Summary
Cellemembran-kaste mikropartikler (MPS) er aktive biologiske vesikler, som kan isoleres, og deres patofysiologiske virkninger undersøgt i forskellige modeller. Her beskriver vi en fremgangsmåde til generering af MP'er afledt fra T-lymfocytter (LMPs) og til at demonstrere deres proapoptotiske virkning på luftveje epitelceller.
Abstract
Interessen for de biologiske roller cellemembran-afledte vesikler i celle-celle kommunikation er steget i de senere år. Mikropartikler (MPS) er en sådan type af vesikler, en diameter på fra 0,1 um til 1 um, og typisk kaste fra plasmamembranen af eukaryote celler, der undergår aktivering eller apoptose. Her beskriver vi genereringen af T lymfocyt-afledt mikropartikler (LMPs) fra apoptotiske CEM T-celler stimuleret med actinomycin D. LMPs isoleres gennem en flertrins differentialcentrifugering proces og karakteriseret ved anvendelse af flowcytometri. Denne protokol viser også en in situ celledød påvisningsmetode for at demonstrere proapoptotiske virkning LMPs på bronchieepithelceller celler afledt fra muse primær respiratorisk bronchiale vævseksplantater. Heri beskrevne fremgangsmåder giver en reproducerbar procedure til isolering af rigelige mængder LMPs fra apoptotiske lymfocytter in vitro. LMPs afledtpå denne måde kan anvendes til at vurdere karakteristika for forskellige sygdomsmodeller og til farmakologi og toksikologi test. Da luftvejsepitel tilbyder en beskyttende fysisk og funktionel barriere mellem det eksterne miljø og det underliggende væv, anvendelse af bronkial vævseksplantater snarere end immortaliserede epiteliale cellelinjer tilvejebringer en effektiv model for undersøgelser, der kræver luftvejene tarmkanalen væv.
Protocol
BEMÆRK: Male C57BL / 6-mus (5-7 uger gamle) fra Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada.) Og manipuleret ifølge protokoller godkendt af CHU Sainte-Justine Animal Care udvalget. Mus bronchiale vævseksplantater giver en god kilde til primære bronkiale epitelceller at undersøge de proapoptotiske virkninger af LMPs på epitelceller. Denne protokol beskriver in vitro generering af LMPs, samt en fremgangsmåde til påvisning af apoptotiske epitelceller på LMPs-behandlede bronchiale vævseksplantater. Denne protokol består af 3 sektioner.
1. LMPs Produktion og karakterisering
BEMÆRK: For at undgå forurening, sikre, at alle, der anvendes i dette forsøg materialer er sterile eller autoklaveres. Udfør alle trin ved stuetemperatur i et biologisk sikkerhedsskab under steril tilstand, medmindre andet er angivet.
1.1) Stimulering og Indsamling af parlamentsmedlemmer9
- Optø en alikvot af 10 millioner CEM T-celler i et 37 ° C vandbad. Fortyndes i 10 ml forvarmet serumfrit hæmatopoietisk medium, såsom X-vivo i et 15 ml sterilt rør og centrifugeres ved 200 gx 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 5 ml foropvarmet medium.
- Overfør celler i en T75 vævskulturkolbe (for suspensionsceller) med 15 ml forvarmet hæmatopoietisk medium, såsom X-vivo og inkuberes i 4 dage i en befugtet inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2.
- Efter 4 dage overføre hele dyrkningsmediet og celler i en T175 vævskulturkolbe indeholdende 100 ml frisk medium. Fortsæt inkubation af cellerne i omkring 72 timer under de samme betingelser, indtil de er vokset til en densitet på 2 millioner celler / ml.
- Ligeligt fordelt celler mellem fire T175 kolber hver indeholdende 150 ml frisk medium og fortsætte cellekultur, indtil cellerne er vokset (ca. 48 timers inkubation) til en densitet på 2 millioner / ml.
- Tilføj actinomycin D (opløst i DMSO ved 2 mg / ml) til mediet i en slutkoncentration på 0,5 ug / ml og inkuberes i 24 timer.
- Overfør alle dyrkningsmediet i 50 ml koniske rør og spin ned cellerne ved 750 xg i 5 min. Supernatanten overføres til 50 ml koniske rør og centrifugeres ved 1500 xg i 15 minutter for at fjerne store cellefragmenter.
- Supernatanten overføres til en 250 ml flaske og ultracentrifuge ved 12.000 xg i 50 min. Supernatanten fjernes, og indsamle pellets.
- Wash LMPs beriget pellets med 40 ml sterilt PBS i et 50 ml rør ved centrifugering ved 12.000 xg i 50 min. Gentag dette trin to gange.
- Saml den sidste vask supernatanten; det vil blive brugt som vehikelkontrol. Suspendere LMPs pellets i 1ml PBS og overføres til en 1,5 ml steril mikrorør. Alikvote og gemme isolerede LMPs ved -80 ° C (for at undgå flere gratis-tø-cykler).
1.2) Karakterisering af parlamentsmedlemmer via FACS-analyse 4
- Forbered 2 prøver af annexin buffer, 1 med og en anden uden CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus eller minus 5 mM CaCl2.
- Filter annexin buffer og FACS flow sheathvæske anvendelse af et 0,22 um filter til fjernelse af partikler.
- Fortynd 1 pi LMPs i 44 pi annexin buffer med 5 mM CaCl2 i en FACS rør. Forbered andet rør med 1 pi LMPs i 44 pi annexin buffer uden CaCl2 (negativ kontrol).
- Tilsæt 5 pi annexinV-Cy5 i hvert rør og bland godt. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Reaktionen standses ved fortynding af blandingen med 400 pi FACS flow sheathvæske i hvert rør.
- Tilføj 10 pi (200.000 perler) af 7 pm optælling beads suspension som en intern standard i hvert rør for at opnå en absolut tæller.
- Etablering porte relative størrelse (FSC-H, PMT E00, log skala) og den relative granularitetskravene (SSC-H, PMT 325, log skala) dot plot på flowcytometeret hjælp størrelse kalibreret fluorescerende kugler på 1 um (gate 1) og tælle perler gate på 7 um (gate 2).
- Analyser LMPs prøve på FSC-H / SSC-H plot ved hjælp af de etablerede porte og FL-4 kanal til annexin (PMT 765, log skala) dot plot, ved at erhverve et signal indtil 20.000 tælle perler er nået i gate 2.
- Bestem de positive annexinV begivenheder LMPs i annexin buffer indeholdende CaCl2, og derefter trække begivenhederne i LMPs i annexin buffer uden CaCl2 (negativ kontrol).
- Beregn absolutte antal parlamentsmedlemmer baseret på den følgende ligning:
1.3) Bestemmelse af MP Protein Koncentration (Bradford Assay)
- Forbered 5 seriefortyndinger af et protein standard 1,25-20 ug / ml. Pipette 800 pi af hver standard og prøve opløsning i en ren reagensglas i to eksemplarer. Tilsæt 200 pi Bradford dye reagens til hvert rør. Bland godt, derefter inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Mål absorbans ved 595 nm. Bestem proteinkoncentration LMPs ved hjælp af lineær regression af standardkurven.
2. Bronkiale vævseksplantater og LMPs Behandling
BEMÆRK: Vær særlig opmærksom på det sterile arbejdsmiljø, og aseptisk forberede løsninger og medium, der anvendes i følgende forsøg. For at forberede den fuldstændig helbredelse Medium, tilsættes 1 ml af vævsheling Medium Kosttilskud med serum (optøet på is) til 100 ml vævsheling Medium og bland godt.
2.1) Fremstilling af bronkial vævseksplantater
- Før dyrkning, ridse 6 områder af 1 cm2hver på kanten af overfladen af hver 100 mm vævskulturskål med en skalpel. Coat hver ridset 100 mm vævskulturskål med 2 ml dyrkningsskålen coatingopløsning, og inkuber skålen i en befugtet CO2-inkubator O / N ved 37 ° C. Vacuum sug overskydende opløsning, og skålen fyldes med 15 ml Tissue Vask Medium.
- Aflive C57BL / 6 mus (5 til 7 uger gamle) af CO 2 inhalation efter protokoller, der er godkendt af dyret pleje etiske komité.
- Aseptisk dissekere lungevæv med skalpel, Dumont super fin pincet, og kirurgiske sakse. Fjern forsigtigt parenchymceller og blodkar. Placer lungevæv i iskoldt Tissue Vask Medium til transport til laboratoriet, hvis det er relevant.
- Yderligere dissekere bronkier nedsænket i Tissue vaskemedium og adskille bronkie med en diameter på 1 til 2,5 mm fra perifere lungevæv. Skær bronchiale væv i ~ 5 mm tykke bronchiale ringe med en skalpel. Brug en øse bevægelse med de sterile buede microdissecting pincet til at afhente de bronchiale fragmenter og placere dem på de ridsede områder af retterne.
- Fjern Tissue Vask Medium, og inkuberes fragmenterne ved stuetemperatur i ~ 5 minutter at give dem mulighed for at holde sig til retterne.
- Der tilsættes 10 ml Complete Healing medium til hver skål og placere dem i en kontrolleret atmosfære modulopbygget inkubator kammer. Skyl kammer med høj gasblanding O 2 (70% O 2, 25% N2 og 5% CO 2). Placer kammeret i en bordplade orbital inkubator og ryst den ved 37 ° C. Ryst kammeret i 24 timer ved 10 cyklusser i minuttet for at tillade mediet til at flyde med mellemrum i løbet af fragmenterne.
- Efter 24 timers inkubation observere vævseksplantater under et fase-kontrast inverteret lysmikroskop. Vælg bronchiale eksplantater med komplet, fint hår bevægelse og livlig bronkieepitel til efterfølgende LMPs behandling.
2.2) LMPs Behandling
- Forbered komplet vækstmedium som følger: tø vækstmedium kosttilskud med serum og fibroblast-inhibitor på is. Tilsæt 1 ml af vækstmediet supplerer med serum og 200 pi fibroblast-hæmmer til 100 ml vækstmedium; blandes grundigt. Varm komplet vækstmedium ved 37 ° C i 10 minutter før brug.
- Fortynd isolerede LMPs i et nyt sterilt Eppendorf-rør med PBS for at fremstille en LMPs lager ved en koncentration på 800 ug / ml.
- Tilsæt 0,5 ml komplet vækstmedium til hver brønd af en 12-brønds vævskulturplade.
- Overføre de valgte bronchiale eksplantater med de buede microdissecting pincet fra den foregående protokol (punkt 2.1) til hver brønd af vævskulturpladen.
- Mærk dyrkningspladen hensigtsmæssigt at identificere LMPs behandling brønde og kontrolbrønde. 25 pi LMPs lager i hver LMPs behandling godt (for en slutkoncentration på 40 ug / ml) og 25 pi vehikelkontrol (se LMP produktion) til kontrolbrøndene.
- Fortsæt inkubation i en kontrolleret atmosfære modulært inkubator kammer ved 37 ° C med forsigtig rystning.
- Efter 24 timer vaskes eksplantater 3 gange med PBS og gå videre til næste trin (4% paraformaldehyd [PFA] fiksering).
3. Histopatologisk undersoegelse
3.1) Forbered følgende løsninger før du fortsætter til næste skridt
- Forbered 1x PBS-buffer ved at blande 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,76 mM KH 2 PO 4, pH 7,4.
- For at forberede 4% PFA, opløses 20 g PFA i 400 ml vand, opvarmes til 60 ° C under omrøring; tilføje et par dråber af 10 M NaOH for at rydde løsningen. Næste tilføje 1x PBS-buffer og justere lydstyrken til 500 ml og pH til 7,4. Filter og alikvot; opbevares ved -20 ° C.
- Forbered følgende dehydrering eller rehydrering reagenser; 100%, 90%, 70%, 50% ethanol og xylen.
- Placer hver eksplantat i en mærket mikrocentrifugerør med 1,5 ml 4% PFA og inkuberes O / N ved 4 ° C. Skyl eksplantaterne to gange med 1x PBS.
- Dehydrer eksplantater gennem en alkohol-serien (70% ethanol: 3 gange 30 minutter hver; 90% ethanol: 2 gange 30 minutter hver; 100% ethanol: 3 gange 30 minutter hver og herefter xylen: 3 gange 20 minutter hver). Udfør alle trin ved stuetemperatur i et stinkskab.
- Imbed vævseksplantater i paraffin ved 58 ° C i en ovn. Forbered 5 um tykke vævssnit under anvendelse af en roterende mikrotom.
- Float sektionerne i en 56 ° C vandbad, og derefter montere afsnittene på mærkede histologiske slides. Placer dias i manuelle farvning stativer og tørre ved 65 ° C i 1 time. Lad dias til afkøling ved stuetemperatur.
- Dyp stativerne i 4 på hinanden følgende plet skåle indeholdende xylen i 10 minutter hver til at fjerne paraffin. Dyp stativerne i en ethanol-serien til at fjerne xylen: 100%, så 95%, thda 80%, så 70%, så 50% ethanol (5 min for hvert skridt). Skyl stativerne med postevand i 5 minutter for at fjerne ethanol.
3.3) hematoxylin og eosin (H & E) Farvning
- Fortsætte med at arbejde med de faste vævssnit; placere stativet i en farvning fad fyldt med Mayers hematoxylin i 15 min. Skyl stativet med ledningsvand for at fjerne Hematoxylin for 20 min.
- Anbring i destilleret vand i 30 sec.Place i 95% ethanol i 30 sek. Placer i Eosin Y løsning farvning skål til 1 min. Dehydrer gennem 2 ændringer i 95% ethanol, 100% ethanol og xylen i 2 minutter hver.
- Udfør en hurtig kontrol under et mikroskop for at sikre, at overskydende eosin fjernes. Placer 2 til 3 dråber Mounting Medium (Fisher SP15-100) på hvert dias, derefter dække med et dækglas.
3.4) I Situ Cell Død Detection: TUNEL Assay
- Inden du begynder, forberede proteinase K brugsopløsning: 20 ug / ml i10 mM Tris / HCl, pH 7,4.
- Gentag trin 1 til 5 i afsnit 3.2 (Explant fiksering og vævssnit afparaffinering). Skyl dias med deioniseret H 2 O.
- Fordyb dias med 1x PBS i 10 min. Dræn overskydende PBS. Inkuber vævssnit i 30 minutter ved RT med proteinase K brugsopløsning. Skyl glider to gange med 1x PBS.
- Udfør TUNEL assay som beskrevet i instruktionen for celledød afsløring kit. Monter hjælp montering medium, og dækglasset manuelt med dækglas.
- Analysere prøver under et lysmikroskop. Brug Image Pro 4.5 at analysere de apoptotiske celler i brun farve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LMPs blev karakteriseret med annexin V farvning 10 ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) analyse og gated anvendelse af 1 um perler, hvor 97% af MP'er (≤1 um) var annexin-V-Cy5 positive (figur 1A og 1B). Typisk blev omkring 2,5 mg LMPs opnået efter denne protokol. Bronkial vævseksplantater fra C57BL / 6-mus blev udsat for køretøjet og LMPs behandling. Histopatologisk analyse af bronkial sektioner viste virkningen af LMPs på den strukturelle integritet af de bronchiale epitel. I kontrolforsøg eksplantater bronkieepitelet var stort set ubeskadiget (figur 2A); Men i LMPs-behandlede eksplantater blev overfladiske epitelcellelag beskadiget eller tabt, og der var et signifikant fald i epitelcellehøjde og densitet (figur 2B). TUNEL-positive farvning (en markør af apoptose) var mere udtalt i LMPs behandlet bronkieepitel sammenlignet med kontrol ( 
Figur 1. Flow cytometri analyse af MP'er afledt fra CEM T-cellelinie. (A) Bestemmelse af fremad (FSC) og sidespredning (SSC) karakteristika med 1 um perler, der anvendes til gate parlamentsmedlemmer. (B) Begivenheder i parlamentsmedlemmer gate blev yderligere vurderet til mærkning med annexin V-Cy5 at skelne sande begivenheder fra elektronisk støj og dermed øge specificiteten af parlamentsmedlemmer afsløring. Klik her for at se en større udgave af dette tal. 
Figur 2. LMPs-induceret bronchieepithelceller lag skader. Repræsentative histopatologiske billeder af bronkial epithelium af eksplantater behandlet med (A) kontrol eller (B) LMPs (40 ug / ml i 24 timer). Eksplantat snit blev farvet med hematoxylin og eosin. Sorte pile peger på epithellaget. Delvis tab af de overfladiske og basale cellelag er tydeligt i sektioner af LMPs-behandlede bronchiale eksplantater (B). Forstørrelse 400X, bar = 20 uM. Klik her for at se en større udgave af dette tal. 
Figur 3. LMPs-induceret bronchieepithelceller celleapoptose de apoptotiske celler i epitellaget i segmenter bronkier blev påvist ved TUNEL assay.; positivt farvede celler er vist i brun. Repræsentative billeder af bronchiale epitelceller i kontrol (A)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parlamentsmedlemmer er aktive mediatorer af intercellulære krydstale og deres undersøgelse er lovende på mange områder af videnskaben. 11 Denne undersøgelse præsenteret en detaljeret protokol for in vitro i stor målestok af LMPs afledt af en apoptotisk T-cellelinie. Disse parlamentsmedlemmer udtryk et stort repertoire af lymfocyt-molekyler og er biologisk impliceret i reguleringen af cellulære og vævshomeostase. Dog kan LMPs hidrører fra forskellige kilder være biologisk anderledes. 4,9,12,13
LMPs vise forskellige egenskaber afhængigt af de stimuli, der bruges til at generere dem in vitro og den celle, hvorfra de er afledt. Som sådan bør ekstrapolation af data opnået in vitro ved anvendelse LMPs afledt fra udødeliggjorte cellelinier til data fra LMPs genereret in vivo udføres med forsigtighed.
Denne protokol beskriver flere centrifugeringstrin kræves til isolering af parlamentsmedlemmer; derfor careful manipulation er nødvendig for at minimere tabet af MP'er under denne proces. Snap indefrysning af isolerede LMPs ved -70 ° C, anbefales; vi har observeret, at bioaktiviteter af LMPs under disse betingelser kan bevares i op til 2 år (upublicerede data).
Til dato, flowcytometri betragtes som "gold standard" for parlamentsmedlemmer analyse. Polykromatiske flowcytometrisk analyse anvendes til at bestemme subpopulationer af parlamentsmedlemmer fra forskellige cellulære oprindelse. Ikke desto mindre er de nuværende kommercielt tilgængelige flowcytometre begrænset i deres evne til at analysere mindre størrelse parlamentsmedlemmer populationer (mindre end 300 nm) og at skelne mellem cellerester og parlamentsmedlemmer. Desuden kan FACS-analyse (cytofluorimetrisk analyse) være en alternativ metode til TUNEL assay at tælle apoptotiske celler til statistisk analyse.
Her viser vi, at bronchiale eksplantater dyrkes ex vivo, kan tilvejebringe en god kilde til luftvejene epitelceller feller farmakologi og toksikologi screening. Fordi disse bronchiale eksplantater ligne deres oprindelige fysiologiske miljøer, kan de være anvendelige til bestemmelse af signalveje af visse bronkiale eller lungesygdomme. Må dog kun anvende bronchiale eksplantater vil ikke i stand til at bekræfte den apoptotiske virkning LMPs på epitelceller er et resultat af direkte og / eller fra sekundær til aktiveringen af hjemmehørende immunceller. For at undersøge den direkte virkning af LMPs vil de primære luftvejs epitelceller være passende til dette formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af tilskud fra de canadiske Institutes of Health Research (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec - Vision Health Research Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LMPs production and characterization | |||
| CEM T cells | ATCC | CCL-119 | |
| X-VIVO 15 medium | Cambrex, Walkersville | 04-744Q | |
| Flask T75 | Sarstedt | 83.1813.502 | |
| Flask T175 | Sarstedt | 83.1812.502 | |
| Actinomycin D | Sigma Chemical Co. | A9415-2mg | |
| PBS | Lifetechnologies | 14190-144 | |
| 0.22 µm filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Annexin-VCy5 | BD Pharmagen | 559933 | |
| FACS flow solution | BD Bio-sciences | 342003 | |
| Fluorescent microbeads (1 µm) | Molecular Probes | T8880 | |
| Polysterene counting beads (7 µm) | Bangs laboratories | PS06N/6994 | |
| Polypropylene FACS tubes | Falcon | 352058 | |
| 1 ml pipet | Fisher | 13-678-11B | |
| 5 ml pipet | Falcon | 357543 | |
| 25 ml pipet | Ultident | DL-357551 | |
| 1.5 ml conical polypropylene micro tube | Sarstedt | 72.690 | |
| 15 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 50 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| 50 ml high speed polypropylene copolymer tube | Nalgene | 3119-0050 | |
| 250 ml high speed polypropylene bottle | Beckman | 356011 | |
| Protein assay (Bradford assay) | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | |
| Protein assay standard II | Bio-Rad Laboratories | 500-0007 | |
| Test tube 16 x 100 | VWR | 47729-576 | |
| Test tube 12 x 75 | Ultident | 170-14100005B | |
| Cell incubator | Mandel | Heracell 150 | |
| Low speed centrifuge | IEC | Centra8R | |
| High speed centrifuge | Beckman | Avanti J8 | |
| High speed rotor for 250ml bottle | Beckman | JLA16.250 | |
| High speed rotor for 50ml tube | Beckman | JA30.50 | |
| Fow cytometry | BD Bio-sciences | FACS Calibur | |
| Spectrophotometer | Beckman | Series 600 | |
| Bronchial tissue explants and sections | |||
| C57BL/6 mice (5-7 weeks old) | Charles River Laboratories, Inc. | ||
| Mouse Airway PrimaCell™ System: | CHI Scientific, Inc. | 2-82001 | |
| Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades | Becton Dickinson AcuteCare | 371310 | #10 |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools Inc. | 10003-12 | #7 |
| phase-contrast inverted microscope | Olympus Optical CO., LTD. | CK2 | |
| high O2 gas mixture | VitalAire Canada Inc. | ||
| modular incubator chamber | Billups-Rothenberg Inc. | MIC-101 | |
| MaxQ 4000 incubated orbital shaker | Barnstead Lab-Line, | SHKA4000-7 | |
| 12-well tissue culture plate | Becton Dickinson and Company | 353043 | |
| Plastic tissue culture dishes (100 mm) | Sarstedt, Inc. | 83.1802 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools Inc. | 14060-09 | Straight, sharp, 9cm longth |
| Half-curved Graefe forceps | Fine Science Tools Inc. | 11052-10 | |
| humidified CO2 incubator | Mandel Scientific Company Inc. | SVH-51023421 | |
| Histopathological examination | |||
| formalin formaldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | HT5011 | |
| paraffin | Fisher scientific International, Inc. | T555 | |
| ethyl alcohol | Merck KGaA, Darmstadt | EX0278-1 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | G6403 | |
| Cacodylate | Sigma-Aldrich, Inc. | 31533 | |
| microscope slides | VWR Scientific Inc. | 48300-025 | 25x75 mm |
| Xylene | Fisher scientific International, Inc. | X5-4 | |
| Mayer's hematoxylin | Sigma-Aldrich, Inc. | MHS16 | Funnel with filter paper |
| HCl | Fisher scientific International, Inc. | A144s-500 | |
| eosin | Sigma-Aldrich, Inc. | HT110116 | Funnel with filter paper |
| Permount™ Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific Inc. | SP15-100 | |
| glass coverslip | surgipath medical industries, Inc. | 84503 | 24×24 #1 |
| TUNEL detection kit | In Situ Cell Death Detection, POD | 11 684 817 910 | |
| oven | Despatch Industries Inc. | LEB-1-20 | |
| rotary Microtome | Leica Microsystems Inc. | RM2145 | |
| filter paper | Whatman International Ltd. | 1003150 | #3 |
| Microscope | Nikon Imaging Japan Inc. | E800 | |
| staining dish complete | Wheaton Industries, Inc. | 900200 | including dish, rack, cover |
| 1.5 ml eppendorf tube | Sarstedt Inc. | 72.69 | 39x10 mm |
| Orbital and Reciprocating Water Bath | ExpotechUSA | ORS200 | |
| phosphate buffered saline | GIBCO | 14190-144 | |
| fume hood | Nicram RD Service | 3707E |
References
- Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).
- Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).
- Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles. Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).
- Yang, C., et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).
- Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells. Cancer Biol Ther. 10 (5), 448-456 (2010).
- Angelillo-Scherrer, A. Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis. Circ Res. 110 (2), 356-369 (2012).
- Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).
- Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis. Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).
- Martin, S., et al. Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression. Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).
- Shet, A. S., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Yang, C., et al. Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Soleti, R., et al. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).
