Summary
Cellemembranen-skur mikropartikler (MPS) er aktive biologiske vesikler som kan isoleres og deres patofysiologiske effekter undersøkt i ulike modeller. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å generere MP'er avledet fra T-lymfocytter (LMPs), og for å demonstrere deres proapoptotiske effekt på luftveis epitelceller.
Abstract
Interessen for de biologiske roller cellemembranen-avledet vesikler i celle-celle kommunikasjon har økt de siste årene. Mikropartikler (MPS) er en slik type vesikler, som varierer i diameter fra 0,1 pm til 1 pm, og vanligvis skur fra plasmamembranen av eukaryote celler som gjennomgår apoptose eller aktivering. Her beskriver vi generering av T-lymfocytt-avledede mikropartikler (LMPs) fra apoptotiske CEM T-celler stimulert med actinomycin D. LMPs isoleres gjennom en flertrinnsprosess differensialsentrifugering og karakterisert ved hjelp av flow cytometri. Denne protokollen presenterer også en in situ celledød deteksjonsmetode for å demonstrere apoptosiske effekten av LMPs på bronkial epitelceller som stammer fra mus primære luftveis bronkial vev explants. Fremgangsmåtene beskrevet heri tilveiebringe en reproduserbar fremgangsmåte for isolering av rikelig mengder LMPs fra apoptotiske lymfocytter in vitro. LMPs avledetpå denne måte kan brukes til å evaluere egenskapene til forskjellige sykdomsmodeller, og for farmakologi og toksikologi testing. Bruken av bronkial vev eksplantater fremfor immortaliserte epiteliale cellelinjer gitt at luftveisepitel har en beskyttende fysiske og funksjonelle barriere mellom det ytre miljø og det underliggende vev, gir en effektiv modell for undersøkelser som krever luftveiskanalen vev.
Protocol
MERK: Mann C57BL / 6 mus (5-7 uker gammel) er fra Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada.) Og manipulert i henhold til protokoller godkjent av CHU Sainte-Justine Animal Care komiteen. Mus bronkial vev explants gi en god kilde til primær bronkial epitelceller for å undersøke apoptosiske effekter LMPs på epitelceller. Denne protokollen beskriver in vitro-dannelse av LMPs, så vel som en fremgangsmåte for påvisning av apoptotiske epitelceller på LMPs-behandlede bronkiale vev eksplantater. Denne protokollen består av 3 seksjoner.
1. LMPs fremstilling og karakterisering
MERK: For å hindre forurensning, sørge for at alle materialer som brukes i dette eksperimentet er steril eller autoklaveres. Utføre alle trinnene ved RT i en biologisk sikkerhetsskap under sterile tilstand, hvis ikke annet er angitt.
1.1) Stimulering og innkreving av parlamentsmedlemmer9
- Tine en delmengde av 10 millioner CEM T-celler i et 37 ° C vannbad. Fortynn i 10 ml forvarmet serumfritt medium hematopoietisk eksempel X-VIVO, i et 15 ml sterilt rør og sentrifuger ved 200 gx 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 5 ml forvarmet medium.
- Overfør cellene inn i en T75 vevskulturkolbe (for suspensjonsceller) med 15 ml forvarmet medium hematopoietisk slik som X-VIVO og inkuberes i 4 dager i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Etter 4 dager, overføre alle dyrkningsmedium og celler i en T175 vevskultur kolbe inneholdende 100 ml friskt medium. Fortsett å inkubere cellene i omtrent 72 timer under de samme betingelser til de har vokst til en tetthet på 2 millioner celler / mL.
- Jevnt fordelt mellom fire celler T175-kolber hver inneholdende 150 ml friskt medium og fortsette cellekultur inntil cellene har vokst (ca. 48 timers inkubasjon) til en tetthet på 2 millioner / ml.
- Legg actinomycin D (oppløst i DMSO ved 2 mg / ml) til mediet til en sluttkonsentrasjon på 0,5 pg / ml og inkuberes i 24 timer.
- Overfør hele kulturmediet i 50 ml koniske rør og spinne ned cellene ved 750 x g i 5 min. Overfør supernatanten til 50 ml koniske rør og sentrifuger ved 1500 xg i 15 minutter for å fjerne store cellefragmenter.
- Overfør supernatanten til en 250 ml flaske og ultrasentrifuge ved 12.000 xg i 50 min. Kast supernatanten og samle pellets.
- Vask LMPs anriket pellets med 40 ml steril PBS i et 50 ml rør ved sentrifugering ved 12 000 xg i 50 min. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Samle siste vask supernatanten; det vil bli brukt som bærerkontroll. Suspendere LMPs pellets i enml PBS og overføre til en 1,5 ml steril mikrorør. Alikvote og lagre isolerte LMPs ved -80 ° C (for å unngå flere gratis-tine sykluser).
1.2) Karakterisering av parlamentsmedlemmer via FACS Analyse 4
- Forbered to prøver av annexin buffer, en med og en annen uten CaCI2: Hepes 10 mm, NaCl 140 mm, pluss eller minus 5 mM CaCI2.
- Filtrer annexin buffer og FACS strømnings kappe fluid ved hjelp av et 0,22 um filter for å fjerne partikler.
- Fortynne 1 mL av LMPs i 44 mL av annexin buffer med 5 mM CaCI2 inn en FACS tube. Forberede en ny tube med en ul LMPs i 44 mL av annexin buffer uten CaCI2 (negativ kontroll).
- Tilsett 5 mL av annexinV-Cy5 i hvert rør og bland godt. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Stopp reaksjonen ved å fortynne blandingen med 400 ul FACS strømnings kappe fluid i hvert rør.
- Tilsett 10 ul (200.000 perler) av 7 mikrometer telling beads suspensjon som indre standard i hvert rør for å oppnå en absolutt teller.
- Etablere porter relative størrelse (FSC-H, PMT E00, log skala) og relativ detaljnivå (SSC-H, PMT 325, log skala) dot tomt på flowcytometeret bruker størrelse-kalibrert fluoriserende perler av en mikrometer (gate 1) og telle perler gate 7 mikrometer (gate 2).
- Analyser LMPs prøven på FSC-H / SSC-H tomten ved hjelp av de etablerte porter og FL-4 kanal for annexin (PMT 765, log skala) prikkplott, ved å anskaffe et signal til 20.000 tellende perler er nådd i gate 2.
- Bestem de positive annexinV hendelsene i LMPs i annexin buffer som inneholder CaCl 2, og deretter trekke fra hendelsene i LMPs i annexin buffer uten CaCI2 (negativ kontroll).
- Beregning av den absolutte antall MP'er basert på den følgende ligning:
1.3) Fastsettelse av MP Protein Konsentrasjon (Bradford-analyse)
- Forbered fem seriefortynninger av en proteinstandard 1,25 til 20 pg / ml. Pipetter 800 pl av hver standard og prøveoppløsning inn i et rent prøverør i duplikat. Tilsett 200 ul av Bradford-farge reagens til hvert rør. Bland godt, deretter inkuberes ved romtemperatur i 5 min.
- Måle absorbans ved 595 nm. Bestem proteinkonsentrasjon på LMPs ved bruk av lineær regresjon for standardkurve.
2. Bronkitt Tissue eksplanter og LMPs Treatment
MERK: Vær spesielt oppmerksom på den sterile arbeidsmiljøet, og aseptisk forberede løsninger og medium som brukes i følgende eksperimenter. For å forberede Complete Healing Medium, tilsett 1 ml Tissue Healing Medium Kosttilskudd med Serum (tint på is) til 100 ml Tissue Healing Medium og bland godt.
2.1) Fremstilling av Bronkitt Tissue eksplantater
- Før dyrking, klø seks områder av 1 cm 2hverandre ved kanten av overflaten på hver 100 mm vevskulturskål med et skalpellblad. Belegge hver er blitt oppskrapet 100 mm vevskulturskål med 2 ml av kulturskål beleggsløsning, og inkuber fatet i en fuktet CO2-inkubator O / N ved 37 ° C. Vakuum aspirer overskudd løsning og fylle tallerken med 15 ml Tissue Vaske Medium.
- Avlive C57BL / 6 mus (5 til 7 uker gammel) av CO 2 innånding henhold til protokoller godkjent av dyr omsorg etikkomité.
- Aseptisk dissekere lungevev med skalpell, Dumont super fin pinsett, og kirurgisk saks. Fjerne parenchyma og blodkar nøye. Plassere lungevev inn iskald Tissue Vaske Medium for transport til laboratoriet, hvis det er aktuelt.
- Videre dissekere bronkie neddykket i Tissue Vasking medium og separere bronkie med en diameter på 1 til 2,5 mm fra perifere lungevev. Slice bronkial vev i ~ 5 mm tykke bronkieringene med en skalpell. Bruk en scooping bevegelse med sterile buede microdissecting pinsett til å plukke opp bronkial fragmenter og plassere dem på ripete områdene av rettene.
- Ta av Tissue Vaske Medium, og inkuber fragmenter ved RT for ~ 5 min å tillate dem å forholde seg til rettene.
- Tilsett 10 ml Complete Healing Middels til hver tallerken og legg dem i en kontrollert atmosfære modulær kuvøse kammeret. Skyll kammer med høy O2 gassblanding (70% O 2, 25% N2 og 5% CO 2). Plasser kammeret i en bord- inkubator og rist den ved 37 ° C. Rist kammer i 24 timer ved 10 sykluser pr minutt for å tillate mediet å strømme intermitterende i løpet av de fragmenter.
- Etter 24 timers inkubasjon, observere vev explants under et fasekontrast invertert lysmikroskop. Velg bronkial eksplantater med komplett, fint hår bevegelse og livlig bronkialepitelet for påfølgende LMPs behandling.
2.2) LMPs Treatment
- Forberede komplett vekstmedium som følger: tine vekstmellom kosttilskudd med serum og fibroblast inhibitor på is. Tilsett 1 ml av vekstmediet kosttilskudd med serum og 200 ul fibroblast-inhibitor til 100 ml av vekstmedium; bland godt. Varm komplett vekstmedium ved 37 ° C i 10 min før bruk.
- Fortynn isolerte LMPs i et nytt Eppendorf-rør med steril PBS for å fremstille en LMPs lager ved en konsentrasjon på 800 ug / ml.
- Tilsett 0,5 ml komplett vekstmedium til hver brønn av en 12-brønns vevskulturplate.
- Overføre de valgte bronkial eksplantater med de buede microdissecting tang fra den tidligere protokollen (avsnitt 2.1) til hver brønn av vevskulturplaten.
- Merke kultur plate hensiktsmessig å identifisere LMPs behandlings brønner og kontrollbrønner. Tilsett 25 ul LMPs lager i hver LMPs behandling brønn (for en endelig konsentrasjon på 40 ug / ml) og 25 ul kontroll kjøretøyet (se LMP s produksjon) i kontrollbrønnene.
- Fortsett inkubasjon i en kontrollert atmosfære modulær inkubator kammer ved 37 ° C med forsiktig risting.
- Etter 24 timer vaske eksplantater tre ganger med PBS og gå videre til neste trinn (4% paraformaldehyde [PFA] fiksering).
3. Histopatologisk undersøkelse
3.1) Forbered følgende løsninger før du fortsetter til neste trinn
- Forbered 1x PBS-buffer ved å blande 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na HPO 2 4, 1,76 mM KH 2PO 4, pH 7,4.
- For å fremstille 4% PFA, oppløse 20 g av PFA i 400 ml vann, oppvarmet ved 60 ° C under omrøring; legge til et par dråper 10 M NaOH for å fjerne løsningen. Neste legge 1x PBS buffer og justere volumet til 500 ml og pH til 7,4. Filter og delmengde; oppbevar ved -20 ° C.
- Forbered følgende dehydrering eller rehydrering reagenser; 100%, 90%, 70%, 50% etanol og xylen.
- Plassere hver eksplantat i en merket mikrosentrifugerør med 1,5 ml 4% PFA og inkuber O / N ved 4 ° C. Skyll explants to ganger med 1x PBS.
- Dehydrere eksplantater gjennom en alkoholserie (70% etanol: 3 ganger i 30 min hver gang; 90% etanol: to ganger i 30 min hver gang; 100% etanol: 3 ganger i 30 minutter hver, og deretter xylen: 3 ganger i 20 min hver). Utføre alle trinn ved RT i en avtrekkshette.
- Imbed vev eksplantater i parafin ved 58 ° C i en ovn. Forberede 5 mikrometer tykke vevsdelene med en rotasjonsmikrotom.
- Flyte seksjonene i en 56 ° C vannbad, og deretter montere delene på merket histologiske lysbilder. Plasser lysbildene i manuelle fargings stativer og tørr ved 65 ° C i 1 time. Tillate lysbildene avkjøles ved RT.
- Dypp stativene i 4 påfølgende beis retter som inneholder xylen i 10 minutter hver til å fjerne parafin. Dypp stativene i en etanol-serien for å fjerne xylen: 100%, deretter 95%, thno 80%, deretter 70%, deretter 50% etanol (5 min for hvert trinn). Skyll stativene med vann fra springen i 5 min for å fjerne etanol.
3.3) Hematoxylin og eosin (H & E) Farging
- Fortsette å arbeide med de faste vevsdelene; plassere stativet inn i en farging tallerken fylt med Mayers Hematoxylin i 15 min. Skyll stativ med vann fra springen for å fjerne Hematoxylin i 20 min.
- Plasser i destillert vann i 30 sec.Place i 95% etanol i 30 sek. Plassere i Eosin Y løsning farging parabolen for 1 min. Dehydrerer gjennom to endringer av 95% etanol, 100% etanol, og xylen i 2 minutter hver.
- Utføre en rask sjekk under et mikroskop for å sikre at overflødig eosin fjernes. Plassere 2 til 3 dråper Montering Medium (Fisher SP15-100) på hvert bilde, og deretter dekke med et dekkglass.
3.4) In Situ Cell Død Detection: TUNEL analysen
- Før du begynner, forberede proteinase K arbeidsløsning: 20 mikrogram / ml i10 mM Tris / HCl, pH 7,4.
- Gjenta trinn 1 til 5 av avsnitt 3.2 (Eksplantering fiksering og vev seksjon deparaffinization). Skyll lysbilder med avionisert H 2 O.
- Fordype lysbildene med 1x PBS i 10 min. Drenere overflødig PBS. Inkuber vevssnitt i 30 minutter ved RT med proteinase K arbeidsløsning. Skyll lysbilder to ganger med 1x PBS.
- Utfør TUNEL analysen som beskrevet i bruksanvisningen for celledød deteksjon kit. Montere ved hjelp av monterings medium, og dekk manuelt med dekkglass.
- Analyser av prøvene under et lysmikroskop. Bruk Image Pro 4.5 for å analysere de apoptotiske celler i brun farge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LMPs var preget med annexin V farging 10 av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse og gated bruker en mikrometer perler der 97% av parlamentsmedlemmer (≤1 mikrometer) ble annexin-V-Cy5 positive (figur 1A og 1B). Vanligvis ble omtrent 2,5 mg LMPs oppnådd etter denne protokollen. Bronkial vev explants fra C57BL / 6 mus ble utsatt for kjøretøy og LMPs behandling. Histopatologisk analyse av bronkial seksjoner viste effekten av LMPs på den strukturelle integritet av det bronkiale epitel. I kontroll eksplantater, bronkialepitelet var stort sett uskadet (Figur 2A); Men i LMPs-eksplantater behandlet, ble det overflatiske epitelcellelaget skadet eller tapt, og det var en signifikant reduksjon i epitelcelle høyde og tetthet (Figur 2B). TUNEL-positiv farging (en markør for apoptose) ble mer uttalt i LMPs behandlet bronkialepitelet sammenlignet med kontrollgruppen ( 
Figur 1. Flowcytometri analyse av parlamentsmedlemmer avledet fra CEM T cellelinje. (A) Fastsettelse av fremover (FSC) og side scatter (SSC) egenskaper med en mikrometer perler som brukes til å portparlamentsmedlemmer. (B) Hendelser i parlamentsmedlemmer gate ble videre undersøkt for merking med annexin V-Cy5 å skille sanne hendelser fra elektronisk støy , og dermed øke spesifisiteten av parlamentsmedlemmer gjenkjenning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2. LMPs utløst bronkial epitellaget skade. Representative histopatologiske bilder av bronkial epithelium av eksplantater behandlet med (A) kontroll, eller (B) LMPs (40 ug / ml i 24 timer). Eksplantering seksjonene ble farget med Hematoxylin og eosin. Sorte piler peker på epitellaget. Usammenhengende tap av overfladiske og basalcellelagene er tydelig i seksjoner av LMPs-behandlede bronkial eksplantater (B). Forstørrelse 400X, bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3. LMPs-indusert bronkiale epitelceller apoptose Den apoptotiske celler i epitellaget av segment bronkier ble påvist ved TUNEL assay.; positivt fargede celler er vist i brunt. Representative bilder av bronkial epitelceller i kontroll (A)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parlamentsmedlemmer er aktive formidlere av interkrysstale og deres studie er lovende i mange områder av vitenskap. 11 Denne studien presentert en detaljert protokoll for in vitro storskala generasjon LMPs avledet fra en apoptotisk T cellelinje. Disse parlamentsmedlemmer uttrykker et stort repertoar av lymfocytt molekyler og er biologisk innblandet i reguleringen av mobilnettet og vev homeostase. Imidlertid kan LMPs avledet fra forskjellige kilder være biologisk forskjellig. 4,9,12,13
LMPs viser ulike egenskaper avhengig av de stimuli som brukes til å generere dem in vitro og cellen hvorfra de er avledet. Som sådan bør ekstrapolering av data innhentet in vitro ved hjelp LMPs avledet fra udødeligcellelinjer til data fra LMPs generert in vivo utføres med forsiktighet.
Denne protokollen beskriver flere sentrifugeringstrinn som kreves for isolering av MP'er; Derfor, careful manipulasjon er nødvendig for å minimere tap av parlamentsmedlemmer i løpet av denne prosessen. Snap frysing av isolerte LMPs ved -70 ° C anbefales; Vi har observert at de bioaktiviteter av LMPs under disse forholdene kan bevares i opptil 2 år (upubliserte data).
Til dags dato, flowcytometri regnes som "gullstandard" for parlamentsmedlemmer analyse. Polykromatisk flowcytometrisk analyse brukes til å bestemme subpopulasjoner av parlamentsmedlemmer fra ulike cellulære opprinnelse. Ikke desto mindre er de nåværende kommersielt tilgjengelige flowcytometere begrenset i deres evne til å analysere mindre størrelse politikere populasjoner (mindre enn 300 nm), og for å skille mellom cellerester og MPS. I tillegg kan FACS-analyse (cytofluorimetric analyse) være en alternativ metode for å TUNEL assay for å telle apoptotiske celler for statistisk analyse.
Her viser vi at bronkial eksplantater kultivert ex vivo kan gi en god kilde til luftveis epitelceller feller farmakologi og toksikologi screening. Fordi disse bronkial eksplantater ligner sine opprinnelige fysiologiske miljøer, kan de være nyttige for å bestemme signalveier i visse bronkiale eller lungesykdommer. Bruk imidlertid bare bronkial eksplantater vil ikke i stand til å bekrefte apoptotisk effekt av LMPs på epitelceller er et resultat av direkte eller / og fra videregående til aktivering av fastboende immunceller. For å undersøke den direkte effekten av LMPs, vil de primære luftveis-epitelceller være egnet for dette formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra den kanadiske Institutes of Health Research (178 918), Fonds de recherche no santé du Québec - Vision Health Research Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LMPs production and characterization | |||
| CEM T cells | ATCC | CCL-119 | |
| X-VIVO 15 medium | Cambrex, Walkersville | 04-744Q | |
| Flask T75 | Sarstedt | 83.1813.502 | |
| Flask T175 | Sarstedt | 83.1812.502 | |
| Actinomycin D | Sigma Chemical Co. | A9415-2mg | |
| PBS | Lifetechnologies | 14190-144 | |
| 0.22 µm filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Annexin-VCy5 | BD Pharmagen | 559933 | |
| FACS flow solution | BD Bio-sciences | 342003 | |
| Fluorescent microbeads (1 µm) | Molecular Probes | T8880 | |
| Polysterene counting beads (7 µm) | Bangs laboratories | PS06N/6994 | |
| Polypropylene FACS tubes | Falcon | 352058 | |
| 1 ml pipet | Fisher | 13-678-11B | |
| 5 ml pipet | Falcon | 357543 | |
| 25 ml pipet | Ultident | DL-357551 | |
| 1.5 ml conical polypropylene micro tube | Sarstedt | 72.690 | |
| 15 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 50 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| 50 ml high speed polypropylene copolymer tube | Nalgene | 3119-0050 | |
| 250 ml high speed polypropylene bottle | Beckman | 356011 | |
| Protein assay (Bradford assay) | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | |
| Protein assay standard II | Bio-Rad Laboratories | 500-0007 | |
| Test tube 16 x 100 | VWR | 47729-576 | |
| Test tube 12 x 75 | Ultident | 170-14100005B | |
| Cell incubator | Mandel | Heracell 150 | |
| Low speed centrifuge | IEC | Centra8R | |
| High speed centrifuge | Beckman | Avanti J8 | |
| High speed rotor for 250ml bottle | Beckman | JLA16.250 | |
| High speed rotor for 50ml tube | Beckman | JA30.50 | |
| Fow cytometry | BD Bio-sciences | FACS Calibur | |
| Spectrophotometer | Beckman | Series 600 | |
| Bronchial tissue explants and sections | |||
| C57BL/6 mice (5-7 weeks old) | Charles River Laboratories, Inc. | ||
| Mouse Airway PrimaCell™ System: | CHI Scientific, Inc. | 2-82001 | |
| Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades | Becton Dickinson AcuteCare | 371310 | #10 |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools Inc. | 10003-12 | #7 |
| phase-contrast inverted microscope | Olympus Optical CO., LTD. | CK2 | |
| high O2 gas mixture | VitalAire Canada Inc. | ||
| modular incubator chamber | Billups-Rothenberg Inc. | MIC-101 | |
| MaxQ 4000 incubated orbital shaker | Barnstead Lab-Line, | SHKA4000-7 | |
| 12-well tissue culture plate | Becton Dickinson and Company | 353043 | |
| Plastic tissue culture dishes (100 mm) | Sarstedt, Inc. | 83.1802 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools Inc. | 14060-09 | Straight, sharp, 9cm longth |
| Half-curved Graefe forceps | Fine Science Tools Inc. | 11052-10 | |
| humidified CO2 incubator | Mandel Scientific Company Inc. | SVH-51023421 | |
| Histopathological examination | |||
| formalin formaldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | HT5011 | |
| paraffin | Fisher scientific International, Inc. | T555 | |
| ethyl alcohol | Merck KGaA, Darmstadt | EX0278-1 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | G6403 | |
| Cacodylate | Sigma-Aldrich, Inc. | 31533 | |
| microscope slides | VWR Scientific Inc. | 48300-025 | 25x75 mm |
| Xylene | Fisher scientific International, Inc. | X5-4 | |
| Mayer's hematoxylin | Sigma-Aldrich, Inc. | MHS16 | Funnel with filter paper |
| HCl | Fisher scientific International, Inc. | A144s-500 | |
| eosin | Sigma-Aldrich, Inc. | HT110116 | Funnel with filter paper |
| Permount™ Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific Inc. | SP15-100 | |
| glass coverslip | surgipath medical industries, Inc. | 84503 | 24×24 #1 |
| TUNEL detection kit | In Situ Cell Death Detection, POD | 11 684 817 910 | |
| oven | Despatch Industries Inc. | LEB-1-20 | |
| rotary Microtome | Leica Microsystems Inc. | RM2145 | |
| filter paper | Whatman International Ltd. | 1003150 | #3 |
| Microscope | Nikon Imaging Japan Inc. | E800 | |
| staining dish complete | Wheaton Industries, Inc. | 900200 | including dish, rack, cover |
| 1.5 ml eppendorf tube | Sarstedt Inc. | 72.69 | 39x10 mm |
| Orbital and Reciprocating Water Bath | ExpotechUSA | ORS200 | |
| phosphate buffered saline | GIBCO | 14190-144 | |
| fume hood | Nicram RD Service | 3707E |
References
- Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).
- Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).
- Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles. Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).
- Yang, C., et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).
- Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells. Cancer Biol Ther. 10 (5), 448-456 (2010).
- Angelillo-Scherrer, A. Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis. Circ Res. 110 (2), 356-369 (2012).
- Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).
- Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis. Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).
- Martin, S., et al. Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression. Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).
- Shet, A. S., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Yang, C., et al. Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Soleti, R., et al. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).
