Abstract
Analysere de fysiologiske reaktioner olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN), når stimuleres med specifikke ligander er afgørende at forstå grundlaget for olfaktoriske drevne adfærd og deres modulation. Disse kodning egenskaber er stærkt afhængige den oprindelige samspil mellem lugtmolekyler og olfaktoriske receptor (OR) udtrykt i OSN. Identiteten, specificitet og ligand spektrum af udtrykt eller er kritiske. Sandsynligheden for at finde den ligand af OR udtrykkes i en OSN valgt tilfældigt inden epitelet er meget lav. For at løse denne udfordring, denne protokol bruger genetisk mærkede mus, der udtrykker det fluorescerende protein GFP under kontrol af promotoren af definerede yderste periferi. OSN er placeret i en stram og organiseret epitel foring næsehulen, med omkringliggende celler påvirke deres modning og funktion. Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af et intakt lugteepitel og registrere gennem patch-clamp optagelser egenskaber OSN expressing definerede lugtstofreceptorer. Protokollen gør det muligt at karakterisere OSN membranegenskaber samtidig holde indflydelsen af tilstødende væv. Analyse af patch-clamp resultater giver en præcis kvantificering af ligand / ELLER interaktioner, transduktionsveje og farmakologi, OSN 'kodning egenskaber og deres modulation på membranen niveau.
Introduction
Olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN) repræsenterer det første skridt i olfaktoriske perception. Beliggende i den olfaktoriske epitel foring næsehulen hos gnavere, de omdanne kemiske oplysninger af lugtstoffer i aktionspotentialer sendes gennem deres axon til hjernen. For bedre at forstå de olfaktoriske kodning mekanismer, er det nødvendigt at karakterisere transduktion og membran egenskaber OSN. Indtil for nylig blev de fleste af de teknikker, der anvendes til at karakterisere egenskaber pattedyr OSN udført på dissocieret OSN 1-4. Dissociationsprocessen anvender forskellige mekaniske og kemiske (dvs. enzymer) processer at befri OSN fra deres omgivelser. Disse processer inducere et lavt antal tilgængelige celler til optagelser. Dette lave antal kan være endnu mere kritisk i tilfælde af GFP mærkede celler. Dissociation fjerner også de lokale celle-til-celle-interaktioner mellem OSN og andre celler i det olfaktoriske epitel, der kan forbedre survival og modulering af OSN egenskaber. For at omgå dissociation procedure blev en intakt præparat udviklet 5.
Hver OSN udtrykker én olfaktoriske receptor (OR) udvalgt fra en stor multigenfamilie 6. Der er ~ 1.000 yderste periferi udtrykt i de vigtigste olfaktoriske epitel i musen. På grund af det store antal OR i vildtype dyr, at chancerne optage OSN udtrykker det samme eller er meget lave. For at overvinde disse begrænsninger er tilgængelige gen målrettede mus, hvor alle OSN udtrykker en identificeret eller er mærket med et fluorescerende protein 7-9. Disse mærkede OSN blev anvendt til at gøre funktionel analyse i dissocierede præparater 7,10,11 med ulemperne nævnt tidligere. En intakt epitel forberedelse 5 af genetisk mærkede mus omgår derfor disse spørgsmål. Det gør det muligt at overvåge aktiviteten af OSN udtrykker præcist definerede yderste periferi i et miljø så tæt på i vivo som muligt. Desuden patch-clamp optagelser af OSN tillader også præcis analyse af ejendomme membran, transduktion pathway farmakologi, ligand / ELLER interaktioner. Alle disse emner kan næppe analyseres under anvendelse ekstracellulære optagelser. Vi brugte denne teknik til at overvåge svarene fra OSN udtrykker de lugtstofreceptorer SR1 og MOR23 12,13. Muligheden for teknikken blev bekræftet af andre grupper på MOR23 udtrykker OSN 14 samt andre yderste periferi udtrykker neuroner 15,16. Overvågningen af en defineret population af OSN kan føre til en analyse af deres egenskaber i mange forskellige sammenhænge, såsom udvikling 14, aldring 17, lugtstof-induceret plasticitet 18, og den rolle, variationer i lugtstof receptorens sekvens i lugt kodning 15. Denne protokol giver således et effektivt værktøj til at overvåge de funktionelle egenskaber af definerede OSN på membranen niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne fra Université de Bourgogne dyr pleje og blev godkendt af Université de Bourgogne etiske komité.
1. Dyr
- Brug gensplejsede ELLER-IRES-tauGFP mus til rådighed på Jackson Laboratory. Disse mus blev udviklet i Dr. Peter Mombaerts 'laboratorium for at analysere axon målretning og udvikling af det olfaktoriske system, 19. For eksempel MOR23-IRES-tauGFP linje, stock nummer 006643, bærer det officielle stammen navn B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Tilsvarende SR1-IRES-tauGFP linje, stock nummer 6717 bærer det officielle navn B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
- Med hensyn til dyrenes alder: for et bedre resultat af protokollen, bruge dyr mellem 2 og 4 uger gamle. I denne aldersgruppe, dissektion er lettere (blødere knogler, fastere lugteepitel) og dendritiske drejeknapper er bigger sammenligne med ældre dyr.
2. Fremstilling af elektroder og løsninger
- For stimulerende pipetter: køb prepulled stimulerende pipetter. Ellers manuelt forberede dem.
- Ved hjælp af en flamme, bøje seks 1 mm glas pipetter på omkring 1 cm fra spidsen. Sæt disse seks pipetter plus et straight 7 th i 1,5 cm varmekrymperør styrke ved et øje.
- Heat shrink slangen til at opretholde tønder knyttet sammen. Vedhæft en ekstra varme krympeflex til den anden ende af tønderne. Træk dette stimulerende pipette med en multi-tønde aftrækker.
- Tilføj nogle hvide væske lim omkring øjet til at styrke den bøjede tips. Lad tørre O / N.
- Forberede 1 eller 2 I normal Ringers ekstracellulær opløsning (i mM: NaCl 124, KCI 3, MgSO4 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH 2 PO 4 1,25, glucose 15, pH 7,6 og 305 mOsm). Opbevares ved 4 ° Cindtil anvendelse.
- Forbered intracellulær stamopløsning (i mM): KCI 70, KOH 53, methansulfonsyre 30, EGTA 5, HEPES 10, saccharose 70; pH 7,2 (KOH) og 310 mOsm. Opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse. God til flere uger.
- Forbered intracellulær optagelse løsning med nystatin ekstemporalt (i sidste øjeblik), før eksperimentet.
- 3 mg nystatin afvejes, tilsættes 50 pi DMSO; vortex 20 sek derefter sonikeres 2-3 min, indtil fuldstændig fortyndet.
- Tilsættes 20 pi DMSO-nystatin opløsning i 5 ml intracellulær stamopløsning. Vortex 20 sek, derefter sonikeres 3 min. Denne opløsning opbevares ved 4 ° C og beskyttes mod direkte lys, nystatin er lysfølsomt. Denne opløsning kan anvendes i et par timer. Udskift hver dag.
- Når lugteepitelet præparat er under mikroskopet, tage nogle af denne opløsning i en 1 ml sprøjte med en flamme-langstrakt gul spids til at fylde elektroderne; beskytte mod direkte lys. Når på RT, den nystatin løsninger ikke stabil; erstatte opløsning i 1 ml sprøjten hver time eller holde det i is.
- Træk optagelse elektroder med en aftrækker for at opnå lang hals og lille tip (~ 2 um) med en modstand på 15-20 MOhm med den interne nystatin løsning.
- Forbered lugtstof løsning på 0,5 M i DMSO under emhætte; portion og holde ved -20 ° C indtil brug. Fortynd lugtstof i Ringers opløsning indtil den ønskede koncentration. Fyld stimulerende pipette.
3. Forberedelse af lugteepitel
Bemærk: OR-IRES-tauGFP mus udtrykker tauGFP under kontrol af OR promotoren. I disse mus er alle neuroner, der udtrykker OR af interesse mærkes med GFP. Denne protokol er tilpasset til yderste periferi udtrykt i alle zoner. Men dissektioner og optagelser er lettere for disse regioner udtrykt i dorsale zone.
- Bedøver dyret ved injektion af en blanding af ketamin og xylazin (150 mg / kg og 10 mg / kg BODy vægt, henholdsvis). Halshugning kan udføres med skarpe saks for unge mus, eller med en korrekt vedligeholdt gnaver guillotine for ældre mus.
- Hjælp ring dissekere saks gøre en langsgående mediale snit gennem den dorsale hud. Fjern skindet ved at trække det fra hinanden. Under anvendelse af de saks, klippe de nedre kæber på kæben fælles. Fjern de øverste fortænder af en koronalt snit parallelt med tænderne.
- Lav en koronale snit af hovedet bag øjnene og holde kun den forreste del af hovedet. Dyppe den i iskold Ringer-opløsning for dissektion under anvendelsesområdet.
- Dissekere under anvendelsesområdet: i den ventrale side, lave en langsgående snit langs overkæben / tænderne. Skær dorsale knogler på langs, efter den dorso-laterale side af næsehulen. Fjerne de fleste knogler og gane; overføre skillevæg og epitelet knyttet til det i oxygeneret Ringer ved stuetemperatur.
- For den endelige dissektion: Lige før du starter optagelsensession, skalle epitelet fra den underliggende septum med pincet. Frigør epitel med pincet og med to 4-5 mm sakse udskæringer (brug microvannas saks) på den forreste del af skillevæggen, hvor vedhæftningen er stærkere.
- Fjern forsigtigt vomeronasale organ ved at skære det ud langs dens dorsale forbindelse til septal epitel. Overfør epithelet til en optagelse kammer med slimlaget opad; holde det fladt i kammeret med en harpe.
- Installere kammer under en opretstående mikroskop udstyret med fluorescensoptik og et følsomt kamera. Visualisere forberedelsen på computerskærmen ved stor forstørrelse gennem en 40X vand-nedsænkning mål (blændetal 0,8) og en ekstra 2X eller 4X forstørrelse opnås ved en luppen. Perfundere kontinuerligt med oxygeneret Ringer ved stuetemperatur (1-2 ml / min).
4. Optagelse Session
- Søg efter fluorescerende celle: ophidse forberedelsen på 480nm for EGFP, som udsender lys i 530-550 nm-området; målrette en dendritiske knop, som er pålideligt synlig i fluorescens og under lyse felt.
- Fyld elektrode med intracellulær opløsning med nystatin; fjerne boblerne ved forsigtigt at banke på elektroden.
- Indsæt elektrode på elektrodeholder, anvende positivt tryk i pipetten; Resistens bør være 15-20 MOhm.
- Bringe elektrode tæt til cellen; når modstanden når ~ 40 MQ, slip positivt tryk og anvende let undertryk for at nå en gigaseal.
- Når forseglingen er nået, indstilles membranpotentialet ved ca. -75 mV;
- Når cellen er åbnet, fortsætte med stimuleringsprotokoller, farmakologiske behandlinger. Til måling af reaktion på en enkelt lugtstof stimulation, optage 200-500 msek af spontan aktivitet, stimulere til 500 msek og måling af, cellen i op til 10 sek 13. For farmakologiske behandlinger, perfundere de farmakologiske midler påden ønskede koncentration 20.
5. Data Analysis
- Analyser strømme fremkaldt af lugtstof stimulation som følger: den maksimale amplitude, stigningen-tid (nødvendige tid for at nå 90% af den maksimale amplitude, i millisekunder), den samlede strøm (areal under kurven i Pas), det tidspunkt, på 50% (tiden mellem indtræden og forskydningen af indsatsen på 50% af den maksimale amplitude, i millisekunder).
- Brug af peak transduktion strømninger (maksimal amplitude nået) i forskellige koncentrationer, tegne og passe en dosisreaktionskurve hjælp af Hill-ligningen: I = Imaks / (1 + (K 1/2 / C) n), hvor jeg repræsenterer spidsstrømmen , Imax den maksimale respons ved mættende koncentrationer, K1 / 2 den koncentration, ved hvilken halvdelen af den maksimale respons blev nået, C er koncentrationen af lugtstof og n Hill koefficient.
- Analysere optagelser af membranpotentialet i strømtang for maksimal depolarisering, den total potentiale fremkaldte (areal under kurven i mVsec); rekord spontan spiking aktivitet i løbet af 30 sek til 1 min optagelser; rekord ophidselse gennem spikes fremkaldt af injektion af strømme (5-10 Pa).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatet af denne protokol afhænger af kvaliteten af dissektion. Denne dissektion trin skal være korte (mindre end 10 til 15 min) og præcis (dvs. at undgå skader af epitelet). Figur 1 illustrerer, hvordan en ideel forberedelse ligner på forskellige forstørrelser. Ved en lav forstørrelse under lysfelt de forskellige celletyper (såsom knopper af OSN, støtte celler) kan skelnes (figur 1A). På det højeste forstørrelse niveau, typisk 80X til 160X, i lyse felt, de dendritiske drejeknapper af OSN bør være tydeligt kan skelnes fra de understøttende celler (Figur 1B). Under fluorescerende lys, kun de dendritiske drejeknapper og cilier af GFP mærkede celler er synlige (Figur 1C). Ved at sammenligne de 2 billeder, kan de mærkede celler gribes an med optagelsen pipette (figur 1D).
Temperaturen af dissektion sålution og timingen af dissektion er kritiske. Den første del af dissektion, bør udarbejdelsen af skillevæggen (afsnit 3.1.1 til 3.2) finde sted inden for 5 til 10 min i iskold løsning. Den endelige dissektion (3.3) skal vare mindst 5 minutter ved stuetemperatur. I tilfælde dissektion varet for længe, eller blev udført i dissektion opløsning for varmt, fremstillingen uvægerligt ser hurtigt beskadiget: dendritiske drejeknapper er flydende over overfladen af epitelet, og ligner døde celler.
Når en tætning er nået, og cellen åbnes under påvirkning af nystatin, kan typiske spændingsafhængige strømme observeres (figur 2A). Formen og egenskaber ved disse strømme kan anvendes til at overvåge helbred af cellen: i en døende celle eller hvis forseglingen kvalitet er faldende, vil disse strømme 'amplitude falde. Under den nuværende clamp-konfiguration, kan registreres aktionspotentialer enten spontant (figur 2B) eller ved injektion af en depolariserende strøm (figur 2C). Fyring egenskaber induceret af strøm injektion karakterisere ophidselse af den optagne neuron. Ophidselse af forskellige OSN 'befolkning kan sammenlignes (ved hjælp af klassiske frekvens og ISI beregninger).
En multibarrel pipette fyldt med forskellige lugtstoffer og / eller forskellige koncentrationer af lugtstoffer kan anvendes til at stimulere cellerne ved tryk udslyngning. Dette gør det muligt at måle lugtstoffet inducerede responser. De duftstoffer og koncentrationer bør vælges afhængigt af OR udtrykt i cellen af interesse, for eksempel Lyral er liganden for MOR23, acetophenon for M71, eugenol for mOREG. I eksperimentet illustreret på figur 3, de optagede MOR23-IRES-tauEGFP neuroner reagerede på forskellige koncentrationer af Lyral, en ligand for MOR23 under strømtang tilstand (figur 3A) eller under spænding clamp modus (figure 3B). I spænding klemme tilstand optagelser, kan forskellige egenskaber overvåges for at kvantificere respons (maksimal amplitude, stiger-tid, samlede strøm fremkaldte osv.) Som udføres klassisk i elektrofysiologi. Med den maksimale amplitude af lugtstof-inducerede respons, kan dosis-respons plottes og monteret under anvendelse af Hill-ligningen. Disse resultater giver oplysninger om kodning egenskaber hver OSN: Detektionsgrænse, tidsmæssig dynamiske, dynamisk range og mætning niveau. Eksempler på dosisresponskurver er vist på figur 3C. Alle disse oplysninger kan sammenlignes mellem de enkelte OSN at måle potentielle heterogenitet inden for en population; de kan også sammenlignes mellem OSN med eller uden anvendelse af en behandling for at måle potentielle modulation og plasticitet.
Figur 1: Repræsentative billeder af en sund sammensætning (A) Intact lugteepitel ekstraheret fra næsehulen af en SR1-IRES-tauGFP transgene mus observeret under lyse felt tilstand på det 40X forstørrelse.. OSN dendritiske drejeknapper (sort pil hoveder) er indesluttet i en maskestørrelse på understøttende celler (SC) og Bowman kirtler (BG). (B) Dendritisk drejeknapper af SR1 udtrykke OSN observeret under lyse felt tilstand (hvid og rød pilespidser). (C) Den samme felt som i (B) under fluorescerende lys viser dendritiske drejeknapper af SR1 udtrykker OSN. (D) Optagelse pipette nærmer sig en SR1-udtrykkende OSN under lyse felt. Den røde pilespids repræsenterer den samme SR1 OSN i (B - D). Målestok: 5 um.
Figur 2: Repræsentative membran egenskaber opnås med protokol:. Patch-clamp optagelser på den dendritiske knop af en SR1-IRES-tauGFP OSN (A) Spænding gated strømme fremkaldt af stigende depolariserende skridt fra membranen potentiale -67 mV til +40 mV. (B) Spontan aktivitet registreret i den aktuelle klemme konfiguration; aktionspotentialer kan observeres under 15 sek optagelse epoke. (C) Action potentialer fremkaldt af en +7 pA excitatorisk strøm; denne protokol indeholder oplysninger om ophidselse af cellen.
Figur 3:. Repræsentative eksempler på lugtstofreceptorer inducerede responser i en MOR23-IRES-tauEGFP neuron Stigende koncentrationer af Lyral, en ligand af MOR23 receptor, inducerer stigende responser både strømtang (A) og i spænding klemme (B). Membranpotentialet blev fastspændt på -67 mV. (C) Eksempler på individuelle dosisresponskurver erhvervet tre M71 neuroner som reaktion på stigende koncentrationer af acetophenon og monteret med Hill-ligningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen af denne protokol korrekt overvåge egenskaber sunde OSN afhænger i høj grad af kvaliteten af præparatet. Derfor dissektion trin er kritisk. Først er det vigtigt at være opmærksom på kvaliteten (pH, osmolaritet), iltning og temperatur (iskold, men ikke frosne) i dissektion medium. For det andet skal manipulation af epitel med dissekere værktøjer være så begrænset som muligt for at undgå skader. Endelig er det afgørende at opnå en sammensætning så flad som muligt for at få adgang til den største OSN population som muligt.
Dissektion kvalitet er grundlæggende at opnå en sund præparat. Imidlertid kan forskellige fremgangsmåder anvendes til dissektion: her præsenterer vi en ventral til dorsal dissektion men nogle brugere kan foretrække at starte dissektion dorsalt at åbne næsehulen hurtigt og har en hurtig adgang til den septale fordybning af det olfaktoriske epitel. Hver bruger kan dermed tilpasse PRotocol for den mest effektive strategi til at nå en sund fremstilling af området af interesse.
Når præparatet er under lup, er permanent overvågning af præparatets sundhed kræves. Faktisk en usund præparat fører til en lav sandsynlighed for at nå en gigaseal. En lav effektiv opnåelse gigaseals kan forbedres ved at ændre området af interesse om forberedelsen for at finde sundere OSN. En mere drastisk løsning er at erstatte fremstillingen udelukkende af en ny. Når forseglingen er nået, til en lav sandsynlighed nå "åbnet" tilstand kan finde sted. Dette kan skyldes det indre løsningens kvalitet. Den interne opløsning skal fremstilles kort før eksperimentet. Anvendelsen af vortex og lydbehandling er kritisk, da opløseligheden af nystatin er temmelig lav. For at forbedre sandsynligheden for åbningen, bør den interne opløsning igen vortexet i 10 sekunder og derefter sonikeret i 30 til 60 sek. Denne usuallierede forbedrer effektiviteten af cellen åbning.
For at stimulere den indspillede OSN med lugtstoffer, protokollen præsenteret bruger en 7 tønde stimulerende pipette. Denne type pipette indebærer en begrænsning i antallet af lugtstoffer og / eller koncentration af testet på hver optagede celler til syv lugtstoffer. Denne begrænsning er relativt ubetydelig i tilfælde af en dosisresponskurve da den kan dække op til 7 logaritmiske enheder af koncentration. Men i tilfælde af screening eksperimenter, hvor forskellige lugtstoffer testes, kan en syv tønde pipette vise begrænsninger. Ved screening eksperimenter, målet er at finde en ligand for mærkede OSN udtrykker forældreløs OR. Brug af denne protokol vil kræve brug af lugtstof blandinger. Hver blanding fremkalde en reaktion vil så blive opdelt i individuelle lugtstoffer. Dette blev gjort for at screene amin lugtstoffer på TAAR udtrykker OSN 16. I disse eksperimenter de fluorescerende neuroner udtrykte Taars og liganden var unknown. Ved hjælp af protokollen, kunne forfatterne screene flere snesevis af amin lugtstoffer i blandinger. Blandingerne fremkalder en reaktion blev derefter opdelt til enkelt lugtstoffer for at finde den mest effektive ligand.
Afstanden mellem kontrolapparat stedet og stimulerende pipette bør vælges med omtanke for at minimere den mekaniske stimulering af cellen 20. Hvis trykket er for højt (over 30 psi i vores optageforhold) og / eller afstanden for lille (under 20 um), kan den mekaniske respons hos nogle OSN selv maskere lugtstof respons. Tryk og afstand mellem puster pipette og optagelsen site er også afgørende for at styre løsningen udveksling under stimulation. Koncentrationen nå neuron er tidligere vurderet til at være så tæt som muligt til koncentrationen stede i pipetten gennem en række tests 13. Disse tests anvendes en opløsning farvet med blåt farvestof at måle indsættelse og offset af than stimulation. Ved hjælp af 20 psi tryk og 30 um afstand, blev den maksimale intensitet af stimulus nået inden for 300 ms. Forskydningen af stimulus blev også nøje vurderet: da præparatet er under kontinuerlig strøm af perfusioneret løsning blev stimulus udvasket inden 0,8-0,9 sek 13.
Lugten kodning egenskaber OSN blev historisk målt enten gennem ekstracellulære optagelser in vivo eller gennem forsøg med isolerede celler. I pattedyr blev ekstracellulære optagelser udført ved først in vivo i rotter 21. I ekstracellulære optagelser, OR udtrykt i den indspillede celle er ukendt dermed begrænse succes ratio for at finde en celle reagerer på den testede lugtstof. Protokollen tillader registrering og karakterisering af definerede receptorer i neuroner i det cellulære miljø af epitelet. Receptorernes egenskaber kan derfor analyseres på forskellige niveauer: det specifikke ligand/ ELLER interaktioner i første trin af transduktion pathway; følgelig agonist / antagonist-interaktioner af forskellige testede ligander; egenskaberne af blandinger integration af definerede yderste periferi, og den rolle, transduktion vej for OSN 'specificitet; indflydelsen på olfaktoriske kodning af celle-til-celle interaktioner (såsom GAP junction) inden epitelet; og endelig modulering af transduktion pathway hjælp farmakologiske midler.
I de dissocierede celler optagelser, som tidligere nævnt, dissociationsprocessen fjerner slim og celle-til-celle-interaktioner inden det olfaktoriske epitel. Dette kan inducere ændringer i de kodende egenskaber af OSN. Calcium imaging eksperimenter på isolerede celler blev hyppigt rapporteret. For eksempel blev dosisresponskurver af M71 udtrykker OSN som reaktion på acetophenon rapporteret 7. Disse dosisresponskurver er stejlere end den dosis-respons kurver opnået ved anvendelse af protokollenpræsenteres her 4. Disse forskelle kan skyldes de celle-til-celle-interaktioner i intakte forberedelse og også til fjernelse af slim i isolerede celler. Slim er kendt for at indeholde mange protein og enzymer involveret i perireceptor begivenheder grundlæggende for det olfaktoriske transduktion 22,23. I protokollen rapporteret her, bevarelse af strukturen af det olfaktoriske epitel og den formodede tilstedeværelse af slimet bidrager til at bevare de native funktioner i lugtstof kodning i OSN. De anvendte koncentrationer i protokollen er angivet i mol / L og sædvanligvis i 10 -7 -10 -3 rækkevidde. Disse koncentrationer er højere end koncentrationer, der anvendes i værelser med faset optagelser (enten i lokale potentiale felt eller ekstracellulære optagelser). Disse forskelle kan skyldes i) den flydende fase af optagelserne (og dermed af stimulation) og ii) den langsomme udvaskning af slim ved perfusion under optagelser. Faktisk udvaskning af mucos og afsnittet af OSN 'axoner under dissektion kan støtte, at forberedelsen præsenteret potentielt kvalificeret som en "pseudo-intakte" snarere end en "fuldt intakt" præparat. Dette præparat repræsenterer, dog optageforholdene så tæt på in vivo som muligt, og alligevel fremkalder patch-clamp optagelser. Som enhver in vitro præparat fra et pattedyrs organisme, overlevelsen forbliver tidsbegrænset. Denne grænse kan være på grund af udvaskning af slim, den del af OSN 'axoner samt fraværet af blodcirkulationen i præparatet.
Protokollen præsenteres her tillader en at optage membran egenskaber af olfaktoriske sensoriske neuroner. Denne teknik kan have flere applikationer såsom analyse af membran egenskaber OSN, farmakologiske undersøgelser af OSN, modulation af odorant kodning egenskaber OSN og deorphanization af yderste periferi. Begivenhederne registreret under calcium imaging er slow og langtidsholdbare. Patch-clamp optagelser i denne protokol føre til data om hurtige begivenheder i olfaktoriske transduktion pathway på membranen niveau.
Optagelserne præsenteres her udføres i patch-clamp-konfiguration. I denne konfiguration kan membranen egenskaber af den indspillede celle skal analyseres, om det er den olfaktoriske transduktion pathway maskiner eller de spændingsafhængige strømme involveret. Forsøg med denne protokol kan levere data om modulation af lugtstof kodning egenskaber OSN. Farmakologiske midler kan anvendes til at undersøge den olfaktoriske transduktion under forskellige forhold: for eksempel kan MDL12330A, en blokker af adenylatcyclase III (ACIII) 24,25 påføres i perfusionsopløsningen til at undersøge den rolle, ACIII i et lugtstof respons. Derudover kan denne protokol bruges til at undersøge, hvordan olfaktoriske kodning egenskaber moduleres i forskellige forhold såsom det olfaktoriske miljø <sup> 18 eller under indflydelse af hormoner, der er involveret i fodring adfærd 26. Endelig kan denne protokol også føre til data om OR / ligand interaktion og decifrere agonist / antagonist aktiviteter på definerede disse regioner eller endda i tilfældigt udvalgte receptorer 27.
Endelig med de begrænsninger på grund af 7 tønde stimulerende pipette denne protokol kan også bruges til deorphanizing yderste periferi. Som tidligere, i dette tilfælde nævnt, kan flere lugtstof blandinger afprøves. Blandinger fremkalder en reaktion bør derefter opdeles i individuelle testet på andre celler lugtstoffer.
Ved at målrette OSN udtrykker definerede yderste periferi, denne protokol giver stærke data om periferi, ligander / periferi interaktioner, transduktion pathway egenskaber og sammenligne egenskaberne af definerede populationer af OSN i forskellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
