Abstract
Het analyseren van de fysiologische reacties van olfactorische sensorische neuronen (OSN) wanneer gestimuleerd met specifieke liganden is van cruciaal belang om de basis van olfactorische-gedreven gedrag en hun modulatie begrijpen. Deze coderende eigenschappen hangen sterk af van de initiële interactie tussen geurmoleculen en de olfactorische receptor (OR) uitgedrukt in de ASN. De identiteit, specificiteit en ligand spectrum van de uitgedrukt of zijn kritisch. De kans op het ligand van de OR uitgesproken vinden in een OSN binnen het epitheel willekeurig gekozen is zeer laag. Om deze uitdaging aan te pakken, dit protocol maakt gebruik van genetisch gelabelde muizen die het fluorescente eiwit GFP onder de controle van de promotor van gedefinieerde ultraperifere regio's. OSNs wordt in een strakke en georganiseerde epitheel langs de neusholte met naburige cellen hun rijping en functie beïnvloeden. Hier wordt een methode beschrijven we een intacte reukepitheel te isoleren en op te nemen door middel van patch-clamp opnames van de eigenschappen van OSNs expressing gedefinieerd geurstof receptoren. Het protocol kan men OSN membraaneigenschappen karakteriseren terwijl de invloed van het naburige weefsel. Analyse van de patch-clamp resultaten levert een exacte kwantificering van ligand / of interacties, transductieroutes en farmacologie, OSNs 'codering eigenschappen en hun modulatie op het membraan niveau.
Introduction
Olfactorische sensorische neuronen (OSN) vormen de eerste stap van olfactorische waarneming. Gelegen in de olfactorische epithelium langs de neusholte bij knaagdieren, zij de chemische karakterisering van geurstoffen in maatregelen potentialen die via de axon naar de hersenen. Om een beter inzicht olfactorische coderingsmechanismen, moet de transductie en membraaneigenschappen van OSNs karakteriseren. Tot voor kort waren de meeste van de technieken om de eigenschappen van zoogdier OSNs karakteriseren werden op gedissocieerd OSNs 1-4 uitgevoerd. De dissociatie proces maakt gebruik van verschillende mechanische en chemische (dat wil zeggen, enzymen) processen om de ASN's te bevrijden uit hun omgeving. Deze werkwijzen leiden tot een lage aantal beschikbare cellen voor opnames. Dit lage aantal kan nog kritischer bij GFP gemerkte cellen. Dissociatie wordt ook de lokale cel-cel interacties tussen ASN's en andere cellen van de reukepitheel die overleefde kunnen versterkenal en modulatie van eigenschappen OSNs '. Om de dissociatie procedure omzeilen, werd een intact preparaat ontwikkeld 5.
Elke OSN drukt een olfactorische receptor (OR) geselecteerd uit een groot multigenfamilie 6. Er zijn ~ 1000 UPR uitgedrukt in de belangrijkste olfactorisch epitheel bij de muis. Vanwege het grote aantal OR in wildtype dieren, de kansen om ASN expressie dezelfde record of zeer laag. Om deze beperkingen te overwinnen, gen gerichte muizen zijn verkrijgbaar waarbij alle OSNs expressie een bepaalde of gelabeld met een fluorescent proteïne 7-9. Deze gelabelde OSNs werden gebruikt om functionele analyse doen in gedissocieerde voorbereidingen 7,10,11 met de eerder genoemde nadelen. Een intacte epitheel voorbereiding 5 van genetisch gelabelde muizen omzeilt daarom deze kwesties. Het laat de controle van de activiteit van OSNs uiten precies gedefinieerde ultraperifere regio's in een omgeving die zo dicht mogelijk bij in vivo mogelijk. Trouwens, patch-clamp opnames van OSNs ook mogelijk nauwkeurige analyse van de membraan eigenschappen, transductieroute farmacologie, ligand / of interacties. Al deze onderwerpen kunnen nauwelijks worden geanalyseerd met behulp van extracellulaire opnames. We gebruikten deze techniek om de reacties van OSNs uiting van de geurstof receptoren SR1 en MOR23 12,13 bewaken. De haalbaarheid van deze techniek werd bevestigd door andere groepen MOR23 expressie OSNs 14 alsmede andere UPR expressie neuronen 15,16. Het bewaken van een bepaalde populatie OSNs kan leiden tot de analyse van de eigenschappen in ander verband zoals de ontwikkeling 14, verouderen 17, geurstof geïnduceerde plasticiteit 18, en de rol van de wijzigingen van Type de geurstof receptor in geur codering 15. Dit protocol geeft dus een krachtig instrument om het toezicht op de functionele eigenschappen van gedefinieerde OSNs op het membraan niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Université de Bourgogne en werd goedgekeurd door de Université de Bourgogne ethische commissie.
1. Dieren
- Gebruik genetisch gemanipuleerde OR-IRES-tauGFP muizen verkrijgbaar bij de Jackson Laboratory. Deze muizen werden ontwikkeld Dr. Peter Mombaerts 'laboratorium teneinde axon targeting en ontwikkeling van het olfactorische systeem 19 te analyseren. Bijvoorbeeld, de MOR23-IRES-tauGFP lijn, stock nummer 006.643, draagt de officiële stamnaam B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Ook de SR1-IRES-tauGFP lijn, stock nummer 6717 draagt de officiële naam B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
- Met betrekking tot de leeftijd van de dieren: voor een beter resultaat van het protocol, dieren worden gebruikt tussen 2 en 4 weken. In deze leeftijdsgroep, de dissectie is makkelijker (zachtere botten, steviger reukepitheel) en de dendritische knoppen zijn bigger vergelijken oudere dieren.
2. Voorbereiding van de elektroden en oplossingen
- Voor de stimulerende pipetten: aankoop prepulled stimulerende pipetten. Anders handmatig te bereiden.
- Met behulp van een vlam, buig zes 1 mm glazen pipetten op ongeveer 1 cm van de punt. Plaats deze zes pipetten plus een straight 7 e in 1,5 cm krimpslang te versterken door een oogje.
- Warmte krimpen de slang aan op de vaten met elkaar verbonden te houden. Bevestig een extra warmte-krimpkous aan het andere uiteinde van de vaten. Trek deze stimulerende pipet met een multi-barrel puller.
- Voeg wat witte vloeistof lijm rond het oogje aan de gebogen tips versterken. Laten drogen O / N.
- Bereid 1 of 2 L normale Ringer's extracellulaire oplossing (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO 4 1,3, CaCl2 2, NaHCO 3 26, NaH 2 PO 4 1,25, glucose 15, pH 7,6 en 305 mOsm). Houd bij 4 ° Ctot gebruik.
- Bereid intracellulaire voorraadoplossing (in mM) KCl 70, KOH 53, methaansulfonzuur 30, EGTA 5, HEPES 10, 70 sucrose; pH 7,2 (KOH) en 310 mOsm. Bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Goed voor enkele weken.
- Bereid intracellulaire opname oplossing met nystatine ex tempore (op het laatste moment) alvorens experiment.
- Weeg 3 mg nystatine, voeg 50 pl DMSO; vortex 20 sec dan ultrasone trillingen 2-3 min tot volledig verwaterd.
- Voeg 20 pl DMSO-nystatine oplossing in 5 ml intracellulaire voorraadoplossing. Vortex 20 sec, dan ultrasone trillingen 3 min. Bewaar deze oplossing bij 4 ° C en beschermen tegen direct licht, nystatine is lichtgevoelig. Deze oplossing kan gedurende enkele uren. Vervang elke dag.
- Zodra de reukepitheel preparaat onder de microscoop, neemt een deel van deze oplossing in een 1 ml spuit met een vlam langwerpige gele punt aan de elektroden te vullen; beschermen tegen direct licht. Eenmaal bij kamertemperatuur, de oplossing nystatineniet stabiel; vervang de oplossing in de 1 ml elk uur spuit of houdt het in ijs.
- Trek de opname elektroden met een trekker te lange nek en een kleine tip (~ 2 micrometer) te verkrijgen met een weerstand van 15-20 MQ met de interne nystatine-oplossing.
- Bereid geurstof oplossing 0,5 M in DMSO onder zuurkast; aliquot en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Verdun geurstof in Ringer's oplossing tot de gewenste concentratie. Vul de stimulerende pipet.
3. Bereiding van reukepitheel
Opmerking: OR-IRES-tauGFP muizen drukken de tauGFP onder de controle van de OR promoter. In deze muizen worden alle neuronen uiting van de OR plaats gelabeld met GFP. Dit protocol is aangepast voor UPR uitgedrukt in alle zones. Echter, dissecties en opnames zijn gemakkelijker voor de ultraperifere regio's, uitgedrukt in de dorsale zone.
- Verdoven het dier door injectie van een mengsel van ketamine en xylazine (150 mg / kg en 10 mg / kg bodgewichtspercenten, respectievelijk). Onthoofding kunnen worden uitgevoerd met een scherpe schaar voor jonge muizen of met een goed onderhouden knaagdier guillotine voor oudere muizen.
- Met behulp ring ontleden schaar maken een longitudinale mediale incisie door de dorsale huid. Verwijder de huid van elkaar te trekken. Met behulp van de schaar, knip de onderkaak aan de kaak gewricht. Verwijder de bovenste voortanden door een coronale snede evenwijdig met de tanden.
- Voeg een coronale snede van de kop achter de ogen en houdt slechts het voorste deel van de weg. Dompelen in ijskoude Ringer oplossing voor ontleding onder het toepassingsgebied.
- Ontleden onder de scope: in de buikzijde, maak een longitudinale snede langs de bovenkaak / de tanden. Snijd de dorsale bot in lengterichting, na de dorso-laterale zijde van de neusholte. Verwijder de meeste botten en gehemelte; breng het septum en het epitheel verbonden in Ringer geoxygeneerde bij kamertemperatuur.
- Voor de finale dissectie: Vlak voor het begin van de opnamesessie, afpellen het epitheel van de onderliggende septum met een tang. Maak het epitheel met een pincet en twee 4-5 mm schaar sneden (gebruik microvannas scharen) en het voorste deel van het septum, waar de hechting is sterker.
- Verwijder de vomeronasal orgel zorgvuldig door te snijden het uit langs de dorsale verbinding met de septale epitheel. Breng de epitheel naar een opname kamer met de slijmlaag naar boven; flat in de kamer met een harp houden.
- Installeer kamer onder een rechtopstaande microscoop uitgerust met fluorescentie optiek en een gevoelige camera. Visualiseer de voorbereiding op het computerscherm bij een hoge vergrotingsfactor door een 40X water-immersie objectief (numerieke opening 0,8) en een extra 2X of 4X vergroting bereikt door een vergrootglas. Perfuseren continu met zuurstofrijk Ringer bij RT (1-2 ml / min).
4. Opname Session
- Zoeken naar fluorescerende cel: prikkelen de voorbereiding op 480nm voor EGFP, die licht in het 530-550 nm uitzendt; richten een dendritische knop die betrouwbaar zichtbaar in fluorescentie en onder felle veld.
- Vul elektrode met intracellulaire oplossing nystatine; Verwijder luchtbellen door voorzichtig te tikken op de elektrode.
- Plaats elektrode op elektrodehouder, overdruk in de pipet toe te passen; Weerstand moet 15-20 MQ zijn.
- Breng elektrode nabij de cel; eens weerstand bereikt ~ 40 MQ, laat positieve druk en toe te passen lichte onderdruk een gigaseal bereiken.
- Zodra afdichting is bereikt, stelt de membraanpotentiaal op ongeveer -75 mV;
- Wanneer de cel wordt geopend, verder met stimulatieprotocollen, farmacologische behandelingen. Om de respons op één geurstof stimulatie, verslag 200-500 msec van spontane activiteit meten stimuleren van 500 msec en de respons van de cel tot 10 sec 13. Voor farmacologische behandelingen, perfuseren de farmacologische middelen bijde gewenste concentratie 20.
5. Data Analysis
- Analyseer stromen opgewekt door stimulatie geurstof als volgt: de maximale amplitude, de opkomst-tijd (tijd die nodig is om 90% van de maximum amplitude bereikt, in msec), de totale stroom (oppervlak onder de curve in Pas), het tijdstip 50% (tijd tussen de aanvang en de offset van de responsie op 50% van de maximum amplitude, in msec).
- Met behulp van de piek transductie stromingen (maximale amplitude bereikt) bij verschillende concentraties, tekenen en past een dosis-respons curve met behulp van de Hill vergelijking: I = Imax / (1 + (K 1/2 / C) n), waar ik vertegenwoordigt de piekstroom , imax de maximale respons in verzadigende concentraties, K1 / 2 de concentratie waarbij de helft van de maximale respons werd bereikt, C de concentratie geurstof en n de Hill-coëfficiënt.
- Analyseer opnames van membraanpotentiaal in de huidige klem voor de maximale depolarisatie, de total potentiaal opgewekt (oppervlakte onder de curve in mVsec); opnemen spontane spiking activiteit meer dan 30 sec tot 1 min opnamen; opnemen prikkelbaarheid door de spikes uitgelokt door injectie van stromingen (5-10 jaar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het resultaat van dit protocol afhankelijk van de kwaliteit van de dissectie. Deze dissectie stappen moeten kort (minder dan 10 tot 15 min) en nauwkeurige (dat wil zeggen, tot schade van het epitheel te voorkomen) zijn. De Figuur 1 illustreert hoe een ideale voorbereiding eruit ziet op verschillende niveaus vergroting. Bij een lage vergroting onder felle gebied van de verschillende celtypen (zoals knoppen van OSNs, ondersteunende cellen) zijn te onderscheiden (figuur 1A). Op het hoogste vergrotingsniveau typisch 80X 160X, in helderveld, de dendritische knoppen van de OSNs dienen duidelijk van de steuncellen (Figuur 1B) zijn. Onder tl-licht, alleen de dendritische knoppen en cilia van GFP-gelabelde cellen zichtbaar zijn (figuur 1C). Bij vergelijking van de 2 beelden, kunnen de gelabelde cellen worden benaderd met de opname pipet (figuur 1D).
De temperatuur van de dissectie zodatlution en timing van de dissectie kritisch. Het eerste deel van de dissectie, moet de voorbereiding van het septum (paragraaf 3.1.1 tot 3.2) plaats te vinden binnen 5 tot 10 min in ijskoude oplossing. De uiteindelijke dissectie (3,3) moet minder dan 5 min bij kamertemperatuur duren. In geval duurde de dissectie te lang of ontleding werd uitgevoerd in oplossing te warm, altijd het preparaat ziet snel beschadigd: dendritische knoppen zweeft boven het oppervlak van het epitheel, en lijken dode cellen.
Zodra een afdichting wordt bereikt en de cel opent onder invloed van nystatine, kunnen typische spanningsafhankelijke stromen worden waargenomen (Figuur 2A). De vorm en eigenschappen van deze stromen kan worden gebruikt om de gezondheid van de cel te volgen: in een stervende cel of indien de kwaliteit van de afdichting wordt afneemt, zullen deze stromen 'amplitude afnemen. Onder de huidige klem configuratie kan actiepotentialen hetzij spontaan worden opgenomen (figuur 2B), of door injectie van een depolariserende stroom (figuur 2C). Het afvuren eigenschappen veroorzaakt door stroominjectie karakteriseren de prikkelbaarheid van de opgenomen neuron. Exciteerbaarheid in populatie verschillende OSNs 'kunnen worden vergeleken (met behulp van klassieke frequentie en ISI berekeningen).
Een multibarrel pipet geladen met verschillende geurstoffen en / of verschillende concentraties van geurstoffen kan worden gebruikt om de cellen te stimuleren door druk uitwerpen. Hierdoor kan de geurstof geïnduceerde responsen te meten. De reukstoffen en concentraties kiezen afhankelijk van de OR expressie in de cel van belang, bijvoorbeeld lyral is het ligand voor MOR23, acetofenon voor M71, eugenol voor mOREG. In het experiment geïllustreerd aan de figuur 3, de opgenomen MOR23-IRES-tauEGFP neuronen gereageerd op verschillende concentraties van lyral, een ligand voor MOR23, onder de huidige clamp mode (figuur 3A) of onder de spanning klem mode (Figure 3B). In voltage clamp mode opnames kunnen verschillende kenmerken worden gecontroleerd om de reactie te kwantificeren (maximale amplitude, stijgen-time, totale stroom opgewekt, enz.) Als klassiek uitgevoerd in elektrofysiologie. De maximale amplitude van het geurstof-geïnduceerde respons, kunnen dosis-respons wordt uitgezet en aangebracht met de Hill-vergelijking. Deze resultaten geven informatie over de codering eigenschappen van elk OSN: detectie drempel, tijdelijke dynamisch, dynamisch bereik en verzadiging niveau. Voorbeelden van dosis-responscurves worden getoond in figuur 3C. Al deze gegevens kunnen worden vergeleken tussen individuele OSNs aan potentiële heterogeniteit binnen een populatie te meten; zij kunnen ook vergeleken worden tussen ASN's met of zonder toepassing van een behandeling voor potentiële modulatie en plasticiteit te meten.
Figuur 1: Vertegenwoordiger beelden van een gezonde voorbereiding (A) Intact reukepitheel gewonnen uit de neusholte van een SR1-IRES-tauGFP transgene muizen waargenomen onder felle gebied staat op de 40x vergroting.. OSN dendritische knoppen (zwarte pijlpunten) zijn ingesloten in een maaswijdte van ondersteunende cellen (SC) en Bowman klieren (BG). (B) Dendritische knoppen van SR1 uiten OSNs waargenomen onder felle veld conditie (wit en rood pijlpunten). (C) hetzelfde veld als in (B) onder tl-licht zien dendritische knoppen van SR1 uiten OSNs. (D) Opname pipet naderen van een-SR1 uiten OSN onder felle veld. De rode pijlpunt vertegenwoordigt dezelfde SR1 OSN in (B - D). Schaal bar: 5 micrometer.
Figuur 2: Representatieve membraaneigenschappen resultaten verkregen met het protocol. Patch-clamp opnamen op de dendritische knop van een SR1-IRES-tauGFP OSN (A) Spanning gated stromingen opgewekt door toenemende depolariserende stappen van de membraanpotentiaal -67 mV tot +40 mV. (B) spontane activiteit opgenomen in de huidige klem configuratie; actiepotentialen kan worden waargenomen tijdens de 15 seconden opname periode. (C) Actiepotentialen uitgelokt door een 7 pA prikkelende stroom; Dit protocol geeft informatie over de prikkelbaarheid van de cel.
Figuur 3:. Representatieve voorbeelden van geurende geïnduceerde responsen in een MOR23-IRES-tauEGFP neuron Toenemende concentraties van lyral, een ligand van de receptor MOR23 induceren toenemende responsen zowel in de huidige clamp (A) en de spanning klem (B). De membraanpotentiaal werd vastgeklemd -67 mV. (C) Voorbeelden van afzonderlijke dosis-respons curves verkregen drie M71 neuronen in reactie op toenemende concentraties van acetofenon en uitgerust met de Hill-vergelijking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vermogen van dit protocol om de eigenschappen van een gezonde OSNs correct monitoren sterk afhankelijk van de kwaliteit van de voorbereiding. Daarom zijn de dissectie stappen kritisch. Ten eerste is het essentieel om aandacht te besteden aan de kwaliteit (pH, osmolariteit), zuurstof en temperatuur (ijskoud maar niet ingevroren) van de dissectie medium. Ten tweede moet de manipulatie van het epitheel ontleden gereedschappen zo beperkt mogelijk schade te voorkomen. Tenslotte is het essentieel om een preparaat zo vlak mogelijk te verkrijgen om toegang te krijgen tot de grootste OSN populatie mogelijk.
De dissectie kwaliteit is van fundamenteel belang voor een gezonde voorbereiding te verkrijgen. Echter, kunnen verschillende benaderingen worden gebruikt voor dissectie: Hier presenteren we een ventrale dissectie dorsaal maar sommige gebruikers kunnen de voorkeur aan de dissectie dorsaal aan de neusholte snel openen en een snelle toegang tot het septum uitsparing van de reukepitheel starten. Elke gebruiker kan de pr dus aan te passenotocol de meest efficiënte strategie om een gezonde bereiding van het interessegebied bereiken.
Wanneer het preparaat onder de microscoop wordt permanent toezicht op de gezondheid van de bereiding's nodig. Inderdaad, een ongezonde voorbereiding leidt tot een lage kans op een gigaseal bereiken. Een lage efficiëntie bij het verkrijgen gigaseals kan worden verbeterd door het interessegebied op te voeren teneinde gezonde OSNs vinden. Een drastische oplossing is het preparaat geheel te vervangen door een nieuwe. Zodra de verzegeling is bereikt, een lage waarschijnlijkheid bereikt de "open" staat kan plaatsvinden. Dit kan te wijten zijn aan de kwaliteit van de interne standaardoplossing is. De interne oplossing moet binnenkort worden voorbereid voor het experiment. Het gebruik van vortex en sonificatie zijn kritisch daar de oplosbaarheid van nystatine vrij klein is. Om de waarschijnlijkheid van het openen verbeteren, wordt de inwendige oplossing opnieuw gevortext gedurende 10 sec en daarna gesoniceerd gedurende 30 tot 60 sec. Dit usually verbetert de efficiëntie van de celopening.
Om de opgenomen OSN met geurstoffen te stimuleren, het protocol gepresenteerd maakt gebruik van een 7 vat stimulerende pipet. Dit type pipet impliceert een beperking in het aantal geurstoffen en / of concentratie van geurstoffen getest op elke waargenomen cellen tot zeven. Deze beperking is relatief niet significant bij een dosis response curve omdat het kan dekken 7 logeenheden concentratie. In het geval van screening experimenten, waarin verschillende geurstoffen getest, zeven vat pipet gelden beperkingen vertonen. In screening experimenten, het doel is om een gelabeld ligand voor OSNs expressie wees OF vinden. Met dit protocol houdt in dat geurstof mengsels vereisen. Elk mengsel opwekken reactie wordt vervolgens verdeeld in afzonderlijke geurstoffen. Dit werd gedaan om amine geurstoffen te screenen op Taar uiten OSNs 16. In deze experimenten, de fluorescente neuronen tot expressie Taars en de ligand was unknown. Met behulp van het protocol, kunnen auteurs tientallen amine geurstoffen in mengsels screenen. De mengsels opwekken reactie werd vervolgens afgebroken met één geurstoffen teneinde de meest efficiënte ligand te vinden.
De afstand tussen de opname onderzocht en de stimulerende pipet moet verstandig worden gekozen om de mechanische stimulatie van de cel 20 te minimaliseren. Als de druk te hoog is (boven de 30 psi in onze opname-omstandigheden) en / of de afstand te klein (minder dan 20 micrometer), kan de mechanische respons in sommige OSNs zelfs maskeren de geurstof reactie. De druk en de afstand tussen de puffen pipet en de opname site zijn ook van cruciaal belang om de oplossing te wisselen tijdens de stimulatie te controleren. De concentratie bereiken van het neuron is eerder geëvalueerd zo dicht mogelijk bij deze concentratie in de pipet door een reeks proeven 13 zijn. Deze tests gebruikte oplossing gekleurd met blauwe kleurstof aan het ontstaan meten en compenseren van dHij stimulatie. Met behulp van 20 psi en 30 micrometer afstand, de maximale intensiteit van de stimulus werd bereikt binnen 300 msec. De offset van de stimulus werd ook zorgvuldig geëvalueerd: sinds de voorbereiding is onder continue stroom van geperfundeerde oplossing, werd de stimulus uitgewassen binnen 0,8-0,9 sec 13.
De geur codering eigenschappen van OSNs historisch werden gemeten hetzij door extracellulaire opnames in vivo of door middel van experimenten op geïsoleerde cellen. In zoogdieren werden extracellulaire registraties uitgevoerd eerst in vivo bij ratten 21. In extracellulaire opnames, OR expressie gebracht in de cel opgenomen onbekend derhalve beperkt de succesratio een cel reageren op de geurstof geteste vinden. Het protocol maakt het opname- en karakterisering van bepaalde receptoren in neuronen in de cellulaire omgeving van het epitheel. De eigenschappen receptoren 'kan dus worden geanalyseerd op verschillende niveaus: het specifieke ligand/ OF interacties tijdens de eerste stap van de transductie pathway; bijgevolg de agonist / antagonist interacties van diverse liganden getest; de eigenschappen van mengsels integratie van gedefinieerde ultraperifere regio's en de rol van de transductieroute voor specificiteit OSNs '; de invloed op olfactorische codering van cel-cel interacties (zoals GAP kruising) in het epitheel; en tenslotte de modulatie van de transductie pathway via farmacologische agentia.
In de gedissocieerde cellen opnames, zoals eerder vermeld, de dissociatie proces verwijdert het slijm en de cel-cel interacties in het reukepithelium. Deze kunnen veranderingen in de coderende eigenschappen van de OSNs induceren. Calcium imaging experimenten op geïsoleerde cellen werden vaak gemeld. Zo werden dosis-respons curven van M71 tot expressie OSNs reactie op acetofenon gerapporteerd 7. De dosis-respons curves zijn steiler dan de dosis-respons curves verkregen met de protocolHier 4 gepresenteerd. Deze verschillen kunnen het gevolg zijn van de cel-tot-cel interacties in het intacte preparaat en ook om het verwijderen van slijm in geïsoleerde cellen. Slijm is bekend dat veel eiwitten en enzymen betrokken bij perireceptor events fundamenteel voor de olfactorische transductie 22,23 bevatten. In de hier gerapporteerde protocol, het behoud van de structuur van de olfactorische epithelium en de vermoede aanwezigheid van slijm bij aan de natieve kenmerken van geurstof codering in OSNs behouden. De concentraties die in het protocol worden aangegeven in mol / L en meestal in de 10 -7 -10 -3 bereik. Deze concentraties zijn hoger dan concentraties gebruikt in opnames lucht gefaseerde (hetzij in de lokale veld potentieel of extracellulaire opnames). Deze verschillen kunnen het gevolg zijn van i) de vloeibare fase van de opnamen (en dus van de stimulatie) en ii) de langzame wegspoelen van het slijm door de perfusie tijdens opnames. In feite, het wegspoelen van het mucons en het gedeelte van de axonen OSNs 'tijdens dissectie kan ondersteunen dat het preparaat gepresenteerde mogelijk worden aangemerkt als "pseudo-intact" in plaats van "volledig intact" preparaat. Dit preparaat vertegenwoordigt echter opnameomstandigheden zo dicht mogelijk bij in vivo mogelijk en toch opwekken patch-clamp. Zoals elke in vitro voorbereiding van een zoogdier organisme, het voortbestaan blijft de tijd beperkt. Deze beperking kan te wijten zijn aan het wegspoelen van het slijm, het gedeelte van axonen OSNs 'en de afwezigheid van de bloedcirculatie in het preparaat.
De hier gepresenteerde protocol kan men membraaneigenschappen van olfactorische sensorische neuronen opnemen. Deze techniek kan meerdere toepassingen, zoals analyse van de membraan eigenschappen van OSNs, farmacologische onderzoeken OSNs, modulatie van geurstof codering eigenschappen van OSNs en ontwezing van ultraperifere regio hebben. De gebeurtenissen opgenomen tijdens calcium imaging worden SLOw en langdurig. Patch-clamp opnamen in het huidige protocol leiden tot gegevens over de snelle gebeurtenissen in olfactorische transductieroute op het membraan niveau.
De hier gepresenteerde opnames worden uitgevoerd in de patch-clamp-configuratie. In deze configuratie kan het membraan eigenschappen van de opgenomen cel geanalyseerd worden, of het nu de olfactorische transductie pathway machine of de spanningsafhankelijke stroom betrokken. Experimenten met dit protocol kunnen gegevens over de modulatie van de geurstof coderende eigenschappen van OSNs. Farmacologische middelen kunnen worden gebruikt om de olfactorische transductie in verschillende omstandigheden onderzocht: bijvoorbeeld kan MDL12330A, een blokker van adenylaatcyclase III (ACIII) 24,25 in de perfusievloeistof worden toegepast om de rol van ACIII een geurstof responding. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt om te onderzoeken hoe olfactorische coderende eigenschappen worden gemoduleerd in verschillende omstandigheden, zoals het olfactorische omgeving <sup> 18 of onder invloed van hormonen die betrokken zijn bij het voeden gedrag 26. Ten slotte kan dit protocol ook leiden tot gegevens over OR ligandinteractie / en ontcijferen agonist / antagonist activiteiten op gedefinieerde ultraperifere regio of zelfs in willekeurig gekozen receptoren 27.
Tenslotte, met de beperkingen vanwege de 7 barrel stimulerende pipet Dit protocol kan ook gebruikt worden voor deorphanizing UPR. Zoals eerder in dit geval genoemd kunnen verschillende geurstof mengsels getest. Mengsels opwekken van een antwoord moet vervolgens worden verdeeld in afzonderlijke geurstoffen getest op andere cellen.
Door zich te richten OSNs uiten gedefinieerde ultraperifere regio's, dit protocol biedt krachtige data over de UPR, liganden / ultraperifere regio interacties, transductieroute eigenschappen en te vergelijken eigenschappen van gedefinieerde populaties van OSNs in verschillende omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
