21, -λ1 | 100,0 |
| NTC 10 | IFN-λ2 | 114,3 |
Tabell 4: NTC arbets lager blandar information.
Discussion
Denna rapport beskriver konstruktion, tillverkningsserier, och en inriktning på analys av en analys för att mäta transkription av en uppsättning mycket liknande gener i ett forskningslaboratorium inställning. Den hög genomströmning QRT-PCR-analys redovisas här mäter IFN och - λ subtyper med hög specificitet. Denna metod innebär två viktiga aspekter, utformningen av Pr / Pb-apparater som diskriminerar mellan medlemmar av en homolog gen familj och utveckling av en produktionsplattform för att skapa tillförlitliga och konsekventa 384 brunnar analysplattor förladdade med Pr / Pb-apparater. De QRT-PCR-sonder införliva ett strukturellt (MB) eller kemiska (LNA) strategi för att öka deras specificitet 29. För två av de primeruppsättningar i rhesus-analysen (tabell 2), var amplifieringen-Refractory Mutation System (ARMS) införlivas primersekvensema för att ytterligare öka specificiteten 30. Även om det är i allmänhet bäst att rikta exon-exon korsningar till EnhaNCE specificitet en QRT-PCR-reaktion, detta var inte möjligt eftersom den typ I IFN gener saknar introner. Därför kommer genomiskt DNA amplifieras i PCR-reaktionen, och måste brytas ned av DNas-behandling efter RNA-extraktion.
Målområdet för Pr / Pb-apparater var begränsad till de kodande regionerna av den mogna peptiden för varje IFN. På grund av den höga sekvenslikhet bland IFN-α subtyper, i synnerhet den mogna peptidregionen, var det ibland nödvändigt att kompromissa känsligheten för att ge specificitet. Detta var särskilt fallet med IFN-α17, där den mogna peptid avskriften har bara fyra unika baser jämfört mot de andra IFN-α subtyper. Targeting IFN-α17 krävs primrar som binder transkripten av multipla subtyper, begränsa specificitet till sonden. Som en följd av detta kommer PCR-reaktionen förstärka andra subtyper än IFN-α17 därigenom konsumerar en stor del av PCR-reagens och lowering amplituden hos fluorescenssignalen från den specifika sonden för IFN-α17. En ytterligare utmaning mot utforma känsliga och specifika Pr / Pb-apparater för mycket liknande gener såsom IFN är möjligheten att de kommenterade sekvenser i GenBank databasen kanske inte är fullständig eller heltäckande vid utformning. Återigen var det en utmaning för IFN-α17, där nyligen kommenterade sekvenser inte helt kan passas in med den version av sekvensen i databasen vid tiden för konstruktionen. Därför när man utformar Pr / Pb uppsättningar för gener som inte har intensivt studerats, är det klokt att regelbundet kontrollera den senaste kommenterad sekvensen av en målgen. Slutligen är det nödvändigt att säkerställa att de Pr / Pb-apparater inte förstärka pseudo som kan transkriberas men sätts inte.
Efter utformningen av Pr / Pb-apparater, är nästa utmaning att optimera PCR förhållanden sjutton olika Pr / Pb sätter på en 384-brunnar. Avskrift standarder är viktant testa specificiteten av en Pr / Pb set och blivit avgörande för att harmonisera QRT-PCR-förhållanden för de många olika PCR-reaktioner. Testa en Pr / Pb set mot avskrift standarder etablerar dess effektivitet och känslighet; plasmider som uttrycker mycket liknande pseudo kan vara nödvändiga för att säkerställa att Pr / Pb inställt mäter selektivt transkription av den funktionella genen. Transcript standarderna ger också en kvantitativ medel analys (antal utskrifter), förutom den semi-kvantitativ analys i förhållande till en hushållning gen (ΔCq).
Robotic flerkanalig pipettering från en 96-väl källplatta i flera 384 brunnar analysplattor förbättrar precision och konsekvens av interplatt resultat. Lax spermiens DNA (ssDNA) används som bärare som stabiliserar och bevarar de Pr / Pb-apparater för långtidsförvaring, liksom torkning av reagenser dispenseras i plattorna. Torkning plattorna också minskar volymen av reaktionennödvändig för reproducerbara resultat, vilket i sin tur bevarar dyrbara prover och minskar användningen av dyrbara reagens. Genom dessa steg, är partier av plattor monteras som ger precision och konsekvens i mer än sex månader.
Efter platt förberedelser, kvalitet kontrollåtgärder är kritiska för att kontrollera samstämmigheten ett parti av plattor. För detta ändamål är ytterligare fyra uppsättningar av standarder kördes på en platta. Den "5x standard" platta spår prestanda och skapar en datamängd till vilken en enskild platta standarder jämförs. Medan tio 10-faldiga utspädningar av varje standard används under analys design, utrymmes kräver att fyra punkter används för standardkurvan på varje analysplatta, och för 5x standardplattan. Dessutom bör en positiv kontroll inkluderas på varje platta för att garantera giltigheten av plattan.
Normalt tar det 3-4 timmar att förbereda sex analysplattor från en Pr / Pb source plattan; det är möjligt att förbereda tolv tallrikar på en enda dag i ett forskningslaboratorium. Eftersom varje människa IFN subtyp assayplatta undersöker sjutton Pr / Pb-apparater och rymmer femton experimentprover, en dag av montering producerar en sats av plattor med kapacitet att generera upp till 3060 experimentella datapunkter. Rådata från QRT-PCR-plattformen kan bearbetas och monteras med hjälp av programmerings skript i ett kalkylprogram programvara för att automatiskt fylla en fördefinierad analys mall. Denna metod minimerar hands-on datainmatning, och därigenom förhindra kopiering fel och gör utredaren att fokusera på analys av data snarare än uppgifter montering. Som beskrivs här, kan denna hög genomströmning QRT-PCR-analys tillämpas för att mäta uttrycket av interferon subtyper inom human- och rhesus makak prover och kan anpassas för att använda för andra arter eller homologa genuppsättningar. Flexibiliteten i plattslayouten tillåter användaren att ändra primer / probuppsättningar att skräddarsy generna avintresse mot en speciell celltyp eller modellsystem. Denna analys kan användas för att mäta IFN-expressions signaturer i cellodlingsmodeller studerar patogener eller i patientprover i samband med sjukdomsmodeller för att kartlägga de signalmekanismer som är inblandade i immunsvar.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency avtalet YI-AI-6153-01, FDA / CBER intramural medel, och FDA medicinska motåtgärder Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, och KDK stöddes av en utnämning till Vetenskaps Deltagande Program vid Centrum för Biologics utvärdering och forskning administreras av Oak Ridge Institute for Science Education genom ett Interagency avtal mellan USA departmen of Energy och USA Food and Drug Administration.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0 ml Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1,250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5 ml Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
References
- Yan, N., Chen, Z. J. Intrinsic antiviral immunity. Nature. 13, 214-222 (2012).
- Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
- Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
- Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
- Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
- Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
- Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
- Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
- Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
- Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
- Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
- Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
- Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
- Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
- Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
- Heathcote, J., Main, J. Treatment of hepatitis C. Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).
- Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
- Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
- Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
- Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
- Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
- Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
- Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
- Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
- Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
- Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933 (2009).
- Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
- Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
- Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
- Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).
