Summary
الخلية المجهرية الدقيقة-تسليط غشاء (النواب) هي الحويصلات البيولوجية النشطة التي يمكن أن تكون معزولة وآثارها المرضية في جسم المريض التحقيق في نماذج مختلفة. نحن هنا تصف طريقة لتوليد النواب المستمدة من الخلايا الليمفاوية T (LMPS) ولإظهار تأثير proapoptotic على الخلايا الظهارية مجرى الهواء.
Abstract
تزايد الاهتمام في الأدوار البيولوجية للخلية الحويصلات المشتقة من الغشاء في التواصل خلية خلية في السنوات الأخيرة. المجهرية الدقيقة (النواب) هي واحدة مثل هذا النوع من الحويصلات، والتي تتراوح قطرها من 0.1 ميكرومتر إلى 1 ميكرومتر، وتسلط عادة من غشاء البلازما من خلايا حقيقية النواة تمر تفعيل أو موت الخلايا المبرمج. نحن هنا وصف جيل من T-المستمدة اللمفاويات المجهرية الدقيقة (LMPS) من خلايا CEM T أفكارك حفز مع أكتينوميسين يتم عزل D. LMPS من خلال عملية الطرد المركزي التفاضلي متعددة الخطوات، وتميزت باستخدام التدفق الخلوي. ويعرض هذا البروتوكول أيضا في الموقع موت الخلايا طريقة الكشف لإثبات تأثير proapoptotic من LMPS على الخلايا الظهارية الشعب الهوائية المستمدة من الماوس الابتدائية الجهاز التنفسي إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة توفر الإجراء استنساخه لعزل كميات وفيرة من LMPS من الخلايا الليمفاوية أفكارك في المختبر. المستمدة LMPSفي هذه الطريقة يمكن استخدامها لتقييم خصائص النماذج المرض المختلفة، والصيدلة وعلم السموم الاختبار. وبالنظر إلى أن ظهارة الهوائية تقدم حاجز مادي وعملي وقائي بين البيئة الخارجية والأنسجة الكامنة، واستخدام إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية بدلا من خطوط الخلايا الظهارية خلد يوفر نموذج فعال للتحقيقات التي تتطلب الأنسجة المسالك الهوائية.
Protocol
ملاحظة: ذكر C57BL / 6 الفئران (5-7 أسابيع من العمر) هي من نهر تشارلز مختبرات الدولية، وشركة (سانت المستمر، كيبيك، كندا.) والتلاعب بها وفقا لبروتوكولات التي وافق عليها سانت جوستين جنة رعاية الحيوان CHU. توفر الماوس إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية مصدر جيد للخلايا الظهارية القصبية الأولية للتحقيق في الآثار proapoptotic من LMPS على الخلايا الظهارية. يصف هذا البروتوكول الجيل في المختبر من LMPS، وكذلك وسيلة للكشف عن الخلايا الظهارية أفكارك على LMPS المعاملة إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية. ويتكون هذا البروتوكول من 3 أقسام.
1. LMPS الإنتاج وتوصيف
ملاحظة: لمنع التلوث، وضمان أن جميع المواد المستخدمة في هذه التجربة هي معقمة أو تعقيمها. تنفيذ جميع الخطوات في RT في خزانة السلامة البيولوجية تحت ظروف معقمة، ما لم يذكر خلاف ذلك.
1.1) تحفيز ومجموعة من النواب9
- ذوبان الجليد قسامة من 10 مليون خلية CEM T في 37 ° C حمام الماء. تمييع في 10 مل قبل حرارة متوسطة للدم مثل X-VIVO، في 15 مل أنبوب معقم والطرد المركزي في 200 GX 5 دقائق خالية من المصل. نضح خلايا وطاف resuspend في 5 مل المتوسطة قبل تحسنت.
- نقل الخلايا إلى ثقافة قارورة الأنسجة T75 (للخلايا تعليق) مع 15 مل المتوسطة المكونة للدم قبل تحسنت مثل X-VIVO واحتضان لمدة 4 أيام في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- بعد 4 أيام، ونقل جميع مستنبت والخلايا في قارورة الثقافة الأنسجة T175 تحتوي على 100 مل متوسطة جديدة. مواصلة احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة في ظل نفس الظروف حتى أنها قد نمت لكثافة من 2 مليون خلية / مل.
- تقسيم بالتساوي بين خلايا أربعة قوارير T175 تحتوي كل منها على 150 مل متوسطة جديدة ومواصلة زراعة الخلايا حتى نمت الخلايا (ما يقرب من 48 ساعة حضانة) إلى كثافة من 2 مليون / مل.
- إضافة أكتينوميسين D (الذائبة في DMSO في 2 ملغ / مل) إلى متوسطة في تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل واحتضان لمدة 24 ساعة.
- نقل جميع مستنبت إلى 50 مل أنابيب مخروطية وتدور أسفل الخلايا في 750 x ج لمدة 5 دقائق. نقل طاف في أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1،500 x ج لمدة 15 دقيقة لإزالة شظايا خلية كبيرة.
- نقل طاف في زجاجة 250 مل ونابذة فائقة السرعة في 12،000 x ج لمدة 50 دقيقة. تجاهل طاف وجمع الكريات.
- غسل الكريات LMPS المخصب مع PBS 40 مل العقيمة في أنبوب 50 مل بواسطة الطرد المركزي عند 12،000 x ج لمدة 50 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين.
- جمع غسل الماضي طاف. سيتم استخدامها كما السيطرة على السيارة. تعليق الكريات LMPS في 1مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى 1.5 مل microtube العقيمة. قسامة وتخزين LMPS معزولة في -80 ° C (لتجنب متعددة دورات خالية من ذوبان الجليد).
1.2) توصيف النواب عن طريق تحليل FACS 4
- إعداد 2 عينات من العازلة annexin (1)، مع وأخرى دون CaCl 2: HEPES 10 ملي، كلوريد الصوديوم 140 ملم، زائد أو ناقص 5 ملي CaCl 2.
- تصفية عازلة annexin وFACS السائل غمد تدفق باستخدام فلتر 0.22 ميكرون لإزالة الجسيمات.
- تمييع 1 ميكرولتر من LMPS في 44 ميكرولتر من العازلة annexin مع 5 ملي CaCl 2 في أنبوب FACS. إعداد أنبوب آخر مع 1 ميكرولتر من LMPS في 44 ميكرولتر من العازلة annexin دون CaCl 2 (المراقبة السلبية).
- إضافة 5 ميكرولتر من annexinV-Cy5 في كل أنبوب وتخلط جيدا. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام. وقف رد فعل عن طريق تمييع المزيج مع 400 ميكرولتر من FACS السائل غمد التدفق في كل أنبوب.
- إضافة 10 ميكرولتر (200،000 الخرز) من 7 ميكرون العد BEAتعليق DS كمعيار داخلي في كل أنبوب للحصول على عدد المطلق.
- إنشاء بوابات الحجم النسبي (FSC-H، PMT E00، تسجيل النطاق) وتحبب النسبي (SSC-H، PMT 325، تسجيل نطاق و) مؤامرة نقطة على تدفق عداد الكريات باستخدام معايرة حجم حبات الفلورسنت من 1 ميكرون (بوابة 1) و عد حبات البوابة في 7 ميكرون (بوابة 2).
- تحليل عينة LMPS على FSC-H / SSC-H مؤامرة باستخدام البوابات التي أقامتها وFL-4 قناة لannexin (PMT 765، تسجيل نطاق و) مؤامرة نقطة، من خلال الحصول على إشارة حتى يتم التوصل إلى 20،000 الخرز العد والفرز في بوابة 2.
- تحديد الأحداث annexinV الإيجابية للLMPS في المخزن annexin تحتوي على CaCl 2، ومن ثم طرح أحداث LMPS في المخزن annexin دون CaCl 2 (المراقبة السلبية).
- حساب العدد المطلق للنواب على أساس المعادلة التالية:
1.3) تحديد النائب Protein التركيز (برادفورد الفحص)
- إعداد 5 التخفيفات المسلسل من مستوى البروتين 1،25-20 ميكروغرام / مل. ماصة 800 ميكرولتر من كل حل معيار وعينة في أنبوب اختبار نظيف في مكررة. إضافة 200 ميكرولتر من برادفورد صبغ كاشف لكل أنبوب. تخلط جيدا، ثم يحضن في RT لمدة 5 دقائق.
- قياس الامتصاصية في 595 نانومتر. تحديد تركيز البروتين من LMPS باستخدام الانحدار الخطي للمنحنى القياسية.
2. إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية وعلاج LMPS
ملاحظة: إيلاء اهتمام خاص لبيئة العمل معقمة، وجو معقم و مطهر إعداد الحلول والوسيلة المستخدمة في التجارب التالية. لإعداد الشفاء التام المتوسطة، إضافة 1 مل من الأنسجة شفاء ملاحق المتوسطة مع المصل (إذابة على الجليد) إلى 100 مل الأنسجة شفاء متوسطة وتخلط جيدا.
2.1) إعداد الشعبي إإكسبلنتس الأنسجة
- قبل زراعة، خدش 6 مجالات 1 سم 2كل على حافة سطح كل 100 ملم الأنسجة صحن الثقافة بشفرة المشرط. معطف كل خدش 100 ملم الأنسجة صحن الثقافة مع 2 مل من محلول طلاء صحن الثقافة، واحتضان الطبق في ترطيب CO 2 حاضنة O / N عند 37 درجة مئوية. فراغ نضح الحل الفائض وملء الطبق مع 15 مل من الأنسجة غسل المتوسطة.
- الموت ببطء C57BL / 6 الفئران (5 إلى 7 أسابيع من العمر) من خلال CO 2 الاستنشاق وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة الأخلاق رعاية الحيوان.
- جو معقم و مطهر تشريح أنسجة الرئة مع مشرط، دومون منتاش السوبر غرامة، ومقص جراحي. إزالة حمة والأوعية الدموية بعناية. وضع أنسجة الرئة في الجليد الباردة الأنسجة غسل المتوسطة لنقلها إلى المختبر، إن وجدت.
- وعلاوة على ذلك تشريح القصبات الهوائية غارقة في الأنسجة غسل المتوسطة وفصل القصبات الهوائية التي يبلغ قطرها بين 1 و 2.5 ملم من أنسجة الرئة الطرفية. أنسجة الشعب الهوائية شريحة إلى ~ 5 ملم حلقات الشعب الهوائية سميكة مع مشرط. تستخدم حركة شفط مع ملقط معقم microdissecting منحنية لالتقاط شظايا الشعب الهوائية ووضعها على المناطق خدش من الأطباق.
- إزالة الأنسجة غسل المتوسطة، واحتضان شظايا في RT ل~ 5 دقائق للسماح لهم الانضمام إلى الأطباق.
- إضافة 10 مل من الشفاء التام من متوسطة إلى كل طبق ووضعها في جو يسيطر غرفة الحاضنة وحدات. مسح الغرفة مع ارتفاع خليط الغاز O 2 (70٪ O 2، 25٪ N 2 و 5٪ CO 2،). وضع الغرفة في حاضنة المدارية الفوق والتخلص منه في 37 ° C. يهز الغرفة لمدة 24 ساعة على 10 دورة في الدقيقة للسماح المتوسط وتتدفق بشكل متقطع على مدى شظايا.
- بعد 24 ساعة الحضانة، ومراقبة إإكسبلنتس الأنسجة تحت المجهر الضوء على النقيض من المرحلة مقلوب. حدد إإكسبلنتس الشعب الهوائية مع كاملة، حركة الشعر الجميلة وظهارة الشعب الهوائية حية للعلاج LMPS اللاحقة.
2.2) LMPS العلاج
- إعداد الكامل المتوسطة النمو على النحو التالي: المكملات المتوسطة النمو ذوبان الجليد مع المصل والخلايا الليفية المانع على الجليد. إضافة 1 مل من مكملات النمو المتوسطة مع المصل و 200 ميكرولتر المانع الخلايا الليفية إلى 100 مل من النمو المتوسطة. تخلط جيدا. تدفئة متوسطة النمو الكامل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل استخدامها.
- تمييع LMPS المعزولة في أنبوب إيبندورف العقيمة جديد مع PBS لإعداد الأوراق المالية LMPS بتركيز 800 ميكروغرام / مل.
- إضافة 0.5 مل من النمو الكامل متوسطة إلى كل بئر من 12-جيدا لوحة زراعة الأنسجة.
- نقل إإكسبلنتس الشعب الهوائية المختارة مع ملقط microdissecting المنحنية من البروتوكول السابق (القسم 2.1) إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة.
- تسمية لوحة الثقافة بشكل مناسب لتحديد الآبار العلاج LMPS وآبار المراقبة. إضافة 25 ميكرولتر الأسهم LMPS في كل معاملة LMPS جيدا (لتركيز النهائي من 40 ميكروغرام / مل) و 25 مركبة سيطرة ميكرولتر (انظر LMP الصورة الإنتاج) إلى آبار المراقبة.
- تستمر الحضانة في جو يسيطر غرفة الحاضنة وحدات عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف.
- بعد 24 ساعة، ويغسل إإكسبلنتس 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، والشروع في الخطوة التالية (4٪ بارافورمالدهيد [PFA] تثبيت).
3. المرضية فحص
3.1) إعداد الحلول التالية قبل الشروع في خطوات التالي
- إعداد 1X العازلة في برنامج تلفزيوني عن طريق خلط 137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.76 ملي KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 7.4.
- لإعداد 4٪ PFA، حل 20 غراما من PFA في 400 مل من الماء، يسخن في 60 درجة مئوية مع التحريك. إضافة بضع قطرات من 10 M هيدروكسيد الصوديوم لمسح الحل. التالي إضافة 1X PBS عازلة وضبط مستوى الصوت إلى 500 مل ودرجة الحموضة إلى 7.4. تصفية وقسامة. تخزين في -20 ° C.
- إعداد الكواشف الجفاف أو الإماهة التالية: 100٪، 90٪، 70٪، 50٪ من الإيثانول والزيلين.
- وضع كل يزدرع في أنبوب microcentrifuge المسمى مع 1.5 مل من 4٪ PFA واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. شطف إإكسبلنتس مرتين مع 1X PBS.
- يذوى إإكسبلنتس من خلال سلسلة الكحول (70٪ من الإيثانول: 3 مرات كل 30 دقيقة، 90٪ من الإيثانول: 2 مرات 30 دقيقة لكل منهما؛ 100٪ من الإيثانول: 3 مرات كل 30 دقيقة، ثم زيلين: 3 مرات 20 دقيقة لكل منهما). تنفيذ جميع الخطوات في RT في غطاء الدخان.
- إطمر إإكسبلنتس الأنسجة في البارافين في 58 ° C في الفرن. إعداد 5 ميكرومتر أقسام الأنسجة السميكة باستخدام مشراح الدوارة.
- تعويم المقاطع في 56 ° C حمام الماء، ومن ثم تحميل المقاطع على الشرائح النسيجية المسمى. ضع الشرائح في رفوف تلطيخ اليدوية وجافة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. السماح للشرائح لتبرد في RT.
- تراجع الرفوف في 4 أطباق وصمة عار على التوالي التي تحتوي على الزيلين لمدة 10 دقيقة كل لإزالة البارافين. تراجع الرفوف في سلسلة الإيثانول لإزالة زيلين: 100٪، ثم 95٪، الEN 80٪، ثم 70٪ ثم 50٪ من الإيثانول (5 دقائق لكل خطوة). شطف الرفوف مع ماء الصنبور لمدة 5 دقائق لإزالة الايثانول.
3.3) الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ
- مواصلة العمل مع أقسام الأنسجة الثابتة. وضع رف في طبق تلطيخ مليئة الهيماتوكسيلين ماير لمدة 15 دقيقة. شطف رف مع ماء الصنبور لإزالة الهيماتوكسيلين لمدة 20 دقيقة.
- وضع في الماء المقطر لمدة 30 sec.Place في 95٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية. ضع في يوزين Y طبق الحل تلطيخ لمدة 1 دقيقة. يذوى الى 2 التغييرات من الايثانول 95٪، و 100٪ من الإيثانول، والزيلين لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
- إجراء فحص سريع تحت المجهر للتأكد من أن تتم إزالة يوزين الزائد. ضع 2 إلى 3 قطرات من تصاعد المتوسطة (فيشر SP15-100) على كل شريحة، ثم تغطية مع غطاء زجاجي.
3.4) في الموقع خلية كشف الإعدام: الفحص TUNEL
- قبل بداية، وإعداد بروتين K الحل العمل: 20 ميكروغرام / مل في10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4.
- كرر الخطوات من 1 إلى 5 من القسم 3.2 (تثبيت النباتى والأنسجة قسم deparaffinization). شطف الشرائح مع منزوع الأيونات H 2 O.
- تزج الشرائح مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة. استنزاف PBS الزائد. احتضان أقسام الأنسجة لمدة 30 دقيقة في RT مع بروتين K الحل العمل. شطف الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إجراء فحص TUNEL كما هو موضح في دليل التعليمات من موت الخلايا كشف عدة. جبل باستخدام تصاعد المتوسطة، وساترة يدويا مع coverslips الزجاج.
- تحليل العينات تحت المجهر الضوئي. استخدام صورة برو 4.5 لتحليل الخلايا أفكارك في اللون البني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
واتسمت LMPS مع annexin V تلطيخ 10 بواسطة خلية مضان تنشيط الفرز (FACS) تحليل وبوابات باستخدام 1 ميكرومتر الخرز التي كانت 97٪ من النواب (≤1 ميكرون) annexin-V-Cy5 الإيجابي (الشكل 1A و 1B). عادة، تم الحصول على حوالي 2.5 ملغ من LMPS بعد هذا البروتوكول. إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية من C57BL / 6 تعرض الفئران لسيارة والعلاج LMPS. وكشف تحليل الأنسجة من أقسام الشعب الهوائية تأثير LMPS على السلامة الهيكلية للظهارة الشعب الهوائية. في إإكسبلنتس السيطرة، كانت ظهارة الشعب الهوائية التالفة إلى حد كبير (الشكل 2A)؛ ومع ذلك، في إإكسبلنتس LMPS المعاملة، أن أضرارا لحقت طبقة الخلايا الظهارية سطحية أو فقدت، وكانت هناك انخفاض كبير في ارتفاع الخلايا الظهارية والكثافة (الشكل 2B). تلطيخ TUNEL إيجابية (علامة على موت الخلايا المبرمج) كان أكثر وضوحا في LMPS المعاملة ظهارة الشعب الهوائية مقارنة مع الشاهد ( 
الشكل 1. تحليل التدفق الخلوي من النواب المستمدة من CEM T خط الخلية. (A) تحديد الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الخصائص مع 1 ميكرومتر الخرز المستخدمة للنواب البوابة. (ب) تم تقييم مزيد من الأحداث في البوابة النواب لوضع العلامات مع annexin V-Cy5 للتمييز الأحداث الحقيقية من الضوضاء الإلكترونية ، وبالتالي زيادة خصوصية كشف النواب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 2. LMPS التي يسببها القصبي الضرر طبقة الظهارية. الصور التشريحية المرضية التمثيلية للepitheli الشعب الهوائيةأم من إإكسبلنتس تعامل مع (A) التحكم أو (B) LMPS (40 ميكروغرام / مل لمدة 24 ساعة). كانت ملطخة أقسام يزدرع مع الهيماتوكسيلين ويوزين. وتشير السهام السوداء إلى الطبقة الظهارية. خسارة غير مكتمل من طبقات الخلايا السطحية والقاعدية هو واضح في أقسام إإكسبلنتس الشعب الهوائية LMPS المعاملة (B). التكبير 400X، بار = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 3. LMPS الناجم عن موت الخلايا المبرمج الشعب الهوائية الخلايا الظهارية تم الكشف عن خلايا أفكارك في الطبقة الظهارية للقصبات القطع التي TUNEL الفحص؛ بشكل إيجابي وصفت خلايا ملطخة باللون البني. صور الممثل من الخلايا الظهارية الشعب الهوائية في السيطرة (A)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النواب هي سطاء نشطة من عبر الحديث بين الخلايا ودراستهم واعد في العديد من مجالات العلم. وقدمت هذه الدراسة 11 بروتوكول مفصلة لفي المختبر جيل واسع النطاق للLMPS المستمدة من خط الخلية T أفكارك. هؤلاء النواب تعبر عن ذخيرة كبيرة من الجزيئات اللمفاويات وتورط بيولوجيا في تنظيم التوازن الخلوية والأنسجة. ومع ذلك، قد LMPS المستمدة من مصادر مختلفة تكون مختلفة بيولوجيا. 4،9،12،13
عرض LMPS خصائص متنوعة اعتمادا على المحفزات المستخدمة لتوليد لهم في المختبر، والخلية من التي تشتق منها. على هذا النحو، ينبغي إجراء استقراء البيانات التي تم الحصول عليها في المختبر باستخدام LMPS المستمدة من خطوط الخلايا خلد إلى البيانات من LMPS ولدت في الجسم الحي بحذر.
يصف هذا البروتوكول عدة خطوات الطرد المركزي اللازمة لعزل النواب. وبالتالي، جوهناك حاجة التلاعب areful لتقليل الخسائر من النواب خلال هذه العملية. ويوصى المفاجئة تجميد LMPS معزولة في -70 ° C. لاحظنا أن يمكن الحفاظ على bioactivities من LMPS في ظل هذه الظروف لمدة تصل إلى 2 سنة (بيانات غير منشورة).
حتى الآن، التدفق الخلوي يعتبر "المعيار الذهبي" لتحليل النواب. يستخدم متعدد الألوان تحليل تدفق cytometric لتحديد مجموعات سكانية فرعية من النواب من أصول الخلوية المختلفة. ومع ذلك، فإن أجهزة قياس التدفق الخلوي المتاحة تجاريا الحالية محدودة في قدرتها على تحليل النواب السكان أصغر الحجم (أقل من 300 نانومتر) والتمييز بين الحطام الخلوي والنواب. وبالإضافة إلى ذلك، تحليل FACS (تحليل cytofluorimetric) قد يكون طريقة بديلة لTUNEL فحص عد خلايا أفكارك للتحليل الإحصائي.
هنا، وتبين لنا أن إإكسبلنتس الشعب الهوائية مثقف خارج الحي يمكن أن توفر مصدرا جيدا للخلايا الظهارية مجرى الهواء وأو الصيدلة وفحص السموم. لأن هذه إإكسبلنتس الشعب الهوائية تشبه البيئات الفسيولوجية الأصلية، فإنها قد تكون مفيدة لتحديد مسارات إشارات من بعض الأمراض الشعب الهوائية أو الرئة. ومع ذلك، استخدم إإكسبلنتس الشعب الهوائية فقط لن يتمكن من تأكيد تأثير أفكارك من LMPS على الخلايا الظهارية ونتج عن مباشرة و / أو من الثانوية إلى تفعيل الخلايا المناعية المقيمين. للتحقيق في التأثير المباشر للLMPS، فإن الخلايا الظهارية الهوائية الأساسي يكون مناسبا لهذا الغرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (178918)، فون دي بحوث أون سانتيه كيبيك - الرؤية شبكة بحوث الصحية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LMPs production and characterization | |||
| CEM T cells | ATCC | CCL-119 | |
| X-VIVO 15 medium | Cambrex, Walkersville | 04-744Q | |
| Flask T75 | Sarstedt | 83.1813.502 | |
| Flask T175 | Sarstedt | 83.1812.502 | |
| Actinomycin D | Sigma Chemical Co. | A9415-2mg | |
| PBS | Lifetechnologies | 14190-144 | |
| 0.22 µm filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Annexin-VCy5 | BD Pharmagen | 559933 | |
| FACS flow solution | BD Bio-sciences | 342003 | |
| Fluorescent microbeads (1 µm) | Molecular Probes | T8880 | |
| Polysterene counting beads (7 µm) | Bangs laboratories | PS06N/6994 | |
| Polypropylene FACS tubes | Falcon | 352058 | |
| 1 ml pipet | Fisher | 13-678-11B | |
| 5 ml pipet | Falcon | 357543 | |
| 25 ml pipet | Ultident | DL-357551 | |
| 1.5 ml conical polypropylene micro tube | Sarstedt | 72.690 | |
| 15 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 50 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| 50 ml high speed polypropylene copolymer tube | Nalgene | 3119-0050 | |
| 250 ml high speed polypropylene bottle | Beckman | 356011 | |
| Protein assay (Bradford assay) | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | |
| Protein assay standard II | Bio-Rad Laboratories | 500-0007 | |
| Test tube 16 x 100 | VWR | 47729-576 | |
| Test tube 12 x 75 | Ultident | 170-14100005B | |
| Cell incubator | Mandel | Heracell 150 | |
| Low speed centrifuge | IEC | Centra8R | |
| High speed centrifuge | Beckman | Avanti J8 | |
| High speed rotor for 250ml bottle | Beckman | JLA16.250 | |
| High speed rotor for 50ml tube | Beckman | JA30.50 | |
| Fow cytometry | BD Bio-sciences | FACS Calibur | |
| Spectrophotometer | Beckman | Series 600 | |
| Bronchial tissue explants and sections | |||
| C57BL/6 mice (5-7 weeks old) | Charles River Laboratories, Inc. | ||
| Mouse Airway PrimaCell™ System: | CHI Scientific, Inc. | 2-82001 | |
| Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades | Becton Dickinson AcuteCare | 371310 | #10 |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools Inc. | 10003-12 | #7 |
| phase-contrast inverted microscope | Olympus Optical CO., LTD. | CK2 | |
| high O2 gas mixture | VitalAire Canada Inc. | ||
| modular incubator chamber | Billups-Rothenberg Inc. | MIC-101 | |
| MaxQ 4000 incubated orbital shaker | Barnstead Lab-Line, | SHKA4000-7 | |
| 12-well tissue culture plate | Becton Dickinson and Company | 353043 | |
| Plastic tissue culture dishes (100 mm) | Sarstedt, Inc. | 83.1802 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools Inc. | 14060-09 | Straight, sharp, 9cm longth |
| Half-curved Graefe forceps | Fine Science Tools Inc. | 11052-10 | |
| humidified CO2 incubator | Mandel Scientific Company Inc. | SVH-51023421 | |
| Histopathological examination | |||
| formalin formaldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | HT5011 | |
| paraffin | Fisher scientific International, Inc. | T555 | |
| ethyl alcohol | Merck KGaA, Darmstadt | EX0278-1 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | G6403 | |
| Cacodylate | Sigma-Aldrich, Inc. | 31533 | |
| microscope slides | VWR Scientific Inc. | 48300-025 | 25x75 mm |
| Xylene | Fisher scientific International, Inc. | X5-4 | |
| Mayer's hematoxylin | Sigma-Aldrich, Inc. | MHS16 | Funnel with filter paper |
| HCl | Fisher scientific International, Inc. | A144s-500 | |
| eosin | Sigma-Aldrich, Inc. | HT110116 | Funnel with filter paper |
| Permount™ Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific Inc. | SP15-100 | |
| glass coverslip | surgipath medical industries, Inc. | 84503 | 24×24 #1 |
| TUNEL detection kit | In Situ Cell Death Detection, POD | 11 684 817 910 | |
| oven | Despatch Industries Inc. | LEB-1-20 | |
| rotary Microtome | Leica Microsystems Inc. | RM2145 | |
| filter paper | Whatman International Ltd. | 1003150 | #3 |
| Microscope | Nikon Imaging Japan Inc. | E800 | |
| staining dish complete | Wheaton Industries, Inc. | 900200 | including dish, rack, cover |
| 1.5 ml eppendorf tube | Sarstedt Inc. | 72.69 | 39x10 mm |
| Orbital and Reciprocating Water Bath | ExpotechUSA | ORS200 | |
| phosphate buffered saline | GIBCO | 14190-144 | |
| fume hood | Nicram RD Service | 3707E |
References
- Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).
- Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).
- Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles. Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).
- Yang, C., et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).
- Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells. Cancer Biol Ther. 10 (5), 448-456 (2010).
- Angelillo-Scherrer, A. Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis. Circ Res. 110 (2), 356-369 (2012).
- Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).
- Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis. Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).
- Martin, S., et al. Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression. Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).
- Shet, A. S., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Yang, C., et al. Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Soleti, R., et al. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).
