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Behavior

स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन तकनीक को लागू पशु व्यवहार पर आनुवंशिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए

Published: May 10, 2015 doi: 10.3791/52653
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, The Pennsylvania State University

Summary

Lentiviruses cDNAs व्यक्त या shRNAs चूहों के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में जीन की अभिव्यक्ति न्यूनाधिक कर सकते हैं की स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन। यहाँ, हम इस तरह के खुले मैदान टेस्ट (ओ एफ टी) और मजबूर तैरो टेस्ट (एफ एस) के रूप में व्यवहार कार्यों, साथ स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन गठबंधन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Abstract

स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन चूहों में लक्षित मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए उच्च अनुमापांक lentiviruses वितरित करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। Lentiviruses overexpress या मस्तिष्क के ऊतकों के लिए महत्वपूर्ण नुकसान के बिना एक अपेक्षाकृत ध्यान केंद्रित क्षेत्र में पछाड़ना जीन की अभिव्यक्ति कर सकते हैं या तो। वसूली के बाद, इंजेक्ट माउस ऐसे ओपन फील्ड परीक्षण (ओ एफ टी) और मजबूर तैरो टेस्ट (एफ एस) के रूप में विभिन्न व्यवहार कार्यों पर परीक्षण किया जा सकता है। बहुधा एक माउस एक उपन्यास खुले मैदान के मध्य में खर्च करता है कि समय की मात्रा को मापने के द्वारा चूहों में हरकत और चिंतित फेनोटाइप का आकलन करने के लिए बनाया गया है। एक और अधिक उत्सुक माउस नियंत्रण की तुलना में उपन्यास मैदान के मध्य में काफी कम समय बिताना होगा। एफ एस टी पानी की एक बाल्टी में रखा जब चूहों स्थिर खर्च उस समय की राशि बढ़ाता द्वारा विरोधी अवसादग्रस्तता फेनोटाइप का आकलन है। एक विरोधी अवसादग्रस्तता phenotype के साथ एक माउस जानवरों नियंत्रण की तुलना में काफी कम समय स्थिर खर्च करेगा। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य ster उपयोग करने के लिए हैव्यवहार परीक्षण के साथ संयोजन के रूप में एक lentivirus के eotactic इंजेक्शन पशु व्यवहार मिलाना कैसे आनुवंशिक कारकों का आकलन करने के लिए।

Introduction

यह आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए आसान है क्योंकि माउस व्यापक रूप से तंत्रिका जीव विज्ञान में इस्तेमाल किया गया है। जीन पीटा तकनीक प्रत्येक आनुवंशिक कारक माउस व्यवहार को आकार कैसे शोधकर्ताओं ने जांच करने के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, रचनात्मक-loxP प्रणाली ऊतक के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है और विभिन्न ऊतकों में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं जो चूहों में type- विशिष्ट जीन पीटा, सेल। 1 हालाँकि, व्यवहार में, रचनात्मक प्रमोटरों की अभिव्यक्ति पैटर्न पर नियंत्रण करने के लिए मुश्किल हो जाता है , और अब तक कई स्थापित रचनात्मक चालकों क्षेत्र विशेष अभिव्यक्ति हासिल नहीं किया है। 2,3

वैकल्पिक रूप से, स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन वयस्क माउस के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करता है कि एक विधि है। सीडीएनए या shRNA व्यक्त अनुवांशिक इंजीनियर वायरस को इंजेक्शन लगाने के द्वारा, जीन अभिव्यक्ति के क्षेत्र विशेष मॉडुलन प्राप्त किया जा सकता है। प्रत्येक माउस के मस्तिष्क के आकार बदलता रहता है, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के स्थान स्टीरियोटैक्टिक coordi का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता हैनितंब माउस मस्तिष्क की खोपड़ी पर स्थलों से निर्धारित किया है। सबसे अधिक इस्तेमाल किया स्थलों पर्वबिन्दु, लैम्ब्डा, और interaural लाइन कर रहे हैं। एक मस्तिष्क एटलस से प्राप्त निर्देशांक का उपयोग करना, प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र के 4 सटीक स्थान Antero-पीछे (ए / पी), औसत दर्जे का पार्श्व (एम / एल) से पहचाना जा सकता है, और पृष्ठीय उदर (डी / वी) से कुल्हाड़ियों पर्वबिन्दु / interaural लाइन चौराहे। इंजेक्शन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की जा सकती है, ताकि आम तौर पर चूहों के दिमाग में इंजेक्शन वायरस, या तो लाल या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी या GFP) के साथ टैग कर रहे हैं।

चूहों के व्यवहार के मूल्यांकन मानसिक विकारों के बुनियादी अनुसंधान के लिए विशेष रूप से आवश्यक हैं। रोगियों में मानसिक बीमारियों के लक्षण आम तौर पर असामान्य व्यवहार शामिल है। इन मानव व्यवहार के कुछ evolutionarily संरक्षित कर रहे हैं और सीधे मजाक उड़ाया और माउस में मनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अवसाद व्यवहार निराशा को मापने के द्वारा माउस में मॉडलिंग की जा सकती है। बार बार अवसाद के साथ लोगवे कभी भी मदद मिलेगी करते कुछ भी नहीं है के रूप में हालांकि एन, अंत में आत्महत्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि एक लक्षण महसूस हो रहा है। कृन्तकों में, इस पानी का एक पूल में तैर बनाम तैराकी एक माउस (ऊपर देने के रूप में देखा) समय की राशि है जो उपाय जबरिया तैरो टेस्ट (एफ एस टी) का उपयोग करते हुए मॉडलिंग की जा सकती है। इस प्रतिमान विरोधी अवसाद के साथ phenotype के बचाव के द्वारा मान्य है। अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में काफी कम समय स्थिर खर्च करेगा अवसाद विरोधी प्राप्त हुआ है जो 7,8,9 चूहों। एक और व्यवहार परीक्षण खुले मैदान टेस्ट (ओ एफ टी) चूहों में हरकत का आकलन करने के लिए बनाया गया है, और इसके साथ ही चूहों में उत्सुक फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 5,6 इस परीक्षा में वे बंद कर रहे हैं, जब चूहों को सुरक्षित महसूस करते हैं कि इस तथ्य पर आधारित है एक उपन्यास खुले मैदान में दीवार के लिए। वे उत्सुक जानवर हैं के रूप में जंगली प्रकार चूहों अंततः, उपन्यास वातावरण का पता लगाने जाएगा। हालांकि, क्षेत्र के केंद्र में कम समय खर्च माउस पहल पर काबू पाने में सक्षम नहीं होगा, के रूप में माउस में चिंता इंगित करता हैएल डर एक उपन्यास पर्यावरण के द्वारा लाया। एक खुले मैदान के मध्य में बिताए समय की राशि द्वारा मात्रा के रूप में माउस की चिंता, कई मानसिक विकारों में मौजूद है जो मानव में नैदानिक ​​चिंता, की तुलना में किया जा सकता है।

व्यवहार मानदंड के साथ स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के संयोजन एक लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र में एक विशेष जीन की अभिव्यक्ति को बदलने के लिए एक उपन्यास तरीका है। माउस व्यवहार पर संग्राहक जीन की अभिव्यक्ति के प्रभाव को फिर से निर्धारित किया जा सकता है। पूरे दिमाग पीटकर के विपरीत, इस विधि यह केवल विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों लक्ष्य के रूप में विशेष रूप से उपयोगी है। इसके अलावा, स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन आम तौर पर वयस्क जंगली प्रकार माउस में प्रदर्शन कर रहे हैं, इसलिए, अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति विकास के चरणों भर में बनाए रखा गया है। जीन के विकास का भ्रूण या प्रसव के बाद के चरण के दौरान अस्तित्व के लिए आवश्यक है, तो इस विधि को उलझाना प्रभाव से बचना होगा। एक प्रमुख सीमा प्रयोगात्मक चूहों throug के लिए जाने की जरूरत है किएच चूहों की खोपड़ी है, जिसमें एक इनवेसिव सर्जरी, खोला जाएगा। इसके अलावा, जीन मॉडुलन की डिग्री वायरस की अनुमापांक और दक्षता से निर्धारित होता है। वायरस विशेष उपकरणों की आवश्यकता है जो स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक का उपयोग कर सही क्षेत्र, में इंजेक्शन की जरूरत है। सही इंजेक्शन साइट का सत्यापन ही पोस्टमार्टम पूरा किया जा सकता है।

इस विधि में पहले विभिन्न मस्तिष्क संबंधी बीमारियों में एक विशेष जीन की भागीदारी का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, वायरल मध्यस्थता आरएनएआई (डोपामाइन संश्लेषित किया जा करने के लिए अनुमति देता है) गु जीन को लक्षित सब्सटैंशिया निग्रा कॉम्पेक्टा में इंजेक्ट किया गया था, और हरकत व्यवहार विश्लेषण का आयोजन किया गया था। 10 अन्य अध्ययन के संबंध में माउस व्यवहार का आकलन करने के लिए एक lentivirus के मुंह बंद DISC1 की स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन का इस्तेमाल किया एक प्रकार का पागलपन के लिए। DISC1 की पछाड़ना नवीनता के जवाब में वृद्धि हुई हरकत के लिए एलईडी (समानताएं एक प्रकार का पागलपन में सकारात्मक लक्षण), और अधिक से अधिक गतिहीनताएफ एस टी। 11 इसी तरह, एक अतिरिक्त अध्ययन 5 हिंदुस्तान टाइम्स 1 बी overexpression, बहुधा में वृद्धि हुई खोजपूर्ण व्यवहार करने के लिए इस विधि का उपयोग कर एक विरोधी चिंता phenotype के साथ संगत है कि नेतृत्व मिला। 12 स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन रचनात्मक-loxP चूहों में पुनर्संयोजन प्रेरित करने के लिए रचनात्मक वायरस वितरित कर सकते हैं । इस विधि चुनिंदा प्रमस्तिष्कखंड में Y2 रिसेप्टर और हलकी लीक terminalis के बिस्तर नाभिक को हटाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। व्यवहार विश्लेषण करने पर, इन चूहों जीन केंद्रीय प्रमस्तिष्कखंड में हटा दिया गया था जब एक विरोधी अवसादग्रस्तता phenotype के लिए पाया गया है, लेकिन जीन basolateral प्रमस्तिष्कखंड या हलकी लीक terminalis के बिस्तर नाभिक में हटा दिया गया था जब कोई फेनोटाइप। 13 इस प्रकार, इस तकनीक पशु व्यवहार पर आनुवंशिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक अनूठे उपकरण प्रदान करता है।

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Protocol

नोट: जानवरों को शामिल सभी प्रोटोकॉल के पेनसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार पीछा किया गया था, IACUC # 44,057

1. Lentivirus की उत्पादन

नोट: अभिकर्मक पहले दिन, LentiX-293 कोशिकाओं 80% confluency पर होना चाहिए।

  1. बस अभिकर्मक पहले DMEM के साथ कोशिकाओं कुल्ला और आरटी पर 5 मिनट के लिए पेनिसिलिन (100 आइयू / एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ DMEM / 10% FBS की 10 एमएल में सेते हैं।
  2. 1 मिनट के लिए 1 DMEM के मिलीलीटर और भंवर में: 3 अनुपात (पी के 3 μl डीएनए के 1 माइक्रोग्राम): डीएनए और Polyethylenimine (पी) 1 (1 मिलीग्राम / एमएल) पतला। डीएनए की मात्रा डीएनए की एकाग्रता पर निर्भर है जोड़ा। 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    1. उदाहरण के लिए, पकवान प्रति पी के 60 μl के साथ वेक्टर प्लाज्मिड के 10 माइक्रोग्राम, psPax2 14 प्लाज्मिड के 5 माइक्रोग्राम, vesicular मुखशोथ वायरस (VSV) के 5 माइक्रोग्राम के शामिल डीएनए प्लाज्मिड के 20 माइक्रोग्राम, का उपयोग करें।
  3. DMEM (एक 100 मिमी डिश में 10 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम के लिए यानी 1 मिलीलीटर) की कुल संस्कृति के माध्यम से 1 / 10th मात्रा में शामिल करें। डिश में ड्रॉप द्वारा डीएनए पी मिश्रण बूंद के 1 मिलीलीटर जोड़ें और संस्कृति के माध्यम से डीएनए के साथ अच्छी तरह से मिश्रित है जब तक आसपास के पकवान ज़ुल्फ़।
  4. आरटी पर 6 घंटे के लिए सेते हैं और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. अभिकर्मक के बाद 48 घंटा, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 627 XG पर वायरल सतह पर तैरनेवाला और स्पिन इकट्ठा। एक ultracentrifuge ट्यूब में 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से वायरल सतह पर तैरनेवाला के 30 मिलीलीटर फ़िल्टर।
  6. ट्यूब शेष है, और parafilm का छोटा सा टुकड़ा के साथ ट्यूब कवर करने के लिए बाँझ पानी जोड़ें। स्पिन ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 120 मिनट के लिए 11,249 XG पर। एक वैक्यूम टिप का उपयोग तरल निकालें।
  7. ठंड पीबीएस के 100 μl ट्यूब जोड़ें। धीरे 4 डिग्री सीओ / एन पर ट्यूब रॉक।
  8. वायरस, पिपेट टी फिर से निलंबित करने के लिएवह पीबीएस टिप के साथ गोली छू नहीं सावधान किया जा रहा है, गोली में 10 से अधिक बार कदम 1.8 में जोड़ा गया। इस पूरी होने तक गोली फिर से निलंबित नहीं किया जाएगा।
  9. -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में ट्यूब, फ्लैश फ्रीज प्रति 10-20 μl पर वायरस विभाज्य।

2. stereotactic इंजेक्शन

उपकरण के 2.1) तैयार करना

  1. सर्जरी से पहले कैंची, कुंद अंत संदंश, एक सुई धारक, छुरी, कपास swabs की एक जोड़ी है, और एक नसबंदी सूचक के साथ एक सील पैक में एक कपड़ा, और आटोक्लेव रखें। साथ ही, 10% povidone आयोडीन, 70% एथिल शराब, absorbable sutures, एक हीटिंग पैड, कृत्रिम आँसू प्राप्त है, एक गिलास मनका अजीवाणु, ड्रिल, एक ड्रिल बिट, 2 डिस्पोजेबल सीरिंज, एक इंजेक्शन सिरिंज, बिजली के रेजर, एनाल्जेसिक (ketoprofen), संवेदनाहारी (Avertin), दस्ताने, और इंजेक्शन पंप के साथ एक स्टीरियोटैक्टिक तंत्र।
  2. 0.2 और का उपयोग कर एक बाँझ हुड में 1.25% Avertin ताजा समाधान उस दिन, फिल्टर बनाओ# 181; बाँझ सिरिंज फिल्टर कर रहा हूँ, और एक बाँझ सीरम शीशी में जगह है। Tert-AMYL शराब के 5 मिलीलीटर में 2,2,2-tribromoethyl शराब का 2.5 जी मिलाएं, फिर 200 मिलीलीटर पानी में भंग। 5. 15 से नीचे पीएच रखें

माउस का 2.2) तैयार करना

  1. माउस (375 मिलीग्राम / किग्रा) के वजन के आधार पर Avertin प्रशासन। 15 एक intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के माध्यम से Avertin के साथ माउस इंजेक्षन, और फिर पूरी तरह से anesthetized तक वापस अपने पिंजरे में जगह है।
  2. आईपी ​​इंजेक्शन (ketaprofen, 5 मिलीग्राम / किग्रा), और जगह सुखाने को रोकने के लिए माउस की आँखों पर कृत्रिम आँसू के माध्यम से एक एनाल्जेसिक दीजिए।
  3. माउस उनके पैर pinching द्वारा पूरी तरह से सो रहा है सुनिश्चित करें। माउस पैर चुटकी करने के लिए जवाब है, तो (50 μl की खुराक में) अधिक संवेदनाहारी दे। एक बिजली के रेजर का उपयोग माउस के सिर दाढ़ी। (थूथन के शीर्ष करने के लिए, आम तौर पर सिर्फ कान के पीछे से) पर संचालित किया जा करने के लिए क्षेत्र, और आसपास के क्षेत्र दाढ़ी।
  4. माउस मैं जगहस्टीरियोटैक्टिक तंत्र Nto। पूर्वकाल दबाना पर सामने दांत कुंडी, और दबाना कम और जबड़ा पूरी तरह से सुरक्षित है, इसलिए है कि यह कस लें।
  5. पूरी तरह से सिर को स्थिर करने के कान नहर में कान सलाखों डालें। भीतरी कान को नुकसान पहुंचा सकता है, जो बहुत दूर में कान सलाखों सम्मिलित करने के लिए नहीं सावधान रहना। समाप्त करने के बाद, माउस का शरीर सिर की स्थिति में बाधा पहुँचा के बिना थोड़ा स्थानांतरित करने के लिए सक्षम होना चाहिए।
  6. प्रक्रिया के दौरान माउस के शरीर के तापमान को विनियमित करने के क्रम में माउस के तहत एक हीटिंग पैड रखें।
  7. अच्छी तरह से शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को साफ करें। एक कपास झाड़ू का उपयोग करना, शल्य साइट के मध्य से शुरू करने और बाहर की तरफ बढ़ रहा है, एक परिपत्र गति में 10% povidone आयोडीन रगड़ें। फिर, एक ही फैशन में शल्य साइट पर 70% एथिल शराब रगड़ना करने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें। दो बार दोहराएँ।

2.3) पहले चीरा

  1. माउस तैयार होने के बाद, बाँझ उपकरण बैग खुला। दस्ताने बदलें touchi से पहलेयंत्र एनजी। बाँझ कपड़े बाहर ले जाओ और कपड़े पर उपकरणों जगह है। किसी भी उपकरण एक संयुक्त राष्ट्र बाँझ सतह को छूता है, यह बाँझ 15 सेकंड के लिए ग्लास मनका अजीवाणु का उपयोग करें।
  2. गैर प्रमुख हाथ में प्रमुख हाथ और कुंद के अंत संदंश में स्केलपेल ले लो। कुंद अंत संदंश धीरे पकड़ माउस की त्वचा का प्रयोग करें, और स्केलपेल का उपयोग कर एक चीरा बनाते हैं। के बारे में 1.5 सेमी (नाक की ओर) कान के ऊपर चीरा शुरू और कान के नीचे के बारे में 0.5 सेमी करने के लिए करता हूं। (चित्रा 1) पर्वबिन्दु को बेनकाब करने के लिए माउस के सिर के बीच नीचे खड़ी चीरा बढ़ाएँ।
  3. पर्वबिन्दु कल्पना है एक बार, धीरे खोपड़ी की सतह को कवर करने के लिए किसी भी रक्त निकालने के लिए एक बाँझ कपास टिप ले लो। सिर के पक्ष की ओर त्वचा पुश करने के लिए दो कपास युक्तियों का उपयोग करें।

2.4) उपकरण सेटअप

  1. किसी भी रक्त खोपड़ी की सतह से हटा दिया जाता है, और पर्वबिन्दु स्पष्ट रूप से कल्पना की है, के बाद (चोर सिरिंज तैयार10 8 टीयू 1 μl की / एमएल, मात्रा) के centration। धूआं हुड में, वायरस के साथ सिरिंज इंजेक्शन जा भरें। कोई बुलबुले के अंदर कर रहे हैं सुनिश्चित करें। यह पूरी तरह से सुरक्षित है, यकीन है कि स्टीरियोटैक्टिक तंत्र में सिरिंज रखें।
  2. बाँझ सिरिंज सुई की नोक पर्वबिन्दु के चौराहे और interaural लाइन के लिए सेट कर दिया जाता है, ताकि यह सही खोपड़ी की सतह से ऊपर है जब तक धीरे धीरे सिरिंज कम है। शून्य के रूप में इस बिंदु निर्धारित है, और इस बात से निर्देशांक निर्धारित करते हैं।
  3. ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र पर निर्भर करता है, स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक बदलती हैं। एक मस्तिष्क एटलस 4 का उपयोग करके इन निर्देशांक निर्धारित करते हैं। निर्देशांक निर्धारित कर रहे हैं एक बार, उन निर्देशांक मैच के लिए सिरिंज की सुई चाल है। निर्देशांक का उपयोग कर दांतेदार गाइरस लक्ष्य बनाएं: = +/- 1 मिमी, ए / पी = -1.82 मिमी एम / एल। छेद drilled होने की जरूरत है, जहां कल्पना करने के लिए खोपड़ी के ऊपर सही करने के लिए सुई लोअर।
  4. थोड़ा, सिरिंज उठाएँ ड्रिल लेने के लिए और ड्रिल द्वि जगहखोपड़ी के बारे में एक 45 डिग्री के कोण पर लक्ष्य ड्रिल साइट से ऊपर टी सही। ड्रिलिंग शुरू, और खोपड़ी रास्ता देती है जब तक ड्रिलिंग रहते हैं। खोपड़ी रास्ता देता है, प्रतिरोध में एक बूंद का पता लगाया जा सकता है। कॉर्टिकल क्षति को रोकने के लिए इतनी के रूप में, मस्तिष्क में ड्रिल करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  5. एक बाँझ कपास टिप ले लो और छेद से किसी भी रक्त दूर पोंछ।
  6. टिप दिमाग सही नहीं है (खोपड़ी) की सतह पर बैठता है, ताकि सिरिंज कम करें। डी / वी ब्रेन एटलस निर्देशांक के आधार पर वांछित गहराई तक लोअर 0 करने के लिए सिरिंज (गहराई) समन्वय सेट करें। -1.79 मिमी के लिए दांतेदार गाइरस, सेट डी / वी तक पहुँचने के लिए।
  7. 0.2 μl / मिनट की दर से इंजेक्शन प्रारंभ करें। सिरिंज वांछित गहराई की तुलना में कम पर्ची नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए देखें। यदि ऐसा होता है, धीरे फिर वांछित गहराई तक सिरिंज बढ़ा।
  8. इंजेक्शन के समाप्त होने पर, किसी भी अवशिष्ट वायरस अवशोषित किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के बारे में 2 मिनट इंतज़ार करो। धीरे धीरे सिरिंज बढ़ाने के लिए और किसी भी ली को दूर करने के लिए एक कपास टिप का उपयोगइंजेक्शन साइट से रुपये।
  9. अन्य गोलार्द्ध के लिए दोहराएँ।

2.5) suturing

  1. इसकी पैकेजिंग और पकड़ से सुई धारकों का उपयोग कर सुई बाँझ सिवनी और सुई निकालें। दूर सुई धारक से सुई की ओर इशारा बढ़त चेहरा। गैर प्रमुख हाथ में कुंद अंत संदंश पकड़ो, और माउस पर पकड़ के लिए त्वचा में उपयोग करें। प्रमुख हाथ के साथ शुरू करो।
  2. धीरे त्वचा के माध्यम से सिवनी धक्का और चीरा के दूसरे पक्ष पर त्वचा को हड़पने के लिए कुंद अंत संदंश का उपयोग करें। के बारे में 0.75 इंच रहता है जब तक के माध्यम से सिवनी सामग्री खींचो।
  3. सुई के चलते हैं, और सुई धारक एक बार चारों ओर सीवन रैप करने के लिए कुंद अंत संदंश का उपयोग करें, तो, सुई धारक के साथ 0.75 इंच शेष सिवनी ले लो, और, के माध्यम से सिवनी खींच सुई और सुई धारक इतना है कि वे मूल रूप से पर थे जो कि सिर के सामने के किनारे पर खत्म होता है। यह एक गाँठ फार्म चाहिए।
  4. इस चरण को दोहराएँतीन से अधिक बार, सिर की तरफ बारी सुई धारक प्रत्येक समय पर समाप्त होता है।
  5. सिवनी कट और चरणों को दोहराएँ 2.5.1-2.5.3 चीरा बंद कर दिया है जब तक।

2.6) पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल

  1. धीरे माउस से कान सलाखों हटाने, और पूर्वकाल दबाना से अपने जबड़े को हटा दें।
  2. यह उठता है और अपने दम पर ही निकल जाता है जब तक हीटिंग पैड पर माउस रखें। दैनिक माउस मॉनिटर, और रखने के लिए और इस तरह, सौंदर्य खाने या पीने के लिए नहीं के रूप में दर्द के लक्षण, के लिए आंख बाहर। आवश्यक समझा जब अतिरिक्त एनाल्जेसिक दीजिए।

3. ओपन फील्ड टेस्ट

3.1) की स्थापना

  1. 50 सेमी ऊंची दीवारों के साथ, आयाम 50 सेमी x 50 सेमी के साथ एक खाली वर्ग, प्लास्टिक अखाड़ा प्राप्त (लेकिन थोड़ा बड़ा हो सकता है)। प्रयोग की शुरुआत करने से पहले 70% एथिल शराब के साथ क्षेत्र को साफ करें। एथिल शराब पूरी तरह से मैदान में एक माउस रखने से पहले सूख गया है सुनिश्चित करें।
  2. पर अखाड़ा रखेंफर्श, और प्रकाश व्यवस्था छाया और चमक को कम करने के लिए सेट किया गया है सुनिश्चित करने के लिए प्रयास करें।
  3. ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, (माउस की एक स्पष्ट दृष्टि से देखते हैं अब तक काफी दूर पूर्ण धरना पूरे क्षेत्र है, लेकिन पास पर्याप्त), खुले मैदान के सीधे ऊपर खुले मैदान के ऊपर लगभग 1.5 फुट कैमरे की स्थिति।
  4. बॉक्स (30 सेमी x 30 सेमी की लगभग एक क्षेत्र) के केंद्र में एक क्षेत्र को निर्धारित करें। 16, एक क्षेत्र निर्धारित साइड पैनल में जोन 1 टैब पर क्लिक करें।
    1. ऊपरी पैनल में एक आकार रूपरेखा का चयन करें, और केंद्र क्षेत्र की परिधि रूपरेखा। जोन जोड़ने का चयन करें, और केंद्र क्षेत्र के अंदर पर क्लिक करें। कार्यक्रम संकेतों का उपयोग करना, (यह इस प्रक्रिया के लिए 'केंद्र' के रूप में निर्दिष्ट किया जाएगा) क्षेत्र का नाम। व्यवहार परीक्षण हाथ से रन बनाए हो जाएगा, तो क्षेत्र के नीचे टेप का उपयोग कर के रूप में चिह्नित, 10 सेमी x 10 सेमी वर्गों में बांटा गया है सुनिश्चित करें।
  5. सॉफ्टवेयर सेट करें ताकि सेटिंग्स सही हैं, और माउस आसानी से visi है किस्क्रीन पर ble। परीक्षण क्षेत्र (प्रकाश) और माउस रंग के साथ संगत होना करने के लिए मशीन पर पता लगाने सेटिंग्स का समायोजन करके यह पूरा।
    नोट: सेटिंग्स सही हैं, सिस्टम किसी भी छाया या मूत्र / fecal बात केवल माउस ट्रैक, और नहीं करना चाहिए। विशेष सॉफ्टवेयर सेटिंग्स क्षेत्र की प्रकाश व्यवस्था, और माउस के रंग पर निर्भर करते हैं।

3.2) Acclimation और टेस्ट

  1. अपने आसपास के लिए उन्हें acclimate करने के क्रम में परीक्षण से पहले व्यवहार कक्ष 1 घंटे में प्रयोगात्मक चूहों ले जाएँ। दशानुकूलन के लिए उनके पिंजरे में चूहों छोड़ दें।
  2. टेप करने के लिए कैमरे पर व्यवहार कार्य चालू करें और माउस दीवार का सामना करना पड़ रहा है इतना है कि क्षेत्र के बीच सामने की ओर माउस जगह है।
  3. 5 मिनट के लिए टाइमर सेट, और दूर क्षेत्र से कदम। यदि संभव हो तो गलती से माउस को प्रभावित नहीं करने के लिए इतनी के रूप में, कमरा छोड़ दें।
  4. 5 मिनट के लिए कर रहे हैं एक बार, माउस को हटाने और उनके पिंजरे में उन्हें जगह है।
  5. अच्छी तरह से अगले माउस को आगे बढ़ने से पहले क्षेत्र को साफ करने के लिए 70% एथिल अल्कोहल का प्रयोग करें। एथिल शराब पूरी तरह से सूख गया है सुनिश्चित करें।

3.3) स्कोरिंग

  1. सभी चार पंजे बीच 30 सेमी x 30 सेमी के अंदर हैं जब मैदान के मध्य में होने के रूप में माउस पर विचार करें।
  2. माउस के केंद्र में खर्च करता है समय की राशि यों। वैकल्पिक रूप से, इस समय (जैसे Noldus ethovison के रूप में) ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारण करते हैं।
    1. ऐसा करने के लिए, विश्लेषण टैब पर जाएँ, और विश्लेषण प्रोफाइल के तहत "आंदोलन" पर क्लिक करें। वर्तमान में स्थापित श्रेणियों हटाएँ, और उसके स्थान टैब के अंतर्गत "क्षेत्र में" का चयन करें। केंद्र क्षेत्र का चयन करें। इसके बाद, परिणाम देखने के लिए (परिणाम टैब के अंतर्गत) "विश्लेषण उत्पादन" का चयन करें। प्रत्येक परीक्षण प्रकट करना चाहिए के लिए समय लिस्टिंग तालिका स्थिर बिताया।
  3. अन्यथा, हाथ से बहुधा स्कोर। खुले मैदान ope के तल पर उल्लिखित 25 10 सेमी x 10 सेमी चौकों होनी चाहिएn क्षेत्र (के रूप में कदम 3.1.3 में उल्लिखित)। माउस के मैदान के केंद्र में प्रविष्टियों की संख्या के अलावा, केंद्र में खर्च करता है समय की राशि यों। 16
    नोट: केंद्र 30 सेमी x 30 सेमी क्षेत्र खुले मैदान का केंद्र माना जाता है। एक माउस सभी चार पंजे 30 X 30 सेमी क्षेत्र के अंदर कर रहे हैं, तो केंद्र क्षेत्र में रहने के रूप में माना जाता है।

4. जबरिया तैरो टेस्ट

नोट: व्यवहार कार्यों के बीच पांच दिनों की एक न्यूनतम की अनुमति दें।

4.1) की स्थापना

  1. एक 2 एल स्पष्ट बाल्टी प्राप्त है, और 22 डिग्री सेल्सियस पानी के साथ भरें। एक मेज पर बाल्टी, जगह और प्रकाश छाया और चमक को कम करने के लिए सेट किया गया है सुनिश्चित करने के लिए प्रयास करें।
  2. ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, सीधे भूमि के ऊपर बाल्टी के कैमरे की स्थिति।
  3. सॉफ्टवेयर सेट अप माउस को स्क्रीन पर आसानी से दिख रहा है कि इतनी।

4.2) Acclimation और टेस्ट

  1. व्यवहार की भूमिका में प्रयोगात्मक चूहों ले जाएंपरीक्षण से पहले ओम 1 घंटा परिवेश acclimate करने के लिए। दशानुकूलन के लिए उनके पिंजरे में चूहों छोड़ दें।
  2. टेप करने के लिए कैमरे के व्यवहार कार्य को चालू करें। धीरे, पानी की बाल्टी के बीच में माउस जगह है। में माउस ड्रॉप करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें। धीरे धीरे माउस के निचले हिस्से, उसके सामने पैर पहले पानी को छूने इसलिए। जलमग्न से उनके सिर को रोकने के लिए ध्यान रखना।
  3. 6 मिनट के लिए टाइमर सेट, और व्यवहार के क्षेत्र से दूर कदम।
  4. 6 मिनट तक कर रहे हैं एक बार, बाल्टी से माउस को हटाने, और उनके पिंजरे में वापस माउस रखने से पहले अतिरिक्त पानी पोंछ।

4.3) स्कोरिंग

  1. तैराकी बनाम तैरते समय यों, (यह डिफ़ॉल्ट सेटिंग) किया जाना चाहिए Noldus ने सुझाव दिया है के रूप में ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं, तो 11% प्रतिशत गतिहीनता की स्थापना की।
  2. ट्रैकिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए यों, विश्लेषण टैब पर जाएँ, और विश्लेषण प्रोफाइल के तहत आंदोलन पर क्लिक करें। पर, वर्तमान में स्थापित श्रेणियों हटाएँ, और फिर गतिशीलता राज्य का चयन(व्यक्तिगत व्यवहार के तहत) के बाईं ओर पैनल। 11% तक बिस्तर पर रहने सेट करें।
  3. परिणाम टैब के तहत, ट्रैक दृश्य का चयन करें। परिणाम देखने के लिए (परिणाम टैब के अंतर्गत) विश्लेषण उत्पादन का चयन करें। प्रत्येक परीक्षण प्रकट करना चाहिए के लिए समय लिस्टिंग तालिका स्थिर बिताया।
  4. हाथ स्कोरिंग हैं, माउस माउस स्थिर खर्च करता है समय की तैराकी या चढ़ाई, और राशि खर्च करता है समय को मापने। इसके अलावा, पहली बार स्थिर करने के लिए विलंबता को मापने। परिणाम अनुभाग में देखें चित्र 2।

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Representative Results

सटीक स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन सही निर्देशांक स्थापित करने पर काफी निर्भर करता है। वायरस इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया सुई की नोक पर्वबिन्दु के चौराहे और interaural लाइन (चित्रा 1) पर सीधे सेट किया जाना चाहिए। यह सुई को सही ढंग से रखा गया है या नहीं, पता लगाने के लिए एक stereomicroscope उपयोग करने के लिए उपयोगी है। माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख रहे हैं वायरस इंजेक्शन थे, तो यह पर्वबिन्दु के चौराहे और interaural लाइन पर सीधे भूमि जाएगा, जिससे कि सुई तैनात किया जाना चाहिए। यही कारण है कि सिरिंज सुई में उद्घाटन सीधे चौराहे से ऊपर रखा जाना चाहिए, है। इस अध्ययन में, RBM8a, एक्सॉन जंक्शन परिसर में एक कोर कारक के खिलाफ shRNA व्यक्त lentivirus, दांतेदार गाइरस में इंजेक्ट किया गया था। lentivirus के भी संक्रमित न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए आरएफपी व्यक्त करता है। 2 लाल सिग्नल (चित्रा 3) से संकेत के रूप वायरस सही क्षेत्र में इंजेक्ट किया गया था कि पता चलता है।

व्यवहार कार्यों में महत्व हासिल करने के लिए _content ">, नमूना आकार समूह प्रति 12-15 चूहों से लेकर चाहिए। व्यवहार कार्यों दो सप्ताह स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के बाद आयोजित किया जा सकता है। बहुधा में, एक उत्सुक फेनोटाइप मौजूद है चूहों में काफी कम समय खर्च करते हैं नियंत्रण समूह की तुलना में खुले मैदान के केंद्र। परिणामों वयस्क चूहों के दांतेदार गाइरस में RBM8a की है कि पछाड़ना से संकेत मिलता है उत्सुक व्यवहार (पी <0.05, चित्रा 4) की ओर जाता है। एफ एस टी में, गतिहीनता में कोई नमूदार अंतर था नियंत्रण और दांतेदार गाइरस में RBM8a पछाड़ना विरोधी अवसादग्रस्तता व्यवहार (चित्रा 5) को प्रभावित नहीं करता है, सुझाव है कि प्रयोगात्मक चूहों,। के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण एक दो पूंछ, दो नमूना-असमान विचरण टी परीक्षण प्रदर्शन करने में शामिल थे।

चित्र 1
चित्रा 1: शीर्षस्थान और इंटर के चौराहेकर्ण रेखा। स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के लिए, सिरिंज सुई पर्वबिन्दु के चौराहे और interaural लाइन के साथ लाइन में खड़ा किया जाना चाहिए। इस बिंदु को शून्य पर सेट किया जाता है।

चित्र 2
चित्रा 2: योजनाबद्ध illustrating पूरे प्रयोग के लिए इस समय।

चित्र तीन
दांतेदार गाइरस में वायरस के सफल इंजेक्शन illustrating प्रतिनिधि मस्तिष्क टुकड़ा पैमाने बार = 100 माइक्रोन: चित्रा 3।।

चित्रा 4
चित्रा 4:। नियंत्रण और एक उपन्यास ओपन क्षेत्र के केंद्र में खर्च प्रयोगात्मक चूहों प्रयोगात्मक चूहों signif खर्च है कि समय की राशिएक उत्सुक फेनोटाइप का संकेत क्षेत्र के केंद्र में icantly कम समय, (एन = 9-11, *, टी 18 = -2.72, पी <0.05, मतलब SEM)

चित्रा 5
चित्रा 5:। नियंत्रण और प्रयोगात्मक चूहों एफ एस टी में स्थिर रहे हैं कि समय की राशि प्रयोगात्मक चूहों स्थिर बिताए समय में नियंत्रण से अलग नहीं करना (एन = 9-11, = 1.25 टी 18, पृष्ठ> 0.05, मतलब SEM)

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Discussion

सफल स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन तीन कारकों पर निर्भर करते हैं: सुई की (टिप, जिंदा माउस रखने (पर्वबिन्दु के चौराहे और interaural लाइन पर सुई की नोक) निर्देशांक के लिए सही शून्य बिंदु की स्थापना, और शून्य बात करने का अधिकार गहराई सेटिंग सिर्फ) मस्तिष्क के ऊतकों के बाहरी छू। चूहों की व्यवहार्यता महत्वपूर्ण है। सर्जरी के अस्तित्व माउस ठीक anesthetized और पर्याप्त एनाल्जेसिक प्राप्त करता है सुनिश्चित करने के द्वारा सहायता प्राप्त किया जा सकता है। दर्द की सर्जरी के बाद गरीब वसूली का एक प्रमुख कारण माना जाता है। माउस को पूरी तरह से सर्जरी के दौरान anesthetized सुनिश्चित करना है कि (यह पैर चुटकी का जवाब नहीं होना चाहिए), और एनाल्जेसिक की सही खुराक देने, अस्तित्व की मदद करनी चाहिए (माउस के वजन के आधार पर)। 17 इसके अतिरिक्त, माउस पर रखा जाना चाहिए सर्जरी की प्रक्रिया में एक हीटिंग पैड यह संज्ञाहरण से ऊपर उठता है, जब तक। वे anesthetized हैं जब चूहे अपने शरीर के तापमान को नियंत्रित नहीं कर सकते हैं। उनके शरीर गुस्साature सर्जरी की प्रक्रिया के दौरान काफी कमी आ जाएगी। स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी की लंबाई अपेक्षाकृत कम है हालांकि, हाइपोथर्मिया गंभीरता से माउस अस्तित्व प्रभावित हो सकती है। उचित suturing तकनीक को भी एक सफल सर्जरी के संचालन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। चूहे उनके टांके में लेने की कोशिश करेंगे, ताकि घाव पर बहुत अधिक तनाव डाल करने के लिए के रूप में यह भी तंग टांके हटाने को रोकने के लिए पर्याप्त तंग कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन नहीं। प्रत्येक सिलाई में चार समुद्री मील माउस सिवनी निकालने में असमर्थ है कि यह सुनिश्चित करना चाहिए। एक खुला घाव को नकारात्मक रूप से किसी भी व्यवहार प्रयोगों को प्रभावित करती है, जो संक्रमण, के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि होगी के रूप में उचित suturing महत्वपूर्ण है।

बहुधा हरकत और चूहों में उत्सुक phenotype के आकलन के लिए बनाया गया एक व्यवहार प्रतिमान है। माउस व्यवहार का परीक्षण करते हैं, यह चूहों से निपटने और क्षेत्र को स्थापित करते समय बहुत सावधान रहना जरूरी है। बहुधा में, प्रतिमान माउस की आशंका whe जोड़ी करने के लिए डिज़ाइन किया गया हैएन अपनी प्राकृतिक जिज्ञासा के साथ, एक नए माहौल में रखा जाता है और नवीनता का पता लगाने की इच्छा। एक जंगली प्रकार माउस शुरू में यह और अधिक संवेदनशील है जहां खुले मैदान के केंद्र में प्रवेश करने से हिचक हो जाएगा, लेकिन अंत में इसकी वजह से सहज जिज्ञासा के लिए, ऐसा करेंगे। एक उत्सुक माउस में, एक और अधिक संवेदनशील स्थान (क्षेत्र के बीच में) को पार करने की आशंका उनके प्राकृतिक जिज्ञासा और केंद्र में खर्च काफी कम समय में परिणाम होगा, जो पता लगाने के लिए इच्छा से अधिक हो जाएगा। यकीन प्रतिमान सही ढंग से कार्य करने के लिए, यह खुले मैदान के अलावा अन्य कारकों के साथ जुड़े तनाव कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। तनाव माउस व्यवहार कक्ष (ताकि बाहरी वातावरण एक संभव confounding चर नहीं है) करने के लिए acclimate करने के लिए अनुमति देता है, और पिछले माउस के साथ जुड़े सभी बदबू आ रही है हटा दिया गया है कि गारंटी करने के लिए, चूहों के बीच क्षेत्र बाहर की सफाई के द्वारा कम किया जा सकता है। 18 अनुचित तरीके की वजह से कर रहे हैं कि किसी भी मतभेद को खत्म करने में मदद करनी चाहिए ये कदम handliएनजी चूहों। इस अध्ययन में, RBM8a पछाड़ना चूहों नियंत्रण की तुलना में, एक उपन्यास खुले मैदान के मध्य में काफी कम समय बिताया। चूहों वे नियंत्रण की तुलना में, और अधिक कमजोर कर रहे हैं, जहां उपन्यास खुले मैदान के मध्य में प्रवेश करने के लिए और अधिक संकोच कर रहे हैं, क्योंकि यह एक उत्सुक फेनोटाइप का सूचक है।

एफ एस टी चूहों में विरोधी अवसादग्रस्तता फेनोटाइप की जांच करना चाहता है। पानी की एक बाल्टी में रखा, तैराकी बनाम अस्थायी काफी कम समय खर्च करते हैं कि चूहों एक विरोधी अवसादग्रस्तता phenotype के पास करने के लिए माना जाता है। मजबूर कर तैरने के परीक्षण में गतिहीनता (उदाहरण के लिए दे रही है) व्यवहार निराशा के रूप में व्याख्या की है। इस प्रतिमान विरोधी अवसाद उपचार द्वारा मान्य है। विरोधी अवसाद दवाओं काफी कम समय बिताना होगा कि प्राप्त 7,8,9 चूहे एक विरोधी अवसादग्रस्तता फेनोटाइप का संकेत है, जो नियंत्रण, की तुलना में तैर रही है। इस अध्ययन में, RBM8a पछाड़ना चूहों काफी स्थिर बिताए समय में नियंत्रण चूहों से अलग नहीं किया था। थीएस वयस्क चूहों के दांतेदार गाइरस में RBM8a पछाड़ना एक अवसादग्रस्तता, या विरोधी अवसादग्रस्तता phenotype के प्रकाश में लाना नहीं करता है कि इंगित करता है। हमारे पिछले अध्ययन में, वयस्क चूहों के दांतेदार गाइरस में RBM8a overexpression काफी एक विरोधी अवसादग्रस्तता प्रभाव को इंगित करता है, जो नियंत्रण की तुलना में समय स्थिर कम हो जाती है। 16

इस पत्र में प्रतिनिधित्व के लिए इस्तेमाल किया स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन दांतेदार गाइरस को निशाना बनाया गया। ब्याज की जीन अत्यधिक वयस्क माउस में वहाँ व्यक्त किया जाता है के बाद से दांतेदार गाइरस, लक्ष्य साइट के रूप में चुना गया था। इसके अलावा, दांतेदार गाइरस अवसाद और चिंता के साथ संबद्ध किया गया है। उदाहरण के लिए, एक अध्ययन में चुनिंदा पृष्ठीय या उदर दांतेदार गाइरस में या तो दाना कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए POMC-ChR2 चूहों का इस्तेमाल किया। पृष्ठीय और उदर दोनों दांतेदार गाइरस के एक्टिवेशन चिंता में दांतेदार गाइरस के एक संभावित भूमिका का संकेत है, एक उपन्यास पर्यावरण की वृद्धि की खोज करने के लिए नेतृत्व किया। 19 एक अलग अध्ययनबिगड़ा न्यूरोजेनेसिस साथ कि चूहों। एक अवसादग्रस्तता फेनोटाइप का संकेत है, एफ एस टी में गतिहीनता बढ़ गया था 20 इसके अलावा, अग्रमस्तिष्क में एपी OA 1 की सक्रियता एक विरोधी अवसादग्रस्तता एफ एस टी में प्रभाव, नवीनता दबा खिला, और सुक्रोज खपत परीक्षण करने के लिए सुराग मिल गया। वीईजीएफ़ एपी OA 1 की दांतेदार गाइरस में दस्तक दी डाउन हो गया था, यह विरोधी अवसादग्रस्तता फेनोटाइप 21 इन आंकड़ों दांतेदार गाइरस चिंता और अवसाद के pathophysiology में एक भूमिका है कि सलाह देते हैं। खो दिया है, और दांतेदार गाइरस हो सकता है कि संकेत दिया गया था एक अच्छा क्षेत्र हमारे आनुवंशिक मॉडुलन और व्यवहार प्रयोगों के लिए लक्षित करने के लिए। दांतेदार गाइरस में सभी कोशिकाओं को संक्रमित किया जाएगा तो यह है कि केवल कोशिकाओं को विभाजित (रेट्रोवायरस) करने के लिए विरोध के रूप में एक lentivirus, विशेष रूप से इस्तेमाल किया गया था।

एक वायरस एक विशिष्ट में इंजेक्ट किया जा सकता है के बाद से (अन्य व्यवहार कार्यों के अतिरिक्त) इन तीन प्रयोगात्मक डिजाइन का एक संयोजन, चूहों में व्यवहार phenotypes के आकलन के लिए एक उपन्यास तरीका हैविशिष्ट विकासात्मक समय पर आईसी मस्तिष्क क्षेत्र। व्यवहार कार्यों के साथ रखा एक lentivirus के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन का प्रयोग केवल पूरा होने में कुछ महीने लग जाते हैं और शोधकर्ताओं के एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र में जीन की अभिव्यक्ति का व्यवहार प्रभाव पर प्रारंभिक आंकड़ों को इकट्ठा करने के लिए अनुमति देता है। इसके विपरीत, सशर्त पीटा चूहों अक्सर उत्पन्न करने के लिए साल लग। इसके अलावा, वायरस के सेल प्रकार वरीयता आगे कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, रेट्रोवायरस केवल एक lentivirus के सभी प्रकार की कोशिकाओं को संक्रमित करता है, जबकि (जैसे दांतेदार गाइरस में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में) कोशिकाओं को विभाजित संक्रमित कर सकते हैं। 22,23 इस प्रकार, एक साथ सह इंजेक्शन के साथ, इन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है और व्यक्तिगत रूप से मान्य प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल एक त्वरित प्रदान लेकिन व्यापक तरीके माउस व्यवहार पर, एक लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र में विशिष्ट जीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereotactic Apparatus item 51725 Stoelting co. 51725
Quintessential stereotaxic pump  Stoelting co. 53311
Injection Styringe, 65 RN Hamilton 7633-01
DMEM Sigma-Aldrich D5796
PEI  Polysciences Inc. 23966
Scissors Fine Surgical Tools 14084-08
Blunt end forceps Fine Surgical Tools 11002-12
Needle holder  Fine Surgical Tools 12001-13
Drill Ram Products Inc Microtorque control box, Tech2000 handpiece with pedal
Glass bead sterilizer Inotech  IS-400
Absorbable sutures  Unify M-K518r19 Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs VWR 89031-270
Heating pad Gaymar T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears Rugby NDC 0536-6550-91
Disposable syringe BD Syringe 309623
Cloth
Gloves  Ansell Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic see veternarian 
Tracking software Noldus Ethovision XT
Tracking Camera Noldus Media Recorder

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References

  1. Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
  2. Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
  3. Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
  4. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in sterotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).
  5. Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
  6. Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
  7. Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
  8. Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
  9. Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
  10. Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
  11. Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
  12. Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
  13. Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
  14. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
  15. Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
  16. Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
  17. Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
  18. Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
  19. Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
  20. Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
  21. Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
  22. Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
  23. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).

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व्यवहार अंक 99 stereotactic इंजेक्शन खुले मैदान टेस्ट मजबूर तैरना परीक्षण चिंता व्यवहार न्यूरोसाइंस
स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन तकनीक को लागू पशु व्यवहार पर आनुवंशिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए
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McSweeney, C., Mao, Y. Applying… More

McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. J. Vis. Exp. (99), e52653, doi:10.3791/52653 (2015).

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