Summary
הזרקת stereotactic של lentiviruses להביע cDNAs או shRNAs יכול לווסת ביטוי גנים באזורים ספציפיים במוח של עכברים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשלב זריקות stereotactic עם משימות התנהגותיות, כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST).
Abstract
הזרקת stereotactic היא טכניקה שימושית כדי לספק lentiviruses גבוה כייל לאזורים במוח ממוקדים בעכברים. Lentiviruses יכול גם ביטוי יתר או ביטוי גני מציאה באזור יחסית ממוקד ללא פגיעה משמעותית ברקמת המוח. לאחר התאוששות, העכבר המוזרק יכול להיבדק על משימות התנהגותיות שונות כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST). OFT נועד להעריך את התנועה ואת הפנוטיפ החרדה בעכברים על ידי מדידת משך זמן שמבלה עכבר במרכז שדה פתוח רומן. עכבר חרד יותר ישקיע פחות באופן משמעותי זמן במרכז שדה רומן השוואה לקבוצת ביקורת. FST מעריך את הפנוטיפ אנטי-דיכאון על ידי כימות את כמות הזמן שמבלים עכברים נייחים כאשר הניחו לדלי של מים. עכבר עם פנוטיפ אנטי-דיכאון יבלה נייח פחות זמן באופן משמעותי לעומת שליטת בעלי חיים. המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש בsterהזרקת eotactic של lentivirus בשיתוף עם בדיקות התנהגותיות להעריך כיצד גנטי גורמים לווסת התנהגויות של בעלי חיים.
Introduction
העכבר כבר בשימוש נרחב בנוירוביולוגיה כי זה קל לתפעל גנטי. טכניקות נוקאאוט הגן מאפשרות לחוקרים לחקור כיצד כל גורם גנטי מעצב התנהגויות עכבר. יתר על כן, מערכת cre-loxP מספקת כלי רב ערך עבור דקיק ובתא type- נוקאאוט ספציפי גן בעכברים, המאפשר לחוקרים ללמוד תפקוד גן ברקמות שונות. 1 עם זאת, בפועל, דפוסי ביטוי של יזמי cre קשים לשליטה , ועד כה רבים cre נהגים הוקמו לא השיגו ביטוי ספציפי לאזור. 2,3
לחלופין, הזרקת stereotactic היא שיטה שמכוונת אזורים ספציפיים במוח של העכבר הבוגר. על ידי הזרקת וירוסים מהונדסים גנטי לבטא cDNA או shRNA, אפנון האזור ספציפי של ביטוי גנים יכול להיות מושגת. למרות שגודל המוח של כל עכבר משתנה, המיקום של אזורים מסוימים במוח ניתן לקבוע באמצעות coordi stereotacticנטס להגדיר מציוני הדרך בגולגולת של מוח העכבר. ציוני הדרך הנפוצות ביותר הן גבחת, למבדה, וקו interaural. באמצעות קואורדינטות מתקבלות מאטלס מוח, 4 המיקום המדויק של כל אזור במוח ניתן לזהות על ידי Antero-האחורי (/ P), (M / L) המדיאלי-צדדי, וגב-הגחון (D / V) צירים מ גבחת / צומת קו interaural. בדרך כלל וירוסים שהוחדר לתוך מוחם של עכברים מתויגים עם או חלבון אדום, או ירוק ניאון (RFP או GFP), כך שניתן תהיה אישרו זריקות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערכות התנהגות של עכברים נחוצות במיוחד למחקר בסיסי של הפרעות פסיכיאטריות. סימפטומים של הפרעות פסיכיאטריות בחולים בדרך כלל כרוכים בהתנהגויות חריגות. חלק מהתנהגויות האנושיות אלה אבולוציונית שימור וניתן חיקה ישירות ונצפה בעכבר. לדוגמא, דיכאון יכול להיות מודל בעכבר על ידי מדידת ייאוש התנהגות. אנשים עם דיכאון לעתים קרובותen מרגיש כאילו שום דבר שהם עושים אי פעם לעזור, סימפטום שיכול סופו של דבר להוביל להתאבדות. במכרסמים, זה יכול להיות מודל באמצעות הבדיקה בכפייה לשחות (FST), אשר מודדת את כמות הזמן שעכבר שחיה לעומת צף בבריכה של מים (נתפס כויתור). פרדיגמה זו אומתה על ידי הצלת פנוטיפ עם תרופות נגד דיכאון. 7,8,9 עכברים שקבלו תרופות נגד דיכאון יבלה נייח זמן באופן משמעותי פחות בהשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה. עוד מבחן התנהגותי, מבחן שדה הפתוח (OFT) נועד להעריך את התנועה בעכברים, וגם יכול לשמש כדי לנתח את הפנוטיפ החרדה בעכברים. 5,6 מבחן זה מבוסס על ההנחה שהעכברים מרגישים בטוחים יותר כאשר הם קרובים אל הקיר בשדה פתוח רומן. עכברים מסוג בר סופו של דבר יהיה לחקור את סביבת הרומן, כפי שהם בעלי חיים סקרנים. עם זאת, הוצאות פחות זמן במרכז השדה מציינת חרדה בעכבר, כמו העכבר לא יהיה מסוגל להתגבר על initiaפחד l הביא על ידי סביבת רומן. החרדה של העכבר, כמו לכמת ידי כמות הזמן מושקעת במרכז שדה פתוח, ניתן להשוות לחרדה קלינית בבני אדם, אשר שוהה בהפרעות פסיכיאטריות רבות.
השילוב של זריקות stereotactic עם פרדיגמות התנהגות הוא דרך חדשנית לשנות את הביטוי של גן מסוים באזור מוח ממוקד. ההשפעה של ביטוי גנים מווסת על התנהגויות עכבר אז יכולה להיות נחושה. בניגוד לנוקאאוט המוח כולו, שיטה זו שימושית במיוחד כפי שרק מטרות אזורים ספציפיים במוח. בנוסף, זריקות stereotactic מבוצעות בדרך כלל בעכבר הסוג בר המבוגר, לכן, ביטוי גני אנדוגני נשמר לאורך שלבי התפתחות. שיטה זו תמנע את ההשפעה לבלבל אם נדרש הגן להישרדות בשלב העוברי או לאחר לידה של פיתוח. מגבלה עיקרית אחת היא שעכברי הניסוי צריך ללכת through ניתוח פולשני, שבו יש לי הגולגולות של עכברים שייפתח. יתר על כן, מידת אפנון גן נקבעת על ידי כייל והיעילות של הנגיף. הווירוס צריך להיות מוזרק לאזור הנכון באמצעות קואורדינטות stereotactic, אשר דורש מכשירים מיוחדים. אימות של הזריקה הנכונה יכולה להסתיים רק לאחר המוות.
שיטה זו שימשה בעבר כדי לבדוק את מעורבותם של גנים ספציפיים במחלות נוירולוגיות שונות. לדוגמא, RNAi בתיווך ויראלי מיקוד גן Th (המאפשר דופמין להיות מסונתז) הוזרק לcompacta nigra substantia, וניתוח ההתנהגות של התנועה נערך. 10 מחקר נוסף המשמש להזרקת stereotactic של DISC1 השתקת lentivirus להעריך התנהגות עכבר ביחס לסכיזופרניה. מציאה של DISC1 הובילה לתנועה מוגברת בתגובה לחידוש (סימפטומים הקבלות חיוביים בסכיזופרניה), וחוסר תנועה גדולה יותר בFST. 11 כמו כן, מחקר נוסף מצא כי ביטוי יתר של 5-HT 1B הוביל להתנהגות גישוש עלתה בOFT, עולה בקנה אחד עם פנוטיפ נוגד חרדה בשיטה זו. 12 זריקות stereotactic יכולות לספק וירוס cre לגרום רקומבינציה בעכברי cre-loxP . שיטה זו שימשה למחוק את קולט Y2 באמיגדלה וגרעין המיטה של terminalis stria סלקטיבי. על ניתוח התנהגות, עכברים אלה נמצאו פנוטיפ אנטי-דיכאון כאשר הגן נמחק באמיגדלה המרכזית, אבל אין פנוטיפ כאשר הגן נמחק באמיגדלה basolateral או גרעין המיטה של terminalis stria. 13 כך, טכניקה זו מספק כלי ייחודי כדי לחקור את ההשפעה הגנטית על התנהגות בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים היו במעקב בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת פנסילבניה, # IACUC 44,057
1. Lentivirus הפקה
הערה: היום לפני transfection, LentiX-293 תאים צריכים להיות בconfluency 80%.
- יש לשטוף את תאים עם DMEM רק לפני transfection דגירה ב 10 מיליליטר של DMEM / 10% FBS עם פניצילין (100 IU / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 5 דקות ב RT.
- לדלל DNA וPolyethylenimine (PEI) (1 מ"ג / מיליליטר) ב 1: 3 יחס (1 מיקרוגרם של ה- DNA: 3 μl של PEI) ב 1 מיליליטר של DMEM ומערבולת דקות 1. הנפח של ה- DNA הוסיף תלוי בריכוז של ה- DNA. לדגור על RT במשך 10 דקות.
- לדוגמא, השתמש 20 מיקרוגרם של פלסמיד דנ"א, מורכב של 10 מיקרוגרם של פלסמיד וקטור, 5 מיקרוגרם של פלסמיד psPax2 14, 5 מיקרוגרם של וירוס stomatitis שלפוחי (VSV) עם 60 μl של PEI לכל צלחת.
- הוסף 1 / נפח 10 של מדיום התרבות הכולל של DMEM (כלומר 1 מיליליטר למדיום תרבות 10 מיליליטר בצלחת 100 מ"מ). הוסף 1 מיליליטר של ירידת תערובת DNA-PEI על ידי ירידה לתוך הצלחת ולערבל את הצלחת סביב עד למדיום התרבות הוא גם מעורב עם ה- DNA.
- דגירה של 6 שעות ב RT ולהסיר את supernatant. הוסף 5 מיליליטר של מדיום התרבות.
- 48 שעות לאחר transfection, לאסוף supernatant וספין נגיפיים ב627 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס בשפופרת 50 מיליליטר. סנן 30 מיליליטר של supernatant ויראלי דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר לצינור ultracentrifuge.
- מוסיף מים סטריליים כדי לאזן את הצינורות, ולכסות את הצינורות עם חתיכה קטנה של parafilm. צינורות ספין ב11249 XG במשך 120 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר נוזלי באמצעות קצה ואקום.
- להוסיף של PBS הקר 100 μl הצינור. נער בעדינות את הצינור על 4 מעלות CO / N.
- מחדש להשעות, לא פיפטה וירוסהוא PBS הוסיף בשלב 1.8 על גלולה 10 פעמים, נזהר שלא לגעת בכדור עם הקצה. גלולה לא מחדש תלויה עד זה הוא מוחלט.
- Aliquot הווירוס ב10-20 μl לכל צינור, הבזק-הקפאה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C.
2. הזרקה stereotactic
2.1) הכנה של מכשירים
- הנח זוג מספריים, מלקחיים בוטה-סוף, בעל מחט, אזמל, צמר גפן, ובד בחבילה אטומה עם מחוון עיקור, וחיטוי לפני הניתוח. בנוסף, להשיג 10% יוד povidone, 70% אתיל אלכוהול, תפרים נספגים, כרית חימום, דמעות מלאכותיות, מעקר זכוכית חרוז, תרגיל, מקדח, 2 מזרקים חד פעמי, מזרק להזרקה, מכונת גילוח חשמלי, משכך כאבים (ketoprofen), הרדמה (Avertin), כפפות, ומנגנון stereotactic עם משאבת הזרקה.
- הפוך 1.25% פתרון Avertin טרי באותו יום, מסנן במנדף סטרילי באמצעות 0.2 &181 #; מ 'מסנן מזרק סטרילי, ואת המקום לתוך בקבוקון סרום סטרילי. מערבבים 2.5 גרם של אלכוהול 2,2,2-tribromoethyl לתוך 5 מיליליטר של אלכוהול טרט-אמיל, אז לפזר ב200 מיליליטר מים. שמור את ה- pH מתחת 5. 15
2.2) הכנת העכבר
- לנהל Avertin מבוסס על המשקל של העכבר (375 מ"ג / קילוגרם). 15 להזריק את העכבר עם Avertin באמצעות הזרקת intraperitoneal (IP), ולאחר מכן למקם חזרה לכלוב שלה עד בהרדמה מלאה.
- תן לשיכוך כאבים באמצעות הזרקת IP (ketaprofen, 5 מ"ג / קילוגרם), ומקום דמעות מלאכותיות על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות.
- ודא שהעכבר הוא ישן באופן מלא על ידי צובט את רגלם. אם העכבר מגיב לקמצוץ הרגל, ואז לתת יותר הרדמה (במינונים של 50 μl). לגלח את הראש של העכבר באמצעות סכין גילוח חשמלי. לגלח את האזור שמסביב לאזור שיופעל על (בדרך כלל מרק מאחורי האוזניים, לחלק העליון של החוטם), ו.
- הנח אותי העכברn כדי מנגנון stereotactic. תפס השיניים הקדמיות על המהדק הקדמי, ולהוריד את המהדק ולהדק אותו כך שהלסת היא מאובטחת באופן מלא.
- הכנס את הברים האוזן לתוך תעלת האוזן כדי לייצב את הראש באופן מלא. היזהר שלא להכניס את הברים אוזן ברחוקה מדי, שעלול לגרום נזק לאוזן הפנימית. ברגע שסיים, הגוף של העכבר צריך להיות מסוגל להעביר מעט מבלי לשבש את עמדתו של הראש.
- הנח כרית חימום מתחת לעכבר כדי לווסת את טמפרטורת הגוף של העכבר לאורך כל ההליך.
- נקה את אזור הניתוח ביסודיות. באמצעות מקלון צמר גפן, למרוח 10% יוד povidone בתנועה מעגלית, החל מאמצע האתר כירורגית ונע כלפי חוץ. לאחר מכן, השתמש מקלון צמר גפן לשפשף 70% אתיל אלכוהול באתר כירורגית באותו אופן. חזור על שתי פעמים.
2.3) ראשית החתך
- ברגע שהעכבר הכין, לפתוח את תיק ציוד סטרילי. כפפות שינוי לפני touching המכשירים. קח את בד סטרילי ולמקם את המכשירים על הבד. אם כל מכשיר נוגע במשטח בלתי-סטרילי, להשתמש במעקר חרוז הזכוכית במשך 15 שניות כדי לעקר אותה.
- קח האזמל במלקחי יד ובוטה סוף הדומיננטיים ביד הלא הדומיננטית. השתמש במלקחיים הבוטה-הסוף לעדינות אחיזת העור של העכבר, ולעשות חתך באמצעות האזמל. בגין החתך כ -1.5 סנטימטרים מעל האוזניים (לכיוון האף) ולהאריך לכ -0.5 סנטימטרים מתחת לאוזניים. להאריך את החתך אנכי באמצע ראשו של העכבר כדי לחשוף את גבחת (איור 1).
- ברגע שהיא דמיינה גבחת, קח טיפ גפן סטרילי כדי להסיר כל דם מכסה את פני השטח של הגולגולת בעדינות. השתמש בשני טיפים כותנה לדחוף את העור כלפי הצד של הראש.
2.4) התקנת ציוד
- אחרי כל דם הוא להסיר את פני השטח של הגולגולת, וגבחת ברורה דמיין, להכין את המזרק (קוןcentration של 10 8 TU / מיליליטר, נפח של μl 1). במנדף, למלא את המזרק עם הווירוס להיות מוזרק. ודא שאין בועות בפנים. מניחים את המזרק במנגנון stereotactic, כדי לוודא שהוא מאובטח באופן מלא.
- לאט לאט להוריד את המזרק עד שהוא ממש מעל פני השטח של הגולגולת, כך שקצה מחט מזרק סטרילי מוגדר לצומת של גבחת וקו interaural. קבע שלב זה כאפס, ולקבוע את קואורדינטות מנקודה זו.
- בהתאם לאזור המוח של עניין, להשתנות קואורדינטות stereotactic. לקבוע קואורדינטות אלה על ידי שימוש באטלס מוח 4. ברגע שהקואורדינטות נקבעות, להזיז את המחט של המזרק כדי להתאים קואורדינטות אלה. מקד את הרכס המשונן באמצעות הקואורדינטות: M / L = +/- 1 מ"מ, / P = -1.82 מ"מ. מנמיכים את המחט לימין מעל לגולגולת לדמיין איפה החור צריך להיות קדח.
- להעלות את המזרק מעט, לקחת את התרגיל ואת המקום דו התרגילימין לא מעל אתר קידוח היעד בכ -45 מעלות זווית לגולגולת. בגין קידוח, ולשמור על קידוח עד הגולגולת נותנת דרך. כאשר הגולגולת נותנת דרך, ניתן להבחין בירידה בהתנגדות. היזהר שלא לקדוח לתוך המוח, כדי למנוע נזק בקליפת המוח.
- קח טיפ גפן סטרילי ולמחות כל דם מהחור.
- מנמיכים את המזרק כך שהקצה יושב ממש על פני השטח של המוח (לא הגולגולת). הגדר את / D V לתאם (עומק) ל0. תחתון המזרק לעומק הרצוי, המבוסס על קואורדינטות אטלס המוח. כדי להגיע לרכס המשונן, D / V מוגדר -1.79 מ"מ.
- התחל ההזרקה בשיעור של 0.2 μl / דקה. צפה כדי להבטיח שהמזרק לא יחליק נמוך מהעומק הרצוי. במקרה זה, בעדינות להעלות את המזרק לעומק הרצוי שוב.
- לאחר ההזרקה נגמרה, לחכות כ -2 דקות על מנת להבטיח שנקלט כל וירוס שיורית. לאט לאט להעלות את המזרק ולהשתמש קצה כותנה כדי להסיר כל liפאונד מאתר ההזרקה.
- חזור לחץ הכדור השני.
2.5 תפירה)
- הסר את התפר ומחט סטרילית מהאריזה ואחיזתה המחט באמצעות מחזיקי המחט. להתמודד עם הקצה המחודד של המחט מבעל המחט. החזק את המלקחיים הבוטה-הסוף ביד הלא הדומיננטית, ולהשתמש בו כדי אחיזת העור בעכבר. התחל עם היד הדומיננטית.
- דחף בעדינות את התפר דרך העור ולהשתמש במלקחיים הבוטה-הסוף לתפוס את העור בצד השני של החתך האחר. משוך את חומר התפר דרך עד 0.75 אינץ 'על נשאר.
- לשחרר את המחט, ולהשתמש במלקחיים הבוטה-הסוף לעטוף את התפר סביב זמן בעל מחט אחת, ולאחר מכן, לתפוס את התפר שנותר 0.75 אינץ 'עם בעל המחט, ולמשוך את התפר דרך, כך שבעל המחט ומחט בסופו של בצד של הראש הפוך לזה שהם היו במקור. זה אמור ליצור קשר.
- חזור על שלב זהעוד שלוש פעמים, לסירוגין בצד של ראש בעל המחט בסופו בכל פעם.
- חותך את התפר ולחזור על צעדים 2.5.1-2.5.3 עד החתך נסגר.
2.6) טיפול שלאחר ניתוח
- הוצא בעדינות את הברים אוזן מהעכבר, ולהסיר את לסתו מהמהדק הקדמי.
- שמור את העכבר על כרית החימום עד שמתעורר ונע סביב בכוחות עצמו. לפקח העכבר יומי, ולשמור ועין על סימנים של כאב, כמו לא טיפוח, אכילה או שתייה. תן לשיכוך כאבים נוספים כאשר הכרחי.
מבחן שדה פתוח 3.
3.1) הגדרה
- להשיג כיכר ריקה, זירת פלסטיק עם ממדים של 50 סנטימטרים X 50 סנטימטרים, עם חומות גבוהות 50 סנטימטר (אבל יכול להיות מעט גדול יותר). נקה את הזירה עם 70% אתיל אלכוהול לפני תחילת הניסוי. ודא אתיל האלכוהול התייבש לחלוטין לפני הצבת עכבר לזירה.
- מניחים את הזירה ברצפה, ולנסות להבטיח התאורה מוגדרת כדי למזער צללים ובוהקים.
- אם אתם משתמשים בתוכנת מעקב, מקם את המצלמה ישירות מעל לשדה הפתוח, כ 1.5 רגל מעל השדה הפתוח (מספיק רחוק כדי להקיף מלא כל הזירה, אבל קרוב מספיק כדי לקבל תצוגה ברורה של העכבר).
- הגדר את האזור במרכז התיבה (כ שטח של 30 סנטימטרים X 30 סנטימטרים). 16 להגדרת אזור, לחץ על כרטיסיית אזור 1 בלוח הצד.
- בחר מתאר צורה בפנל העליון, ומתאר למתחם של אזור המרכז. בחר להוסיף אזור, ולחץ על החלק הפנימי של אזור המרכז. שימוש בהנחיות התכנית, שם האזור (זה יהיה מכונה 'מרכז' לנוהל זה). אם בדיקת ההתנהגות תהיה הבקיע ביד, לוודא את החלק התחתון של השדה מחולק ל- 10 סנטימטרים X 10 סנטימטרים ריבועים, מסומן באמצעות קלטת.
- להגדיר את התוכנה כך שההגדרות נכונות, והעכבר הוא בקלות Visible על המסך. להשיג זאת על ידי התאמת הגדרות זיהוי במחשב כדי להיות תואם עם זירת הבדיקות (תאורה) וצבע עכבר.
הערה: כאשר ההגדרות נכונות, המערכת צריכה לעקוב רק העכבר, ולא כל צללים או שתן / צואה. הגדרות התוכנה הספציפיות תלויות בתאורה של הזירה, ואת הצבע של העכבר.
3.2) הסתגלות ומבחן
- הזז עכברי ניסוי לשעת חדר 1 התנהגותיות לפני הבדיקה על מנת להסתגל לסביבתם. השאר את העכברים בכלוב שלהם להסתגלות.
- הפעל את המצלמה לקלטת המשימה התנהגותיות ולמקם את העכבר לכיוון חזית אמצע הזירה כך שהעכבר עם הפנים לקיר.
- הגדר את השעון במשך 5 דקות, ולהתרחק מהזירה. במידת האפשר, לצאת מהחדר כדי לא להשפיע על העכבר בטעות.
- ברגע 5 דקות הן למעלה, להסיר את העכבר ולמקם אותם בכלוב שלהם.
- השתמש 70% אתיל אלכוהול כדי לנקות ביסודיות את השדה לפני שתמשיך לעכבר הבא. ודא אתיל האלכוהול התייבש לחלוטין.
3.3) ניקוד
- קחו למשל את העכבר כמו להיות במרכז השדה, כאשר כל ארבע כפות נמצאות בתוך 30 סנטימטרים X 30 סנטימטרים באמצע.
- לכמת את כמות הזמן שמבלה את העכבר במרכז. לחלופין, לקבוע זמן זה באמצעות תוכנת מעקב (כגון ethovison Noldus).
- כדי לעשות זאת, ללכת ללשונית הניתוח, ולחץ על "תנועה" בפרופילי ניתוח. מחק את הקטגוריות מוגדרות כעת, ולאחר מכן בחר "באזור" בכרטיסייה המיקום. בחר את אזור המרכז. בשלב הבא, בחר באפשרות "פלט ניתוח" (תחת לשונית תוצאות) לצפייה בתוצאות. טבלה המפרטת את המשך הזמן נייח עבור כל ניסוי אמור להופיע.
- אחרת, תוצאת OFT ביד. השדה הפתוח צריך להיות ריבועי 25 10 סנטימטרים X 10 סנטימטרים המפורטים בחלק התחתון של אופשדה n (כפי שמתואר בשלב 3.1.3). לכמת את כמות הזמן שמבלה את העכבר במרכז, בנוסף למספר הכניסות למרכז הזירה. 16
הערה: 30 סנטימטרים X 30 סנטימטרים אזור המרכז נחשבת למרכז של השדה הפתוח. עכבר נחשב מאכלסים את אזור המרכז אם כל ארבע כפות נמצאות בתוך אזור סנטימטרים 30 x 30.
מבחן לשחות בכפייה 4.
הערה: אפשר מינימום של חמישה ימים בין משימות התנהגותיות.
4.1) הגדרה
- להשיג דלי ברור 2 L, ולמלא עם 22 מעלות צלזיוס מים. מניחים את הדלי על שולחן, ולנסות להבטיח התאורה מוגדרת כדי למזער צללים ובוהקים.
- אם אתם משתמשים בתוכנת מעקב, מקם את המצלמה ישירות מעל לדלי.
- הגדר את התוכנה כך שהעכבר הוא בקלות גלוי על המסך.
4.2) הסתגלות ומבחן
- הזז עכברי ניסוי לro ההתנהגותאום שעה 1 לפני הבדיקה להסתגל לסביבה. השאר את העכברים בכלוב שלהם להסתגלות.
- הפעל את המצלמה לקלטת המשימה התנהגותיות. בעדינות, מניח את העכבר באמצע דלי מים. ודא שלא שחרר את העכבר ב. לאט לאט להוריד את העכבר, כך שכפות רגליו הקדמיות לגעת במים הראשונות. לטפל כדי למנוע את ראשם מההצללה.
- הגדר את השעון ל -6 דקות, ולהתרחק מהאזור התנהגותיות.
- ברגע 6 דקות הן למעלה, להסיר את העכבר מהדלי, ולנגב את עודפי מים לפני הצבת העכבר לכלוב שלהם.
4.3) ניקוד
- אם אתם משתמשים בתוכנת מעקב, להגדיר חוסר תנועה אחוזים ל -11%, כפי שהוצע על ידי Noldus (זה צריך להיות הגדרת ברירת המחדל), לכמת זמן צף לעומת שחייה.
- כדי לכמת באמצעות מערכת המעקב, עבור לכרטיסיית הניתוח, ולחץ על תנועה תחת פרופילי ניתוח. מחק את הקטגוריות מוגדרות כעת, ולאחר מכן בחר מדינת ניידות, בבצד הלוח השמאלי (בהתנהגות פרט). הגדר חוסר תנועה עד 11%.
- בחר הדמיה מסלול, תחת לשונית התוצאות. בחר פלט ניתוח (תחת לשונית תוצאות) לצפייה בתוצאות. טבלה המפרטת את המשך הזמן נייח עבור כל ניסוי אמור להופיע.
- אם יד ניקוד, למדוד את זמן העכבר מבלה חייה או טיפוס, וכמות הזמן שמבלה את העכבר נייח. בנוסף, למדוד את זמן האחזור לנייח בפעם הראשונה. ראה איור 2 בסעיף תוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקת stereotactic מדויקת מסתמכת במידה רבה על הגדרת הקואורדינטות הנכונות. קצה המחט המשמשת להזרקת הווירוס צריך להיות מוגדר באופן ישיר על הצומת של גבחת וקו interaural (איור 1). זה מועיל להשתמש סטראו כדי לברר אם או לא המחט ממוקמת כראוי. כאשר מסתכלים מבעד למיקרוסקופ, המחט צריכה להיות ממוקמת כך שאם הוזרקו הווירוס, זה היה לנחות ישירות על הצומת של גבחת וקו interaural. כלומר, הפתיחה במחט המזרק צריכה להיות ממוקמת ישירות מעל הצומת. במחקר זה, lentivirus להביע shRNA נגד RBM8a, גורם מרכזי במתחם צומת אקסון, הוזרק להגירוס המשונן. Lentivirus גם מבטא RFP לתייג נוירונים נגועים. איור 2 מראה כי הווירוס הוזרק לאזור הנכון כפי שצוין על ידי האות האדומה (איור 3).
_content "> כדי להשיג משמעות במשימות התנהגותיות, גודל המדגם צריך לנוע 12-15 עכברים בכל קבוצה. ניתן לבצע משימות התנהגות שבועיים לאחר זריקות stereotactic. בOFT, פנוטיפ חרדה נוכח אם עכברים להשקיע פחות באופן משמעותי זמן ב מרכז השדה הפתוח בהשוואה לקבוצת הביקורת. התוצאות מצביעות על מציאה של RBM8a ברכס המשונן של עכברים בוגרים מוביל להתנהגויות חרדה (p <0.05, איור 4). בFST, לא היה הבדל הנצפה בחוסר תנועה בין שליטה ועכברים ניסוי, מצביעים על כך שמציאת RBM8a ברכס המשונן אינה משפיעה על התנהגות אנטי-דיכאון (איור 5). ניתוח סטטיסטי מורכב מביצוע שני זנב, מבחן t שונות שני מדגם-שוויוני.
איור 1: צומת של גבחת ואינטרקו שמיעתי. לזריקות stereotactic, מחט המזרק צריך להיות בשורה עם הצומת של גבחת וקו interaural. נקודה זו מוגדרת באפס.
איור 2: הממחיש סכמטי ציר הזמן לניסוי כולו.
איור 3: פרוסת מוח נציג הממחיש זריקה מוצלחת של וירוס לתוך הרכס המשונן סרגל קנה המידה = 100 מיקרומטר..
איור 4: משך זמן שהבקרה ועכברים ניסוי שהות במרכזו של רומן להרחיב שדה עכברי ניסוי לבלות signif.icantly פחות זמן במרכז הזירה, המצביע על הפנוטיפ חרדה (N = 9-11, *, T 18 = -2.72, p <0.05, SEM הממוצע)
איור 5:. כמות הזמן שהבקרה ועכברים ניסוי הם נייחות בFST עכברי ניסוי אינם שונים מפקדים בזמן בילה נייח (N = 9-11, T 18 = 1.25, p> 0.05, SEM הממוצע)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זריקות stereotactic מוצלחות מסתמכות על שלושה גורמים: שמירה על העכבר בחיים, הגדרת נקודת האפס הנכונה לקואורדינטות (קצה המחט בצומת של גבחת וקו interaural), וקביעת העומק הנכון לנקודת האפס (קצה המחט רק נגיעה החיצונית של רקמת המוח). הכדאיות של עכברים היא חשובה. הישרדות ניתוח יכולה להסתייע ובלוודא כי העכבר הוא מורדם כראוי ומקבל משכך כאבים נאותים. כאב ידוע כגורם עיקרי להתאוששות לאחר הניתוח ירוד. על מנת להבטיח כי העכבר הוא בהרדמה מלאה בכל הניתוח (זה לא צריך להגיב לצביטות רגל), ונותן את המינון הנכון של משככי כאבים (המבוסס על המשקל של העכבר), אמור לעזור הישרדות. 17 בנוסף, העכבר צריכים להיות כל הזמן ב כרית חימום לאורך כל תהליך הניתוח עד שמתעוררת מההרדמה. עכברים לא יכולים לווסת את טמפרטורת הגוף שלהם כאשר הם מורדמים. מזג גופםשבמקום יירד באופן משמעותי בתהליך הניתוח. למרות אורכו של ניתוח stereotactic הוא קצר יחסית, היפותרמיה עלולה לפגוע ברצינות הישרדות עכבר. טכניקת תפירה נכונה היא גם סייעה בביצוע ניתוח מוצלח. עכברים ינסו להרים בתפרים שלהם, ולכן חשוב לוודא שהתפרים הדוקים מספיק כדי למנוע ההסרה, אבל לא חזק מדי כמו לשים יותר מדי מתח על הפצע. ארבעה קשרים בכל תפר צריכים להבטיח שהעכבר אינו יכול להסיר את התפר. התפירה נכונה חשובה כמו פצע פתוח יגביר את הרגישות לזיהומים, אשר משפיעים לרעה על כל ניסויים התנהגותיים.
OFT הוא הפרדיגמה התנהגות שנועדה להעריך את התנועה ואת הפנוטיפ החרדה בעכברים. כאשר בודקים את התנהגות עכבר, חשוב להיות זהירים מאוד בעת טיפול בעכברים ובהקמת הזירה. בOFT, הפרדיגמה נועדה להתאים את החשש של העכבר when ממוקם בסביבה חדשה, עם סקרנותו הטבעית ורצון לחקור חידוש. עכבר סוג בר יהיה בתחילה להיות מהסס להיכנס למרכז השדה הפתוח, שבו הוא פגיע יותר, אבל סופו של דבר לעשות זאת, בשל הסקרנות המולדת שלו. בעכבר חרדה, החשש של חציית שטח פגיע יותר (מרכז השדה) יהיה גדול יותר מהסקרנות הטבעית שלהם והרצון לחקור, אשר תגרום לזמן באופן משמעותי פחות בילה במרכז. כדי לוודא את הפרדיגמה עובדת בצורה נכונה, חשוב למזער את הלחץ הקשורים לגורמים האחרים מלבד השדה הפתוח. מתח יכול להיות ממוזער על ידי מתן בעכבר כדי להסתגל לחדר התנהגותיות (כך הסביבה החיצונית אינה משתנה בלבול אפשרי), ומנקה את השדה בין עכברים, כדי להבטיח שכל הריחות הקשורים לעכבר הקודם הוסרו. 18 פעולות אלה אמורות לעזור לחסל את כל הבדלים שנגרמים על ידי שלא כדין handliעכברי ng. במחקר זה, עכברי מציאה RBM8a בילו פחות זמן במרכז שדה פתוח רומן, בהשוואה לקבוצת ביקורת. זה מעיד על הפנוטיפ חרדה, מאז העכברים אינם ששים יותר להיכנס לאמצע השדה הפתוח הרומן, שבו הם פגיעים יותר, בהשוואה לקבוצת ביקורת.
FST מבקש לחקור את הפנוטיפ אנטי-דיכאון בעכברים. כאשר הניח דלי מים, עכברים שמבלים פחות זמן צף לעומת שחייה נחשבים ליש פנוטיפ אנטי-דיכאוני. חוסר תנועה במבחן לשחות בכפייה מתפרשת כייאוש התנהגות (למשל לוותר). פרדיגמה זו אומתה על ידי טיפול נגד דיכאון. 7,8,9 עכברים שמקבלים תרופות נגד דיכאון ישקיעו פחות באופן משמעותי זמן צף השוואה לקבוצת ביקורת, אשר מעידה על הפנוטיפ אנטי-דיכאוני. במחקר זה, עכברי מציאה RBM8a לא היו שונים באופן משמעותי מעכברי שליטה בזמן בילה נייח. תיים מצביע על כך שמציאת RBM8a ברכס המשונן של עכברים בוגרים לא לעורר פנוטיפ דיכאון, או אנטי-דיכאוני. במחקר הקודם שלנו, ביטוי יתר RBM8a ברכס המשונן של עכברים בוגרים מקטין באופן משמעותי את הזמן נייח השוואה לקבוצת ביקורת, דבר שמצביע על השפעה אנטי-דיכאוני. 16
זריקות stereotactic משמשות לייצוג במאמר זה היו ממוקדים להגירוס המשונן. Gyrus המשונן נבחר כאתר היעד, שכן הגן של העניין מתבטא שם מאוד בעכבר הבוגר. בנוסף, gyrus המשונן נקשר עם דיכאון וחרדה. לדוגמא, מחקר אחד השתמש בעכברי POMC-ChR2 להפעיל באופן סלקטיבי תאי גרגיר באו הגב או gyrus המשונן הגחון. הפעלה של הרכס המשונן שני הגב והגחון הובילה לחקירה מוגברת של סביבת רומן, המצביע על תפקיד פוטנציאלי של הרכס המשונן בחרדה. 19 מחקר שונהנמצא כי עכברים עם neurogenesis לקויה גדלו חוסר תנועה בFST, המצביעים על הפנוטיפ דיכאון. 20 יתר על כן, הפעלה של OA Ap 1 במוח הקדמי מובילה להשפעה אנטי-דיכאון בFST, האכלה מודחקת חידוש, ובדיקת צריכת סוכרוז. כאשר VEGF היה דפק למטה ברכס המשונן של OA Ap 1, פנוטיפ אנטי-דיכאוני זה היה אבוד. 21 נתונים אלה מצביעים על כך שיש לו את הרכס המשונן תפקיד בפתופיזיולוגיה של חרדה ודיכאון, והצביע על כך שהרכס המשונן עשוי להיות אזור טוב למקד לאפנון הגנטי שלנו וניסויים התנהגותיים. Lentivirus שימש במיוחד, כך שכל התאים ברכס המשונן יהיו נגועים, בניגוד לתאי החלוקה בלבד (רטרו).
שילוב של שלושת אלה עיצובים ניסיוניים (בנוסף למשימות התנהגותיות אחרות) הוא דרך חדשנית להערכת פנוטיפים התנהגותיים בעכברים, שכן וירוס יכול להיות מוזרק לתוך specifאזור במוח IC בזמנים התפתחותית ספציפיים. שימוש בזריקות stereotactic של lentivirus זיווג עם משימות התנהגותיות לוקחת רק כמה חודשים כדי להשלים ומאפשר לחוקרים לאסוף נתונים ראשוניים על השפעות התנהגותיות של ביטוי גנים באזור מסוים במוח. בניגוד לכך, עכברי נוקאאוט מותנים לעתים קרובות לקחת שנים כדי ליצור. יתר על כן, העדפת סוג התא של וירוסים יכול לשמש כדי למקד עוד יותר תאים. לדוגמא, רטרווירוסים יכולים רק להדביק חלוקת תאים (כגון תאי גזע עצביים ברכס המשונן) ואילו lentivirus מדביק את כל סוגי התאים. 22,23 כך, יחד עם עמיתים להזרקה, פרוטוקולי ניסוי בשימוש נרחב ובנפרד תוקף אלה מספקים מהירים אבל דרך מקיפה כדי לבחון את תפקידו של גן מסוים באזור מוח ממוקד, על התנהגויות עכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
References
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
- Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in sterotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
- Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
- Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
- Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
- Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
- Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
- Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
- Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
- Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
- Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
- Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
- Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
- Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
- Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
- Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).
