Abstract
ניתוח התגובות הפיזיולוגיות של תאי עצב תחושתיים חוש הריח (OSN) כאשר מגורה עם ligands הספציפי הוא קריטי כדי להבין את הבסיס של התנהגויות מונעים ריח והאפנון שלהם. מאפייני קידוד אלה תלויים במידה רבה באינטראקציה הראשונית בין מולקולות ריח וקולטני הריח (OR) באו לידי ביטוי בOSNs. ספקטרום זהות, הסגוליות ויגנד של ביטוי או קריטיים. ההסתברות למצוא יגנד של או הביטוי בOSN נבחר באופן אקראי בתוך האפיתל הוא נמוך מאוד. כדי להתמודד עם אתגר זה, פרוטוקול זה משתמש גנטי עכברים מתויגים המבטאים את ה- GFP חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של האמרגן של חדרי ניתוח שהוגדר. OSNs ממוקם באפיתל הדוק ומסודר המצפים את חלל האף, עם תאי שכנים משפיעים ההתבגרות ותפקודם. כאן אנו מתארים שיטה לבודד אפיתל ריח שלם ולהקליט דרך הקלטות תיקון מהדק המאפיינים של דואר OSNsxpressing קולטנים odorant מוגדרים. הפרוטוקול מאפשר לאפיין תכונות קרום OSN, תוך שמירה על ההשפעה של רקמות שכנות. ניתוח של תוצאות תיקון מהדק מניב כימות מדויק של יגנד / או אינטראקציות, מסלולי העברה ופרמקולוגיה, תכונות הקידוד 'OSNs והאפנון שלהם ברמת הקרום.
Introduction
נוירונים חושיים ריח (OSN) מייצגים את השלב הראשון של תפיסת חוש הריח. ממוקם באפיתל ההרחה המצפה את חלל האף במכרסמים, הם יהפכו את המידע הכימי של ניחוחי לפוטנציאל פעולה שנשלח דרך האקסון שלהם למוח. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני קידוד חוש הריח, יש צורך לאפיין את תכונות התמרה וקרום של OSNs. עד לאחרונה, רוב הטכניקות המשמשות כדי לאפיין את המאפיינים של OSNs יונקים בוצעו על 1-4 OSNs ניתקו. תהליך הניתוק משתמש (כלומר, אנזימים) תהליכים שונים מכאניים וכימיים לשחרר OSNs מסביבתם. תהליכים אלה גורמים למספר נמוך של תאים זמינים להקלטות. מספר נמוך זה יכול להיות אפילו יותר קריטי במקרה של תאי ה- GFP שכותרתו. דיסוציאציה גם מסירה את אינטראקציות תא אל התא המקומיות בין OSNs ותאים אחרים של אפיתל הריח שעשוי לשפר survivאל ואפנון של הנכסים "OSNs. כדי לעקוף את הליך הניתוק, הכנה שלמה פותחה 5.
כל OSN מבטא קולטן אחד חוש הריח (OR) נבחר ממשפחת multigene גדולה 6. יש ~ 1,000 חדרי ניתוח הביטוי באפיתל ההרחה העיקרי בעכבר. בשל המספר הגדול של בעלי חיים או בסוג בר, הסיכויים להקליט OSNs להביע זהה או נמוכים מאוד. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עכברי גן ממוקד זמינים שבו כל OSNs להביע מזוהה או מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי 7-9. OSNs שכותרתו אלה שמשו לעשות אנליזה פונקציונלית בהכנות ניתק 7,10,11 עם החסרונות שהוזכרו קודם לכן. הכנת אפיתל ללא פגע 5 מעכברים שכותרתו גנטית ולכן עוקפת בעיות אלה. זה מאפשר הניטור של הפעילות של OSNs להביע חדרי ניתוח מוגדרים במדויק בסביבה הקרוב בviVO ככל האפשר. חוץ מזה, הקלטות תיקון מהדק של OSNs גם יאפשרו ניתוח מדויק של תכונות קרום, פרמקולוגיה מסלול התמרה, יגנד / או אינטראקציות. בקושי ניתן לנתח את כל הנושאים הללו באמצעות הקלטות תאית. השתמשנו בטכניקה זו כדי לעקוב אחר התגובות של OSNs מבטאות את הקולטנים odorant SR1 וMOR23 12,13. ההיתכנות של הטכניקה אושרה על ידי קבוצות אחרות בMOR23 להביע 14 OSNs כמו גם בחדרי ניתוח אחרים להביע נוירונים 15,16. הניטור של אוכלוסייה מוגדרת של OSNs יכול להוביל לניתוח של המאפיינים שלהם בהקשרים רבים ושונים כגון פיתוח 14, הזדקנות 17, odorant מושרה פלסטיות 18, ותפקידם של שינויים ברצף של קולטן odorant בריח קידוד 15. פרוטוקול זה ובכך מספק כלי רב עוצמה כדי לעקוב אחר התכונות הפונקציונליות של OSNs המוגדר ברמת הקרום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של Université de Bourgogne ואושר על ידי ועדת האתיקה Université de Bourgogne.
1. בעלי חיים
- השתמש עכברים או-IRES-tauGFP מהונדסים גנטי זמינים במעבדה ג'קסון. עכברים אלו פותחו במעבדה של ד"ר פיטר 'Mombaerts כדי לנתח מיקוד ופיתוח האקסון של מערכת ההרחה 19. לדוגמא, קו MOR23-IRES-tauGFP, מספר מניות 006,643, נושא את השם הרשמי מתח B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; באופן דומה, הקו-SR1 IRES-tauGFP, מספר מניות 6717 נושא את השם הרשמי B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
- לגבי הגיל של בעלי החיים: לתוצאה טובה יותר של הפרוטוקול, להשתמש בבעלי חיים בין 2 ל 4 שבועות של גיל. בקבוצת גיל זו, לנתיחה היא (עצמות רכות, אפיתל ריח מוצק יותר) קלים יותר והידיות הדנדריטים הן דוgger להשוות לבעלי חיים מבוגרים.
2. הכנת אלקטרודות ופתרונות
- לטפטפות המגרה: רכישת prepulled גירוי טפטפות. אחרת, להכין אותם באופן ידני.
- שימוש בלהבה, לכופף שש טפטפות זכוכית 1 מ"מ בכ 1 סנטימטר מהקצה. הכנס שש טפטפות אלה בתוספת 7 ה ישר בצינורות כיווץ בחום 1.5 סנטימטר לחזק על ידי לולאה.
- חום לכווץ את צינורות כדי לשמור על החביות המצורפות יחד. צרף צינורות לכווץ נוספים לגפיים האחרים של החביות. משוך פיפטה גירוי זה עם חולץ רב-חבית.
- להוסיף קצת דבק נוזלי לבן סביב חריר כדי לחזק את הטיפים הכפופים. בואו N / O היבש.
- הכן L 1 או 2 של הפתרון תאי רינגר הרגיל (מ"מ: 124 NaCl, KCl 3, 4 MgSO 1.3, CaCl 2 2, 3 NaHCO 26, Nah 2 PO 4 1.25, 15 גלוקוז; mOsm pH 7.6 ו 305). שמור על 4 מעלות צלזיוסעד לשימוש.
- הכן פתרון מניות תאיים (מ"מ): 70 KCl, KOH 53, חומצת methanesulfonic 30, EGTA 5, HEPES 10, סוכרוז 70; pH 7.2 (KOH) וmOsm 310. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. טוב למספר שבועות.
- הכן פתרון תאיים הקלטה עם nystatin הכנה מוקדמת (ברגע האחרון) לפני הניסוי.
- שוקל 3 מ"ג של nystatin, להוסיף 50 μl של DMSO; מערבולת 20 שניות לאחר מכן sonicate 2-3 דקות עד מדוללים לחלוטין.
- הוסף 20 μl של פתרון DMSO-nystatin ב 5 מיליליטר של פתרון מניות תאיים. מערבולת 20 שניות, ואז sonicate 3 דקות. שמור פתרון זה על 4 מעלות צלזיוס ולהגן מפני אור ישיר, nystatin הוא רגיש לאור. פתרון זה יכול לשמש לכמה שעות. להחליף כל יום.
- לאחר הכנת אפיתל ההרחה היא מתחת למיקרוסקופ, לקחת חלק בפתרון זה במזרק 1 מיליליטר עם קצה צהוב-מוארך להבה למלא את האלקטרודות; להגן מפני אור ישיר. ברגע שב RT, פתרון nystatinאינו יציב; להחליף את הפתרון במזרק 1 מ"ל כל שעה או לשמור אותו בקרח.
- משוך אלקטרודות הקלטה עם חולץ להשיג צוואר ארוך וטיפ קטן (~ 2 מיקרומטר) עם התנגדות של 15-20 MΩ עם פתרון nystatin הפנימי.
- הכן פתרון odorant על 0.5 M בDMSO מתחת למכסה המנוע קטר; aliquot ולשמור ב -20 ° C עד שימוש. לדלל odorant בפתרון של רינגר עד הריכוז הרצוי. מלא את פיפטה הגירוי.
3. הכנת אפיתל הרחה
הערה: עכברים או-IRES-tauGFP להביע tauGFP תחת שליטתו של היזם או. בעכברים אלו, כל הנוירונים המבטאים את או עניין מסומנים עם GFP. פרוטוקול זה מותאם עבור חדרי הניתוח באו לידי ביטוי בכל האזורים. עם זאת, ניתוחים והקלטות קלים יותר לחדרי ניתוח הביע באזור הגב.
- להרדים את החיה על ידי הזרקת תערובת של קטמין ו xylazine (150 מ"ג / קילוגרם ו -10 מ"ג / קילוגרם דירקטוריוןמשקל y, בהתאמה). עריפת ראש יכול להתבצע במספריים חדים לעכברים צעירים או עם הגיליוטינה מכרסמים מתוחזקים היטב לעכברים מבוגרים.
- מספריים לנתח טבעת באמצעות לעשות חתך המדיאלי אורך דרך עור הגב. הסר את העור על ידי משיכתו לגזרים. בעזרת המספריים, לחתוך את הלסתות התחתונות במפרק הלסת. הסר את השיניים הקדמיות העליונות במקביל חתך עטרה לשיניים.
- ביצוע חתך עטרה של הראש מאחורי העיניים ולשמור את החלק הקדמי בלבד של הראש. לטבול אותו בתמיסת רינגר קר כקרח לנתיחה בהיקף.
- לנתח תחת ההיקף: בצד הגחון, לעשות חתך אורכי לאורך הלסת העליונה / השיניים. חותך את עצמות גב לאורך זמן, הבאים בצד dorso-הרוחב של חלל האף. להסיר את רוב העצמות וחיך; להעביר את המחיצה ואפיתל קשור אליו ברינגר חומץ בRT.
- לנתיחה הסופית: ממש לפני שמתחילה את ההקלטהפגישה, לקלף את האפיתל מהמחיצה הבסיסית עם מלקחיים. לנתק את האפיתל עם מלקחיים ועם שני 4-5 חתכי מספריים מ"מ (מספריים microvannas שימוש) בחלק הקדמי של מחיצת האף שבו ההידבקות חזקה.
- מוציא בזהירות את איבר יעקובסון על ידי חיתוך אותו לאורך הגב שלה לחיבור האפיתל במחיצה. העבר את האפיתל לחדר הקלטה עם שכבת הריר פונה כלפי מעלה; לשמור את זה שטוח בתא עם נבל.
- התקן תא תחת מיקרוסקופ הזקוף מצויד באופטיקה הקרינה ומצלמה רגישה. דמיין את ההכנה על מסך המחשב בהגדלה גבוהה דרך 40X מטרת מים טבילה (צמצם מספרי 0.8) והגדלת 2X או 4X נוסף הושגה על ידי זכוכית מגדלת. Perfuse ברציפות עם צלצול מחומצן בRT (1-2 מיליליטר / דקה).
4. הקלטת מושב
- לחפש את תא ניאון: להלהיב את ההכנה ב480ננומטר לEGFP, אשר פולט אור בטווח 530-550 ננומטר; יעד ידית הדנדריטים אחד שהיא באופן מהימן גלוי בקרינה ותחת שדה בהיר.
- מלא אלקטרודה עם פתרון תאיים עם nystatin; להסיר בועות בעדינות על ידי הקשה על האלקטרודה.
- הכנס האלקטרודה על בעל אלקטרודה, להפעיל לחץ חיובי בפיפטה; התנגדות צריכה להיות 15-20 MΩ.
- להביא האלקטרודה קרובה לתא; פעם התנגדות מגיעה ~ 40 MΩ, לשחרר לחץ חיובי ולהפעיל לחץ שלילי קל להגיע gigaseal.
- ברגע שהוא הגיע חותם, להגדיר את פוטנציאל הממברנה בכ -75 mV;
- ברגע שהתא נפתח, להמשיך עם פרוטוקולי גירוי, טיפולים תרופתיים. כדי למדוד את התגובה לגירוי odorant אחת, שיא 200-500 אלפיות שני של פעילות ספונטנית, לעורר עבור 500 אלפית שני ולמדוד את התגובה של התא לתקופה של עד 10 שניות 13. לטיפולים תרופתיים, perfuse הסוכנים תרופתיים בהריכוז הרצוי 20.
ניתוח נתונים 5.
- לנתח זרמים שהושרו על ידי גירוי odorant אחריו כמו: משרעת המרביות, עלייה-הזמן (זמן דרוש כדי להגיע ל -90% ממשרעת המרבית, באלפיות שני), הסכום הנוכחי (שטח מתחת לעקומה בPAS), בפעם ב 50% (זמן בין תחילת והקיזוז של התגובה ב -50% את המשרעת המרבית, באלפיות השני).
- שימוש בזרמי התמרה השיא (משרעת מרבי הגיע) בריכוזים שונים, לצייר ולהתאים עקומת תגובת מינון באמצעות משוואת היל: אני = Imax / (1 + (K 1/2 / n C)), שבו אני מייצג את השיא נוכחי , IMAX התגובה המרבית בריכוזים להרוות, K1 / 2 הריכוז שבהגיעה מחצית מהתגובה המרבית, C ריכוז odorant וn מקדם היל.
- ניתוח הקלטות של פוטנציאל הממברנה במהדק נוכחי לשלילת הקוטביות המרבית, טוטהפוטנציאל l הושר (שטח מתחת לעקומה בmVsec); פעילות שיא ספונטנית spiking מעל 30 שניות עד 1 הקלטות דקות; שיא רגישות דרך קוצים שהושרו על ידי הזרקה של זרמים (5-10 הרשות הפלסטינית).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאה של פרוטוקול זה תלויה באיכות של הנתיחה. צעדים לנתיחה זה חייבים להיות קצרים (פחות מ 10 עד 15 דקות) ומדויקים (כלומר, כדי למנוע נזקים של האפיתל). איור 1 מדגים כיצד הכנה אידיאלית נראית כמו ברמות הגדלה שונות. בהגדלה נמוכה בשדה בהיר תאים מסוגים השונים (כגון ידיות של OSNs, תמיכה תאים) הם (איור 1 א) להבחנה. ברמה הגבוהה ביותר בהגדלה, בדרך כלל 80x ל160X, בשדה בהיר, ידיות הדנדריטים של OSNs צריכה להיות הבחנה מתאי התומכים (איור 1) באופן ברור. תחת אור הניאון, רק את הידיות וריסים של תאים דנדריטים GFP שכותרתו גלויות (איור 1 ג). על ידי השוואת 2 תמונות, ניתן לגשת התאים שכותרתו עם פיפטה ההקלטה (1D איור).
הטמפרטורה של הנתיחה כךlution ועיתוי הם קריטיים לנתיחה. החלק הראשון של הניתוח, צריכה ההכנה של מחיצת האף (סעיף 3.1.1 3.2) יתקיים בתוך 5 עד 10 דקות בתמיסה קרה כקרח. הנתיחה הסופית (3.3) צריכה להימשך פחות מ -5 דקות בטמפרטורת חדר. במקרה הנתיחה נמשכה זמן רב מדי, או בוצעה בפתרון לנתיחה חם מדי, ההכנה תמיד נראית במהירות פגומה: ידיות הדנדריטים צפות מעל פני השטח של האפיתל, ודומה לתאים מתים.
ברגע שהוא הגיע חותם והתא נפתח תחת ההשפעות של nystatin, ניתן לצפות זרמי מתח מגודר טיפוסיים (איור 2 א). צורה והמאפיינים של זרמים אלה יכולים לשמש כדי לפקח על הבריאות של התא: בתא למות או אם האיכות של החותם יורדת, משרעת 'הזרמים אלה יקטנו. תחת תצורת המהדק הנוכחית, ניתן להקליט פוטנציאל פעולה באופן ספונטני (איור 2B) או על ידי הזרקה של זרם depolarizing (איור 2 ג). מאפייני הירי הנגרמים על ידי הזרקה נוכחית מאפיינים את הרגישות של נוירון שנרשם. רגישות אוכלוסיית OSNs שונה של ניתן להשוות (באמצעות תדר קלאסי וחישובי ISI).
פיפטה multibarrel עמוסה odorants שונה ו / או ריכוזים שונים של ניחוחי יכולה לשמש כדי לעורר את התאים על ידי פליטת לחץ. זה מאפשר למדוד את תגובות odorant מושרה. יש לבחור ניחוחי והריכוזים בהתאם לאו ביטוי בתא של עניין, למשל Lyral הוא יגנד לMOR23, אצטופנון לM71, eugenol לmOREG. בניסוי המאויר באיור 3, נוירונים MOR23-IRES-tauEGFP נרשמו הגיבו לריכוזים שונים של Lyral, יגנד לMOR23, תחת מצב הנוכחי מהדק (איור 3 א) או על פי מצב מהדק מתח (איור 3B יור). בהקלטות מצב מהדק מתח, יכולים להיות במעקב מאפיינים שונים לכמת את התגובה (משרעת מרבי, לעלות בזמן, הסכום הנוכחי שהושרו, וכו '.) כפי שבוצע באופן קלאסי באלקטרופיזיולוגיה. שימוש במשרעת המרבית של התגובה מושרה odorant, מנה-תגובה ניתן להתוות ומצויד באמצעות משוואת היל. תוצאות אלו מספקות מידע על מאפייני הקידוד של כל OSN: סף גילוי, דינמי זמני, טווח דינמי ורמת הרוויה. דוגמאות למנת תגובה עקומות מוצגות באיור 3 ג. ניתן להשוות את כל הפרטים האלה בין OSNs הבודד למדוד ההטרוגניות פוטנציאלית בתוך אוכלוסייה; הם גם יכולים להשוות בין OSNs עם או בלי יישום של טיפול למדוד אפנון ופלסטיות פוטנציאליים.
p-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 1: נציג תמונות של הכנה בריאה () אפיתל הרחה שלמים שחולץ מחלל האף של עכבר מהונדס SR1-IRES-tauGFP נצפה תחת מצב שדה בהיר בהגדלת 40X.. ידיות OSN הדנדריטים (ראשי חץ שחור) מוקפות ברשת של תאי תומכים (SC) ובלוטות באומן (BG). (ב) ידיות דנדריטים של SR1 להביע OSNs נצפה תחת מצב שדה בהיר (ראשי חץ לבן ואדום). אותו השדה כמו ב( ב ') תחת אור הניאון מראה ידיות הדנדריטים של OSNs להביע SR1 (C). (ד) פיפטה הקלטה מתקרבת OSN לבטא SR1 תחת שדה בהיר. החץ האדום מייצג את אותו SR1 OSN ב( B - D). בר סולם: 5 מיקרומטר.
"תמיד"> 
זרמי מתח מגודר הקלטות תיקון מהדק על ידית הדנדריטים של OSN SR1-IRES-tauGFP () שהושרו על ידי הגדלת צעדי depolarizing מהקרום פוטנציאלי -67 mV ל+40: איור 2: תוצאות תכונות קרום נציג שהושגו עם פרוטוקול. mV. פעילות ספונטנית נרשמה בתצורת המהדק הנוכחית (ב); ניתן לצפות פוטנציאל פעולה בעידן ההקלטה 15 שניות. פוטנציאלים (ג) פעולה שהושרו על ידי +7 הרשות הפלסטינית מעורר נוכחי; פרוטוקול זה מספק מידע על הרגישות של התא.
together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 3:. ריכוזי דוגמאות מייצגות של תגובות odorant מושרה בנוירון MOR23-IRES-tauEGFP הגדלת של Lyral, יגנד של הקולטן MOR23, לגרום להגדלת תגובות הן במהדק נוכחי () ובמהדק מתח (ב '). פוטנציאל הממברנה היה מהודק ב-67 mV. (ג) דוגמאות למנת תגובה עקומות פרט שנרכש על שלושה נוירונים M71 בתגובה להגדלת ריכוזים של אצטופנון ומצויד במשוואת היל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היכולת של פרוטוקול זה כדי לפקח בצורה נכונה את המאפיינים של OSNs הבריא תלויה במידה רבה באיכות של התכשיר. לכן, הצעדים לנתיחה הם קריטיים. הראשון הוא קריטי לשים לב לאיכות (pH, osmolarity), חמצון וטמפרטורה של המדיום לנתיחה (אבל לא קפוא קר כקרח). שנית, המניפולציה של האפיתל עם כלים לנתח חייבת להיות מוגבלת ככל האפשר, כדי למנוע נזקים. לבסוף, זה הוא קריטי להשגת הכנה שטוחה ככל האפשר על מנת לגשת לאוכלוסיית OSN הגדולה ככל האפשר.
איכות הנתיחה היא יסוד להשגת הכנה בריאה. עם זאת, גישות שונות יכולות לשמש לנתיחה: כאן אנו מציגים הגחון למגבים לנתיחה, אך חלק מהמשתמשים יכולים מעדיפים להתחיל dorsally הנתיחה כדי לפתוח את חלל האף במהירות ויש לי גישה מהירה להפסקה במחיצה של אפיתל ההרחה. כל משתמש יכול להתאים לכן יחסי הציבורotocol לאסטרטגיה היעילה ביותר להגיע להכנה בריאה של האזור של עניין.
לאחר ההכנה היא מתחת למיקרוסקופ, נדרש ניטור קבוע של הבריאות של ההכנה. ואכן, הכנה לא בריאה גורמת לסבירות נמוכה להגיע gigaseal. יעילות נמוכה בהשגת gigaseals ניתן לשפר על ידי שינוי האזור של ריבית על ההכנה כדי למצוא OSNs בריא. פתרון דרסטי יותר הוא להחליף את ההכנה לחלוטין על ידי אחד חדש. ברגע שהוא הגיע לחותם, הסתברות נמוכה כדי להגיע למדינה "פתחה" יכולה להתקיים. זה יכול להיות בגלל האיכות של הפתרון הפנימי. הפתרון הפנימי חייבים להיות מוכן זמן קצר לפני הניסוי. השימוש במערבולת וsonication הוא קריטיים שכן המסיסות של nystatin היא נמוכה למדי. כדי לשפר את ההסתברות של פתיחה, הפתרון הפנימי צריך להיות vortexed שוב במשך 10 שניות ולאחר מכן sonicated עבור 30 עד 60 שניות. א.ס.א. זהברית משפרת את היעילות של פתיחת התא.
כדי לעורר את OSN נרשם עם ניחוחות, הפרוטוקול המובא משתמש פיפטה גירוי 7 חבית. סוג זה של פיפטה מרמז הגבלה במספר odorants ו / או הריכוז של odorants נבדק על כל תאים שנרשמו לשבע. מגבלה זו היא יחסית לא משמעותית במקרה של עקומת תגובת מינון שכן הוא יכול לכסות עד 7 יחידות יומן של ריכוז. עם זאת, במקרה של ניסויי הקרנה, שבו odorants שונה נבדקים, פיפטה שבע חבית עשויה להראות מגבלות. בהקרנת ניסויים, המטרה היא למצוא ליגנד לOSNs שכותרתו להביע יתום או. שימוש בפרוטוקול זה דורש השימוש בתערובות odorant. כל תערובת לעורר תגובה תחולק לאחר מכן לניחוחי בודד. הדבר נעשה כדי להקרין odorants האמין על TAAR להביע OSNs 16. בניסויים אלה, נוירונים הניאון הביעו TAARs ויגנד היה אונקnown. שימוש בפרוטוקול, מחברים יכולים להקרין כמה עשרות odorants האמין בתערובות. התערובות לעורר תגובה היו שבורות אז עד odorants אחת כדי למצוא יגנד יעיל ביותר.
המרחק בין אתר ההקלטה ופיפטה הגירוי יש לבחור בחוכמה כדי למזער את הגירוי המכני של התא 20. אם הלחץ הוא גבוה מדי (מעל 30 psi בתנאי ההקלטה שלנו) ו / או המרחק הקטן מדי (מתחת ל -20 מיקרומטר), התגובה המכנית בחלק OSNs יכולה אפילו להסוות את תגובת odorant. לחץ ומרחק בין פיפטה מתנשפת ואתר ההקלטה הם קריטיים גם לפיקוח על מטבע פתרון בזמן הגירוי. הריכוז להגיע לנוירון הוערך בעבר להיות קרוב ככל האפשר להווה הריכוז בפיפטה באמצעות סדרה של בדיקות 13. בדיקות אלה משמשים פתרון צבעוני עם צבע כחול למדוד את ההופעה וקיזוז של tהוא הגירוי. באמצעות 20 לחץ psi ו -30 מיקרומטר מרחק, העצמה מקסימלית של הגירוי הושגה בתוך 300 אלפיות שניים. הקיזוז של הגירוי גם להעריך בזהירות: מאז ההכנה היא תחת זרימה רציפה של פתרון מרוסס, הגירוי היה דהוי בתוך 0.8-0.9 שניות 13.
ריח קידוד מאפיינים של OSNs נמדד היסטורי או באמצעות הקלטות תאי in vivo או באמצעות ניסויים בתאים מבודדים. ביונקים, הקלטות תאי בוצעו בהתחלה in vivo בחולדות 21. בהקלטות תאית, או לידי ביטוי בתא נרשם אינו ידוע ובכך להגביל את יחס ההצלחה למצוא תא מגיב לodorant נבדק. הפרוטוקול מאפשר הקלטה ואפיון של קולטנים שהוגדרו בתאי עצב בסביבה הסלולרית של האפיתל. לכן ניתן לנתח מאפייני 'קולטנים ברמות שונות: יגנד הספציפי/ או אינטראקציות במהלך השלב הראשון של מסלול התמרה; כתוצאה מכך, אגוניסט / אנטגוניסט האינטראקציות של ligands המגוון נבדק; המאפיינים של אינטגרציה תערובות של חדרי ניתוח מוגדרים והתפקיד של מסלול התמרה לסגולי 'OSNs; ההשפעה על קידוד חוש הריח של אינטראקציות תא אל התא (כגון צומת GAP) בתוך האפיתל; ולבסוף האפנון של מסלול התמרה באמצעות סוכנים תרופתיים.
בהקלטות התא ניתק, כאמור, תהליך הניתוק מסיר את הריר ואינטראקציות תא אל התא בתוך אפיתל ההרחה. זה עשוי לגרום לשינויים בתכונות הקידוד של OSNs. ניסויי הדמיה סידן בתאים מבודדים לעתים קרובות דווחו. לדוגמא, עקומות מנה-תגובה של M71 להביע OSNs בתגובה לאצטופנון דווחו 7. מנת התגובה עקומות אלה הם תלולים יותר מעקומות מנה-התגובה שהושגו באמצעות הפרוטוקולמוצג כאן 4. פערים אלה עשויים להיות בשל אינטראקציות תא אל התא בהכנה בשלמות וגם להסרת של ריר בתאים מבודדים. הריר ידוע מכיל הרבה חלבון ואנזימים מעורבים באירועי perireceptor בסיסיים לתמרת חוש הריח 22,23. בפרוטוקול שדווח כאן, שימור מבנה אפיתל הריח והנוכחות המשוערת של הריר לתרום לשמירה על התכונות המקוריות של קידוד odorant בOSNs. הריכוזים המשמשים בפרוטוקול מצוינים בmol / L, ובדרך כלל נמצאים ב10 -7 -10 -3 הטווח. ריכוזים אלה הם גבוהים יותר מריכוזים בשימוש בקלטות-שלבי אוויר (או בפוטנציאל שדה מקומי או הקלטות תאיים). פערים אלה עשויים להיות בשלי) השלב הנוזלי של ההקלטות (ולכן של הגירוי) ו- II) סחף האיטי של הריר על ידי זלוף במהלך הקלטות. למעשה, כישלון של MUCשלנו והסעיף של אקסונים "OSNs במהלך נתיחה שעשויים לתמוך בהכנה הוצגה להיות פוטנציאל הוסמכה כ" פסאודו-שלמה" ולא הכנה "מלא-שלמה". הכנה זו מייצגת, לעומת זאת, הקלטות תיקון מהדק תנאי הקלטה קרובים לin vivo ככל האפשר, ובכל זאת לעורר. כמו כל הכנה במבחנה מאורגניזם יונקים, ההישרדות נשארת בזמן מוגבל. מגבלה זו יכולה להיות בגלל כישלון של הריר, הסעיף של אקסונים "OSNs כמו גם היעדר זרימת דם בתוך ההכנה.
הפרוטוקול המובא כאן מאפשר להקליט תכונות קרום של תאי עצב תחושתיים חוש הריח. טכניקה זו יכולה להיות יישומים רבים כגון ניתוח של מאפייני קרום של OSNs, חקירות תרופתיות של OSNs, אפנון של נכסי קידוד odorant של OSNs, וdeorphanization של חדרי ניתוח. האירועים שנרשמו במהלך ההדמיה סידן SLOw וארוך טווח. הקלטות תיקון מהדק ביתרון הפרוטוקול הנוכחי לנתונים על אירועים מהירים במסלול התמרה חוש הריח ברמת הקרום.
ההקלטות שהוצגו כאן מבוצעות בתצורת תיקון מהדק. בתצורה זו, תכונות הקרום של התא נרשם ניתן לנתח, אם זה מכונות מסלול התמרה חוש הריח או זרמי המתח מגודר המעורבים. ניסויים בפרוטוקול זה יכול לספק נתונים על האפנון של odorant קידוד מאפיינים של OSNs. סוכנים תרופתיים יכולים לשמש כדי לחקור את התמרה חוש הריח בתנאים שונים: למשל, MDL12330A, חוסם של cyclase adenylate III (ACIII) 24,25 יכול להיות מיושם בפתרון זלוף לחקור את התפקיד של ACIII בתגובת odorant. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור כיצד חוש הריח מאפייני קידוד הם מווסתים בתנאים שונים כמו איכות סביבת חוש הריח <sup> 18 או תחת השפעה של הורמונים מעורבים בהתנהגויות האכלת 26. לבסוף, פרוטוקול זה יכול גם להוביל לנתונים על או אינטראקציה יגנד / ופענוח אגוניסט / אנטגוניסט פעילות בחדרי ניתוח מוגדר או אפילו בקולטנים שנבחרו באקראי 27.
לבסוף, עם המגבלות בשל פיפטה גירוי 7 החבית, פרוטוקול זה יכול להיות גם לשמש לdeorphanizing חדרי ניתוח. כפי שהוזכר קודם לכן, במקרה זה, ניתן לבדוק כמה תערובות odorant. תערובות לעורר תגובה אמורות להיות מחולקות לניחוחי בודד נבדק על תאים אחרים.
על ידי מיקוד OSNs להביע חדרי ניתוח מוגדרים, פרוטוקול זה מספק נתונים רבי עוצמה על אינטראקציות חדרי ניתוח, חדרי ניתוח / ligands, מאפייני מסלול התמרה ולהשוות מאפיינים של אוכלוסיות מוגדרות של OSNs בתנאים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
