Summary
Micropartículas verter à membrana celular (MPs) são vesículas biológicas activas que podem ser isolados e os seus efeitos patofisiológicos investigados em vários modelos. Descrevemos aqui um método para a geração de MPs derivadas de linfócitos T (LMPS) e para demonstrar o seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias respiratórias.
Abstract
O interesse nas funções biológicas de células derivadas de vesículas de membrana em comunicação célula-célula tem aumentado nos últimos anos. As micropartículas (MP) são um tal tipo de vesículas, que variam em diâmetro de 0,1 mm a 1 mm, e normalmente eliminados da membrana plasmática de células eucarióticas submetidos a activação ou a apoptose. Aqui descreve-se a geração de linfócitos T derivados de micropartículas (LMPS) a partir de células CEM T apoptóticas estimuladas com actinomicina D. LMPS são isoladas através de um processo de múltiplos passos de centrifugação diferencial e caracterizadas por citometria de fluxo. Este protocolo também apresenta um método de detecção da morte celular in situ para demonstrar o efeito pró-apoptótica de LMPS em células epiteliais brônquicas derivadas de rato primários respiratórias explantes de tecido brônquico. Os métodos aqui descritos proporcionam um procedimento reprodutível para o isolamento de quantidades abundantes de LMPS de linfócitos apoptóticos in vitro. LMPS derivadodeste modo pode ser utilizado para avaliar as características de vários modelos de doenças, e para a farmacologia e toxicologia de teste. Dado que o epitélio das vias aéreas como uma barreira física e funcional protectora entre o ambiente externo e o tecido subjacente, o uso de explantes de tecido brônquico, em vez de linhas de células epiteliais imortalizadas fornece um modelo eficaz para investigações que requerem tecido vias aéreas.
Protocol
NOTA: Masculino camundongos C57BL / 6 (5-7 semanas de idade) são de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canadá.) E manipulados de acordo com protocolos aprovados pela Comissão de CHU Sainte-Justine Animal Care. Rato explantes de tecido dos brônquios fornecer uma boa fonte de células epiteliais brônquicas primárias para investigar os efeitos pró-apoptóticos de LMPS em células epiteliais. Este protocolo descreve a geração in vitro de LMPS, bem como um método para detectar células apoptóticas epiteliais brônquicas em explantes de tecido tratados com LMPS. Este protocolo é composta de 3 seções.
1. LMPS produção e caracterização
NOTA: Para evitar a contaminação, garantir que todos os materiais utilizados no experimento são estéreis ou autoclavado. Execute todas as etapas na RT em uma cabine de segurança biológica em condições estéreis, salvo indicação em contrário.
1.1) Estímulo e Recolha de MPs9
- Descongelar uma aliquota de 10 milhões de células T CEM em um banho de água a 37 ° C. Dilui-se em 10 ml de meio pré-aquecido hematopoiéticas, tais como X-Vivo, em um tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 200 gx 5 min isento de soro. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de pré-aquecido.
- Transferência de células para um balão de cultura de tecidos T75 (para as células em suspensão) com 15 ml de meio pré-aquecido hematopoiéticas, tais como X-Vivo e incubar durante 4 dias numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Após 4 dias, transferir todo o meio de cultura e as células para um balão de cultura de tecidos T175 contendo 100 ml de meio fresco. Continuar a incubação das células durante cerca de 72 horas sob as mesmas condições até terem crescido até uma densidade de 2 milhões de células / ml.
- Células uniformemente dividida entre quatro frascos T175 contendo cada um 150 ml de meio fresco e continuam até que as células de cultura de células foram cultivadas (aproximadamente 48 horas de incubação) a uma densidade de 2 milhões / ml.
- Adicionar actinomicina D (dissolvido em DMSO a 2 mg / ml) ao meio, numa concentração final de 0,5 ug / ml e incubar durante 24 horas.
- Transferir todo o meio de cultura para tubos cónicos de 50 ml e girar para baixo as células a 750 xg durante 5 min. Transferir o sobrenadante para 50 ml tubos cónicos e centrifugar a 1500 xg por 15 min para remover fragmentos de células grandes.
- Transferir o sobrenadante para um frasco de 250 ml e ultracentrífuga a 12.000 xg durante 50 min. Desprezar o sobrenadante e recolher pellets.
- Lavar peletes LMPS enriquecido com 40 ml de PBS estéril num tubo de 50 ml por centrifugação a 12.000 xg durante 50 min. Repita esta etapa duas vezes.
- Recolher o último sobrenadante da lavagem; ele será usado como controlo do veículo. Suspender as pastilhas em 1 LMPSml de PBS e transferir para um microtubo de 1.5 ml estéril. Alíquotas e armazenar LMPS isoladas a -80 ° C (para evitar múltiplos ciclos de livre-descongelamento).
1.2) Caracterização de MPs via Análise FACS 4
- Preparar 2 amostras de tampão de anexina, com uma e outra sem CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, mais ou menos 5 mM de CaCl2.
- Filtro de tampão de FACS e anexina fluxo do fluido do invólucro através de um filtro de 0,22 um para remover as partículas.
- Dilui-se 1 ul de LMPS em 44 ul de tampão de anexina com CaCl2 a 5 mM para um tubo de FACS. Preparar outro tubo com 1 ml de LMPS em 44 ul de tampão de anexina sem CaCl2 (controle negativo).
- Adiciona-se 5 ul de annexinV-Cy5 em cada tubo e misturar bem. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Parar a reacção por diluição da mistura com 400 ul de fluido de revestimento de fluxo FACS em cada tubo.
- Adicionam-se 10 ul (200000 pérolas), de 7 mm de contagem beasuspensão ds como padrão interno em cada tubo para se obter uma contagem absoluta.
- Estabelecer portas do tamanho relativo (FSC-H, PMT E00, escala logarítmica) e granularidade relativa (SSC-H, PMT 325, escala logarítmica) gráfico de pontos no citômetro de fluxo utilizando partículas fluorescentes calibrado de tamanho de 1 mm (portão 1) e contando grânulos portão 7 mm (portão 2).
- Analisar a amostra LMPS em FSC-H enredo / SSC-H usando os portões estabelecidos e FL-4 canais para anexina (PMT 765, escala logarítmica) gráfico de pontos, através da aquisição de um sinal de até 20 mil contas de contagem são alcançado em portão 2.
- Determinar os eventos positivos de annexinV LMPS em tampão de anexina contendo CaCl 2 e em seguida subtrair os eventos de LMPS em tampão de anexina sem CaCl2 (controle negativo).
- Calcula-se o número absoluto de MPs com base na seguinte equação:
1.3) Determinação do MP Protein Concentração (Ensaio de Bradford)
- Prepare a 5 diluições em série de um padrão de proteína 1,25-20 ug / ml. Pipetar 800 ul de cada solução padrão e amostra para um tubo de ensaio limpo em duplicado. Adicionar 200 ul de reagente corante de Bradford a cada tubo. Misture bem, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Medir a absorvância a 595 nm. Determinar a concentração de proteína de LMPS utilizando a regressão linear da curva padrão.
2. explantes tecido brônquico e Tratamento LMPS
NOTA: Preste atenção especial para o ambiente de trabalho estéril, e assepticamente preparar as soluções e médio utilizadas nos seguintes experimentos. Para preparar o meio de cura completa, adicionar 1 ml de tecido em cicatrização Médias Suplementos com Serum (descongeladas em gelo) a 100 ml Tissue Cura Médio e misture bem.
2.1) Preparação de explantes de tecidos bronquiais
- Antes de cultura, arranhar 6 áreas de 1 cm 2cada um na extremidade da superfície de cada 100 milímetros prato de cultura de tecidos com uma lâmina de bisturi. Casaco cada riscado 100 mm de prato de cultura de tecido com 2 ml da solução de revestimento de prato de cultura, e incuba-se a placa em uma incubadora de CO 2 humidificado O / N a 37 ° C. Vacuum aspirar a solução excedente e encher o prato com 15 ml de lavar roupa Tissue Medium.
- Eutanásia camundongos C57BL / 6 (5-7 semanas de idade) por inalação de CO2 de acordo com protocolos aprovados pelo comitê de ética do cuidado animal.
- Assepticamente dissecar tecido pulmonar com bisturi, Dumont super fino pinça e tesouras cirúrgicas. Remova cuidadosamente vasos do parênquima e do sangue. Coloque o tecido pulmonar em gelada Tissue lavar Médio para o transporte para o laboratório, se for o caso.
- Além disso dissecar brônquio submerso no meio de lavagem de tecidos e separar o brônquio com um diâmetro de 1 a 2,5 mm a partir de tecidos periféricos de pulmão. Fatia tecidos bronquiais em ~ 5 milímetros anéis brônquica grossas com um bisturi. Use um movimento de escavar com as estéreis forceps microdissecting curvas para pegar os fragmentos dos brônquios e colocá-los para as áreas riscadas dos pratos.
- Remover o meio de lavagem de tecidos, e os fragmentos incubar à temperatura ambiente durante ~ 5 min para permitir que adiram aos pratos.
- Adicionar 10 ml de meio de cura completa para cada prato e coloque-os em uma atmosfera controlada câmara incubadora modular. Lave com a câmara de mistura de gás de alta O 2 (70% de O2, 25% de N2 e 5% de CO 2,). Coloque a câmara numa incubadora orbital de bancada e agite-o a 37 ° C. Agitar a câmara durante 24 horas a 10 ciclos por minuto para permitir que a forma de fluir de forma intermitente ao longo dos fragmentos.
- Após 24 horas de incubação, observar os explantes de tecido sob um microscópio de luz de contraste de fase invertida. Selecione explantes brônquica, com completa, movimento cabelos finos e animada epitélio brônquico para tratamento LMPS subseqüente.
2.2) Tratamento LMPS
- Prepare meio de crescimento completo como se segue: Crescimento de degelo suplementos médias com soro e de fibroblastos inibidor sobre gelo. Adicionar 1 ml de meio de crescimento os suplementos com soro e 200 ul de inibidor de fibroblastos a 100 ml de meio de crescimento; homogeneizar. Aquecer o meio de crescimento completo a 37 ° C durante 10 min antes da utilização.
- Diluir LMPS isolados em um novo tubo eppendorf estéril com PBS para preparar um estoque LMPS a uma concentração de 800 ug / ml.
- Adicionar 0,5 ml de Meio Completo Crescimento para cada poço de uma placa de 12 poços de cultura de tecidos.
- Transferir os explantes brônquicas seleccionados com os fórceps microdissecting curvas do protocolo anterior (secção 2.1) a cada poço da placa de cultura de tecido.
- Rotular a placa de cultura de forma adequada para identificar LMPS poços de tratamento e poços de controlo. Adicionar 25 ul LMPS estoque em cada tratamento bem LMPS (para uma concentração final de 40 ug / ml) e 25 ul de veículo de controlo (ver LMP s produção) aos poços de controlo.
- Continuar a incubação num incubador modular câmara de atmosfera controlada a 37 ° C com agitação suave.
- Após 24 horas, lavar explantes 3 vezes com PBS e avançar para a (fixação paraformaldeído a 4% [PFA]) próximo passo.
3. exame histopatológico
3.1) Prepare as seguintes soluções antes de prosseguir para as próximas etapas
- Preparar tampão PBS 1x por mistura de NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,76 mM, KH 2 PO 4, pH 7,4.
- Para preparar PFA a 4%, dissolver 20 g de PFA em 400 ml de água, aquecida a 60 ° C com agitação; adicionar algumas gotas de NaOH 10 M para limpar a solução. Em seguida adicionar tampão de PBS 1x e ajustar o volume para 500 ml e o pH a 7,4. Filtrar e alíquota; armazenar a -20 ° C.
- Prepare os seguintes reagentes de desidratação ou de reidratação; 100%, 90%, 70%, etanol a 50% e xileno.
- Colocar cada explante num tubo de microcentrífuga marcado com 1,5 ml de 4% de PFA e incubar O / N a 4 ° C. Lavar os explantes duas vezes com PBS 1x.
- Desidratar explantes através de uma série de álcoois (etanol a 70%: 3 vezes 30 minutos cada; etanol a 90%: 2 vezes 30 minutos cada; etanol a 100%: 3 vezes cada 30 min, em seguida, o xileno: 3 vezes 20 min cada). Execute todas as etapas na RT em um exaustor.
- Imbed explantes de tecido em parafina a 58 ° C num forno. Prepare 5 mm de espessura de tecido usando um micrótomo rotativo.
- Float as seções em um banho de água a 56 ° C, e em seguida, montar as secções em lâminas histológicas marcados. Colocar as lâminas em cavaletes de coloração manuais e seco a 65 ° C durante 1 h. Permitir que os slides para esfriar em temperatura ambiente.
- Mergulhe as prateleiras em 4 pratos mancha consecutivos contendo xileno por 10 min cada, para remover a parafina. Mergulhar as prateleiras em uma série de etanol para remover o xileno: 100%, depois 95%, thpt 80%, em seguida, 70%, em seguida etanol a 50% (5 minutos para cada etapa). Lavar as cremalheiras com água da torneira durante 5 minutos para remover o etanol.
3.3) Hematoxilina e Eosina (H & E) Coloração
- Continue trabalhando com os cortes de tecidos fixos; colocar o suporte para um prato de coloração com hematoxilina de Mayer durante 15 min. Lavar o rack com água da torneira para remover Hematoxilina para 20 min.
- Colocar em água destilada durante 30 sec.Place em etanol a 95% durante 30 seg. Coloque em Eosina Y coloração solução prato para 1 min. Desidratar através de duas mudanças de etanol a 95%, etanol a 100%, e de xileno durante 2 min cada.
- Realize uma verificação rápida sob um microscópio para garantir que o excesso de eosina é removido. Coloque 2 a 3 gotas de Meio de Suporte (Fisher SP15-100) em cada slide, em seguida, cubra com uma tampa de vidro.
3.4) In Situ celular Detecção de morte: TUNEL Assay
- Antes de começar, preparar a solução de trabalho de proteinase K: 20 ug / ml emTris 10 mM / HCl, pH 7,4.
- Repita os passos 1 a 5 da secção 3.2 (fixação Explant e tecido seção desparafinização). Lavar as lâminas com deionizada H 2 O.
- Mergulhar as lâminas com 1x PBS durante 10 min. Escorra o excesso de PBS. Incubar as secções de tecido, durante 30 min à temperatura ambiente com uma solução de proteinase K a trabalhar. Lavar as lâminas duas vezes com PBS 1x.
- Realize o ensaio TUNEL conforme descrito no manual de instruções do kit de detecção de morte celular. Montar usando meio de montagem, e lamela manualmente com lamelas de vidro.
- Analisar amostras sob um microscópio de luz. Use Imagem Pro 4.5 para analisar as células em apoptose na cor marrom.
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Representative Results
LMPS foram caracterizados com coloração de anexina V por 10 células activadas por fluorescência (FACS) e fechado utilizando uma pm grânulos em que 97% das MPs (≤1 um) foram anexina-V-Cy5 positivo (Figura 1A e 1B). Normalmente, cerca de 2,5 mg de LMPS foram obtidos seguindo este protocolo. Explantes de tecido brônquico de ratos C57BL / 6 foram submetidos a tratamento e LMPS veículo. A análise histopatológica das secções brônquicas revelado o efeito de LMPS sobre a integridade estrutural do epitélio brônquico. Em explantes de controlo, o epitélio bronquial foi em grande parte não danificada (Figura 2A); no entanto, em explantes tratados com LMPS, a camada superficial de células epiteliais foi danificado ou perdido, e houve quedas significativas na altura da célula epitelial e densidade (Figura 2B). TUNEL-positivo (um marcador de apoptose) foi mais pronunciado no epitélio brônquico tratados com LMPS relação ao controle ( 
Figura 1. A citometria de fluxo análise de MPs derivadas de linha de células T CEM. (A) Determinação da frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) características com 1 mm contas utilizadas para MPs portão. (B) Eventos no portão MPs foram ainda avaliadas para marcação com anexina V-Cy5 para distinguir os verdadeiros eventos de ruído eletrônico , aumentando assim a especificidade da detecção MPs. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2. LMPS induzida brônquica danos camada epitelial. Imagens histopatológicos representativos de epitheli brônquicahum de explantes tratados com (A) ou de controlo (B) LMPS (40 ug / ml para 24 horas). Seções de explantes foram coradas com hematoxilina e eosina. Setas pretas apontam para a camada epitelial. Perda irregular das camadas superficiais de células basais e é evidente nas secções de explantes tratados brônquicas-LMPS (B). Aumento de 400X, bar = 20 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3. LMPS apoptose induzida por células epiteliais brônquicas As células apoptóticas na camada epitelial dos brônquios segmentares foram detectados por ensaio de TUNEL.; positivamente as células coradas são retratados em marrom. Imagens representativas de células epiteliais brônquicas em controle (A)
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Discussion
MPs são mediadores ativos de conversas cruzadas intercelular e seu estudo é promissor em muitas áreas da ciência. 11 Este estudo apresentou um protocolo detalhado para in vitro geração em larga escala de LMPS derivado de uma linha de células T por apoptose. Estas MPs expressar um grande repertório de moléculas de linfócitos e são biologicamente implicado na regulação da homeostase celular e tecidual. No entanto, LMPS derivadas de diferentes fontes podem ser biologicamente diferente. 4,9,12,13
LMPS exibir propriedades variadas dependendo dos estímulos utilizados para gerá-los in vitro e a célula a partir da qual eles são derivados. Como tal, a extrapolação dos dados obtidos in vitro utilizando LMPS derivadas de linhas celulares imortalizadas a partir de dados gerados LMPS in vivo deve ser realizado com cuidado.
Este protocolo descreve vários passos de centrifugação necessários para o isolamento de PM; portanto, careful manipulação é necessário para minimizar a perda de MPs durante este processo. Encaixe de congelamento LMPS isoladas a -70 ° C é recomendada; temos observado que as atividades biológicas de LMPS sob estas condições podem ser preservados por até 2 anos (dados não publicados).
Até à data, a citometria de fluxo é considerada o "padrão ouro" para a análise de MPs. A análise de citometria de fluxo policromática é usado para determinar as subpopulações de MPs de diferentes origens celulares. No entanto, os actuais citómetros de fluxo comercialmente disponíveis estão limitados na sua capacidade de analisar as populações de menor tamanho MPs (menos do que 300 nm) e para distinguir entre os restos celulares e MPs. Além disso, a análise por FACS (análise de citometria de fluxo) pode ser utilizada como alternativa ao ensaio de TUNEL, a contagem de células apoptóticas por análise estatística.
Aqui, nós mostramos que explantes brônquicas cultivadas ex vivo pode fornecer uma boa fonte de células epiteliais das vias aéreas fou farmacologia e toxicologia de triagem. Porque estes explantes brônquios se parecem com seus ambientes fisiológicas originais, eles podem ser úteis para determinar as vias de sinalização de certas doenças dos brônquios ou pulmão. Contudo, usar apenas explantes brônquicos não será capaz de confirmar o efeito apoptótico de LMPS em células epiteliais é resultou directa ou / e do secundário para a activação de células imunitárias residentes. Para investigar o efeito directo de LMPS, as células epiteliais das vias respiratórias primário será apropriado para este fim.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por subsídios da Canadian Institutes of Health Research (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec - Visão Rede de Investigação em Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LMPs production and characterization | |||
| CEM T cells | ATCC | CCL-119 | |
| X-VIVO 15 medium | Cambrex, Walkersville | 04-744Q | |
| Flask T75 | Sarstedt | 83.1813.502 | |
| Flask T175 | Sarstedt | 83.1812.502 | |
| Actinomycin D | Sigma Chemical Co. | A9415-2mg | |
| PBS | Lifetechnologies | 14190-144 | |
| 0.22 µm filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Annexin-VCy5 | BD Pharmagen | 559933 | |
| FACS flow solution | BD Bio-sciences | 342003 | |
| Fluorescent microbeads (1 µm) | Molecular Probes | T8880 | |
| Polysterene counting beads (7 µm) | Bangs laboratories | PS06N/6994 | |
| Polypropylene FACS tubes | Falcon | 352058 | |
| 1 ml pipet | Fisher | 13-678-11B | |
| 5 ml pipet | Falcon | 357543 | |
| 25 ml pipet | Ultident | DL-357551 | |
| 1.5 ml conical polypropylene micro tube | Sarstedt | 72.690 | |
| 15 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 50 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| 50 ml high speed polypropylene copolymer tube | Nalgene | 3119-0050 | |
| 250 ml high speed polypropylene bottle | Beckman | 356011 | |
| Protein assay (Bradford assay) | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | |
| Protein assay standard II | Bio-Rad Laboratories | 500-0007 | |
| Test tube 16 x 100 | VWR | 47729-576 | |
| Test tube 12 x 75 | Ultident | 170-14100005B | |
| Cell incubator | Mandel | Heracell 150 | |
| Low speed centrifuge | IEC | Centra8R | |
| High speed centrifuge | Beckman | Avanti J8 | |
| High speed rotor for 250ml bottle | Beckman | JLA16.250 | |
| High speed rotor for 50ml tube | Beckman | JA30.50 | |
| Fow cytometry | BD Bio-sciences | FACS Calibur | |
| Spectrophotometer | Beckman | Series 600 | |
| Bronchial tissue explants and sections | |||
| C57BL/6 mice (5-7 weeks old) | Charles River Laboratories, Inc. | ||
| Mouse Airway PrimaCell™ System: | CHI Scientific, Inc. | 2-82001 | |
| Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades | Becton Dickinson AcuteCare | 371310 | #10 |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools Inc. | 10003-12 | #7 |
| phase-contrast inverted microscope | Olympus Optical CO., LTD. | CK2 | |
| high O2 gas mixture | VitalAire Canada Inc. | ||
| modular incubator chamber | Billups-Rothenberg Inc. | MIC-101 | |
| MaxQ 4000 incubated orbital shaker | Barnstead Lab-Line, | SHKA4000-7 | |
| 12-well tissue culture plate | Becton Dickinson and Company | 353043 | |
| Plastic tissue culture dishes (100 mm) | Sarstedt, Inc. | 83.1802 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools Inc. | 14060-09 | Straight, sharp, 9cm longth |
| Half-curved Graefe forceps | Fine Science Tools Inc. | 11052-10 | |
| humidified CO2 incubator | Mandel Scientific Company Inc. | SVH-51023421 | |
| Histopathological examination | |||
| formalin formaldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | HT5011 | |
| paraffin | Fisher scientific International, Inc. | T555 | |
| ethyl alcohol | Merck KGaA, Darmstadt | EX0278-1 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | G6403 | |
| Cacodylate | Sigma-Aldrich, Inc. | 31533 | |
| microscope slides | VWR Scientific Inc. | 48300-025 | 25x75 mm |
| Xylene | Fisher scientific International, Inc. | X5-4 | |
| Mayer's hematoxylin | Sigma-Aldrich, Inc. | MHS16 | Funnel with filter paper |
| HCl | Fisher scientific International, Inc. | A144s-500 | |
| eosin | Sigma-Aldrich, Inc. | HT110116 | Funnel with filter paper |
| Permount™ Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific Inc. | SP15-100 | |
| glass coverslip | surgipath medical industries, Inc. | 84503 | 24×24 #1 |
| TUNEL detection kit | In Situ Cell Death Detection, POD | 11 684 817 910 | |
| oven | Despatch Industries Inc. | LEB-1-20 | |
| rotary Microtome | Leica Microsystems Inc. | RM2145 | |
| filter paper | Whatman International Ltd. | 1003150 | #3 |
| Microscope | Nikon Imaging Japan Inc. | E800 | |
| staining dish complete | Wheaton Industries, Inc. | 900200 | including dish, rack, cover |
| 1.5 ml eppendorf tube | Sarstedt Inc. | 72.69 | 39x10 mm |
| Orbital and Reciprocating Water Bath | ExpotechUSA | ORS200 | |
| phosphate buffered saline | GIBCO | 14190-144 | |
| fume hood | Nicram RD Service | 3707E |
References
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