Abstract
特異的なリガンドで刺激すると嗅細胞（OSN）の生理的反応を分析する嗅覚主導の行動とその変調の基礎を理解することが重要です。これらの符号化特性は、匂い分子と嗅覚受容体（OR）との間の最初の相互作用に大きく依存OSNsで表されます。表現または重要であるのアイデンティティ、特異性およびリガンドスペクトル。 ORのリガンドを発見する確率は非常に低い上皮内でランダムに選択されたOSNで表されます。この課題に対処するため、このプロトコルは、定義されたORのプロモーターの制御下で蛍光タンパク質GFPを発現する遺伝子タグ付きマウスを使用しています。 OSNsは、隣接するセルは、それらの成熟と機能に影響を与えると、鼻腔ライニングしっかりと組織化上皮に位置しています。ここでは、OSNs eの特性をそのまま嗅上皮を分離し、パッチクランプ記録を介して記録する方法を説明します定義された嗅覚受容体をxpressing。プロトコルは、隣接する組織の影響力を維持しながら一つはOSNの膜特性を特徴付けることができます。パッチクランプ結果の分析は、リガンド/ OR相互作用、伝達経路および薬理学、OSNs 'コードの特性と膜レベルでのそれらの変調の正確な定量化をもたらします。
Introduction
嗅細胞（OSN）は、嗅覚の最初のステップを表しています。げっ歯類で鼻腔を裏打ちする嗅上皮に位置し、彼らは脳にその軸索を介して送信される活動電位への臭気物質の化学情報を変換します。より良い嗅覚符号化メカニズムを理解するためには、OSNsの伝達及び膜特性を特徴付けることが必要です。最近まで、哺乳類OSNsの性質を特徴づけるために使用される技術のほとんどが解離OSNs 1-4で行いました。解離過程は、その環境からOSNsを解放するために、様々な機械的および化学的（ すなわち 、酵素）プロセスを使用しています。これらのプロセスは、記録のために利用可能な細胞の数が少ないを誘導します。この低い数字は、GFP標識細胞の場合にはより一層重要になることがあります。解離もsurvivを高めることができるOSNsと嗅上皮の他の細胞との間の局所細胞と細胞の相互作用を除去しますアルとOSNsのプロパティの調整。解離手順を回避するためには、無傷の製剤は、5開発しました。
各OSNは、大規模な多重遺伝子ファミリーの6から選択される一つの嗅覚受容体（OR）を発現します。マウスの主嗅上皮で発現〜千論理和があります。野生型動物で、または多数の、同一または非常に低い発現をOSNsを記録するための機会のために。これらの制限を克服するために、遺伝子標的化マウスが利用可能であるもので識別されたOR蛍光タンパク質で標識されている7-9表す全てOSNs。これらの標識されたOSNsは、前述の欠点を持つ解離準備7,10,11で機能解析を行うために使用されました。遺伝的に標識されたマウスからの無傷の上皮の準備5は、したがって、これらの問題を回避します。それはviの中に近い環境で正確に定義された論理和を表現OSNsの活動の監視を可能にしますできるだけVO。また、OSNsのパッチクランプ記録は、膜の特性、伝達経路の薬理学、リガンド/ OR相互作用の正確な分析を可能にします。すべてのこれらのトピックはほとんど細胞外記録を用いて分析することはできません。我々は、嗅覚受容体SR1とMOR23 12,13を表現OSNsの応答を監視するには、この技術を使用していました。技術の実現可能性は、ニューロン15,16を表現OSNs 14を発現しているMOR23上の他のグループだけでなく、上の他の論理和により確認されました。 OSNsの定義された集団の監視は17、付臭剤誘起塑性18、及び臭気コーディング15における嗅覚受容体の配列の変異の役割を老化、このような開発14のような多くの異なる状況での特性の分析につながることができます。このプロトコルは、このように、膜レベルで定義されたOSNsの機能的特性を監視するための強力なツールを提供します。
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Protocol
このプロトコルは、大学·デ·ブルゴーニュの動物ケアのガイドラインに従っており、大学·デ·ブルゴーニュの倫理委員会によって承認されました。
1.動物
- ジャクソン研究所で入手可能な遺伝子操作されたOR-IRES-tauGFPマウスを使用してください。これらのマウスは、嗅覚系19の軸索標的と発展を分析するために、ピーター·Mombaerts「研究室で開発されました。例えば、MOR23-IRES-tauGFPライン、在庫数006643は、公式の歪み名B6を負い、129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ。同様に、SR1-IRES-tauGFPライン、在庫数6717は、正式名称のB6を負い、129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJを。
- 動物の年齢について：プロトコルのより良い成果のために、年齢の2および4週間の間、動物を使用しています。この年齢層では、解剖が容易（より柔らかい骨、より強固な嗅上皮）と樹状ノブが双方向であるですgger古い動物と比較します。
電極と溶液の調製
- 刺激ピペットの場合：購入はピペットを刺激prepulled。そうでない場合は、手動でそれらを準備。
- 炎を使用して、先端から約1cmで6、1mmのガラスピペットを曲げます。アイレットによって強化1.5センチメートル熱収縮チューブでこれらの6つのピペットプラスストレート7 番目に挿入します。
- 熱は、互いに取り付けバレルを維持するためのチューブを縮小します。バレルの他の端に追加の熱収縮チューブを取り付けます。マルチバレルプラーで、この刺激ピペットを引き出します。
- 曲がった先端を強化するためにアイレットの周りにいくつかの白い液体接着剤を追加します。ドライO / Nましょう。
- （：; pHは7.6と305 mOsmでのNaCl 124、KClの3、 硫酸マグネシウム1.3、 塩化カルシウム2、NaHCO 3で26、のNaH 2 PO 4 1.25、グルコース15mMの中で）正常なリンガー細胞外溶液の1または2 Lを準備します。 4°Cで保管してください使用するまで。
- （mm表示）細胞内のストック溶液を調製する：KClを70、KOH 53、メタンスルホン酸30、EGTA 5、HEPES 10、ショ糖70。 pHを7.2（KOH）と310ミリオスモル。使用するまで4℃で保管してください。数週間のために良いです。
- 実験前（直前に）即時にナイスタチンを有する細胞内記録液を準備します。
- ナイスタチンの3 mgの計量、DMSOの50μlを添加します。完全に希釈されるまでボルテックス20秒後、2〜3分を超音波処理します。
- 細胞内の原液5mlのDMSO-ナイスタチン溶液20μlを追加します。ボルテックス20秒は、その後3分間超音波処理します。 4℃でこの溶液を維持し、直接光から保護し、ナイスタチンは、光に敏感です。この溶液は、数時間のために使用することができます。毎日交換してください。
- 嗅上皮製剤は、顕微鏡下であると、電極を埋めるために火炎伸長イエローチップで1mlシリンジに、この溶液の一部を取ります。直接光から保護します。 RT、ナイスタチン溶液を一度に安定していません。時間ごとに注射器や氷の中にそれを保持1mlの溶液を交換してください。
- 内部ナイスタチン溶液で15〜20MΩの抵抗と長い首と小さな先端（〜2μm）を得るために、プラーと記録電極を引き出します。
- ヒュームフードの下でDMSO中に0.5 Mで、付臭剤溶液を調製します。アリコートし、使用するまで-20℃で維持します。所望の濃度まで、リンゲル液中の付臭剤を希釈します。刺激ピペットを埋めます。
嗅上皮の調製
注：OR-IRES-tauGFPマウスまたはプロモーターの制御下tauGFPを発現します。これらのマウスでは、関心のORを表す全てのニューロンをGFPで標識されます。このプロトコルは、すべてのゾーンで発現和するように適合されています。しかし、解剖や録音は背側ゾーンで発現論理和のために容易です。
- ケタミンとキシラジンの混合を注入することにより、動物を麻酔（150ミリグラム/ kgおよび10mg / kgのBODY体重、それぞれ）。断頭は、若いマウスに対する鋭いハサミでまたは古いマウスに対する適切に維持げっ歯類ギロチンで行うことができます。
- リング解剖ハサミを使用すると、背側の皮膚を介して長手方向の内側の切開を行います。それを引き離すことにより、皮膚を削除します。はさみを使用して、顎関節に下顎を切りました。歯に冠状カット平行な上部の前歯を削除します。
- 目の後ろの頭の冠状カットを行い、ヘッドのだけ前方部分を保持します。スコープの下で解剖用の氷冷リンゲル液でそれを浸し。
- スコープの下で解剖：腹側に、上顎/歯に沿った長手方向のカットを行います。鼻腔の背側面以下、縦方向に背側骨をカットします。ほとんどの骨と口蓋を削除します。セプタム、室温で酸素化リンガーにそれに接続されている上皮を転送します。
- 最終的な解剖のための：右の記録を開始する前にセッションでは、ピンセットで基本となる隔壁から上皮を引き剥がします。鉗子でとの密着性が強い中隔の前の部分にある2つの4〜5ミリメートルのシザーカット（使用microvannasはさみ）で上皮を外します。
- 慎重中隔上皮への背側の接続に沿ってそれを切断することにより鋤鼻器官を削除します。上向きに粘液層を有する記録チャンバーに上皮を移します。ハープと室内でフラットに保ちます。
- 蛍光光学系と感度カメラを搭載した正立顕微鏡下でチャンバーをインストールします。 40Xの水浸対物レンズ（開口数0.8）と拡大レンズによって達成余分2Xや4X拡大による高倍率でのコンピュータ画面上の準備を可視化します。室温で酸素化リンガー（1-2 ml /分）で連続的に灌流。
4.レコーディングセッション
- 蛍光細胞を検索：480で準備を励起530から550 nmの範囲の光を放射するためのEGFPナノメートル;蛍光と明視野の下で確実に表示されている1樹状ノブをターゲットにしています。
- ナイスタチンと細胞内液と電極を埋めます。そっと電極をタップして気泡を除去。
- 電極ホルダに電極を挿入し、ピペットで正圧を適用します。抵抗は15〜20MΩでなければなりません。
- セルの近くに電極をもたらします。抵抗は〜40MΩに達すると、正圧を解放し、ギガシールに到達するまでのわずかな負圧を適用します。
- シールに到達すると、約-75 mVの膜電位に設定し、
- セルが開かれると、刺激プロトコル、薬理学的治療を進めます。単一の付臭剤の刺激、自発的活動の記録200〜500ミリ秒の応答を測定するために、500ミリ秒のために刺激して、最大10秒13のための細胞の応答を測定します。薬理学的治療については、次の薬剤を灌流所望の濃度20。
5.データ解析
- 以下のように、付臭剤の刺激によって誘発された電流を分析します（ミリ秒での最大振幅の90％に達するのに必要な時間、）最大振幅、立上り時間、合計電流（PASの曲線下面積）、時間を50％に（ミリ秒で開始し、最大振幅の50％で応答オフセットとの間の時間）。
- 描き、ヒル方程式を用いて用量反応曲線をフィット、異なる濃度（最大振幅に達した）ピーク伝達電流を使用する：I = Imaxと/（1 +（K 1/2 / C）N）Iがピーク電流を表します。 、最大応答の半分に達したときのK1 / 2濃度、C付臭剤の濃度とnヒル係数を飽和濃度で最大応答をIMAX。
- 最大脱分極のための電流クランプ、踏太で膜電位の記録を分析しますL電位は（mVsecの曲線下面積）を誘発しました。 30秒〜1分の記録を超えるレコード自発スパイク活動。電流（5-10 pA）での注射によって誘発されたスパイクを介してレコード興奮。
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Representative Results
このプロトコルの結果は、解剖の品質に依存します。この解剖の手順は、（ すなわち、上皮の損傷を避けるために）短い（10〜15分未満）および正確でなければなりません。 図1は、理想的な準備は、異なる倍率レベルでどのように見えるかを示しています。明視野下での低倍率では（例えば、支持細胞OSNsのノブなど）異なる細胞型は区別できる（ 図1A）です。最高倍率レベルでは、典型的には80X 160Xに、明視野で、OSNsの樹状ノブは支持細胞（ 図1B）から明確に区別する必要があります。蛍光灯の下では、唯一の樹状ノブ、GFP標識細胞の繊毛は、（ 図1C）表示されます。 2つの画像を比較することにより、標識された細胞は、記録ピペット（ 図1D）に近づけることができます。
解剖の温度はそれほどリューションと解剖のタイミングが重要です。解剖の最初の部分は、中隔（3.2節3.1.1）の調製は、氷冷溶液中に5から10分以内に行われるべきです。最終的な解剖（3.3）を室温で5分未満を持続させるべき。樹状ノブは上皮の表面の上に浮いて、死んだ細胞に似ている：あまりにも暖かい場合は切開が長すぎる続いた、または解剖溶液中で行われた、準備は常に迅速に損傷を受けそうです。
シールが達成されると、細胞はナイスタチンの影響下で開くと、典型的な電位依存性電流は、（ 図2A）を観察することができます。これらの電流の形状および特性は、セルの状態を監視するために使用することができる：瀕死の細胞内またはシールの質が低下している場合、これらの電流「振幅が減少します。電流クランプ構成下では、活動電位を自発的に記録することができる（ 図2B）または脱分極電流（ 図2C）の注射によって投与することができます。電流注入により誘発される焼成特性は、記録された神経細胞の興奮性を特徴づけます。異なるOSNs「人口の興奮は、（古典周波数とISIの計算を使用して）比較することができます。
異なる臭気物質および/または臭気物質の異なる濃度を装填multibarrelピペットは、圧力放出によって細胞を刺激するために使用することができます。これは、付臭剤誘導される応答を測定することができます。臭気物質および濃度は、ORに応じて選択する必要があります例えばリラールはMOR23、M71、mOREGためオイゲノールためアセトフェノンのリガンドである、目的の細胞内で発現させました。 図3に示した実験では、記録MOR23-IRES-tauEGFPニューロンは図 （電流クランプモード（ 図3A）の下や電圧クランプモードで、リラール、MOR23のリガンドの異なる濃度に回答しましたUREの3B）。電圧クランプモードの録音では、異なる特性を（時間上昇、総電流が誘発等 、最大振幅）電気生理学に古典的に実行されるように応答を定量化するために監視することができます。臭気物質によって誘発される応答の最大振幅を用いて、用量応答をプロットし、Hill式を使用して取り付けることができます。検出閾値、時間的なダイナミック、ダイナミックレンジと飽和レベル：これらの結果は、各OSNの符号化特性に関する情報を提供します。用量応答曲線の例は図3Cに示されています。すべてのこれらの詳細は、集団内の潜在的な不均一性を測定するために、個々のOSNsの間で比較することができます。彼らはまた伴うまたは潜在的な変調および可塑性を測定するための処理を適用しないOSNs間で比較することができます。
図1：健康的な準備の代表的な画像 40X倍率で明視野条件下で観察されたSR1-IRES-tauGFPトランスジェニックマウスの鼻腔から抽出された（A）無傷の嗅上皮。 OSN樹状ノブ（黒矢頭）は支持細胞（SC）とボウマン腺（BG）のメッシュで囲まれています。 （B）明視野条件（白と赤の矢印の頭）で観察OSNsを表現SR1の樹状ノブ。 （C）SR1を発現OSNsの樹状ノブを示す蛍光灯の下で（B）と同じフィールド。 （D）記録ピペット明視野下でSR1発現OSNに近づきます。赤い矢印が（ - D B）で同じSR1のOSNを表します。スケールバー：5μmです。
図2：プロトコルを用いて得られた代表的な膜特性結果：SR1-IRES-tauGFP OSNの樹状ノブ上のパッチクランプ記録 +40に膜電位-67 mVのから脱分極ステップを増加させることによって誘発（A）電位依存性電流mVに。電流クランプの設定で記録（B）自発活性;活動電位は、15秒の記録エポック中に観察することができます。 7 pAの興奮電流によって誘発される（C）活動電位。このプロトコルは、細胞の興奮性に関する情報を提供します。
図3：MOR23-IRES-tauEGFPニューロンにおける臭気物質誘導される応答の代表例リラール、MOR23受容体のリガンドの濃度を増加させる、電流クランプ（A）に、電圧クランプ（B）の両方において増加する応答を誘導します。膜電位を-67 mVので固定しました。アセトフェノンの濃度を増加し、ヒルの式を装着に応じ三M71ニューロンで取得個々の用量-応答曲線の（C）の例。
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Discussion
正しく健全なOSNsの特性を監視するために、このプロトコルの能力は、製剤の品質に大きく依存します。したがって、解剖の手順は非常に重要です。最初に、解剖媒体の質（pHは、浸透圧）、酸素および温度（氷のように冷たいが、凍結していない）に注意を払うことが重要です。第二に、解剖ツールと上皮の操作は、損害を回避することができるように制限する必要があります。最後に、可能な限り最大のOSN集団にアクセスするために、できるだけ平坦製剤を得ることが重要です。
解剖の質は、健康な準備を得ることが基本です。しかし、異なるアプローチが解剖のために使用することができます。ここでは解剖を背ために腹を提示するが、一部のユーザーは、急速に鼻腔を開き、嗅上皮の中隔の凹部への迅速なアクセスを持つように解剖背を開始することを好むことができます。各ユーザーは、従ってPRを適応させることができます関心領域の健全な準備に到達するための最も効率的な戦略のotocol。
準備が顕微鏡下になると、準備の健康の永久モニタリングが必要です。実際、不健康な準備がギガシールに到達するために低い確率につながります。 gigasealsを得るために低効率はより健康OSNsを見つけるために準備に関心領域を変更することによって改善することができます。より抜本的な解決策は、新しいものに完全に準備を交換することです。シールが達すると、「開いた」状態に到達する低い確率を行うことができます。これは、内部液の品質に起因する可能性があります。内部液は、実験直前に準備する必要があります。ナイスタチンの溶解度がかなり低いため渦超音波処理の使用が重要です。開口の確率を改善するために、内部溶液を再び10秒間ボルテックスし、次いで30〜60秒間超音波処理されるべきです。この有珠山味方は、セルの開口部の効率を向上させることができます。
ニオイ物質と記録されたOSNを刺激するために、提示されたプロトコルは、7バレル刺激ピペットを使用しています。ピペットのこのタイプは、臭気物質および/または7に記録された各細胞に対して試験臭気物質の濃度の数に制限することを意味します。これは濃度の7対数単位までカバーできるので、この制限は、用量応答曲線の場合には比較的重要ではありません。しかし、異なる臭気物質が試験されるスクリーニング実験の場合には、7バレルピペットは限界を示してもよいです。スクリーニング実験では、目標は、孤児ORを表すラベル付きOSNsのリガンドを見つけることです。このプロトコルを使用すると、付臭剤の混合物の使用を必要とします。応答を誘発する各混合物は、次いで、個々の臭気物質に分割されます。これはOSNs 16 TAAR発現にアミン臭気物質をスクリーニングするために行きました。これらの実験では、蛍光ニューロンはTAARsを表明し、リガンドはUNKましたノウン。プロトコルを使用して、著者らは、混合物中のアミン臭気物質の数十をスクリーニングすることができます。応答を誘発するそれらの混合物は、次いで、最も効率的なリガンドを見つけるために、単一の臭気物質に分解されました。
記録部位と刺激ピペットとの間の距離は、セル20の機械的刺激を最小限にするために賢明に選択されるべきです。圧力および/または（20ミクロン以下）が小さすぎるの距離（30私たちの記録条件におけるPSI以上）が高すぎると、いくつかのOSNsでの機械的応答があっても、臭気物質応答をマスクすることができます。パフピペットと記録部位との間の圧力との距離も刺激中の溶液交換を制御することが重要です。ニューロンに達する濃度は、以前のテスト13は一連のピペット内に存在する濃度にできるだけ近くなるように評価しました。これらの試験は、発症を測定するために、青色染料で着色した溶液を使用し、Tのオフセット彼は、刺激します。 20 psiの圧力と30μmの距離を使用して、刺激の最大強度は、300ミリ秒以内に到達しました。刺激のオフセットも慎重に評価した。準備は灌流液の連続的な流れの下であるため、刺激が0.8から0.9秒13内で洗浄しました。
OSNsの特性を符号化する臭気は、歴史的に、in vivoで細胞外記録を介して、または単離された細胞の実験のいずれかを介して測定しました。哺乳動物において、細胞外記録は、ラット21においてインビボで最初に行きました。細胞外記録で、ORは、このように試験された付臭剤に応答する細胞を見つけるために、成功率を制限未知の記録細胞内で発現しました。プロトコルは、上皮の細胞環境におけるニューロンでの記録と定義された受容体の特徴付けを可能にします。受容体のプロパティは、したがって、異なるレベルで分析することができる。特定のリガンドを伝達経路の最初のステップ中/または相互作用。試験された多様なリガンドの結果として、アゴニスト/アンタゴニストの相互作用;混合物の定義されたORの統合とOSNs「特異性の伝達経路の役割の性質;上皮内（例えば、ギャップジャンクションのような）細胞と細胞の相互作用の嗅覚符号化の影響。そして最終的に薬剤を使用して伝達経路の調節。
解離細胞記録では、前述したように、解離過程は、粘液と嗅上皮内の細胞と細胞の相互作用を削除します。これはOSNsのコーディング特性の変化を誘導し得ます。単離された細胞のカルシウムイメージング実験が頻繁に報告されました。例えば、アセトフェノンに応答OSNsを発現するM71の用量反応曲線は、7に報告されました。これらの用量応答曲線は、プロトコルを使用して得られた用量 - 応答曲線よりも急勾配でありますここ4を発表しました。これらの不一致は、無傷の準備で細胞間相互作用に起因し、また、単離された細胞中の粘液を除去することができます。粘液は、嗅覚伝達22,23の基本perireceptor事象に関与する多くのタンパク質および酵素を含むことが知られています。プロトコルは、ここで報告では、嗅上皮の構造の保全と粘液の推定存在がOSNsに付臭剤のコーディングのネイティブな機能を維持するために貢献しています。プロトコルで使用される濃度は、モル/ Lで示され、通常は10 -7〜10 -3の範囲にされています。これらの濃度は、空気段階的記録（ローカルフィールド電位または細胞外記録中）に使用される濃度よりも高いです。これらの不一致は、i）が原因である（したがって）刺激の記録の液相と可能性がありますII）録音時の灌流による粘液の遅いウォッシュアウト。実際には、MUCの洗い出し当方、解剖時のOSNs「軸索のセクションには、提示の準備が潜在的に「擬似無傷」ではなく「完全に無傷」の準備として認定することをサポートすることができます。この調製は、しかし、可能な限り生体内での近くに、まだ引き出す記録条件パッチクランプ記録を表します。哺乳類生物からの任意のインビトロ準備として、生存は時間が制限されたままです。この制限は、粘液の洗い出し、OSNs「軸索のセクションと同様に調製物内の血液循環の欠如に起因している可能性があります。
ここで紹介するプロトコルは1つが嗅細胞の膜特性を記録することができます。この技術は、OSNsの膜特性の解析、OSNsの薬理学的研究、OSNsの付臭剤符号化特性の変調、およびORの脱オーファン化など、複数のアプリケーションを持つことができます。カルシウムイメージング中に記録されたイベントは、SLOwおよび長期的な。膜レベルでの嗅覚伝達経路の急速なイベントに関するデータに存在するプロトコルリードでパッチクランプ記録。
ここに提示記録は、パッチクランプの設定で実行されます。この構成では、記録された細胞の膜特性は、嗅覚伝達経路の機械または関与する電位依存性電流であるかどうかを分析することができます。このプロトコルを使用した実験は、OSNsの付臭剤のコーディング特性の変調についてのデータを提供することができます。薬剤は、異なる条件で嗅覚伝達を研究するために使用することができる：例えば、MDL12330A、アデニル酸シクラーゼIII（ACIII）24,25の遮断薬は、臭気物質応答におけるACIIIの役割を調査するために灌流液に適用することができます。さらに、このプロトコルは、符号化の特性は、例えば、嗅覚環境などの異なる条件で変調される方法嗅覚調査するために使用することができます<SUP> 18や行動26の供給に関与するホルモンの影響下。最後に、このプロトコルはまた、リガンド相互作用についてのOR /データにつながると定義された和に、あるいはランダムに選択された受容体27にアゴニスト/アンタゴニスト活性を解読することができます。
最後に、ピペットを刺激7バレルによる制限が、このプロトコルは、論理和をdeorphanizingために使用することができます。この場合、前述のように、いくつかの臭気物質の混合物を試験することができます。応答を誘発する混合物は、他の細胞でテストされ、個々の臭気物質に分割する必要があります。
定義された論理和を表現OSNsを標的とすることによって、このプロトコルは、論理和、リガンド/の論理和の相互作用、伝達経路のプロパティについての強力なデータを提供し、異なる条件でOSNsの定義された集団の特性を比較します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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