Summary
Cellmembran-skjul mikropartiklar (MPS) är aktiva biologiska vesiklar som kan isoleras och deras patofysiologiska effekter undersökts i olika modeller. Här beskriver vi en metod för att generera MPs härledda från T-lymfocyter (arbetsmarknadspolitiska åtgärder) och för att demonstrera deras proapoptotisk effekt på luftvägsepitelceller.
Abstract
Intresset för de biologiska rollerna av cellmembranhärledda vesiklar i cell-cellkommunikation har ökat under senare år. Mikropartiklar (MPs) är en sådan typ av vesiklar, som sträcker sig i diameter från 0,1 | im till 1 | am och typiskt skjul från plasmamembranet av eukaryotiska celler som genomgår aktivering eller apoptos. Här beskriver vi generering av T-lymfocyt-härledda mikropartiklar (arbetsmarknadspolitiska åtgärder) från apoptotiska CEM T-celler stimulerade med aktinomycin D. arbetsmarknadspolitiska åtgärder är isolerade genom en flerstegs differentiell centrifugeringsprocess och karakteriserades med användning av flödescytometri. Detta protokoll utgör också en in situ celldöd detektionsmetod för att påvisa proapoptotisk effekten av arbetsmarknadspolitiska åtgärder på bronkialepitelceller celler från mus primära respirator bronkial vävnadsexplantat. Metoder som beskrivs här ger ett reproducerbart förfarande för att isolera rikliga mängder arbetsmarknadspolitiska åtgärder från apoptotiska lymfocyter in vitro. Arbetsmarknadspolitiska åtgärder härleddpå detta sätt kan användas för att utvärdera särdragen hos olika sjukdomsmodeller och för farmakologi och toxikologi tester. Med tanke på att luftvägsslemhinnan har en skyddande fysisk och funktionell barriär mellan den yttre miljön och underliggande vävnad, användning av bronkial vävnadsexplantat stället odödliga epitelcellinjer ger en effektiv modell för utredningar som kräver luftvägskanalen vävnad.
Protocol
OBS: Man C57BL / 6-möss (5-7 veckor gamla) är från Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Kanada.) Och manipuleras enligt protokoll godkänts av CHU Sainte-Justine Animal Care kommittén. Mus bronkiala vävnadsexplantat ger en god källa av primära bronkiala epitelceller för att undersöka den proapoptotiska effekten av arbetsmarknadspolitiska åtgärder på epitelceller. Detta protokoll beskriver alstringen in vitro av arbetsmarknadspolitiska åtgärder, liksom ett förfarande för detektering av apoptotiska epitelceller på arbetsmarknadspolitiska åtgärder-behandlade bronkiala vävnadsexplantat. Detta protokoll består av 3 sektioner.
1. arbetsmarknadspolitiska åtgärder Produktion och karakterisering
OBS: För att förhindra kontamination, se till att alla material som används i detta experiment är sterila eller autoklaveras. Utför alla steg vid RT i ett biologiskt säkerhetsskåp i sterilt skick, om inte annat anges.
1.1) Stimulering och Insamling av riksdagsledamöter9
- Tina en alikvot av 10 miljoner CEM T-celler i en 37 ° C vattenbad. Späd i 10 ml förvärmda serumfria hematopoietiska medium såsom X-VIVO, i ett 15 ml sterilt rör och centrifugera vid 200 gx 5 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 ml förvärmda medel.
- Överför celler i en T75-vävnadsodlingskolv (för suspensionsceller) med 15 ml förvärmd hematopoetiska medium såsom X-VIVO och inkubera under 4 dagar i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
- Efter fyra dagar, överföra all odlingsmedium och celler i en T175 vävnadsodlingskolv innehållande 100 ml färskt medium. Fortsätt inkubation av cellerna under ca 72 h under samma betingelser tills de har vuxit till en densitet av 2000000 celler / ml.
- Jämnt fördelade celler mellan fyra T175-kolvar vardera innehållande 150 ml färskt medium och fortsätta cellodling tills cellerna har vuxit (approximativt 48 h inkubation) till en densitet av 2 miljoner / ml.
- Lägg aktinomycin D (upplöst i DMSO vid 2 mg / ml) till mediet vid en slutlig koncentration av 0,5 | ig / ml och inkubera i 24 h.
- Överför hela odlingsmediet i 50 ml koniska rör och centrifugera ner cellerna vid 750 xg under 5 minuter. Överför supernatanten till 50 ml koniska rör och centrifugera vid 1500 xg under 15 min för att avlägsna stora cellfragment.
- Överför supernatanten i en 250 ml flaska och ultracentrifug vid 12.000 xg under 50 min. Kasta bort supernatanten och samla pellets.
- Wash arbetsmarknadspolitiska åtgärder berikad pelletar med 40 ml steril PBS i en 50 ml rör genom centrifugering vid 12.000 xg under 50 min. Upprepa detta steg två gånger.
- Samla den sista tvättn supernatanten; den kommer att användas som vehikelkontroll. Suspendera arbetsmarknadspolitiska åtgärder pellets i 1ml PBS och överför till en 1,5 ml steril mikrorör. Alikvotera och lagra isolerade arbetsmarknadspolitiska åtgärder vid -80 ° C (för att undvika flera gratis-upptiningscykler).
1.2) Karakterisering av riksdagsledamöter via FACS analys 4
- Förbered två prover av annexin buffert, en med och en annan utan CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus eller minus 5 mM CaCl2.
- Filter annexin buffert och FACS flöde omslutande vätska med hjälp av en 0,22 m filter för att avlägsna partiklar.
- Späd 1 l av arbetsmarknadspolitiska åtgärder i 44 pl annexin buffert med 5 mM CaCl2 i en FACS rör. Förbered ett annat rör med en pl av arbetsmarknadspolitiska åtgärder i 44 | il av annexin buffert utan CaCl2 (negativ kontroll).
- Tillsätt 5 pl annexinV-Cy5 i varje rör och blanda väl. Inkubera under 15 min vid RT i mörker. Stoppa reaktionen genom utspädning av blandningen med 400 | il FACS-flödes omslutande vätska i varje rör.
- Tillsätt 10 l (200.000 pärlor) av 7 um räkning beads suspensionen som en intern standard i varje rör för att erhålla ett absolutantal.
- Etablera portar relativa storleken (FSC-H, PMT E00, log skala) och relativ kornighets (SSC-H, PMT 325, log skala) punktdiagram på flödescytometern använder storleks kalibrerad fluorescerande pärlor av 1 pm (grind 1) och räkna pärlor grind vid 7 pm (gate 2).
- Analysera arbetsmarknadspolitiska åtgärder prov på FSC-H / SSC-H plot använder de etablerade grindar och FL-4-kanal för annexin (PMT 765, log skala) punktdiagram, genom att förvärva en signal fram 20.000 räkna pärlor nås i grind 2.
- Bestäm positiva annexinV händelserna arbetsmarknadspolitiska åtgärder i annexin buffert innehållande CaCl2, och sedan subtrahera händelserna arbetsmarknadspolitiska åtgärder i annexin buffert utan CaCl2 (negativ kontroll).
- Beräkna absoluta antalet MPs baserade på följande ekvation:
1.3) Fastställande av MP Protein Koncentration (Bradford Assay)
- Bered fem seriella spädningar av en proteinstandard 1,25-20 pg / ml. Pipett 800 | il av varje standard och provlösning i ett rent provrör i två exemplar. Lägg 200 pl av Bradford färgreagens till varje rör. Blanda väl, sedan inkubera vid RT i 5 min.
- Mät absorbansen vid 595 nm. Bestäm proteinkoncentrationen av arbetsmarknadspolitiska åtgärder med hjälp av linjär regression av standardkurvan.
2. Bronkial vävnadsexplantat och arbetsmarknadspolitiska åtgärder Behandling
OBS: Var särskilt uppmärksam på den sterila arbetsmiljö och aseptiskt förbereda lösningar och medel används i följande experiment. För att förbereda Complete Healing Medium, tillsätt 1 ml vävnadsläkning Medium Kosttillskott med serum (tinade på is) till 100 ml Tissue Healing Medium och blanda väl.
2.1) Beredning av bronkial vävnadsexplantat
- Före odling, skrapa 6 områden 1 cm 2vardera vid kanten av ytan på varje 100 mm vävnadsodlingsskål med ett skalpellblad. Coat varje repad 100 mm vävnadsodlingsskål med 2 ml odlingsskålen beläggningslösning, och inkubera skålen i en fuktad CO2 inkubator O / N vid 37 ° C. Vakuum aspirera överskottet lösningen och fyll skålen med 15 ml Tissue Tvätt Medium.
- Euthanize C57BL / 6-möss (5 till 7 veckor gamla) genom CO2 inhalation enligt protokoll som godkänts av djurvårds etikkommitté den.
- Aseptiskt dissekera lungvävnad med skalpell, Dumont super fin pincett och kirurgisk sax. Försiktigt bort parenkym och blodkärl. Placera lungvävnad i iskallt Tissue Tvätt Medium för transport till laboratoriet, om tillämpligt.
- Ytterligare dissekera luftrör nedsänkt i Tissue Tvätt Medium och separera luftrör med en diameter på 1 till 2,5 mm från perifera lungvävnad. Skiva bronkial vävnader i ~ 5 mm tjocka luftrörs ringar med en skalpell. Använd en skopa rörelse med de sterila böjda microdissecting pincett för att plocka upp bronkial fragment och placera dem på de repade områdena rätter.
- Avlägsna Tissue Tvätt Medium, och inkubera fragmenten vid RT ~ 5 min för att låta dem följa rätter.
- Tillsätt 10 ml Complete Healing Medium till varje skål och placera dem i en kontrollerad atmosfär modulär inkubator kammare. Spola kammare med hög O 2 gasblandning (70% O2, 25% N2 och 5% CO2,). Placera kammaren i en bänk orbital inkubator och skaka den vid 37 ° C. Skaka kammaren under 24 h vid 10 cykler per minut för att tillåta mediet att strömma intermittent över fragmenten.
- Efter 24 timmars inkubation, observera vävnadsexplantat enligt en fas-kontrast inverterat ljusmikroskop. Välj luftrörs explantat med komplett, fint hår rörelse och livlig bronkial epitel för efterföljande arbetsmarknadspolitiska åtgärder behandling.
2,2) arbetsmarknadspolitiska åtgärder Behandling
- Förbered komplett odlingsmedium enligt följande: tö tillväxtmedel kosttillskott med serum och fibroblast hämmare på is. Tillsätt 1 ml av tillväxtmediet kompletterar med serum och 200 l fibroblast hämmare till 100 ml odlingsmedium; blanda väl. Värm komplett tillväxtmedium vid 37 ° C under 10 min före användning.
- Späd isolerade arbetsmarknadspolitiska åtgärder i ett nytt sterilt Eppendorf-rör med PBS för att framställa en arbetsmarknadspolitiska åtgärder lager vid en koncentration av 800 pg / ml.
- Lägg 0,5 ml fullständigt tillväxtmedium i varje brunn på en 12-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- Överför de valda luftrörs explants med böjda microdissecting pincett från det tidigare protokollet (avsnitt 2.1) till varje brunn i vävnadsodlingsplatta.
- Märk odlingsplatta lämpligt att identifiera arbetsmarknadspolitiska åtgärder behandlings brunnar och kontrollbrunnar. Lägg 25 pl arbetsmarknadspolitiska åtgärder lager i varje arbetsmarknadspolitiska åtgärder behandling väl (till en slutlig koncentration av 40 | ig / ml) och 25 pl kontrollvehikel (se LMP produktion) till kontrollbrunnar.
- Fortsätt inkubationen i en kontrollerad atmosfär modulär inkubator kammare vid 37 ° C med försiktig skakning.
- Efter 24 timmar, tvätta explantat 3 gånger med PBS och gå vidare till nästa steg (4% paraformaldehyd [PFA] fixering).
3. Histopatologisk undersökning
3.1) Förbered följande lösningar innan du fortsätter till nästa steg
- Bered 1x PBS-buffert genom att blanda 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,76 mM KH 2 PO 4, pH 7,4.
- För att framställa 4% PFA, upplösa 20 g av PFA i 400 ml vatten, värmdes vid 60 ° C under omröring; tillsätt några droppar 10 M NaOH för att rensa lösningen. Nästa lägga 1x PBS-buffert och justera volymen till 500 ml och pH till 7,4. Filter och delprov; lagra vid -20 ° C.
- Förbered följande uttorkning eller rehydrering reagenser; 100%, 90%, 70%, 50% etanol och xylen.
- Placera varje explantat i ett märkt mikrocentrifugrör med 1,5 ml av 4% PFA och inkubera O / N vid 4 ° C. Skölj explantaten två gånger med 1 x PBS.
- Torka explants genom en alkoholserie (70% etanol: 3 gånger 30 minuter vardera, 90% etanol: 2 gånger 30 minuter vardera, 100% etanol: 3 gånger 30 minuter vardera, sedan xylen: 3 gånger 20 minuter vardera). Utför alla steg vid RT i ett dragskåp.
- Inbädda vävnadsexplantat i paraffin vid 58 ° C i en ugn. Förbered 5 um tjocka vävnadssnitt med hjälp av en roterande mikrotom.
- Float sektionerna i en 56 ° C vattenbad, och sedan montera sektionerna på märkta histologiska diabilder. Placera glasen i manuella färgningsställ och torrt vid 65 ° C under 1 timme. Låt bilderna svalna vid RT.
- Doppa de ställningar i 4 på varandra följande fläck rätter som innehåller xylen i 10 minuter vardera för att avlägsna paraffin. Doppa racken i en etanolserie för att avlägsna xylen: 100%, sedan 95%, thsv 80%, sedan 70%, sedan 50% etanol (5 min för varje steg). Skölj ställen med kranvatten under 5 minuter för att avlägsna etanol.
3,3) hematoxylin och eosin (H & E) Färgning
- Fortsätta att arbeta med avsnitten fasta vävnads; placera stället i en färgningsskål fylld med Mayers hematoxylin för 15 minuter. Skölj rack med kranvatten för att avlägsna Hematoxylin under 20 min.
- Placera i destillerat vatten under 30 sec.Place i 95% etanol under 30 sek. Placera i eosin Y-lösning färgskål i 1 min. Dehydrera genom två byten av 95% etanol, 100% etanol, och xylen för 2 min vardera.
- Utför en snabb kontroll under ett mikroskop för att se till att överskott eosin avlägsnas. Placera 2 till 3 droppar monteringsmedel (Fisher SP15-100) på varje bild, sedan täcka med en täckglas.
3.4) In Situ Celldöd Detection: TUNEL analys
- Före början, förbereda proteinas K arbetslösning: 20 mikrogram / ml i10 mM Tris / HCl, pH 7,4.
- Upprepa steg 1 till 5 i avsnitt 3.2 (Explantation fixering och vävnadssnitt avparaffinering). Skölj objektglasen med avjoniserat H2O
- Doppa objektglasen med 1 x PBS under 10 min. Dränera överskott PBS. Inkubera vävnadssnitt under 30 min vid RT med proteinas K-arbetslösning. Skölj glider två gånger med 1x PBS.
- Utför TUNEL-analysen som beskrivs i bruksanvisningen för celldöd upptäckt kit. Montera med hjälp monteringsmedium och täckglas manuellt med täckglas.
- Analysera prover under ett ljusmikroskop. Använd Bild Pro 4.5 för att analysera de apoptotiska celler i brun färg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsmarknadspolitiska åtgärder karakteriserades med annexin V färgning 10 av fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) analys och gated använder en um pärlor där 97% av riksdagsledamöterna (≤1 pm) annexin-V-Cy5 positiva (Figur 1A och 1B). Typiskt var ca 2,5 mg arbetsmarknadspolitiska åtgärder erhålls efter detta protokoll. Bronkial vävnadsexplantat från C57BL / 6-möss utsattes för fordon och arbetsmarknadspolitiska åtgärder behandling. Histopatologisk analys av bronkiala sektioner avslöjade effekten av arbetsmarknadspolitiska åtgärder på den strukturella integriteten hos den bronkiala epitelet. I kontroll explants, bronkialepiteliet var i stort sett oskadad (Figur 2A); Men i arbetsmarknadspolitiska åtgärder-behandlade explantat var ytliga epitelceller lagret skadas eller förloras, och det fanns en signifikant minskning av epitelceller höjd och täthet (Figur 2B). TUNEL-positiv färgning (en markör för apoptos) var mer uttalad i arbetsmarknadspolitiska åtgärder behandlade bronkialepiteliet jämfört med kontroll ( 
Figur 1. Flödescytometri analys av riksdagsledamöter som härrör från CEM T-cellinje. (A) Fastställande av framåt (FSC) och sidospridning (SSC) egenskaper med en um pärlor som används för att gate parlamentsledamöter. (B) Händelser i MPs gate var vidare bedömas för märkning med annexin V-Cy5 att skilja verkliga händelser från elektroniskt brus och därmed öka specificitet riksdagsledamöter upptäckt. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2. arbetsmarknadspolitiska åtgärder-inducerad bronkiell epitelskada skikt. Representativa histopatologiska bilder av bronkial epithelium av explantat behandlade med (A) kontroll eller (B) arbetsmarknadspolitiska åtgärder (40 | ig / ml under 24 h). Explantatet sektioner färgades med hematoxylin och eosin. Svarta pilar pekar på epitelskiktet. Fläckvis förlust av de ytliga och basalcellskikt är tydligt i sektioner av arbetsmarknadspolitiska åtgärder-behandlade bronkial-explantat (B). Förstoring 400X, bar = 20 ^ M. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3. arbetsmarknadspolitiska åtgärder inducerad bronkial epitelceller apoptos De apoptotiska celler i epiteliala lagret av segment bronkerna upptäcktes av TUNEL-analys. positivt färgade celler avbildas i brunt. Representativa bilder av bronkiella epitelceller i kontroll (A)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Riksdagsledamöter är aktiva förmedlare av intercellulära överhörning och deras studie är lovande på många vetenskapsområden. 11 Denna studie fram ett detaljerat protokoll för in vitro storskalig generation arbetsmarknadspolitiska åtgärder som härrör från en apoptotiska T-cellinje. Dessa riksdagsledamöter uttrycker en stor repertoar av lymfocyt molekyler och biologiskt inblandade i regleringen av cellulära och vävnads homeostas. Emellertid kan arbetsmarknadspolitiska åtgärder härrör från olika källor vara biologiskt annorlunda. 4,9,12,13
Arbetsmarknadspolitiska åtgärder visa varierande egenskaper beroende på de stimuli som används för att generera dem in vitro och den cell från vilken de härrör. Som sådan bör utföras extrapolering av data erhållna in vitro med användning arbetsmarknadspolitiska åtgärder härledda från immortaliserade cellinjer med data från arbetsmarknadspolitiska åtgärder genererade in vivo med försiktighet.
Detta protokoll beskriver flera centrifugeringssteg erfordras för isolering av MPs; därför, cbehövs areful manipulation för att minimera förlusten av MPs under denna process. Snäpp frysning av isolerade arbetsmarknadspolitiska åtgärder vid -70 ° C rekommenderas; Vi har observerat att de bioaktiviteter av arbetsmarknadspolitiska åtgärder under dessa förhållanden kan bevaras i upp till 2 år (opublicerade data).
Hittills flödescytometri anses vara den "gyllene standarden" för riksdagsledamöter analys. Polykromatisk flödescytometrisk analys används för att bestämma subpopulationer av MPs från olika cellulära ursprung. Trots detta är de för närvarande kommersiellt tillgängliga flödescytometrar begränsade i sin förmåga att analysera med mindre storlek MPs populationer (mindre än 300 nm) och att skilja mellan cellrester och MPs. Dessutom kan FACS-analys (cytofluorimetric analys) vara en alternativ metod för TUNEL analys att räkna apoptotiska celler för statistisk analys.
Här visar vi att bronkiala explantat odlade ex vivo kan tillhandahålla en bra källa till luftvägsepitelceller feller farmakologi och toxikologi screening. Eftersom dessa bronkiala explantat likna sina ursprungliga fysiologiska miljöer, kan de vara användbara för bestämning av signalvägar för vissa bronkiala eller lungsjukdomar. Men använd endast luftrörs explants kommer inte kunna bekräfta apoptotiska effekt arbetsmarknadspolitiska åtgärder på epitelceller är ett resultat av direkt eller / och från sekundär till aktivering av inhemska immunceller. För att undersöka den direkta effekten av arbetsmarknadspolitiska åtgärder kommer de primära luftvägsepitelceller vara lämplig för detta ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av anslag från den kanadensiska Institutes of Health Research (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec - Vision Health Research Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LMPs production and characterization | |||
| CEM T cells | ATCC | CCL-119 | |
| X-VIVO 15 medium | Cambrex, Walkersville | 04-744Q | |
| Flask T75 | Sarstedt | 83.1813.502 | |
| Flask T175 | Sarstedt | 83.1812.502 | |
| Actinomycin D | Sigma Chemical Co. | A9415-2mg | |
| PBS | Lifetechnologies | 14190-144 | |
| 0.22 µm filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Annexin-VCy5 | BD Pharmagen | 559933 | |
| FACS flow solution | BD Bio-sciences | 342003 | |
| Fluorescent microbeads (1 µm) | Molecular Probes | T8880 | |
| Polysterene counting beads (7 µm) | Bangs laboratories | PS06N/6994 | |
| Polypropylene FACS tubes | Falcon | 352058 | |
| 1 ml pipet | Fisher | 13-678-11B | |
| 5 ml pipet | Falcon | 357543 | |
| 25 ml pipet | Ultident | DL-357551 | |
| 1.5 ml conical polypropylene micro tube | Sarstedt | 72.690 | |
| 15 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 50 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| 50 ml high speed polypropylene copolymer tube | Nalgene | 3119-0050 | |
| 250 ml high speed polypropylene bottle | Beckman | 356011 | |
| Protein assay (Bradford assay) | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | |
| Protein assay standard II | Bio-Rad Laboratories | 500-0007 | |
| Test tube 16 x 100 | VWR | 47729-576 | |
| Test tube 12 x 75 | Ultident | 170-14100005B | |
| Cell incubator | Mandel | Heracell 150 | |
| Low speed centrifuge | IEC | Centra8R | |
| High speed centrifuge | Beckman | Avanti J8 | |
| High speed rotor for 250ml bottle | Beckman | JLA16.250 | |
| High speed rotor for 50ml tube | Beckman | JA30.50 | |
| Fow cytometry | BD Bio-sciences | FACS Calibur | |
| Spectrophotometer | Beckman | Series 600 | |
| Bronchial tissue explants and sections | |||
| C57BL/6 mice (5-7 weeks old) | Charles River Laboratories, Inc. | ||
| Mouse Airway PrimaCell™ System: | CHI Scientific, Inc. | 2-82001 | |
| Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades | Becton Dickinson AcuteCare | 371310 | #10 |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools Inc. | 10003-12 | #7 |
| phase-contrast inverted microscope | Olympus Optical CO., LTD. | CK2 | |
| high O2 gas mixture | VitalAire Canada Inc. | ||
| modular incubator chamber | Billups-Rothenberg Inc. | MIC-101 | |
| MaxQ 4000 incubated orbital shaker | Barnstead Lab-Line, | SHKA4000-7 | |
| 12-well tissue culture plate | Becton Dickinson and Company | 353043 | |
| Plastic tissue culture dishes (100 mm) | Sarstedt, Inc. | 83.1802 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools Inc. | 14060-09 | Straight, sharp, 9cm longth |
| Half-curved Graefe forceps | Fine Science Tools Inc. | 11052-10 | |
| humidified CO2 incubator | Mandel Scientific Company Inc. | SVH-51023421 | |
| Histopathological examination | |||
| formalin formaldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | HT5011 | |
| paraffin | Fisher scientific International, Inc. | T555 | |
| ethyl alcohol | Merck KGaA, Darmstadt | EX0278-1 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | G6403 | |
| Cacodylate | Sigma-Aldrich, Inc. | 31533 | |
| microscope slides | VWR Scientific Inc. | 48300-025 | 25x75 mm |
| Xylene | Fisher scientific International, Inc. | X5-4 | |
| Mayer's hematoxylin | Sigma-Aldrich, Inc. | MHS16 | Funnel with filter paper |
| HCl | Fisher scientific International, Inc. | A144s-500 | |
| eosin | Sigma-Aldrich, Inc. | HT110116 | Funnel with filter paper |
| Permount™ Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific Inc. | SP15-100 | |
| glass coverslip | surgipath medical industries, Inc. | 84503 | 24×24 #1 |
| TUNEL detection kit | In Situ Cell Death Detection, POD | 11 684 817 910 | |
| oven | Despatch Industries Inc. | LEB-1-20 | |
| rotary Microtome | Leica Microsystems Inc. | RM2145 | |
| filter paper | Whatman International Ltd. | 1003150 | #3 |
| Microscope | Nikon Imaging Japan Inc. | E800 | |
| staining dish complete | Wheaton Industries, Inc. | 900200 | including dish, rack, cover |
| 1.5 ml eppendorf tube | Sarstedt Inc. | 72.69 | 39x10 mm |
| Orbital and Reciprocating Water Bath | ExpotechUSA | ORS200 | |
| phosphate buffered saline | GIBCO | 14190-144 | |
| fume hood | Nicram RD Service | 3707E |
References
- Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).
- Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).
- Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles. Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).
- Yang, C., et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).
- Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells. Cancer Biol Ther. 10 (5), 448-456 (2010).
- Angelillo-Scherrer, A. Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis. Circ Res. 110 (2), 356-369 (2012).
- Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).
- Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis. Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).
- Martin, S., et al. Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression. Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).
- Shet, A. S., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Yang, C., et al. Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Soleti, R., et al. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).
