Aplicando a técnica de injecção estereotáxica para estudar os efeitos genéticos sobre os comportamentos animais

Summary

Injecção estereotáxica de lentivírus expressando cDNAs ou shRNAs pode modular a expressão de genes em áreas específicas do cérebro de ratos. Aqui, apresentamos um protocolo para combinar injeções estereotáxica com tarefas comportamentais, como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST).

Abstract

Injecção estereotáxica é uma técnica útil para entregar lentivírus de título elevado para as áreas do cérebro em ratos segmentados. Os lentivírus podem ou sobre-expressar ou a expressão do gene knockdown numa região centrada relativamente sem danos significativos para o tecido do cérebro. Após a recuperação, o rato injetado pode ser testado em várias tarefas comportamentais, tais como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST). O OFT é concebido para avaliar o fenótipo locomoção e ansioso em ratos, medindo a quantidade de tempo que um rato passa no centro de um novo campo aberto. Um rato mais ansiosos vai gastar muito menos tempo no centro do romance campo em comparação aos controles. O FST avalia o fenótipo anti-depressivo por quantificação da quantidade de tempo que os ratos passam imóvel quando colocada num balde de água. Um rato com um fenótipo anti-depressivo vai gastar muito menos tempo imóvel comparado ao grupo controle. O objetivo deste protocolo é usar o stereotactic injeção de um lentivírus em conjunto com testes comportamentais para avaliar como fatores genéticos modular comportamentos animais.

Introduction

O rato tem sido amplamente utilizada em neurobiologia, porque é fácil de manipular geneticamente. Técnicas gene knockout permitir que os investigadores para investigar como cada fator genético molda comportamentos do mouse. Além disso, o sistema cre-loxP fornece uma ferramenta valiosa para Tecido e célula de tipo nocaute de genes específicos em camundongos, o que permite aos pesquisadores para estudar a função de genes em diferentes tecidos. ¹ Contudo, na prática, os padrões de promotores cre de expressão são difíceis de controlar , e até agora muitos condutores cre estabelecidas não ter alcançado uma expressão específica da região ^2,3.

Em alternativa, a injecção estereotáxica é um método que tem como alvo regiões específicas do cérebro de rato adulto o. Por injecção de vírus geneticamente modificadas que expressam ADNc ou shRNA, a modulação da expressão génica específica da região pode ser alcançado. Embora o tamanho do cérebro de cada ratinho varia, a localização de regiões específicas do cérebro pode ser determinada utilizando coor estereotáxicanates definir a partir de pontos de referência no crânio do cérebro do rato. Os marcos mais comumente usados ​​são bregma, lambda, ea linha interaural. Utilizando as coordenadas obtidas a partir de um atlas cerebrais, ⁴ a localização exacta de cada área do cérebro pode ser identificado pela ântero-posterior (A / P), medial-lateral (H / L), e dorso-ventral (D / V) de eixos bregma / intersecção linha interaural. Tipicamente os vírus injectado no cérebro de ratos são marcados com qualquer proteína fluorescente vermelha ou verde (GFP ou RFP), de modo que as injecções pode ser confirmada por microscopia de fluorescência.

Avaliações comportamentais dos ratos são especialmente necessários para a investigação básica de transtornos psiquiátricos. Os sintomas de transtornos psiquiátricos em pacientes tipicamente envolvem comportamentos anormais. Alguns destes comportamentos humanos são evolutivamente conservada e pode ser directamente imitou e observadas no rato. Por exemplo, a depressão pode ser modelada no rato medindo desespero comportamental. Pessoas com depressão often sentir como se nada fazem sempre vai ajudar, um sintoma que pode eventualmente levar ao suicídio. Em roedores, este pode ser modelado utilizando o Teste de Natação Forçada (FST), que mede a quantidade de tempo que um rato nadando contra flutuando em uma piscina de água (vistos como desistir). Este paradigma é validada por resgatar o fenótipo com anti-depressivos. ^7,8,9 ratos que receberam anti-depressivos vai gastar muito menos tempo imóvel comparação com os controlos não tratados. Outro teste comportamental, o teste de campo aberto (OFT) é concebido para avaliar a locomoção em ratinhos, e, adicionalmente, pode ser utilizada para analisar o fenótipo ansiedade em ratos. ^5,6 Este teste baseia-se na premissa de que os ratos se sentir mais segura quando estão perto para a parede em um romance campo aberto. Camundongos selvagens acabará por explorar o novo ambiente, pois são animais curiosos. No entanto, passar menos tempo no centro do campo indica ansiedade no rato, como o rato não irá ser capaz de superar a INITIAl medo causado por um ambiente de romance. A ansiedade do rato, como quantificado pela quantidade de tempo despendido no centro de um campo aberto, pode ser comparada a ansiedade clínica em seres humanos, o qual está presente em muitos distúrbios psiquiátricos.

A combinação de injecções estereotáxicas com os paradigmas comportamentais é uma nova maneira de alterar a expressão de um gene específico em uma área alvo do cérebro. O efeito da expressão do gene modulado em comportamentos de ratos pode então ser determinada. Em contraste com nocaute do cérebro inteiro, este método é particularmente útil uma vez que tem como alvo apenas áreas específicas do cérebro. Além disso, as injecções estereotáxicas são tipicamente realizadas no tipo selvagem do rato adulto, por conseguinte, a expressão do gene endógeno foi mantida ao longo das etapas de desenvolvimento. Este método vai evitar o efeito confundem, se o gene é necessária para a sobrevivência durante o estágio embrionário ou pós-natal do desenvolvimento. Uma grande limitação é que os camundongos experimentais precisa ir through uma cirurgia invasiva, em que os crânios dos murganhos têm de ser abertos. Além disso, o grau de modulação do gene é determinada por titulação e a eficiência do vírus. O vírus tem de ser injectado na região correcta através de coordenadas estereotáxicas, que requer instrumentos especiais. Verificação do local de injecção correcta só pode ser concluído post mortem.

Este método tem sido utilizado para testar o envolvimento de um gene específico em várias doenças neurológicas. Por exemplo, viral mediada por ARNi do gene alvo Th (que permite a dopamina a ser sintetizado) foi injectada na substância negra compacta, e a análise do comportamento locomotor foi conduzido. ¹⁰ Outro estudo utilizou injecção estereotáxica de um Disc1 silenciamento lentivírus para avaliar o comportamento do rato em relação a esquizofrenia. Knockdown de Disc1 levaram a um aumento da locomoção em resposta a novidade (paralelos sintomas positivos em esquizofrenia), e maior na imobilidadeFST. ¹¹ De forma semelhante, um estudo adicional descobriu que 5-HT _1B superexpressão levou a um comportamento exploratório aumentado no OFT, consistente com um fenótipo anti-ansiedade usando este método. ¹² injecções estereotáxicas pode entregar vírus para induzir a recombinação cre em ratinhos cre-loxP . Este método foi utilizado para eliminar selectivamente o receptor Y2 na amígdala e o núcleo da estria terminal. Após a análise comportamental, estes ratos foram encontrados para um fenótipo anti-depressivo quando o gene foi eliminado na amígdala central, mas não fenótipo quando o gene foi eliminado na amígdala basolateral ou do núcleo do leito do stria terminalis. ¹³ Assim, esta técnica fornece uma ferramenta única para estudar o efeito genético sobre os comportamentos dos animais.

Protocol

NOTA: Todos os protocolos que envolvam animais foram seguidos de acordo com as orientações de cuidados de animais de The Pennsylvania State University, IACUC # 44057

1. Lentivírus Produção

NOTA: O dia antes da transfecção, LentiX-293 deve ser a 80% de confluência.

1. Lavar as células com DMEM apenas antes da transfecção e incubar em 10 ml de DMEM / 10% de FBS com penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 ug / ml) durante 5 min à TA.
2. Dilui-se o ADN e polietilenimina (PEI) (1 mg / ml) em 1: 3 de proporção (1 ug de ADN: 3 ul de PEI) em 1 ml de DMEM e vortex durante 1 min. O volume de ADN adicionada é dependente da concentração do DNA. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
   1. Por exemplo, utilizar 20 ug de plasmídeo ADN, composta por 10 ug de vector de plasmídeo, 5 ug de plasmídeo psPax2 ^14, 5 ug de vírus da estomatite vesicular (VSV) com 60 ul de PEI por prato.
3. Adicionar 1/10 total de volume de meio de cultura de DMEM (isto é, 1 ml para 10 ml de meio de cultura numa placa de 100 mm). Adicionar 1 ml de ADN-PEI mistura gota a gota para o prato e o prato de rodar em volta até ao meio de cultura é bem misturado com o ADN.
4. Incuba-se durante 6 horas à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Adicionar 5 ml de meio de cultura.
5. 48 h após a transfecção, recolher o sobrenadante viral e girar a 627 xg durante 5 min a 4 ° C em um tubo de 50 ml. Filtro de 30 ml de sobrenadante viral através de um filtro de seringa de 0,45 um para um tubo de ultracentrífuga.
6. Adicionar água estéril para equilibrar os tubos, e cobrir os tubos com pequeno pedaço de parafilme. Tubos giram a 11.249 xg durante 120 min a 4 ° C. Remover o líquido utilizando uma ponta de vácuo.
7. Adicione 100 ml de PBS frio do tubo. Agite suavemente o tubo a 4 ° CO / N.
8. Para voltar a suspender o vírus, pipeta tele PBS adicionado no passo 1,8 ao longo dos pellets 10 vezes, tomando cuidado para não tocar a pelota com a ponta. O pellet não será re-suspenso até que este esteja completo.
9. Alíquota o vírus em 10-20 ul por tubo, flash-congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C.

2. injeção estereotáxica

2.1) Preparação de Instrumentos

1. Coloque um par de tesouras, pinças blunt-end, um porta-agulhas, bisturi, cotonetes, e um pano em um pacote selado com um indicador de esterilização e autoclave antes da cirurgia. Além disso, obter 10% de iodo povidona, álcool etílico 70%, suturas absorvíveis, uma almofada de aquecimento, lágrimas artificiais, um talão de vidro esterilizador, broca, uma broca, duas seringas descartáveis, uma seringa de injeção, barbeador elétrico, analgésico (cetoprofeno), anestésico (Avertin), luvas, e um aparelho de estereotaxia com bomba de injecção.
2. Faça solução 1,25% avertin fresco naquele dia, filtro em uma capa estéril usando um 0,2 &# 181; m filtro de seringa estéril, e coloque em um frasco de soro estéril. Misture 2,5 g de álcool 2,2,2-tribromoetilo em 5 ml de álcool terc-amílico, em seguida, dissolvem-se em 200 ml de água. Manter o pH abaixo de 5. ¹⁵

2.2) Preparação do Rato

1. Administrar Avertin com base no peso do rato (375 mg / kg). ¹⁵ Injectar o rato com o avertina através de uma injecção intraperitoneal (IP) de injecção, e, em seguida, colocar volta para a sua gaiola até estar completamente anestesiado.
2. Dê um analgésico via injeção IP (ketaprofen, 5 mg / kg), e lugar de lágrimas artificiais sobre os olhos do mouse para evitar a secagem.
3. Certifique-se de que o mouse é totalmente adormecido por beliscar seu pé. Se o rato responde ao pé de aperto, em seguida, dar mais anestésico (em doses de 50 uL). Raspar a cabeça do rato usando um barbeador elétrico. Raspar a área a ser operada (tipicamente de apenas atrás das orelhas, a parte superior do focinho), e a área circundante.
4. Coloque o rato into do aparelho estereotáxica. Trava os dentes da frente para a braçadeira anterior, e abaixe a braçadeira e aperte-o de modo que a mandíbula é totalmente seguro.
5. Coloque as barras de ouvido no canal do ouvido para estabilizar completamente a cabeça. Tenha cuidado para não inserir as barras de ouvido demasiado para dentro, o que poderia danificar o ouvido interno. Uma vez terminado, o corpo do rato deverá ser capaz de ser movido ligeiramente sem interromper a posição da cabeça.
6. Coloque uma almofada de aquecimento sob o rato a fim de regular a temperatura do corpo do rato ao longo do procedimento.
7. Limpe a área cirúrgica completamente. Usando um cotonete, esfregar 10% de iodopovidona em um movimento circular, a partir do meio do local cirúrgico e movendo-se para o exterior. Em seguida, utilizando um pano de algodão para esfregar o álcool etílico a 70% no local da cirurgia da mesma maneira. Repita mais duas vezes.

2.3) A primeira incisão

1. Uma vez que o rato está preparado, abra o saco de equipamento estéril. Mudar de luvas antes touching os instrumentos. Retire o pano estéril e coloque os instrumentos sobre o pano. Se qualquer instrumento toca uma superfície não-estéril, utilize o talão esterilizador de vidro por 15 segundos para esterilizar.
2. Tome o bisturi na mão e blunt-end fórceps dominantes na mão não-dominante. Use a pinça blunt-end para suavemente aderência da pele do rato, e fazer uma incisão usando o bisturi. Comece a incisão cerca de 1,5 cm acima das orelhas (em direção ao nariz) e se estendem até cerca de 0,5 cm abaixo das orelhas. Estender a incisão vertical no meio da cabeça do rato para expor bregma (Figura 1).
3. Uma vez bregma é visualizada, dê uma ponta de algodão estéril para remover suavemente todo o sangue cobrindo a superfície do crânio. Use duas pontas de algodão para empurrar a pele em direcção ao lado da cabeça.

2.4) Configuração de Equipamento

1. Depois de todo o sangue é removido a partir da superfície do crânio, e é claramente visualizada bregma, preparar a seringa (CONcentração de ⁸ a 10 TU / ml, volume de 1 mL). Na hotte, encher a seringa com o vírus a ser injectado. Certifique-se que não há bolhas estão no interior. Coloque a seringa no aparelho estereotáxico, certificando-se de que está plenamente assegurada.
2. Lentamente inferior da seringa até que esteja bem acima da superfície do crânio, de modo que a ponta da agulha da seringa estéril é definido como a intersecção da bregma e a linha interaural. Definir este ponto como zero, e determinar as coordenadas a partir deste ponto.
3. Dependendo da área de cérebro de interesse, variar as coordenadas estereotáxicas. Determinar essas coordenadas, utilizando um atlas do cérebro ^4. Uma vez que as coordenadas são determinados, mover a agulha da seringa para combinar essas coordenadas. Alvo do giro dentado usando as coordenadas: M / L = +/- 1 mm, de A / P = -1,82 mm. Abaixe a agulha para a direita acima do crânio para visualizar onde o buraco tem de ser perfurados.
4. Levante a seringa um pouco, tomar a broca e coloque a broca bit logo acima do local de perfuração alvo em cerca de um ângulo de 45 ° com o crânio. Começar a perfurar, e manter a perfuração até que o crânio dá lugar. Quando o crânio dá forma, uma queda na resistência pode ser detectada. Seja o cuidado de não perfurar o cérebro, de modo a evitar danos cortical.
5. Pegue um cotonete estéril e limpar qualquer sangue do buraco.
6. Abaixe a seringa de modo que a ponta fica na superfície do cérebro (não o crânio). Definir a coordenada D / V (profundidade) a 0. inferior a seringa para a profundidade desejada, com base nas coordenadas do atlas do cérebro. Para atingir o giro dentado, definida D / V para -1,79 mm.
7. Iniciar a injecção a uma velocidade de 0,2 ul / min. Relógio para garantir que a seringa não escorregar mais baixa do que a profundidade desejada. Se isto ocorrer, levantar suavemente a seringa para a profundidade desejada de novo.
8. Após a injecção está terminada, esperar cerca de 2 minutos para assegurar que qualquer vírus residual foi absorvido. Lentamente levantar a seringa e use um cotonete para remover qualquer lilibras a partir do local de injecção.
9. Repita para o outro hemisfério.

2.5) Sutura

1. Retirar o fio de sutura e agulha estéril da embalagem e prender a agulha usando os suportes da agulha. Enfrentar a borda afiada da agulha longe de suporte da agulha. Segure a pinça blunt-end na mão não dominante, e usá-lo para agarrar a pele do rato. Comece com a mão dominante.
2. Empurrar suavemente o fio de sutura através da pele e utilizam a pinça de extremidade romba para agarrar a pele do outro lado da incisão. Puxe o material de sutura através de até cerca de 0,75 polegadas permanece.
3. Deixe de lado a agulha, e usar a pinça blunt-end para envolver a sutura em torno do suporte de agulha uma vez, em seguida, pegue a sutura restantes 0,75 polegadas com suporte de agulha e puxe o fio de sutura através, de modo que o suporte da agulha e agulhas acabar no lado oposto da cabeça para que eles foram originalmente no. Isso deve formar um nó.
4. Repita este passomais três vezes, alternando o lado da cabeça de retenção da agulha termina-se em cada tempo.
5. Cortar o fio de sutura e repita os passos 2.5.1-2.5.3 até que a incisão é fechada.

2.6) cuidados pós-operatórios

1. Remova cuidadosamente as barras de ouvido do rato, e remover a mandíbula da braçadeira anterior.
2. Mantenha o mouse sobre a almofada de aquecimento até que ele acorda e se move em torno de seu próprio. Monitorar o mouse diariamente, e manter e olho para fora para sinais de dor, como não preparação, comer ou beber. Dê analgésico adicional quando julgar necessário.

3. Abra Campo de Provas

3.1) Configurar

1. Obter um quadrado vazio, arena de plástico com dimensões 50 centímetros x 50 cm, com 50 cm de altura paredes (mas pode ser um pouco maior). Limpar a arena com 70% de álcool etílico antes do início da experiência. Verifique se o álcool etílico esteja totalmente seca antes de colocar um mouse para a arena.
2. Coloque a arena nachão, e tentar garantir a iluminação está definido para minimizar sombras e reflexos.
3. Se estiver usando o software de rastreamento, posicione a câmera diretamente acima do campo aberto, cerca de 1,5 pés acima do campo aberto (longe o suficiente para abranger completo toda a arena, mas perto o suficiente para ter uma visão clara do mouse).
4. Configurar uma zona no centro da caixa (aproximadamente uma área de 30 cm x 30 cm). ¹⁶ Para definir uma zona, clique na guia zona 1 no painel lateral.
   1. Escolher um contorno da forma do painel superior, e o contorno do perímetro da zona central. Selecione adicionar a zona e clique no interior da zona centro. Usando as instruções do programa, nome da zona (isto vai ser referido como "centro" para este procedimento). Se o teste comportamental serão marcados com a mão, certifique-se o fundo do campo é dividido em 10 cm x 10 cm quadrados, marcado com fita.
5. Configure o software para que as configurações estão corretas, eo mouse é facilmente visible na tela. Conseguir isso, ajustando as configurações de detecção na máquina para ser compatível com a arena de testes (iluminação) e cor mouse.
   NOTA: Quando as configurações estiverem corretas, o sistema deve rastrear apenas o mouse, e não quaisquer sombras ou urina / matéria fecal. As definições do software específicos dependem da iluminação da arena, e a cor do rato.

3.2) aclimatação e de ensaio

1. Mova camundongos experimentais para o comportamental sala 1 hora antes do ensaio, a fim de aclimatar-los para os seus arredores. Deixe os ratos em sua gaiola para a aclimatação.
2. Ligue a câmera para gravar a tarefa comportamental e coloque o mouse em direção à frente meio da arena, para que o rato está virado para a parede.
3. Ajustar o cronômetro para 5 min, e afastar-se da arena. Se possível, deixe o quarto para não acidentalmente influenciar o mouse.
4. Uma vez que 5 min estão em alta, remover o mouse e colocá-los em sua gaiola.
5. Use álcool etílico 70% a limpeza profunda de todo o campo antes de prosseguir para a próxima mouse. Verifique se o álcool etílico esteja totalmente seca.

3.3) Scoring

1. Considere o rato como estando no centro do campo quando todas as quatro patas estão dentro do meio de 30 cm x 30 cm.
2. Quantificar a quantidade de tempo que o rato gasta no centro. Alternativamente, determinar desta vez usando software de monitoramento (como Noldus ethovison).
   1. Para fazer isso, vá até a guia análise e clique em "movimento" em perfis de análise. Excluir as categorias definidas atualmente, e em seguida, selecione "na zona" sob a guia de localização. Selecione a zona centro. Em seguida, selecione "saída da análise" (na guia resultados) para ver os resultados. Uma tabela listando o tempo gasto imóvel para cada ensaio deve aparecer.
3. Caso contrário, marcar o OFT à mão. O campo aberto deve ter 25 10 cm x 10 cm quadrados descritas na parte inferior da abercampo n (conforme descrito no passo 3.1.3). Quantificar a quantidade de tempo que o rato gasta no centro, para além do número de entradas para o centro da arena. ¹⁶
   NOTA: O centro de 30 cm x 30 cm área é considerada o centro do campo aberto. Um rato é considerado como habitando a região do centro, se todas as quatro patas estão dentro da área cm a 30 x 30.

4. Teste de Natação Forçada

NOTA: Permitir que um mínimo de cinco dias entre tarefas comportamentais.

4.1) Configurar

1. Obter um balde de 2 L claro, e preencha com 22 ° C de água. Coloque o balde sobre uma mesa, e tentar garantir a iluminação está definido para minimizar sombras e reflexos.
2. Se estiver usando o software de rastreamento, posicione a câmera diretamente em cima do balde.
3. Configurar o seu software de modo que o mouse é facilmente visível no ecrã.

4.2) aclimatação e de ensaio

1. Mova camundongos experimental no ro comportamentalom 1 hora antes do teste para aclimatar os arredores. Deixe os ratos em sua gaiola para a aclimatação.
2. Ligue a câmera para gravar a tarefa comportamental. Delicadamente, coloque o mouse no meio do balde de água. Certifique-se de não deixar cair o mouse em. Lentamente, abaixe o mouse, para que seus pés dianteiros tocar a água em primeiro lugar. Tome cuidado para evitar a sua cabeça fique submerso.
3. Ajustar o cronômetro para 6 min, e afastar-se da área comportamental.
4. Uma vez que 6 min são para cima, remova o mouse do balde, e limpe o excesso de água antes de colocar o mouse de volta em sua gaiola.

4.3) Scoring

1. Se você estiver usando software de monitoramento, definir por cento imobilidade a 11%, como sugerido por Noldus (esta deve ser a configuração padrão), para quantificar o tempo flutuante vs. natação.
2. Para quantificar usando o sistema de rastreamento, vá para a aba análise, e clique em circulação em regime de perfis de análise. Excluir as categorias definidas atualmente, e em seguida, selecione Estado da mobilidade, emo painel do lado esquerdo (em comportamento individual). Definir a imobilidade até 11%.
3. Selecione a visualização da trilha, sob a guia resultados. Selecione saída de análise (na guia resultados) para ver os resultados. Uma tabela listando o tempo gasto imóvel para cada ensaio deve aparecer.
4. Se marcar lado, medir o tempo passa o mouse natação ou escalada, ea quantidade de tempo gasta o mouse imóvel. Além disso, medir a latência para o primeiro tempo de imobilidade. Veja a Figura 2 em resultado secção.

Representative Results

Injeção estereotáxica precisas depende fortemente de definir as coordenadas corretas. A ponta da agulha utilizada para injectar o vírus deve ser definido directamente na intersecção da bregma e a linha interaural (Figura 1). É útil a utilização de um microscópio estereoscópico para determinar se ou não a agulha está correctamente colocado. Ao olhar através do microscópio, a agulha deve ser posicionado de modo que, se o vírus foram injectados, seria aterrar directamente na intersecção da bregma e a linha interaural. Isto é, a abertura da agulha da seringa devem ser colocados directamente por cima da intersecção. Neste estudo, um lentivírus expressando shRNA contra RBM8a, um factor central no complexo de junção exão, foram injectados no giro dentado. O lentivírus também expressa RFP para rotular neurónios infectados. A Figura 2 mostra que o vírus foi injectada na região correta como indicado pelo sinal vermelho (Figura 3).

_content "> Para alcançar significância em tarefas comportamentais, o tamanho da amostra deve variar 12-15 ratinhos por grupo. tarefas comportamentais podem ser realizadas de duas semanas após injeções estereotáxica. No OFT, um fenótipo ansioso está presente se os ratos passam muito menos tempo em o centro do campo aberto em comparação com o grupo de controlo. Os resultados indicam que o knockdown de RBM8a no giro dentado de ratos adulto conduz aos comportamentos de ansiedade (p <0,05, Figura 4). No FST, não houve diferença observável na imobilidade entre controle e camundongos experimentais, sugerindo que RBM8a knockdown no giro dentado não afeta o comportamento anti-depressivo (Figura 5). A análise estatística consistiu em realizar uma de duas caudas, t-teste de variância duas amostras-desigual.

Figura 1: Intersecção de Bregma ea InterLinha aural. Para injeções estereotáxica, a agulha da seringa deve ser alinhada com a intersecção da bregma ea linha interaural. Este ponto é fixado em zero.

Figura 2: Diagrama esquemático ilustrando a Timeline para o Experimento inteiro.

Figura 3: fatia do cérebro Representante ilustrando injeção de sucesso do vírus no giro denteado A barra de escala = 100 mm..

Figura 4: A quantidade de tempo que os ratos experimentais passado no Centro de uma Novela Campo Aberto Controle e camundongos experimentais passar signif.vamente menos tempo no centro da arena, o que indica um fenótipo ansioso (N = 9-11, *, T ₁₈ = -2,72, p <0,05, média ± SEM)

Figura 5:. A quantidade de tempo que o Controle e Experimental Ratos são Immobile no FST camundongos experimentais não diferiram dos controles em tempo gasto imóvel (N = 9-11, T ₁₈ = 1,25, p> 0,05, média SEM)

Discussion

Injecções estereotáxicas de sucesso dependem de três fatores: manter o rato vivo, definindo o ponto zero correto para coordenadas (ponta da agulha na intersecção de bregma ea linha interaural), e definir a profundidade direito ao ponto zero (ponta da agulha apenas a tocar o exterior do tecido cerebral). A viabilidade dos murganhos é importante. Sobrevivência cirurgia pode ser auxiliada por certificando-se de que o mouse está devidamente anestesiados e recebe analgésica adequada. A dor é conhecido por ser uma das principais causas da fraca recuperação após a cirurgia. Assegurar que o rato é totalmente anestesiados durante toda a cirurgia (que não deve responder a beliscões pés), e dando a dose correcta de analgésico (com base no peso do rato), deve ajudar a sobrevivência. ¹⁷ Além disso, o rato deve ser mantido em uma almofada de aquecimento durante todo o processo da cirurgia até que ele acorda da anestesia. Ratos não pode regular a temperatura do corpo quando eles são anestesiados. Seu temperamento corpoature vai cair significativamente durante o processo de cirurgia. Mesmo que a duração da cirurgia estereotáxica é relativamente curto, hipotermia poderia prejudicar seriamente a sobrevivência mouse. A técnica apropriada sutura, também é fundamental para a realização de uma cirurgia bem sucedida. Ratos irá tentar escolher os seus suturas, por isso é crucial para se certificar de que as suturas são apertados o suficiente para impedir a remoção, mas não muito apertado como colocar muita tensão sobre a ferida. Quatro nós em cada ponto deve se assegurar que o mouse não é capaz de remover a sutura. Sutura adequada é importante como uma ferida aberta irá aumentar a susceptibilidade a infecções, o que afectaria negativamente quaisquer experimentos comportamentais.

O OFT é um paradigma comportamental concebido para avaliar a locomoção e o fenótipo ansioso em ratinhos. Ao testar o comportamento do mouse, é importante ter muito cuidado ao manusear os ratos e configuração da arena. No OFT, o paradigma é projetado para emparelhar apreensão do rato when colocado em um novo ambiente, com sua curiosidade natural eo desejo de explorar novidade. Um rato de tipo selvagem será inicialmente hesitantes em entrar no centro do campo aberto, onde é mais vulnerável, mas acabará por fazê-lo, devido a sua curiosidade inata. Em um rato ansioso, a apreensão de atravessar um espaço mais vulneráveis ​​(o centro do campo) será maior do que a sua curiosidade natural e desejo para explorar, o que irá resultar em significativamente menos tempo gasto no centro. Para certificar-se o paradigma funciona corretamente, é importante para minimizar o estresse associado com os outros do que o campo aberto fatores. O stress pode ser minimizado, permitindo que o rato de se adaptar ao ambiente comportamental (de modo que o ambiente exterior não é possível uma variável de confusão), e a limpeza do campo entre ratos, para garantir que todos os cheiros associados com o rato anterior ter sido removida ^18. Essas etapas devem ajudar a eliminar quaisquer diferenças que são causados ​​por incorretamente handlicamundongos GN. Neste estudo, ratos knockdown RBM8a gasto um tempo significativamente menor no centro de um novo campo aberto, em comparação com os controlos. Isto é indicativo de um fenótipo de ansiedade, uma vez que os ratos são mais relutantes em introduzir o meio do novo campo aberto, onde eles são mais vulneráveis, em comparação com os controlos.

O FST pretende investigar o fenótipo anti-depressivo em ratos. Quando colocada num balde de água, os ratinhos que gastam significativamente menos tempo flutuante contra natação são considerados como tendo um fenótipo anti-depressivo. Imobilidade no teste de natação forçada é interpretada como desespero comportamental (por exemplo, dando-se). Este paradigma é validado por tratamento com anti-depressivo. Os murganhos que recebem ^7,8,9 drogas anti-depressivas vai passar significativamente menos tempo de flutuao em comparação com os controlos, o que é indicativo de um fenótipo anti-depressivo. Neste estudo, ratos RBM8a knockdown não diferiu significativamente dos ratinhos de controlo no tempo gasto imóvel. This indica que RBM8a knockdown no giro dentado de ratos adulto não induzir um fenótipo depressivo ou anti-depressiva. No nosso estudo anterior, RBM8a sobreexpressão no giro dentado de ratos adulto diminui significativamente imóvel tempo em comparação com os controlos, o que indica um efeito anti-depressivo. ¹⁶

As injecções estereotáxicas utilizadas para a representação neste trabalho foram alvo de giro dentado. O giro denteado foi escolhida como local alvo, uma vez que o gene de interesse é altamente expresso no ratinho não adulto. Além disso, o giro dentado tem sido associada com a depressão e a ansiedade. Por exemplo, um estudo utilizou ratos POMC-CHR2 para activar de forma selectiva as células de grânulos em qualquer dorsal ou ventral giro dentado. A activação do tanto dorsal e ventral do giro denteado levou a um aumento da exploração de um ambiente novo, indicando um potencial papel do giro dentado na ansiedade. ¹⁹ Um estudo diferentedescobriram que os ratos com a neurogénese prejudicada tinha aumentado imobilidade no TNF, indicando um fenótipo depressivo. ²⁰ Além disso, a activação de AP OA ₁ no cérebro anterior conduz a um efeito anti-depressivo no FST, alimentação novidade suprimida, e ensaio do consumo de sacarose. Quando o VEGF foi batido para baixo no giro dentado de Ap ₁ OA, este fenótipo anti-depressiva foi perdido. ²¹ Estes dados sugerem que o giro denteado tem um papel na patofisiologia da depressão e ansiedade, e indicou que as giro dentado pode ser uma boa área para direcionar para o nosso modulação genética e experimentos comportamentais. Um lentivírus foi utilizado especificamente, de modo que todas as células no giro dentado seriam infectados, ao contrário de somente as células em divisão (retrovírus).

A combinação destes três modelos experimentais (em adição a outras tarefas comportamentais) é uma nova maneira de avaliar os fenótipos comportamentais em ratinhos, uma vez que um vírus pode ser injectado num especifárea do cérebro ic às vezes específicas de desenvolvimento. Usando injecções estereotáxicas de um lentivírus emparelhado com tarefas comportamentais leva apenas alguns meses para ser concluída e permite aos pesquisadores reunir dados preliminares sobre os efeitos comportamentais da expressão gênica em uma área específica do cérebro. Em contraste, camundongos knockout condicional muitas vezes levam anos para gerar. Além disso, o tipo de célula preferência de vírus podem ser utilizados para direccionar adicionalmente as células. Por exemplo, os retrovírus só pode infectar células (tais como células estaminais neurais no giro dentado), enquanto que um lentivírus infecta todos os tipos de células em divisão. ^22,23 Assim, em conjunto com a co-injecção, estes protocolos experimentais utilizados individualmente e validados proporcionar um rápido mas forma abrangente para testar o papel do gene específico em uma área do cérebro alvo, sobre os comportamentos do mouse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder