Anwenden Stereotaktische Injektionstechnik zu genetischen Auswirkungen auf die Tier Behaviors Studie

Summary

Stereotaktische Injektion von Lentiviren ausdrücken cDNAs oder shRNAs die Genexpression in spezifischen Hirnarealen von Mäusen zu modulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur stereotaktischen Injektionen mit Verhaltensaufgaben, wie der Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) zu kombinieren.

Abstract

Stereotaktische Injektion ist eine nützliche Technik, um hohe Titer Lentiviren gezielt Gehirnbereiche in Mäusen zu liefern. Lentiviren kann entweder überexprimiert oder Zuschlags Genexpression in einer relativ fokussierten Bereich ohne signifikante Schädigung des Gehirngewebes. Nach der Wiederherstellung kann der eingespritzte Maus auf verschiedene Verhaltens Aufgaben wie die Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) getestet werden. OFT ist entworfen, um die Fortbewegung und die bestrebt Phänotyp bei Mäusen durch Messung der Menge an Zeit, die eine Maus in die Mitte einer neuen offenen Feld ausgibt beurteilen. Ein ängstlicher Maus wird deutlich weniger Zeit in der Mitte des Romans Feld im Vergleich zu Kontrollen zu verbringen. Die FST beurteilt die anti-depressive Phänotyp durch Quantifizieren der Menge an Zeit, die Mäuse verbringen unbeweglich, wenn sie in einen Eimer Wasser gegeben. Eine Maus mit einer antidepressiven Phänotyp signifikant weniger Zeit unbeweglich Vergleich zu Kontrolltieren zu verbringen. Ziel dieses Protokolls ist es, die ster verwendeneotactic Injektion eines Lentivirus in Verbindung mit Verhaltenstests zu beurteilen, wie genetische Faktoren modulieren tierischen Verhaltensweisen.

Introduction

Die Maus wurde vielfach in der Neurobiologie verwendet, weil es leicht ist, genetisch zu manipulieren. Gen-Knockout-Techniken können die Forscher untersuchen, wie die einzelnen genetischen Faktor formt Maus Verhaltensweisen. Darüber hinaus stellt die cre-loxP-System ein wertvolles Werkzeug für die Gewebe- und Zell arttypischer Gen-Knockout-Mäusen, die Forschern die Genfunktion in verschiedenen Geweben zu untersuchen. ^1, in der Praxis sind jedoch Expressionsmuster von cre Promo schwer kontrollierbar und bisher viele etablierte cre Treiber nicht regionsspezifische Expression erreicht. ^2,3

Alternativ ist die stereotaktische Injektion eine Methode, die spezifischen Regionen des Gehirns von erwachsenen Maus als Ziel hat. Durch Einspritzen von gentechnisch hergestellten Viren, die cDNA oder shRNA kann regionsspezifische Modulation der Genexpression erreicht werden. Obwohl das Gehirn Größe jeder Maus variiert, kann der Ort des spezifischen Hirnregionen mit stereo Koordi bestimmt werdennates gesetzt von Landmarken auf dem Schädel des Maushirn. Die am häufigsten verwendeten Landmarken Bregma, lambda und der interauralen Linie. Mit Hilfe von Koordinaten aus einer Hirnatlas erhalten können ⁴ die genaue Position jedes Hirnareal durch die von vorne nach hinten (A / P), medial-lateral (M / L) identifiziert werden kann, und dorsal-ventralen (D / V) Achsen aus bregma / interauralen Linie Kreuzung. Typischerweise Viren in die Gehirne von Mäusen injiziert werden, entweder rot oder grün fluoreszierendes Protein (RFP oder GFP) markiert, so dass Injektionen können durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt.

Verhaltens Beurteilungen der Mäuse sind besonders für die Grundlagenforschung von psychiatrischen Störungen nötig. Symptome von psychiatrischen Störungen bei Patienten typischerweise abnorme Verhaltensweisen. Einige dieser Verhaltensweisen des Menschen, sind konserviert und kann direkt imitiert und in der Maus beobachtet werden. Beispielsweise kann Depressionen in der Maus durch Messen behavioral despair modelliert werden. Menschen mit Depressionen often das Gefühl, dass sie nichts tun überhaupt helfen, ein Symptom, das schließlich zum Selbstmord führen können. In Nagetiere, kann dies mit Hilfe der Zwangsschwimmtest (FST), die die Zeitdauer eine Maus schwimmen gegen schwebend in einem Pool von Wasser (als Aufgeben gesehen) misst modelliert werden. Dieses Paradigma wird durch die Rettung des Phänotyps mit Antidepressiva validiert. ^7,8,9 Mäuse, die Antidepressiva erhalten haben erheblich weniger Zeit unbeweglich im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zu verbringen. Eine andere Verhaltenstest, der Open Field Test (OFT) wurde entwickelt, um die Fortbewegung in den Mäusen zu bewerten, und zusätzlich kann der ängstliche Phänotyp in Mäusen zu analysieren. ^5,6 Dieser Test beruht auf der Prämisse, dass Mäuse fühlen sich sicherer, wenn sie in der Nähe sind an der Wand in einer neuen offenen Feld. Wildtyp-Mäusen werden schließlich entdecken Sie die neue Umgebung, wie sie neugierige Tiere sind. Jedoch weniger Zeit in der Mitte des Feldes zeigt Angst in der Maus, die Maus nicht in der Lage, um die Initia überwindenl Angst auf eine neue Umgebung gebracht. Die Angst der Maus, wie durch die Menge an Zeit in der Mitte ein offenes Feld verbracht quantifizieren kann, um klinische Angst bei Menschen, die in vielen psychiatrischen Störungen vorhanden ist, verglichen werden.

Die Kombination von stereo Injektionen Verhaltensparadigmen ist eine neuartige Weise, um die Expression eines bestimmten Gens gezielt Gehirnbereich zu ändern. Die Wirkung von modulierten Genexpression Auslösern kann dann bestimmt werden. Im Gegensatz zur Gesamthirn Knockout ist dieses Verfahren besonders nützlich, da sie Ziele nur bestimmte Hirnareale. Darüber hinaus werden der stereotaktischen Injektionen typischerweise im erwachsenen Wildtyp-Maus durchgeführt wird, also die endogene Genexpression gesamten Entwicklungsstufen beibehalten. Diese Methode wird die Wirkung verwechseln zu vermeiden, wenn das Gen für das Überleben während der embryonalen und postnatalen Entwicklungsphase erforderlich. Eine wichtige Einschränkung ist, dass die Versuchsmäuse gehen müssen through eine invasive Chirurgie, in der die Schädel von Mäusen geöffnet werden. Darüber hinaus wird der Grad der Genmodulation durch den Titer und die Effizienz des Virus bestimmt. Das Virus muss in die richtige Region mit stereotaktischen Koordinaten, die spezielle Instrumente erfordert injiziert werden. Überprüfung der korrekten Injektionsstelle kann nur post mortem durchgeführt werden.

Dieses Verfahren wurde früher verwendet, um die Beteiligung eines spezifischen Gens in verschiedenen neurologischen Krankheiten zu prüfen. Zum Beispiel virale vermittelte gerichtete RNAi TH-Gen (die Dopamin synthetisieren können) in die Substantia nigra compacta eingespritzt wird, und den Bewegungsverhaltensanalyse wurde durchgeführt. ¹⁰ einer anderen Studie wurden stereotaktische Injektion eines Lentivirus silencing DISC1 Maus Verhalten in Bezug zu beurteilen um Schizophrenie. Knockdown von DISC1 führte zu einer erhöhten Fortbewegung in Reaktion auf die Neuheit (Parallelen positive Symptome der Schizophrenie) und größer Unbeweglichkeit in derFST. ¹¹ In ähnlicher Weise eine weitere Studie ergab, dass 5-HT _1B Expression zu erhöhten Explorationsverhalten im OFT, konsistent mit einem Anti-Angst-Phänotyp mit dieser Methode. ¹² Stereotaktische Injektionen können cre Virus zu liefern, um die Rekombination in cre-loxP-Mäusen zu induzieren . Diese Methode wurde verwendet, um die Y2-Rezeptor in die Amygdala und der Bettkern der Stria terminalis selektiv zu löschen. Auf Verhaltensanalyse wurden diese Mäuse mit einem anti-depressive Phänotyp, wenn das Gen in der zentralen Amygdala gelöscht gefunden, aber keine Phänotyp, wenn das Gen in die basolaterale Amygdala oder Bett Kern der Stria terminalis gelöscht. ^13. Somit ist diese Technik bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die genetischen Auswirkungen auf die Tierverhalten zu studieren.

Protocol

HINWEIS: Alle Protokolle mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege der Pennsylvania State University folgte, IACUC # 44057

1. Lentivirus Produktion

HINWEIS: Der Tag vor der Transfektion sollten LentiX-293-Zellen bei 80% Konfluenz sein.

1. Spülen Zellen mit DMEM kurz vor der Transfektion und Inkubation in 10 ml DMEM / 10% FBS mit Penicillin (100 IU / ml) und Streptomycin (100 ug / ml) für 5 min bei RT.
2. Verdünnte DNA und Polyethylenimin (PEI) (1 mg / ml) im Verhältnis 1: 3 (1 ug DNA: 3 ul PEI) in 1 ml DMEM und Vortex für 1 min. Das Volumen der DNA gegeben ist abhängig von der Konzentration der DNA. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
   1. Beispielsweise verwenden 20 ug Plasmid-DNA, bestehend aus 10 ug Vektorplasmid wurden 5 ug Plasmid psPax2 ^14, 5 ug des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) mit 60 ul von PEI pro Schale.
3. 1 / 10tel Volumen von Gesamtkulturmedium DMEM (dh 1 ml für 10 ml Kulturmedium in einem 100-mm-Schale). 1 ml der DNA-PEI-Mischung tropfenweise in die Schale und schwenken die Schale herum, bis zu dem Kulturmedium ist allgemein mit der DNA gemischt.
4. Inkubation für 6 Stunden bei Raumtemperatur und Entfernen des Überstandes. 5 ml Kulturmedium.
5. 48 h nach der Transfektion zu sammeln Virusüberstand und Schleudern bei 627 xg für 5 Minuten bei 4 ° C in einem 50 ml-Röhrchen. Filter 30 ml Virusüberstand durch ein 0,45 um-Spritzenfilter in ein Ultrazentrifugenröhrchen.
6. In sterilem Wasser, um die Rohre auszugleichen, und decken Rohre mit kleinen Stück Parafilm. Spin-Röhrchen bei 11.249 × g für 120 min bei 4 ° C. Entfernen Flüssigkeit unter Verwendung einer Vakuumspitze.
7. Füge 100 & mgr; l kaltem PBS Rohres. Schwenken Sie die Röhrchen bei 4 ° CO / N.
8. Um erneut zu suspendieren, das Virus, Pipetten ter PBS hinzugefügt in Schritt 1.8 über die Pellet 10-mal, darauf achten, daß das Pellet mit der Spitze berühren. Das Pellet wird nicht erneut suspendiert werden, bis diese abgeschlossen ist.
9. Aliquot des Virus bei 10-20 & mgr; l pro Röhrchen, flash-freeze in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C.

2. stereotaktische Injektion

2.1) Herstellung des Instruments

1. Platzieren Sie eine Schere, blunt-end Pinzette, ein Nadelhalter, Skalpell, Wattestäbchen und ein Tuch in einer versiegelten Packung mit einem Sterilisationsindikator, und Autoklaven vor der Operation. Darüber hinaus erhalten 10% Povidon-Iod, 70% Ethylalkohol, resorbierbares Nahtmaterial, ein Heizkissen, künstliche Tränen, eine Glasperlen Sterilisator, bohren, ein Bohrer, 2 Einwegspritzen, Injektionsspritze, Elektrorasierer, analgetische (Ketoprofen), Narkose (avertin), Handschuhe und eine stereotaktische Vorrichtung mit der Einspritzpumpe.
2. Machen 1,25% Avertin Lösung frisch an diesem Tag, Filter in eine sterile Haube unter Verwendung eines 0,2 &# 181; m sterile Spritzenfilter, und in einen sterilen Serumampulle. Mischungs 2,5 g 2,2,2-Tribromethyl Alkohols in 5 ml tert-Amylalkohol, dann lösen sich in 200 ml Wasser. Halten Sie den pH-Wert unter 5. ¹⁵

2.2) Herstellung der Maus

1. Verwalten avertin bezogen auf das Gewicht der Maus (375 mg / kg). ¹⁵ Spritzen Sie die Maus mit dem avertin über eine intraperitoneale (IP) Injektion, und legen Sie dann zurück in seinen Käfig, bis sie vollständig betäubt.
2. Geben Sie ein Analgetikum über IP-Injektion (ketaprofen, 5 mg / kg) und Platz künstliche Tränen in den Augen der Maus, um ein Austrocknen zu verhindern.
3. Stellen Sie sicher, dass die Maus ist komplett eingeschlafen durch Kneifen ihren Fuß. Wenn die Maus reagiert auf den Fuß Prise, dann geben Sie mehr Anästhetikum (in Dosen von 50 & mgr; l). Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einem elektrischen Rasierer. Rasieren Sie die Gegend auf (typischerweise von nur hinter den Ohren, an die Spitze der Schnauze) betrieben werden, und die Umgebung.
4. Platzieren Sie die Maus into stereotaktischen Apparat. Verriegeln Sie die Vorderzähne auf der vorderen Klammer, und senken Sie die Klemme und ziehen Sie sie so, dass der Kiefer ist völlig sicher.
5. Setzen Sie die Ohr Bars in den Gehörgang, den Kopf voll zu stabilisieren. Achten Sie darauf, die Ohr Bars in zu weit Einsatz, der das Innenohr beschädigen könnten. Sobald Sie fertig sind, sollte der Körper der Maus in der Lage, ohne Unterbrechung der Position der Kopf leicht bewegt werden können.
6. Legen Sie ein Heizkissen unter der Maus, um die Körpertemperatur der Maus die während des gesamten Verfahrens zu regeln.
7. Reinigen Sie den OP-Bereich gründlich. Mit einem Wattestäbchen, reiben 10% Povidon-Jod in einer Kreisbewegung, ausgehend von der Mitte der Operationsstelle und nach außen bewegt. Dann, mit einem Wattestäbchen zu 70% Ethylalkohol auf der Operationsstelle in der gleichen Weise zu reiben. Wiederholen Sie zweimal.

2.3) den ersten Schnitt

1. Sobald die Maus vorbereitet, öffnen Sie die sterile Ausrüstung Tasche. Wechseln Sie die Handschuhe vor Touching der Instrumente. Nehmen Sie die sterile Tuch und legen Sie die Instrumente auf dem Tuch. Wenn jedes Instrument ein un-sterile Oberfläche berührt, verwenden Sie die Glasperle-Sterilisator für 15 Sekunden, um sie zu sterilisieren.
2. Nehmen Sie das Skalpell in der dominanten Hand und blunt-end Pinzette in der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die stumpfen Enden Pinzette vorsichtig Griff der Haut der Maus, und einen Einschnitt mit dem Skalpell. Beginnen Sie den Schnitt etwa 1,5 cm oberhalb der Ohren (in Richtung der Nase) und erstrecken sich auf etwa 0,5 cm unterhalb der Ohren. Verlängern Sie den Schnitt vertikal in der Mitte des Kopfes der Maus zu Bregma freizulegen (Abbildung 1).
3. Sobald bregma visualisiert, nehmen Sie eine sterile Wattestäbchen vorsichtig den Blut, die die Oberfläche des Schädels. Verwenden Sie zwei Baumwoll-Tipps, um die Haut in Richtung der Seite des Kopfes zu drücken.

2.4) Geräte-Setup

1. Nach jeder Blut wird von der Oberfläche des Schädels entfernt und Bregma ist deutlich sichtbar, bereiten Sie die Spritze (contration von 10 ⁸ TU / ml, das Volumen von 1 & mgr; l). Im Abzug, füllen Sie die Spritze mit dem Virus injiziert werden. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen sind im Inneren. Legen Sie die Spritze in der stereotaktischen Apparat, um sicherzustellen, dass sie vollständig gesichert ist.
2. Langsam senken Sie die Spritze, bis er direkt über der Oberfläche des Schädels, so dass die Spitze der sterilen Spritzennadel an der Kreuzung von Bregma und der interauralen Linie gesetzt. Stellen Sie diesen Punkt als Null ist, und bestimmen, Koordinaten von diesem Punkt.
3. In Abhängigkeit von der Hirngebiet, variieren die stereotaktischen Koordinaten. Bestimmen Sie diese Koordinaten durch die Verwendung eines Hirnatlas ^4. Sobald die Koordinaten festgelegt sind, bewegen Sie die Nadel der Spritze, um diese Koordinaten entsprechen. Ziel Gyrus dentatus unter Verwendung der Koordinaten: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Senken Sie die Nadel nach rechts über den Schädel zu visualisieren, wo das Loch muss gebohrt werden.
4. Heben Sie die Spritze leicht, nehmen Sie den Bohrer und setzen Sie den Bohrer bit direkt über dem Ziel Bohrstelle bei etwa 45 ° Winkel auf den Schädel. Beginnen Bohren, Bohren und halten, bis der Schädel weicht. Wenn der Schädel nachgibt, kann ein Abfall des Widerstands erfasst werden. Achten Sie darauf, in das Gehirn zu bohren, um Rindenschäden vorzubeugen.
5. Nehmen Sie eine sterile Wattestäbchen und wischen Sie das Blut aus dem Loch.
6. Senken die Spritze, so daß sich die Spitze befindet sich direkt auf der Oberfläche des Gehirns (nicht den Schädel). Gesetzt den D / V-Koordinate (Tiefe) auf 0. Nieder die Spritze in der gewünschten Tiefe auf der Grundlage der Gehirnatlas Koordinaten. Um den Gyrus dentatus, stellen D / V bis -1,79 mm zu erreichen.
7. Startet die Injektion mit einer Geschwindigkeit von 0,2 ul / min. Zu beobachten, um sicherzustellen, dass die Spritze nicht niedriger als rutschen die gewünschte Tiefe. Wenn dies geschieht, hebe die Spritze in der gewünschten Tiefe wieder.
8. Nach der Injektion abgeschlossen ist, warten Sie etwa 2 Minuten, um sicherzustellen, dass jede Restvirus absorbiert wurde. Langsam heben Sie die Spritze und verwenden Sie ein Wattestäbchen, um jede li entfernenquid von der Injektionsstelle.
9. Wiederholen Sie für die andere Hemisphäre.

2.5) Naht

1. Entfernen Sie die steriles Naht und Nadel aus ihrer Verpackung und Griff die Nadel mit Hilfe der Nadelhalter. Stellen Sie sich der spitze Kante der Nadel weg von dem Nadelhalter. Halten Sie die stumpfen Enden Pinzette in der nicht-dominanten Hand, und verwenden Sie es zu greifen die Haut an der Maus. Beginnen Sie mit der dominanten Hand.
2. Schieben Sie den Faden durch die Haut und mit den glatten Enden Pinzette, um die Haut auf der anderen Seite des Einschnitts zu greifen. Ziehen Sie das Nahtmaterial durch, bis etwa 0,75 Zoll bleibt.
3. Lassen Sie die Nadel, und verwenden Sie die stumpfen Enden Zangen, um den Faden um den Nadelhalter einmal wickeln, dann greifen die restlichen 0,75 Zoll Naht mit dem Nadelhalter, und ziehen Sie den Faden durch, so dass die Nadel und Nadelhalter am Ende auf der Seite des Kopfes entgegengesetzt zu jener, die sie ursprünglich auf. Dies sollte einen Knoten zu bilden.
4. Wiederholen Sie diesen Schrittdrei weitere Male abwechselnd die Kopfseite der Nadelhalter endet auf jeder Zeit.
5. Schneiden Sie den Faden und wiederholen Sie die Schritte 2.5.1-2.5.3 bis der Schnitt geschlossen.

2.6) postoperative Pflege

1. Entfernen Sie vorsichtig die Ohr Bars von der Maus, und entfernen Sie die Kiefer von der vorderen Klammer.
2. Halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, bis er wacht auf und bewegt sich auf seine eigenen. Überwachen Sie die Maus täglich, und zu halten und Ausschau nach Anzeichen von Schmerzen, wie zum Beispiel nicht Putzen, Essen oder Trinken. Geben Sie zusätzliche analgetische als notwendig erachtet wird.

3. Öffnen Sie Field Test

3.1) einrichten

1. Erhalten Sie leeren Platz, Kunststoff-Arena mit den Abmessungen 50 cm x 50 cm, mit 50 cm hohen Wänden (kann aber etwas größer sein). Reinigen der Arena mit 70% igem Ethylalkohol vor dem Beginn des Experiments. Stellen Sie sicher, der Ethylalkohol vollständig, bevor Sie eine Maus in die Arena getrocknet.
2. Legen Sie die Arena auf demBoden und versuchen sicherzustellen, wird die Beleuchtung eingestellt, um Schatten und Blendung zu minimieren.
3. Bei Verwendung von Tracking-Software, positionieren Sie die Kamera direkt über dem offenen Feld, etwa 1,5 Meter über dem offenen Feld (weit genug weg, um es im voller umfassen den gesamten Arena, aber nahe genug, um einen klaren Blick auf die Maus haben).
4. Richten Sie eine Zone in der Mitte der Box (etwa einer Fläche von 30 cm x 30 cm). ^16. Um eine Zone festzulegen, klicken Sie auf der Registerkarte Zone 1 in der Seitenwand.
   1. Wählen Sie eine Form Umriss in der oberen Platte, und stellen den Umfang der Mittelzone. Wählen Sie hinzufügen Zone, und klicken Sie auf der Innenseite der Mittelzone. Mit den Programmeingabeaufforderungen, Name der Zone (dies wird als "Zentrum" für dieses Verfahren bezeichnet). Wenn die Verhaltenstest wird mit der Hand erzielt werden, stellen Sie sicher, dass der Boden des Feldes wird in 10 cm x 10 cm große Quadrate aufgeteilt, mit Klebeband markiert.
5. Einrichten der Software, so dass die Einstellungen korrekt sind, und sich die Maus leicht visiBLE auf dem Bildschirm. Erreichen dies durch Einstellen der Erkennungseinstellungen auf der Maschine mit dem Testfeld (Beleuchtung) und Maus Farbe kompatibel zu sein.
   Hinweis: Wenn die Einstellungen korrekt sind, sollte das System nur die Maus keine Schatten oder Urin / Fäkalien zu verfolgen, und nicht. Die spezifischen Software-Einstellungen sind abhängig von der Beleuchtung der Arena, und die Farbe der Maus.

3.2) Akklimatisierung und Test

1. Bewegen Versuchsmäusen in die Verhaltensraum 1 h vor dem Test, um sie an ihre Umgebung akklimatisieren. Lassen Sie die Mäuse in ihrem Käfig für die Akklimatisierung.
2. Schalten Sie die Kamera auf Band die Verhaltensaufgabe und setzen Sie die Maus auf die Mitte vor der Arena, so dass die Maus vor der Wand.
3. Stellen Sie den Timer für 5 Minuten, und Schritt weg von der Arena. Wenn möglich, den Raum verlassen, um die Maus nicht versehentlich zu beeinflussen.
4. Nach 5 Minuten um sind, entfernen Sie die Maus und legen Sie sie in ihrem Käfig.
5. Verwenden Sie 70% Ethylalkohol, gründlich reinigen, die Feld, bevor Sie zum nächsten Maus. Stellen Sie sicher, der Ethylalkohol vollständig getrocknet ist.

3.3) Scoring

1. Betrachten Sie die Maus als in der Mitte des Feldes, wenn alle vier Pfoten sind in der Mitte 30 cm x 30 cm.
2. Quantifizieren, wie viel Zeit die Maus in der Mitte verbringt. Alternativ bestimmen diesmal mit Tracking-Software (wie Noldus ethovison).
   1. Um dies zu tun, gehen Sie auf die Registerkarte Analyse, und klicken Sie auf "Bewegung" zu analysiereProfile. Löschen Sie die aktuell eingestellten Kategorien, und wählen Sie dann "in der Zone" auf der Registerkarte Standort. Wählen Sie die Mittelzone. Als nächstes wählen Sie "Analyse-Ausgang" (unter der Registerkarte Ergebnisse), um Ergebnisse anzuzeigen. Eine Tabelle mit den Zeitaufwand für immobile für jede Studie sollte angezeigt werden.
3. Ansonsten punkten die OFT mit der Hand. Das offene Feld sollte 25 10 cm x 10 cm Quadrate auf dem Boden des ope umrissen habenn Feld (wie in Schritt 3.1.3 beschrieben). Quantifizierung der Menge an Zeit verbringt die Maus in der Mitte, die neben der Anzahl der Einträge in die Mitte der Bahn. ¹⁶
   HINWEIS: Die Mitte 30 cm x 30 cm Gegend gilt als das Zentrum der offenen Feld. Eine Maus wird als bewohnen die Mittelregion, wenn alle vier Pfoten sind in der 30 x 30 cm-Bereich betrachtet.

4. Forced Swim-Test

Hinweis: Lassen Sie mindestens fünf Tage zwischen Verhaltensaufgaben.

4.1) einrichten

1. Besorgen Sie sich einen 2 L klare Eimer füllen und mit 22 ° C Wasser. Setzen Sie den Eimer auf einem Tisch, und versuchen Sie es, um sicherzustellen, wird die Beleuchtung eingestellt, um Schatten und Blendung zu minimieren.
2. Bei Verwendung von Tracking-Software, positionieren Sie die Kamera direkt über dem Eimer.
3. Up-Software so einstellen, dass die Maus leicht auf dem Bildschirm sichtbar.

4.2) Akklimatisierung und Test

1. Bewegen Versuchsmäusen in den Verhaltens room 1 Stunde vor dem Test, um die Umgebung zu gewöhnen. Lassen Sie die Mäuse in ihrem Käfig für die Akklimatisierung.
2. Schalten Sie die Kamera auf Band die Verhaltens-Aufgabe. Sanft, platzieren Sie die Maus in der Mitte der Eimer Wasser. Achten Sie darauf, nicht auf die Maus in fallen zu lassen. Langsam senken Sie die Maus, so dass seine Vorderpfoten zuerst das Wasser berühren. Achten Sie darauf, den Kopf von Untertauchen zu verhindern.
3. Stellen Sie den Timer für 6 min, und Schritt weg von der Verhaltensbereich.
4. Nach 6 Minuten um sind, entfernen Sie die Maus aus dem Eimer, und wischen Sie überschüssiges Wasser ab, bevor Sie die Maus wieder in ihren Käfig.

4.3) Scoring

1. Bei Verwendung von Tracking-Software, stellen Prozent Unbeweglichkeit bis 11%, wie durch Noldus empfohlen (dies sollte die Standardeinstellung), um Zeit zu quantifizieren schwimm vs. Schwimmen.
2. Zur Quantifizierung mit dem Tracking-System, öffnen Sie die Registerkarte Analyse, und klicken Sie auf Bewegung unter Analyseprofile. Löschen Sie die aktuell eingestellten Kategorien, und wählen Sie dann Mobilitätszustand aufder linken Seitenwand (unter individuellen Verhalten). Eingestellt Unbeweglichkeit bis 11%.
3. Wählen Sie Track-Visualisierung, unter der Registerkarte Ergebnisse. Wählen Sie Analyse-Ausgang (unter der Registerkarte Ergebnisse), um Ergebnisse anzuzeigen. Eine Tabelle mit den Zeitaufwand für immobile für jede Studie sollte angezeigt werden.
4. Wenn die Hand Scoring, messen die Zeit, die Maus verbringt Schwimmen oder Klettern und Höhe der Zeit die Maus immobile verbringt. Zusätzlich messen die Latenz bis zum ersten Mal unbeweglich. Siehe Abbildung 2 in Ergebnisse Section.

Representative Results

Genaue stereotaktische Injektion stützt sich stark auf die Einstellung der richtigen Koordinaten. Die Spitze der Nadel verwendet, um das Virus zu injizieren sollte direkt an der Kreuzung der Bregma und der interauralen Linie (Abbildung 1) eingestellt werden. Es ist hilfreich, ein Stereomikroskop verwenden, um festzustellen, ob die Nadel richtig sitzt. Beim Blick durch das Mikroskop, sollte die Nadel positioniert werden, dass, wenn das Virus injiziert wurden, wäre es direkt an der Kreuzung der Bregma und der interauralen Linie landen. Das heißt, die Öffnung der Spritzennadel sollte sich direkt über dem Schnittpunkt angeordnet werden. In dieser Studie wurde ein Lentivirus exprimieren shRNA gegen RBM8a, einem Kernfaktor im Exonverbindung Komplex wurde in den Gyrus dentatus injiziert. Lentivirus drückt auch RFP infizierten Neuronen zu beschriften. 2 zeigt, dass das Virus in den richtigen Bereich injiziert, wie durch die Rot-Signal (Figur 3) angegeben.

_content "> Um Bedeutung in Verhaltens Aufgaben zu erzielen, sollte die Probengröße von 12 bis 15 Mäuse pro Gruppe reichen. Behavioral Aufgaben können zwei Wochen nach stereotaktischen Injektionen durchgeführt werden. In der OFT, vorhanden ist eine ängstliche Phänotyp, wenn Mäuse deutlich weniger Zeit in verbringen das Zentrum des offenen Feld im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass der Zuschlags RBM8a im Gyrus dentatus von erwachsenen Mäusen zu besorgt Verhaltensweisen (p <0.05, Abbildung 4). In der FST, gab es keine offensichtlichen Unterschiede in Bewegungslosigkeit zwischen Kontroll- und Versuchsmäusen, was darauf hindeutet, dass RBM8a Zuschlags im Gyrus dentatus beeinflusst nicht anti-depressive Verhalten (Abbildung 5). Die statistische Analyse bestand aus der Durchführung einer zweiseitigen, zwei Abtast- ungleiche Varianz t-Test.

Abbildung 1: Schnittpunkt von Bregma und der Interklanglichen Linie. Für die stereotaktische Injektionen, die Spritzennadel sollte mit dem Schnittpunkt der Bregma und der interauralen gezeichnet werden. Dieser Punkt wird auf Null gesetzt.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zeitachse für die gesamte Experiment.

Abbildung 3: Repräsentative Hirnschnitt veranschaulicht, erfolgreiche Injektion des Virus in den Gyrus dentatus Der Maßstab = 100 & mgr; m..

Abbildung 4: Die Zeit, die Kontrolle und Versuchsmäusen in der Mitte eines Novel Open Field Gesamte Experimentelle Mäuse verbringen signif.kant weniger Zeit in der Mitte der Arena, was auf eine ängstliche Phänotyp (N = 9-11, *, T ₁₈ = -2,72, p <0,05, Mittelwert ± SEM)

Abb. 5: Die Zeit, die Kontrolle und Versuchsmäusen sind unbeweglich in der FST Versuchsmäusen nicht von den Kontrollen in der Zeit verbrachte immobile unterscheiden (N = 9-11, T ₁₈ = 1,25, p> 0,05, Mittelwert ± SEM)

Discussion

Erfolgreiche stereotaktische Injektionen verlassen sich auf drei Faktoren ab: Halten Sie die Maus lebendig, Einstellung der korrekten Nullpunkt für Koordinaten (Spitze der Nadel an der Kreuzung der Bregma und der interauralen Linie) und die Einstellung der richtigen Tiefe auf den Nullpunkt (Spitze der Nadel leicht berührt die Außenseite des Hirngewebe). Die Lebensfähigkeit der Mäuse ist wichtig. Chirurgie Überleben kann, indem sichergestellt wird, dass die Maus richtig betäubt und erhält eine angemessene analgetische unterstützt werden. Schmerz ist bekannt, eine wichtige Ursache von schlechter Genesung nach der Operation sein. Sicherstellung, dass die Maus vollständig in der gesamten Operation narkotisiert (es sollte nicht zu Fuß drückt zu reagieren), und gibt die korrekte Dosis von Analgetikum (bezogen auf das Gewicht der Maus) sollte pežití. ^17. Darüber hinaus sollte die Maus auf aufzubewahren ein Heizkissen in der gesamten Operation Prozess, bis sie aufwacht aus der Narkose. Mäuse können ihre Körpertemperatur nicht regulieren, wenn sie betäubt sind. Ihren Körper Temperamenttur wird während der Operation Prozess erheblich sinken. Auch wenn die Länge der stereotaktischen Operation relativ kurz ist, könnte Hypothermie ernsthaft das Überleben der Mäuse beeinträchtigen. Proper Nahttechnik ist auch maßgeblich an der Durchführung einer erfolgreichen Operation. Mäuse werden versuchen, an ihren Fäden aufnehmen, so ist es von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Nähte sind fest genug, um die Entfernung zu verhindern, aber nicht zu fest, um zu viel Spannung auf die Wunde gelegt. Vier Knoten in jedem Stich sollte sicherstellen, dass die Maus nicht in der Lage, um die Naht zu entfernen. Proper Nähen ist wichtig, da eine offene Wunde wird die Anfälligkeit für Infektionen, die sich negativ auf alle Verhaltensexperimenten beeinflussen würden erhöhen.

Das OFT ist eine Verhaltens Paradigma entwickelt, um die Fortbewegung und die ängstliche Phänotyp in Mäusen zu bewerten. Bei der Prüfung der Maus Verhalten, ist es wichtig, sehr vorsichtig sein beim Umgang mit den Mäusen und Einrichten der Arena. Im OFT wird das Paradigma entwickelt, um der Maus die Befürchtung whe Paarn in einer neuen Umgebung platziert, mit seiner natürlichen Neugier und Lust, Neuheit zu entdecken. Ein Wildtyp-Maus wird zunächst zögerlich, um die Mitte des freien Feld, wo er anfälliger ist geben, aber wird schließlich dazu aufgrund ihrer angeborenen Neugier. In einem besorgten Maus, wird die Auffassung der Überquerung eines anfälliger Raum (die Mitte des Feldes) größer ist als ihre natürliche Neugier und der Wunsch, zu erforschen, was in deutlich weniger Zeit in der Mitte verbracht Ergebnis. Um sicherzustellen, dass das Paradigma ordnungsgemäß funktioniert, ist es wichtig zu betonen, mit den anderen über das offene Feld Faktoren zu minimieren. Stress kann, indem man die Maus, um auf die Verhaltensraum (so die äußere Umgebung ist nicht eine mögliche Verwechselung Variable) zu gewöhnen, und die Reinigung der Bereich zwischen Mäusen, zu garantieren, dass alle Gerüche mit der vorherigen Maus assoziiert entfernt worden sind, minimiert werden. ¹⁸ Diese Schritte sollten helfen, alle Unterschiede, die durch unsachgemäß verursacht werden, zu beseitigen handling Mäusen. In dieser Studie, verbrachte RBM8a Zuschlags Mäusen deutlich weniger Zeit in der Mitte eines neuartigen offenen Feld, im Vergleich zu Kontrollen. Dies ist ein Hinweis auf eine ängstliche Phänotyp, da die Mäuse sind mehr zögern, die Mitte des neuen offenen Feld, wo sie sind anfälliger, im Vergleich zu Kontrollen geben.

Die FST soll die anti-depressive Phänotyp bei Mäusen zu untersuchen. Wenn in einem Eimer mit Wasser gebracht werden Mäuse, die signifikant weniger Zeit schwimm gegen Schwimmen als eine anti-depressive Phänotyp haben. Unbeweglichkeit im Forced Swim Test als behavioral despair interpretiert (zB Verzicht auf). Dieses Paradigma wird durch antidepressive Behandlung validiert. ^7,8,9 Mäuse, erhalten Antidepressiva wird deutlich weniger Zeit damit verbringen, schwimmend im Vergleich zu Kontrollen, die indikativ für eine anti-depressive Phänotyp. In dieser Studie RBM8a Zuschlags Mäusen nicht signifikant von den Kontrollmäusen in der Zeit verbrachte immobile abweichen. This gibt an, dass RBM8a Zuschlags im Gyrus dentatus von erwachsenen Mäusen ist eine depressive oder anti-depressive Phänotyp nicht zu entlocken. In unserer früheren Studie RBM8a Expression im Gyrus dentatus von erwachsenen Mäusen erheblich Zeit unbeweglich gegenüber den Kontrollen ¹⁶ ab, was eine antidepressive Wirkung zeigt.

Die stereotaktische Injektionen für die Darstellung in diesem Dokument verwendet wurden, um den Gyrus dentatus gezielt. Gyrus dentatus wurde als Zielstelle gewählt, da das Gen von Interesse ist hoch dort im adulten Maus ausgedrückt. Darüber hinaus hat der Gyrus dentatus mit Depression und Angst verbunden. Beispielsweise verwendet eine Studie POMC-CHR 2 Mäusen zur selektiven Aktivierung der Körnerzellen in entweder der dorsalen oder ventralen Gyrus dentatus. Aktivierung der sowohl die dorsalen und ventralen Gyrus dentatus zu erhöhten Erforschung einer neuen Umgebung, was auf eine mögliche Rolle des Gyrus dentatus von Angst. ¹⁹ Eine andere Studiefestgestellt, dass Mäuse, die mit Neurogenese beeinträchtigt hatte Unbeweglichkeit in der FST erhöht, was auf eine depressive Phänotyp. ²⁰ Außerdem Aktivierung Ap von oa ₁ im Vorderhirn zu einer antidepressiven Wirkung in der FST, Neuheit drückt Fütterung und Saccharose Verbrauchstest. Wenn VEGF zerlegt im Gyrus dentatus von Ap von oa ₁ wurde diese antidepressive Phänotyp verloren. ²¹ Diese Daten legen nahe, dass der Gyrus dentatus hat eine Rolle in der Pathophysiologie von Angst und Depression, und zeigte, dass die Gyrus dentatus kann ein gutes Gebiet für unsere genetische Modulation und Verhaltensexperimente Ziel. A Lentivirus wurde speziell verwendet, so dass alle Zellen im Gyrus dentatus würde infiziert, im Gegensatz zu nur sich teilende Zellen (Retrovirus).

Eine Kombination dieser drei Versuchsanordnungen (zusätzlich zu anderen Verhaltens Aufgaben) ist ein neuartiger Weg zum Verhaltensphänotypen in Mäusen zu bewerten, da ein Virus in eine spezif injiziert werdenic Gehirnbereich an spezifischen Entwicklungszeiten. Verwendung stereotaktische Injektionen eines Lentivirus gepaart mit Verhaltensaufgaben dauert nur ein paar Monate in Anspruch und ermöglicht es den Forschern präliminäre Daten über die Auswirkungen auf das Verhalten der Genexpression in einem bestimmten Hirnareal zu sammeln. Im Gegensatz dazu nehmen bedingte Knockout-Mäusen oft Jahre, um zu erzeugen. Darüber hinaus können Zelltyp bevorzugt von Viren verwendet werden, um weitere Zielzellen werden. So kann beispielsweise Retroviren infizieren nur teilenden Zellen (wie zB neurale Stammzellen im Gyrus dentatus), während ein Lentivirus infiziert alle Zelltypen. ^22,23 So zusammen mit Co-Injektion, bieten diese weit verbreiteten und individuell validiert experimentelle Protokolle schnell in übersichtlicher Weise die Rolle der spezifischen Gens gezielt Gehirnbereich zu testen, auf Auslösern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder