Abstract
Analizando las respuestas fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) cuando son estimuladas con ligandos específicos es fundamental para entender la base de comportamientos-olfativas impulsada y su modulación. Estas propiedades de codificación dependen en gran medida de la interacción inicial entre las moléculas de olor y el receptor olfatorio (OR) expresados en las OSN. El espectro de la identidad, la especificidad y el ligando de la O expresado son críticos. La probabilidad de encontrar el ligando de la O expresado en una OSN elegido al azar dentro del epitelio es muy baja. Para hacer frente a este reto, este protocolo utiliza genéticamente ratones etiquetados que expresan la proteína fluorescente GFP bajo el control del promotor de RUP definidos. OSNs se encuentran en un epitelio apretado y organizada que recubre la cavidad nasal, con las células vecinas influir en su maduración y función. Aquí se describe un método para aislar un epitelio olfatorio intacto y grabar a través de patch-clamp grabaciones las propiedades de OSN correoXpressing receptores de olor definidas. El protocolo permite que uno para caracterizar propiedades de la membrana OSN mientras se mantiene la influencia del tejido vecino. Análisis de los resultados de patch-clamp produce una cuantificación precisa de ligando / O interacciones, las vías de transducción y la farmacología, las propiedades de codificación OSN y de su modulación a nivel de la membrana.
Introduction
Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) representan el primer paso de la percepción olfativa. Situado en el epitelio olfativo que recubre la cavidad nasal en roedores, transforman la información química de los odorantes en los potenciales de acción se ha enviado a través de su axón al cerebro. Para entender mejor los mecanismos de codificación olfativas, es necesario para caracterizar las propiedades de transducción y de membrana de OSN. Hasta hace poco, la mayoría de las técnicas utilizadas para caracterizar las propiedades de OSN mamíferos se llevaron a cabo en disociado OSN 1-4. El proceso de disociación utiliza varios (es decir, enzimas) procesos mecánicos y químicos para liberar a los OSNs de su entorno. Estos procesos provocan un bajo número de células disponibles para las grabaciones. Este número bajo puede ser aún más crítico en el caso de células GFP marcado. La disociación también elimina los locales interacciones célula a célula entre OSN y otras células del epitelio olfativo que pueden mejorar survivcol y la modulación de las propiedades OSN. Con el fin de eludir el procedimiento de disociación, una preparación intacta fue desarrollado 5.
Cada OSN expresa un receptor olfativo (OR) seleccionado de una gran familia multigénica 6. Hay ~ 1000 RUP expresadas en el epitelio olfativo principal en el ratón. Debido a la gran cantidad de O en los animales de tipo salvaje, las posibilidades para grabar OSN que expresan el mismo o son muy bajas. Para superar estas limitaciones, los ratones de genes dirigidos están disponibles en el que todos OSN expresan un identificadas o están etiquetados con una proteína fluorescente 7-9. Estos OSN marcadas se usan para hacer el análisis funcional en preparaciones disociadas 7,10,11 con los inconvenientes mencionados anteriormente. Una preparación epitelio intacto 5 de ratones genéticamente etiquetados por lo tanto, evita estos problemas. Permite el seguimiento de la actividad de OSN expresando RUP definidas con precisión en un entorno tan cerca en vivo posible. Además, patch-clamp grabaciones de OSN también permiten un análisis preciso de las propiedades de membrana, vía de transducción de la farmacología, ligando / O interacciones. Todos estos temas casi no se pueden analizar usando grabaciones extracelulares. Se utilizó esta técnica para controlar las respuestas de OSN que expresan los receptores de olor SR1 y MOR23 12,13. La viabilidad de la técnica fue confirmado por otros grupos en MOR23 expresan OSN 14, así como en otras regiones ultraperiféricas que expresan neuronas 15,16. El seguimiento de una población definida de OSN puede conducir al análisis de sus propiedades en muchos contextos diferentes, tales como el desarrollo 14, el envejecimiento 17, plasticidad inducida odorante 18, y el papel de las variaciones en la secuencia del receptor de odorizantes de olor en la codificación de 15. Así, este protocolo proporciona una poderosa herramienta para controlar las propiedades funcionales de OSN definidos a nivel de la membrana.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices de cuidado de los animales de la Université de Bourgogne y fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Bourgogne.
1. Los animales
- Utilice ratones O-IRES-tauGFP ingeniería genética disponibles en el Laboratorio Jackson. Estos ratones fueron desarrollados en el laboratorio del Dr. Peter Mombaerts 'con el fin de analizar la orientación axón y el desarrollo del sistema olfativo 19. Por ejemplo, la línea MOR23-IRES-tauGFP, código RS 006643, lleva el nombre de la cepa B6 oficial; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; del mismo modo, la línea SR1-IRES-tauGFP, código RS 6717 lleva el nombre B6 oficial; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
- En cuanto a la edad de los animales: para un mejor resultado del protocolo, utilizar animales entre 2 y 4 semanas de edad. En este grupo de edad, la disección es más fácil (huesos más blandos, más firme epitelio olfativo) y las perillas dendríticas son bigger comparar a los animales más viejos.
2. Preparación de electrodos y Soluciones
- Para las pipetas estimulantes: compra prepulled estimular pipetas. De lo contrario, preparar manualmente.
- El uso de una llama, doble seis 1 mm pipetas de vidrio en alrededor de 1 cm de la punta. Inserte estos seis pipetas más unas rectas 7 º en 1,5 cm tubo de aislamiento fortalecer por un ojal.
- Termocontraíbles el tubo para mantener los barriles unidos juntos. Adjuntar un tubo de aislamiento adicional a la otra extremidad de los barriles. Tire de esta pipeta estimulante con un extractor de múltiples barril.
- Añadir un poco de pegamento líquido blanco alrededor del ojal para fortalecer las puntas dobladas. Deje secar O / N.
- Preparar 1 o 2 litros de solución extracelular normal del timbre (en mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH 2 PO 4 1,25, glucosa 15; pH 7.6 y 305 mOsm). Mantenga a 4 ° Chasta su uso.
- Preparar solución madre intracelular (en mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanosulfónico 30, EGTA 5, HEPES 10, sacarosa 70; pH 7,2 (KOH) y 310 mOsm. Mantenga a 4 ° C hasta su uso. Bueno para varias semanas.
- Prepare la solución intracelular de grabación con nistatina extemporáneamente (a última hora) antes de experimento.
- Pesar 3 mg de nistatina, añadir 50 l de DMSO; vórtice 20 seg después sonicar 2-3 min hasta diluido por completo.
- Añadir 20 l de solución de DMSO-nistatina en 5 ml de solución madre intracelular. Vortex 20 seg, después sonicar 3 min. Mantener esta solución a 4 ° C y proteger de la luz directa, nistatina es sensible a la luz. Esta solución se puede usar durante unas pocas horas. Vuelva a colocar todos los días.
- Una vez que la preparación epitelio olfativo está bajo el microscopio, tomar parte de esta solución en una jeringa de 1 ml con una punta amarilla llama alargada para rellenar los electrodos; protegerlo de la luz directa. Una vez a temperatura ambiente, la solución de nistatinano es estable; sustituir la solución en la jeringa de 1 ml cada hora o mantenerlo en hielo.
- Tire de electrodos de grabación con un extractor para obtener cuello largo y pequeña propina (~ 2 m) con una resistencia de 15 a 20 mO con la solución de nistatina interna.
- Prepare la solución odorante en 0,5 M en DMSO bajo campana de humos; alícuota y mantenerse a -20 ° C hasta su uso. Diluir odorante en solución de Ringer hasta la concentración deseada. Llenar la pipeta estimulante.
3. Preparación de epitelio olfativo
Nota: los ratones O-IRES-tauGFP expresan la tauGFP bajo el control de la O promotor. En estos ratones, todas las neuronas que expresan el OR de interés están etiquetados con las buenas prácticas agrarias. Este protocolo está adaptado para RUP expresadas en todas las zonas. Sin embargo, disecciones y grabaciones son más fáciles para las RUP expresadas en la zona dorsal.
- Anestesiar al animal mediante la inyección de una mezcla de ketamina y xilazina (150 mg / kg y 10 mg / kg de DBOpeso y, respectivamente). Decapitación puede realizarse con unas tijeras afiladas para ratones jóvenes o con una guillotina roedor adecuadamente mantenido para los ratones de más edad.
- Usando anillo tijeras de disección hacen una incisión medial longitudinal a través de la piel dorsal. Quitar la piel tirando de él aparte. Usando las tijeras, corte la mandíbula inferior en la articulación de la mandíbula. Retire los dientes frontales superiores por un corte coronal paralela a los dientes.
- Haga un corte coronal de la cabeza detrás de los ojos y mantener sólo la parte anterior de la cabeza. Sumergir en solución de Ringer helada para la disección en el ámbito.
- Diseccionar bajo el ámbito de aplicación: en la parte ventral, hacer un corte longitudinal a lo largo de la mandíbula superior / los dientes. Cortar los huesos dorsales longitudinalmente, siguiendo el lado dorso-lateral de la cavidad nasal. Retire la mayoría de los huesos y el paladar; transferir el tabique y el epitelio que se le atribuye en Ringer oxigenada a TA.
- Para la disección definitiva: Justo antes de comenzar la grabaciónsesión, pelar lejos el epitelio del tabique subyacente con fórceps. Separe el epitelio con pinzas y con dos 4-5 mm cortes de tijera (uso microvannas tijeras) en la parte anterior del tabique, donde la adherencia es más fuerte.
- Retirar con cuidado el órgano vomeronasal por el corte a lo largo de su conexión dorsal al epitelio septal. Transferir el epitelio a una cámara de grabación con la capa de moco hacia arriba; mantenga plana en la cámara con un arpa.
- Instalar cámara bajo un microscopio vertical equipado con óptica de fluorescencia y una cámara sensible. Visualice la preparación en la pantalla del ordenador a gran aumento a través de un 40X objetivo de inmersión en agua (apertura numérica 0,8) y una ampliación 2X o 4X adicional alcanzado por una lente de aumento. Perfundir continuamente con Ringer oxigenada a TA (1-2 ml / min).
4. Grabación Sesión
- Búsqueda de células fluorescentes: excitar a la preparación a 480nm para EGFP, que emite luz en el rango de 530 a 550 nm; orientar una perilla dendríticas que es visible de forma fiable en la fluorescencia y bajo campo brillante.
- Llenar electrodo con solución intracelular con nistatina; eliminar las burbujas golpeando suavemente sobre el electrodo.
- Inserte electrodo sobre soporte del electrodo, aplique presión positiva en la pipeta; La resistencia debe ser 15-20 mO.
- Traiga electrodo cerca de la célula; una vez que la resistencia alcanza ~ 40 mO, liberar la presión positiva y aplicar una ligera presión negativa para llegar a un gigaseal.
- Una vez que se alcanza el sello, configure el potencial de membrana en alrededor de -75 mV;
- Una vez que se abre la celda, proceder con protocolos de estimulación, tratamientos farmacológicos. Para medir la respuesta a una sola estimulación odorante, ficha 200-500 mseg de la actividad espontánea, para estimular 500 mseg y medir la respuesta de la célula para un máximo de 10 seg 13. Para los tratamientos farmacológicos, perfundir los agentes farmacológicos enla concentración deseada 20.
Análisis 5. Datos
- Analizar las corrientes provocados por la estimulación odorante como sigue: la amplitud máxima, el tiempo de subida (tiempo necesario para alcanzar el 90% de la amplitud máxima, en mseg), la corriente total (área bajo la curva en PAS), el tiempo en el 50% (tiempo entre el inicio y el desplazamiento de la respuesta al 50% de la amplitud máxima, en mseg).
- El uso de las corrientes de pico de transducción (amplitud máxima alcanzada) a diferentes concentraciones, dibujar y ajustar una curva dosis-respuesta utilizando la ecuación de Hill: I = Imax / (1 + (K medio / C) n), donde I representa la corriente máxima IMAX la respuesta máxima a concentraciones de saturación, K1 / 2 la concentración a la que se llegó a la mitad de la respuesta máxima, C la concentración de odorante y n el coeficiente de Hill.
- Analizar las grabaciones de potencial de membrana en pinza de corriente para la despolarización máxima, la total potencial suscitó (área bajo la curva en mVsec); registro de actividad clavar espontánea durante 30 seg a 1 min grabaciones; registro de la excitabilidad través picos provocados por la inyección de corrientes (10.5 Pa).
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Representative Results
El resultado de este protocolo depende de la calidad de la disección. Estos pasos de disección deben ser cortos (menos de 10 a 15 min) y preciso (es decir, para evitar daños del epitelio). La Figura 1 ilustra cómo una preparación ideal se parece a diferentes niveles de aumento. Con una ampliación baja en campo claro los diferentes tipos de células (tales como perillas de OSN, el apoyo a las células) son distinguibles (Figura 1). En el nivel de ampliación más alta, normalmente 80X a 160X, en campo claro, las perillas dendríticas de las OSN deben distinguirse claramente de las células de soporte (Figura 1B). Bajo la luz fluorescente, sólo las perillas dendríticas y los cilios de las células GFP etiquetados son visibles (Figura 1C). Al comparar las 2 imágenes, las células marcadas pueden ser abordados con la pipeta de grabación (Figura 1D).
La temperatura de la disección por lolución y el momento de la disección son críticos. La primera parte de la disección, la preparación del tabique (sección 3.1.1 a 3.2) debe llevarse a cabo dentro de 5 a 10 min en solución enfriada con hielo. La disección final (3.3) debe durar menos de 5 min a temperatura ambiente. En caso de que la disección se prolongó durante demasiado tiempo, o se realizó en solución disección demasiado caliente, la preparación invariablemente se ve dañada rápidamente: perillas dendríticas están flotando encima de la superficie del epitelio, y se asemejan a las células muertas.
Una vez que se alcanza un sello y la célula se abre bajo los efectos de la nistatina, las corrientes típicas voltaje cerrados pueden ser observadas (Figura 2A). La forma y características de estas corrientes se pueden utilizar para controlar la salud de la célula: en una célula que muere o si la calidad de la junta está disminuyendo, la amplitud de estas corrientes 'disminuirá. Bajo la configuración de pinza de corriente, potenciales de acción se pueden grabar, ya sea de forma espontánea (Figura 2B) o por inyección de una corriente de despolarización (Figura 2C). Las propiedades de cocción inducidas por inyección de corriente caracterizan la excitabilidad de la neurona registrada. La excitabilidad de población diferentes OSN 'se puede comparar (con frecuencia clásica y cálculos ISI).
Una pipeta de tubos múltiples cargado con distintas sustancias odoríferas y / o diferentes concentraciones de sustancias odoríferas se puede utilizar para estimular las células de eyección por presión. Esto permite medir las respuestas inducidas odorantes. Los olores y concentraciones deben elegirse en función de la O expresado en la célula de interés, por ejemplo liral es el ligando para MOR23, acetofenona para M71, eugenol para mOREG. En el experimento ilustrado en la Figura 3, las neuronas MOR23-IRES-tauEGFP grabadas respondieron a diferentes concentraciones de liral, un ligando para MOR23, en el modo de abrazadera de corriente (Figura 3A) o en el modo de fijación de voltaje (Fig3B URE). En las grabaciones del modo de abrazadera de tensión, características diferentes pueden ser monitoreados para cuantificar la respuesta (amplitud máxima, aumentando los tiempos, corriente total suscitó, etc.) Que realiza clásicamente en electrofisiología. Uso de la amplitud máxima de la respuesta inducida odorante-, dosis-respuesta se puede trazar y equipado utilizando la ecuación de Hill. Estos resultados proporcionan información sobre las propiedades de codificación de cada OSN: umbral de detección, dinámica temporal, rango dinámico y nivel de saturación. Ejemplos de curvas de dosis-respuesta se muestran en la Figura 3C. Todos estos detalles se pueden comparar entre OSN individuales para medir la heterogeneidad potencial dentro de una población; que también pueden compararse entre OSN con o sin aplicación de un tratamiento para medir la modulación de potencial y la plasticidad.
Figura 1: Imágenes representativas de una preparación saludable (A) epitelio olfativo Intacto extraído de la cavidad nasal de un ratón transgénico SR1-IRES-tauGFP observada bajo condición de campo brillante en la magnificación de 40X.. OSN perillas dendríticas (cabezas de flecha negro) están encerrados en una malla de células de soporte (SC) y las glándulas de Bowman (BG). (B) perillas dendríticas de SR1 expresando OSN observados bajo condición de campo brillante (cabezas de flecha blanca y roja). (C) El mismo campo como en (B) bajo una luz fluorescente que muestra perillas dendríticas de SR1 OSN expresan. (D) de la pipeta de grabación acercarse a una OSN SR1 expresan bajo campo claro. La punta de flecha roja representa la misma SR1 OSN en (B - D). Barra de escala: 5 micras.
Figura 2: representativos propiedades de la membrana resultados obtenidos con el protocolo:. Patch-clamp grabaciones en la perilla dendríticas de un SR1-IRES-tauGFP OSN corrientes de tensión cerrada (A) provocados por el aumento de pasos de despolarización de la membrana potencial de -67 mV a +40 mV. (B) La actividad espontánea registrado en la configuración de pinza de corriente; potenciales de acción se pueden observar durante la época de grabación de 15 segundos. (C) potenciales de acción provocados por una corriente excitatoria 7 pA; este protocolo proporciona información acerca de la excitabilidad de la célula.
Figura 3:. Los ejemplos representativos de respuestas inducidas por odorantes en una neurona MOR23-IRES-tauEGFP concentraciones crecientes de liral, un ligando del receptor de MOR23, inducen el aumento de las respuestas tanto en la pinza de corriente (A) y en la abrazadera de tensión (B). El potencial de membrana se sujetó a -67 mV. (C) Ejemplos de curvas de dosis-respuesta individuales adquiridos en tres neuronas M71 en respuesta a concentraciones crecientes de acetofenona y equipados con la ecuación de Hill.
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Discussion
La capacidad de este protocolo para controlar correctamente las propiedades de OSN saludables depende en gran medida de la calidad de la preparación. Por lo tanto, los pasos de disección son críticos. En primer lugar, es crítico que prestar atención a la calidad (pH, osmolaridad), la oxigenación y la temperatura del medio de disección (pero no congelado enfriado con hielo). En segundo lugar, la manipulación del epitelio con herramientas de disección debe ser tan limitado como sea posible para evitar daños. Por último, es crítico para obtener una preparación lo más plana posible con el fin de acceder a la mayor población OSN como sea posible.
La calidad de la disección es fundamental para obtener una preparación saludable. Sin embargo, diferentes enfoques pueden ser utilizados para la disección: Aquí presentamos un ventral a dorsal disección pero algunos usuarios pueden preferir para iniciar el dorsalmente disección para abrir la cavidad nasal rápidamente y tienen un rápido acceso a la cavidad septal del epitelio olfativo. Cada usuario puede, por tanto, adaptar el protocol para la estrategia más eficiente para alcanzar una preparación saludable de la zona de interés.
Una vez que la preparación es bajo el microscopio, se requiere un control permanente de la salud de la preparación. De hecho, una preparación poco saludable conduce a una baja probabilidad de llegar a un gigaseal. Una baja eficiencia en la obtención de gigaseals se puede mejorar cambiando el área de interés en la preparación con el fin de encontrar OSN saludables. Una solución más drástica es reemplazar la preparación en su totalidad por uno nuevo. Una vez que se alcanza el sello, una baja probabilidad de alcanzar el estado "abierto" puede tener lugar. Esto puede ser debido a la calidad de la solución interna. La solución interna tienen que prepararse poco antes del experimento. El uso de vórtice y sonicación son críticos ya que la solubilidad de nistatina es más bien baja. Para mejorar la probabilidad de apertura, la solución interna debe agitó en vórtex de nuevo durante 10 segundos y luego se sometió a ultrasonidos durante 30 a 60 seg. Esta usualiado mejora la eficiencia de la apertura de las celdillas.
Estimular la OSN grabado con odorantes, el protocolo presentado utiliza una pipeta estimular 7 barril. Este tipo de pipeta implica una limitación en el número de sustancias odoríferas y / o concentración de sustancias odoríferas probados en cada uno células grabadas a siete. Esta limitación es relativamente no significativo en el caso de una curva de respuesta a la dosis ya que puede cubrir hasta 7 unidades log de la concentración. Sin embargo, en el caso de experimentos de selección, en el que diferentes sustancias olorosas son probados, una pipeta siete barril puede mostrar limitaciones. En el cribado experimentos, el objetivo es encontrar un ligando para OSN marcadas que expresan un huérfano OR. El uso de este protocolo requerirá el uso de mezclas odorantes. Cada mezcla de provocar una respuesta será entonces dividida en odorantes individuales. Esto se realiza para detectar olores de amina en TAAR expresando OSN 16. En estos experimentos, las neuronas fluorescentes expresaron TAAR y el ligando era unknown. Utilizando el protocolo, los autores pudieron detectar varias decenas de olores de amina en mezclas. Las mezclas que suscitan una respuesta fueron analizados a continuación a odorantes individuales a fin de encontrar el ligando más eficiente.
La distancia entre el sitio de la grabación y la estimulación de la pipeta debe ser elegido sabiamente con el fin de minimizar la estimulación mecánica de la célula 20. Si la presión es demasiado alta (por encima de 30 psi en nuestras condiciones de grabación) y / o la distancia demasiado pequeña (por debajo de 20 micras), la respuesta mecánica en algunos OSN incluso puede enmascarar la respuesta odorante. La presión y la distancia entre la pipeta resoplando y el sitio de grabación también son críticos para controlar el intercambio de solución durante la estimulación. La concentración de llegar a la neurona se evaluó previamente a estar tan cerca como sea posible a la concentración presente en la pipeta a través de una serie de pruebas 13. Estas pruebas utilizan una solución de color con colorante azul para medir el inicio y el desplazamiento de tque la estimulación. El uso de presión 20 psi y 30 micras distancia, se alcanzó la intensidad máxima del estímulo dentro de los 300 mseg. El desplazamiento del estímulo también fue cuidadosamente evaluados: desde la preparación está bajo flujo continuo de solución perfundidos, el estímulo se lavó en el plazo de 0,8 a 0,9 seg 13.
La propiedades de OSN codificación de olores se midieron históricamente ya sea a través de grabaciones extracelulares en vivo oa través de experimentos en células aisladas. En los mamíferos, las grabaciones extracelulares se realizaron a primera in vivo en ratas 21. En grabaciones extracelulares, el OR expresa en la célula grabada es desconocido limitando de este modo la tasa de éxito para encontrar una célula de responder a la odorante probado. El protocolo permite la grabación y la caracterización de los receptores definidos en las neuronas en el entorno celular del epitelio. Por lo tanto, las propiedades de los receptores pueden ser analizados en los diferentes niveles: el ligando específico/ o interacciones durante el primer paso de la vía de transducción; en consecuencia, el agonista / antagonista interacciones de diversos ligandos ensayados; las propiedades de integración mezclas de RUP definidos y el papel de la vía de transducción de la especificidad OSNs '; la influencia en la codificación olfativa de célula a célula interacciones (como unión GAP) en el epitelio; y, finalmente, la modulación de la vía de transducción utilizando agentes farmacológicos.
En las grabaciones de células disociadas, como se mencionó anteriormente, el proceso de disociación elimina el moco y las interacciones de célula a célula en el epitelio olfativo. Esto puede inducir cambios en las propiedades de codificación de los OSN. Se informaron con frecuencia experimentos de imagen de calcio en las células aisladas. Por ejemplo, se notificaron las curvas de dosis-respuesta de M71 expresar OSN en respuesta a acetofenona 7. Estas curvas de dosis-respuesta son más pronunciada que las curvas de dosis-respuestas obtenidas utilizando el protocoloque aquí se presenta 4. Estas discrepancias pueden deberse a las interacciones de célula a célula en la preparación intacta y también a la eliminación de moco en las células aisladas. El moco se sabe que contiene muchas proteínas y enzimas que participan en eventos perireceptor fundamentales para la transducción olfativa 22,23. En el protocolo informó aquí, la preservación de la estructura del epitelio olfativo y la presencia putativo de la mucosidad contribuyen a preservar las características nativas de codificación odorante en OSN. Las concentraciones utilizadas en el protocolo se indican en mol / L y por lo general están en el rango de 10 -3 -7 -10. Estas concentraciones son más altas que las concentraciones utilizadas en las grabaciones de aire por etapas (ya sea en el potencial de campo local o grabaciones extracelulares). Estas discrepancias pueden ser debido a i) la fase líquida de las grabaciones (y por tanto de la estimulación) y ii) el lento de lavado de la mucosa por la perfusión durante las grabaciones. De hecho, el lavado de los mucnosotros y la sección de los axones de las OSN 'durante la disección podemos apoyar que la preparación será presentado potencialmente calificó como una "pseudo-intacta" en lugar de una preparación "completamente intacta". Esta preparación representa, sin embargo, las condiciones de grabación lo más cerca posible in vivo como sea posible y, sin embargo desencadenantes patch-clamp grabaciones. Como cualquier preparación in vitro de un organismo de los mamíferos, la supervivencia sigue siendo limitado en el tiempo. Este límite puede ser debido a la de lavado de la mucosa, la sección de los axones OSN ', así como la ausencia de circulación de la sangre dentro de la preparación.
El protocolo presentado aquí permite grabar propiedades de la membrana de las neuronas sensoriales olfativas. Esta técnica puede tener múltiples aplicaciones tales como análisis de propiedades de la membrana de la OSN, investigaciones farmacológicas de OSN, la modulación de las propiedades de codificación de olor de OSN y deorphanization de RUP. Los acontecimientos registrados durante imágenes de calcio se SLOw y de larga duración. Patch-clamp grabaciones en el presente protocolo de plomo a los datos sobre los eventos rápidos en vía de transducción olfativa a nivel de la membrana.
Las grabaciones que se presentan aquí se llevan a cabo en la configuración de patch-clamp. En esta configuración, las propiedades de la membrana de la célula registrados pueden analizarse, si se trata de la maquinaria de vía de transducción olfativa o las corrientes de voltaje cerrados involucrados. Los experimentos utilizando este protocolo pueden proporcionar datos sobre la modulación de las propiedades de OSN codificación odorante. Los agentes farmacológicos pueden ser utilizados para investigar la transducción de olfativo en diferentes condiciones: por ejemplo, MDL12330a, un bloqueador de la adenilato ciclasa III (ACIII) 24,25 se puede aplicar en la solución de perfusión para investigar el papel de ACIII en una respuesta odorante. Además, este protocolo se puede utilizar para investigar cómo olfativo propiedades de codificación se modulan en diferentes condiciones, tales como el medio ambiente olfativo <sup> 18 o bajo la influencia de las hormonas implicadas en los comportamientos de alimentación 26. Por último, este protocolo también puede conducir a datos sobre la interacción O / ligando y descifrar / actividades antagonistas agonistas en RUP definidos o incluso en receptores seleccionados en forma aleatoria 27.
Finalmente, con las limitaciones debidas a la pipeta estimular 7 barril, este protocolo se puede también utilizar para deorphanizing RUP. Como se mencionó anteriormente, en este caso, varias mezclas de odorantes pueden ser probados. Mezclas que suscitan una respuesta deben entonces dividir en odorantes individuales probados en otras células.
Al dirigirse a OSN expresando RUP definidos, este protocolo proporciona datos de gran alcance sobre las RUP, ligandos / OR interacciones, propiedades de la vía de transducción y comparar las propiedades de las poblaciones definidas de OSN en diferentes condiciones.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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