L'applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali

Summary

Iniezione stereotassica di lentivirus esprimere cDNA o shRNAs possono modulare l'espressione genica in specifiche aree cerebrali di topi. Qui, vi presentiamo un protocollo per combinare iniezioni stereotassiche con compiti comportamentali, come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST).

Abstract

Iniezione stereotassica è una tecnica utile per fornire lentivirus ad alto titolo di aree cerebrali mirati nei topi. Lentivirus possono sia iperespressione o espressione genica atterramento in una regione relativamente concentrato, senza danni significativi al tessuto cerebrale. Dopo il recupero, il mouse iniettato può essere testato su vari compiti comportamentali come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST). L'OFT è progettato per valutare locomozione e il fenotipo ansia nei topi misurando la quantità di tempo che trascorre un topo nel centro di un campo aperto romanzo. Un topo più ansioso spenderà molto meno tempo nel centro del campo romanzo rispetto ai controlli. La FST valuta il fenotipo antidepressivo quantificando la quantità di tempo che i topi trascorrono immobile, quando sono immessi in un secchio d'acqua. Un mouse con un fenotipo antidepressivo spenderà molto meno tempo rispetto immobile agli animali di controllo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la STERiniezione eotactic di un lentivirus, in combinato disposto con test comportamentali per valutare come i fattori genetici modulare comportamenti animali.

Introduction

Il mouse è stato ampiamente utilizzato in neurobiologia perché è facile da manipolare geneticamente. Tecniche di Gene knockout permettono ai ricercatori di indagare come ogni fattore genetico dà forma comportamenti del mouse. Inoltre, il sistema cre-loxP fornisce uno strumento prezioso per tessutale e Cell tipo- knockout gene specifico nei topi, che consente ai ricercatori di studiare la funzione dei geni in diversi tessuti. ¹ Tuttavia, in pratica, i modelli di espressione dei promotori CRE sono difficili da controllare , e finora molti driver cre stabiliti non hanno raggiunto l'espressione specifica regione. ^2,3

In alternativa, l'iniezione stereotassica è un metodo che gli obiettivi di specifiche regioni cerebrali di topo adulto. Iniettando virus geneticamente modificati che esprimono cDNA o shRNA, regione specifica modulazione dell'espressione genica può essere raggiunto. Anche se le dimensioni del cervello di ogni mouse varia, la posizione di specifiche regioni cerebrali può essere determinato mediante coordi stereotassicanates impostato da punti di riferimento sul cranio del cervello di topo. I punti di riferimento più comunemente usati sono bregma, lambda, e la linea interaurale. Usando coordinate ottenute da un atlante del cervello, ⁴ la posizione esatta di ogni area del cervello può essere identificato dal antero-posteriore (A / P), medio-laterale (M / L), e dorso-ventrale (D / V) assi da bregma / interaurale intersezione linea. In genere i virus iniettato nel cervello dei topi sono etichettati con entrambi proteina fluorescente rosso o verde (RFP o GFP), in modo che le iniezioni possono essere confermate mediante microscopia a fluorescenza.

Sono particolarmente necessari per la ricerca di base di disturbi psichiatrici valutazioni comportamentali di topi. I sintomi di disturbi psichiatrici nei pazienti tipicamente coinvolgono comportamenti anomali. Alcuni di questi comportamenti umani sono evolutivamente conservati e possono essere imitate direttamente e osservato nel topo. Ad esempio, la depressione può essere modellato in topo misurando disperazione comportamentale. Le persone affette da depressione oftit si sentono come se nulla fanno potrà mai aiutare, un sintomo che può portare al suicidio. Nei roditori, questo può essere modellata utilizzando il nuoto forzato test (FST), che misura la quantità di tempo un mouse nuotare contro galleggiante in una vasca d'acqua (vista come rinunciare). Questo paradigma è convalidato dal salvataggio fenotipo con antidepressivi. ^7,8,9 topi che hanno ricevuto antidepressivi spenderà molto meno tempo immobile rispetto ai controlli non trattati. Un altro test comportamentale, il Field Test Open (OFT) è progettato per valutare locomozione nei topi, e inoltre può essere utilizzato per analizzare il fenotipo ansia nei topi. ^5,6 Questo test è basato sulla premessa che i topi sentono più sicuri quando sono vicini alla parete in un campo aperto romanzo. Topi wild-type alla fine di esplorare l'ambiente romanzo, in quanto sono animali curiosi. Tuttavia, spendere meno tempo nel centro del campo indica ansia nel topo, come il mouse non sarà in grado di superare la initial paura causata da un ambiente nuovo. L'ansia del mouse, come quantificato dalla quantità di tempo trascorso nel centro di un campo aperto, può essere paragonato ad ansia clinica nell'uomo, che è presente in molti disturbi psichiatrici.

La combinazione di iniezioni stereotassica con paradigmi comportamentali è un nuovo modo per alterare l'espressione di un gene specifico in una zona del cervello mirato. L'effetto dell'espressione genica modulata sui comportamenti del mouse può essere determinata. In contrasto intero knockout cervello, questo metodo è particolarmente utile in quanto si rivolge solo specifiche aree cerebrali. Inoltre, le iniezioni stereotassica sono tipicamente eseguiti nell'adulto tipo topo selvatico, di conseguenza, l'espressione del gene endogeno è stata mantenuta per tutta stadi di sviluppo. Questo metodo di evitare l'effetto confound se è richiesto il gene per la sopravvivenza nella fase embrionale o postnatale dello sviluppo. Una limitazione importante è che i topi sperimentali hanno bisogno di andare through un intervento chirurgico invasivo, in cui i crani di topi hanno da aprire. Inoltre, il grado di modulazione gene è determinata dal titolo e l'efficienza del virus. Il virus deve essere iniettato nella regione corretta usando coordinate stereotassica, che richiede strumenti speciali. La verifica del sito di iniezione corretta può essere completato solo post mortem.

Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per testare il coinvolgimento di un gene specifico in varie malattie neurologiche. Ad esempio, virale mediata RNAi mira il gene Th (che permette di sintetizzare la dopamina) è stato iniettato nel compacta sostanza nera, e l'analisi del comportamento motorio è stata condotta. ¹⁰ Un altro studio ha utilizzato l'iniezione stereotassica di un silenziamento DISC1 lentivirus per valutare il comportamento del mouse in relazione alla schizofrenia. Knockdown di DISC1 ha portato ad un aumento della locomozione in risposta alle novità (paralleli sintomi positivi nella schizofrenia), e una maggiore immobilità nellaFST. ¹¹ Allo stesso modo, un ulteriore studio ha scoperto che 5-HT _1B sovraespressione ha portato ad un aumento comportamento esplorativo nella OFT, coerente con un fenotipo anti-ansia utilizzando questo metodo. ¹² iniezioni stereotassica in grado di fornire il virus cre indurre ricombinazione in cre-loxP topi . Questo metodo è stato utilizzato per eliminare selettivamente il recettore Y2 nell'amigdala e il nucleo della stria terminale. Dopo l'analisi comportamentale, questi topi sono stati trovati a un fenotipo antidepressivo quando il gene è stato eliminato nell'amigdala centrale, ma non fenotipo quando il gene è stato eliminato nell'amigdala basolaterale o il letto nucleo della stria terminale. ¹³ Così, questa tecnica fornisce uno strumento unico per studiare l'effetto genetico sui comportamenti animali.

Protocol

NOTA: Tutti i protocolli su animali sono stati rilevati in conformità con le linee guida per la cura degli animali di The Pennsylvania State University, IACUC # 44057

1. Lentivirus Produzione

NOTA: Il giorno prima transfezione, LentiX-293 cellule dovrebbe essere al 80% di confluenza.

1. Lavare le cellule con DMEM appena prima trasfezione e incubare in 10 ml di DMEM / 10% FBS con penicillina (100 UI / ml) e streptomicina (100 ug / ml) per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Diluire DNA e polietilenimmina (PEI) (1 mg / ml) in rapporto 1: 3 (1 mg di DNA: 3 ml di PEI) in 1 ml di DMEM e vortex per 1 min. Il volume di DNA aggiunto dipende dalla concentrazione del DNA. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
   1. Ad esempio, utilizzare 20 mg di plasmide DNA, composto da 10 mg di plasmide vettore, 5 mg di psPax2 ¹⁴ plasmide, 5 mg di virus della stomatite vescicolare (VSV) con 60 ml di PEI per piatto.
3. Aggiungere 1 / 10th volume di mezzo di coltura DMEM totale (cioè 1 ml per 10 ml terreno di coltura in un piatto 100 mm). Aggiungere 1 ml di DNA-PEI miscela goccia a goccia nel piatto e agitare il piatto intorno fino al mezzo di coltura è ben miscelato con il DNA.
4. Incubare per 6 ore a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura.
5. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il supernatante virale e centrifugare a 627 xg per 5 minuti a 4 ° C in un tubo da 50 ml. Filtrare 30 ml di surnatante virale attraverso un filtro siringa da 0,45 micron in una provetta ultracentrifuga.
6. Aggiungere acqua sterile per bilanciare i tubi, e coprire tubi con piccolo pezzo di parafilm. Tubi Spin a 11.249 g per 120 min a 4 ° C. Rimuovere il liquido con una punta del vuoto.
7. Aggiungere 100 ml di PBS freddo del tubo. Agitare delicatamente il tubo a 4 ° CO / N.
8. Per ri-sospensione del virus, pipetta tha PBS aggiunto nel passaggio 1.8 negli pellet per 10 volte, facendo attenzione a non toccare il pellet con la punta. Il pellet non sarà nuovamente sospeso fino a quando questo è completo.
9. Aliquota il virus a 10-20 ml per provetta, flash-congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C.

2. iniezione stereotassica

2.1) Preparazione degli strumenti

1. Mettere un paio di forbici, pinze smussato-end, un porta-aghi, bisturi, tamponi di cotone, e un panno in una confezione sigillata con un indicatore della sterilizzazione, e in autoclave prima dell'intervento. Inoltre, è necessario ottenere il 10% povidone iodio, il 70% di alcol etilico, suture assorbibili, una piastra elettrica, lacrime artificiali, un bicchiere tallone sterilizzatore, trapano, una punta, due siringhe monouso, una siringa per iniezione, rasoio elettrico, analgesico (ketoprofene), anestetico (avertin), guanti, e un apparato stereotassico con pompa di iniezione.
2. Rendere 1,25% soluzione avertin fresco quel giorno, il filtro in una cappa sterile utilizzando un 0,2 &# 181; m filtro siringa sterile, e posizionare in una fiala di siero sterile. Miscelare 2,5 g di alcol 2,2,2-tribromoethyl in 5 ml di alcool terz-amile, poi sciogliere in 200 ml di acqua. Mantenere il pH inferiore a 5. ¹⁵

2.2) Preparazione del mouse

1. Amministrare avertin in base al peso del mouse (375 mg / kg). ¹⁵ Iniettare il mouse con la avertin tramite una iniezione intraperitoneale (IP), e quindi posizionare di nuovo nella sua gabbia fino a completo anestetizzato.
2. Dare un analgesico via iniezione IP (ketaprofen, 5 mg / kg), e luogo lacrime artificiali sugli occhi del mouse per evitare l'essiccazione.
3. Assicurarsi che il mouse è completamente addormentato da pizzicare il piede. Se il mouse risponde al pinch piede, poi dare più anestetico (in dosi di 50 microlitri). Radere il capo del mouse utilizzando un rasoio elettrico. Radere l'area da operare (tipicamente da appena dietro le orecchie, all'inizio del muso), e l'area circostante.
4. Posizionare la i del mousento l'apparato stereotassico. Latch i denti anteriori sul morsetto anteriore e abbassare la fascetta e stringerlo in modo che la ganascia è completamente sicuro.
5. Inserire le barre auricolari nel condotto uditivo per stabilizzare completamente la testa. Fare attenzione a non inserire le barre orecchio troppo lontano, che potrebbe danneggiare l'orecchio interno. Una volta terminato, il corpo del mouse dovrebbe essere in grado di essere spostati leggermente senza interrompere la posizione della testa.
6. Posizionare una piastra elettrica sotto il mouse in modo da regolare la temperatura corporea del topo durante tutta la procedura.
7. Pulire accuratamente l'area chirurgica. Usando un tampone di cotone, strofinare 10% povidone iodio in un movimento circolare, partendo dal centro del sito chirurgico e procedendo verso l'esterno. Quindi, utilizzare un tampone di cotone per lucidare il 70% di alcol etilico sul sito chirurgico nello stesso modo. Ripetere l'operazione per due volte.

2.3) La prima incisione

1. Una volta che il mouse è preparata, aprire il sacchetto materiale sterile. Cambiare i guanti prima Touching strumenti. Estrarre il panno sterile e posizionare gli strumenti sul panno. Se qualsiasi strumento tocca una superficie non-sterili, utilizzare il tallone sterilizzatrice vetro per 15 secondi per sterilizzarlo.
2. Prendere il bisturi in mano e smussato-end la pinza dominanti della mano non dominante. Utilizzare le pinze smussato-end per afferrare delicatamente la pelle del mouse, e fare un'incisione con il bisturi. Iniziare l'incisione circa 1,5 cm sopra le orecchie (verso il naso) e si estendono per circa 0,5 cm al di sotto le orecchie. Estendere l'incisione verticalmente al centro della testa del mouse per esporre bregma (Figura 1).
3. Una volta bregma viene visualizzato, prendere una punta di cotone sterile per rimuovere delicatamente il sangue che copre la superficie del cranio. Utilizzare due punte di cotone per spingere la pelle verso il lato della testa.

2.4) Equipment Setup

1. Dopo il sangue viene rimosso dalla superficie del cranio, e bregma è chiaramente visualizzato, preparare la siringa (concentrazione di 10 ⁸ TU / ml, il volume di 1 ml). Nella cappa, riempire la siringa con il virus da iniettare. Assicurarsi che non bolle sono dentro. Posizionare la siringa nell'apparato stereotassica, facendo in modo che sia completamente protetto.
2. Lentamente abbassare la siringa finché è proprio sopra la superficie del cranio, in modo che la punta dell'ago della siringa sterile viene impostato l'intersezione del bregma e la linea interaurale. Impostare questo punto zero, e determinare le coordinate di questo punto.
3. A seconda della zona del cervello di interesse, variare le coordinate stereotassica. Determinare le coordinate utilizzando un atlante del cervello ^4. Una volta che le coordinate sono determinati, spostare l'ago della siringa in modo che corrisponda quelle coordinate. Obiettivo giro dentato utilizzando le coordinate: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1.82 mm. Abbassare l'ago proprio sopra il cranio di visualizzare dove il foro deve essere forato.
4. Sollevare la siringa un po ', prendere il trapano e posizionare il bi trapanot proprio sopra il sito di perforazione di destinazione a circa un angolo di 45 ° al cranio. Inizia la perforazione, e continueranno a perforare sino cranio cede. Quando il cranio cede, un calo di resistenza può essere rilevato. Fare attenzione a non forare nel cervello, in modo da evitare danni corticale.
5. Prendere una punta di cotone sterile e rimuovere il sangue dal foro.
6. Abbassare la siringa in modo che la punta si trova proprio sulla superficie del cervello (non il cranio). Impostare il D / V coordinate (profondità) 0. Lower siringa alla profondità desiderata, in base alle coordinate dell'atlante cerebrali. Per raggiungere il giro dentato, impostare D / V per -1,79 mm.
7. Avviare l'iniezione ad una velocità di 0,2 ml / min. Orologio per assicurarsi che la siringa non scivoli inferiore alla profondità desiderata. Se ciò si verifica, aumentare leggermente la siringa alla profondità desiderata di nuovo.
8. Dopo l'iniezione è terminata, attendere circa 2 minuti per assicurare che tutti i virus residuo è stato assorbito. Lentamente alzare la siringa e utilizzare una punta di cotone per rimuovere qualsiasi liquid dal sito di iniezione.
9. Ripetere l'operazione per l'altro emisfero.

2.5) sutura

1. Rimuovere la sutura sterile e ago dalla confezione e presa l'ago utilizzando i porta-aghi. Affrontare il bordo appuntita dell'ago dalla porta-aghi. Tenere la pinza smussato-end della mano non dominante, e utilizzarlo per afferrare la pelle sul mouse. Inizia con la mano dominante.
2. Spingere delicatamente la sutura attraverso la pelle e utilizzare il forcipe smussato-end per afferrare la pelle sull'altro lato dell'incisione. Tirare il materiale di sutura attraverso fino a circa 0,75 pollici rimane.
3. Rilasciare dell'ago, e utilizzare il forcipe smussato-end per avvolgere la sutura intorno al supporto dell'ago una volta, quindi, afferrare la sutura rimanente 0,75 pollici con porta-aghi, e tirare la sutura attraverso, in modo che il supporto dell'ago e l'ago finire sul lato della testa opposta a quella che erano in origine. Ciò dovrebbe costituire un nodo.
4. Ripetere questa operazionealtre tre volte, alternando il lato della testa porta-aghi finisce su ogni volta.
5. Tagliare la sutura e ripetere i passaggi fino a quando 2.5.1-2.5.3 l'incisione viene chiusa.

2.6) cure post-operatorie

1. Rimuovere delicatamente le barre di orecchio del mouse e rimuovere la sua mascella dal morsetto anteriore.
2. Tenere il mouse sul tappetino di riscaldamento fino a quando non si sveglia e si muove da sola. Monitorare il mouse quotidiano, e tenere d'occhio per i segni di dolore, come quella di non governare, mangiare o bere. Dare analgesico aggiuntivo quando ritenuto necessario.

3. Aprire Field Test

3.1) Impostazione

1. Ottenere un quadrato vuoto, arena di plastica con dimensioni 50 cm x 50 cm, 50 cm di altezza muri (ma può essere leggermente più grande). Pulire campo con 70% di alcool etilico prima dell'inizio dell'esperimento. Assicurarsi che l'alcol etilico è asciugato completamente prima di mettere un mouse nell'arena.
2. Posizionare l'arena sullapiano, e cercare di garantire l'illuminazione è impostato per ridurre al minimo le ombre e riflessi.
3. Se si utilizza software di monitoraggio, posizionare la fotocamera direttamente sovraccarico di campo aperto, a circa 1,5 ft sopra il campo aperto (abbastanza lontano per intero encompass tutta l'arena, ma abbastanza vicino per avere una visione chiara del mouse).
4. Impostare una zona nel centro area (circa una superficie di 30 cm x 30 cm). ¹⁶ Per impostare una zona, fare clic sulla scheda zona 1 nel pannello laterale.
   1. Selezionare un contorno forma nel pannello superiore, e delineare il perimetro della zona centrale. Selezionare aggiungere la zona, e fare clic all'interno della zona centrale. Utilizzando le istruzioni del programma, il nome della zona (questo sarà indicato come 'centro' per questa procedura). Se la prova comportamentale viene ottenuto manualmente, assicurarsi che il fondo del campo è divisa in 10 cm x 10 cm quadrati, contrassegnato con del nastro.
5. Impostare il software in modo che le impostazioni siano corrette, e il mouse è facilmente visiBLE sullo schermo. Realizzare questo regolando le impostazioni di rilevamento sulla macchina per essere compatibile con l'arena di test (illuminazione) e il colore del mouse.
   NOTA: Quando le impostazioni sono corrette, il sistema dovrebbe monitorare solo il mouse, e non tutte le ombre o urina / materia fecale. Le impostazioni del software specifici dipendono l'illuminazione della scena, e il colore del mouse.

3.2) acclimatazione e di prova

1. Spostare topi sperimentali nella comportamentale stanza 1 ora prima del test al fine di acclimatarsi al loro ambiente. Lasciare i topi nella loro gabbia per l'acclimatazione.
2. Accendere la fotocamera su nastro il compito comportamentale e posizionare il mouse verso la parte anteriore centro dell'arena in modo che il mouse si trova di fronte al muro.
3. Impostare il timer per 5 minuti, e allontanarsi dalla scena. Se possibile, lasciare la camera in modo da non influenzare accidentalmente il mouse.
4. Una volta 5 min sono, rimuovere il mouse e metterli nella loro gabbia.
5. Utilizzare 70% di alcol etilico per pulire a fondo il campo prima di procedere alla prossima mouse. Assicurarsi che l'alcol etilico è asciugato completamente.

3.3) Punteggio

1. Si consideri il mouse come essendo nel centro del campo quando tutti e quattro zampe sono all'interno del centro 30 cm x 30 centimetri.
2. Quantificare la quantità di tempo il mouse passa nel centro. In alternativa, determinare questa volta usando il software di monitoraggio (come Noldus ethovison).
   1. Per fare questo, vai alla scheda di analisi, e cliccare su "movimento" sotto profili di analisi. Eliminare le categorie attualmente impostati, e poi selezionare "in zona" sotto la scheda posizione. Selezionare la zona centrale. Quindi, selezionare "output analysis" (nella scheda dei risultati) per visualizzare i risultati. Una tabella che elenca il tempo speso per immobile deve apparire ogni prova.
3. In caso contrario, segnerà l'OFT a mano. Il campo aperto dovrebbe avere 25 10 cm x 10 cm di lato delineati sul fondo della opecampo n (come indicato al punto 3.1.3). Quantificare la quantità di tempo il mouse passa nel centro, oltre al numero di ingressi nel centro dell'arena. ¹⁶
   NOTA: Il centro 30 cm x 30 cm zona è considerata il centro del campo aperto. Un mouse è considerato che abitano la regione centrale se le quattro zampe si trova all'interno dell'area 30 x 30 centimetri.

4. Costretto Swim test

NOTA: Lasciare un minimo di cinque giorni tra le attività comportamentali.

4.1) Impostazione

1. Ottenere un 2 L secchio chiaro, e riempire con 22 ° C acqua. Posizionare il secchio su un tavolo, e cercare di garantire l'illuminazione è impostato per ridurre al minimo le ombre e riflessi.
2. Se si utilizza software di monitoraggio, posizionare la fotocamera direttamente dall'alto della benna.
3. Impostare il software in modo che il mouse è facilmente visibile sullo schermo.

4.2) acclimatazione e di prova

1. Spostare topi sperimentale nel ro comportamentaleom 1 ora prima del test si adatti i dintorni. Lasciare i topi nella loro gabbia per l'acclimatazione.
2. Accendere la fotocamera su nastro il compito comportamentale. Delicatamente, posizionare il mouse al centro del secchio d'acqua. Assicurarsi di non far cadere il mouse. Abbassare lentamente il mouse, così le sue zampe anteriori toccano l'acqua prima. Fare attenzione ad evitare che la loro testa da sommergere.
3. Impostare il timer per 6 min, e allontanarsi dalla zona comportamentale.
4. Una volta 6 min sono, rimuovere il topo dal secchio, e pulire l'acqua in eccesso prima di mettere di nuovo il mouse nella loro gabbia.

4.3) Punteggio

1. Se si utilizza il software di monitoraggio, impostato per cento l'immobilità al 11%, come suggerito da Noldus (questo dovrebbe essere l'impostazione di default), per quantificare il tempo che galleggia contro nuoto.
2. Per quantificare l'utilizzo del sistema di tracking, vai alla scheda di analisi, e fare clic sul movimento sotto profili di analisi. Eliminare le categorie attualmente impostate, e quindi selezionare lo stato di mobilità, suil pannello laterale sinistro (sotto comportamento individuale). Impostare l'immobilità al 11%.
3. Selezionare la visualizzazione pista, sotto la scheda dei risultati. Selezionare uscita analisi (nella scheda dei risultati) per visualizzare i risultati. Una tabella che elenca il tempo speso per immobile deve apparire ogni prova.
4. Se punteggio mano, misurare il tempo con il mouse passa il nuoto o l'arrampicata, e la quantità di tempo il mouse passa immobile. Inoltre, misurare la latenza del primo tempo immobile. Vedere la Figura 2 in Risultati sezione.

Representative Results

Iniezione stereotassica accurata si basa molto su come impostare le coordinate corrette. La punta dell'ago utilizzato per iniettare il virus dovrebbe essere impostato direttamente sull'intersezione di bregma e la linea intraurale (Figura 1). È utile utilizzare uno stereomicroscopio di accertare se l'ago è posizionato correttamente. Quando guardando attraverso il microscopio, l'ago deve essere posizionato in modo che se il virus è stato iniettato, sarebbe atterrare direttamente sull'intersezione di bregma e la linea interaurale. Cioè, l'apertura della siringa deve essere posizionato direttamente sopra l'incrocio. In questo studio, un lentivirus che esprimono shRNA contro RBM8a, un fattore primario nel complesso esone giunzione, è stato iniettato nel giro dentato. La lentivirus esprime anche RFP etichettare neuroni infetti. La Figura 2 mostra che il virus è stato iniettato nella regione corretta come indicato dal segnale rosso (Figura 3).

_content "> Per ottenere un significato in compiti comportamentali, la dimensione del campione deve essere compresa 12-15 topi per gruppo. compiti comportamentali possono essere condotte due settimane dopo le iniezioni stereotassica. In OFT, un fenotipo ansioso è presente se i topi spendono molto meno tempo a il centro del campo aperto rispetto al gruppo di controllo. I risultati indicano che knockdown della RBM8a nel giro dentato di topi adulti conduce a comportamenti ansiosi (p <0.05, Figura 4). Nel FST, non vi era alcuna differenza osservabile in immobilità tra controllo e topi sperimentali, suggerendo che RBM8a atterramento nel giro dentato non influenza il comportamento anti-depressivi (Figura 5). L'analisi statistica consisteva in esecuzione di un due code, varianza t-test a due campioni-disuguale.

Figura 1: Intersezione di Bregma e InterLinea sonora. Per le iniezioni stereotassica, l'ago della siringa deve essere allineato con l'intersezione del bregma e la linea interaurale. Questo punto è fissato a zero.

Figura 2: Schema Illustrando la linea temporale per l'intero esperimento.

Figura 3: la fetta cervello Rappresentante illustrando iniezione di successo del virus nel giro dentato La barra della scala = 100 micron..

Figura 4: la quantità di tempo che il controllo e topi sperimentali trascorso nel centro di un campo aperto romanzo topi sperimentali spendono signif.cativamente meno tempo nel centro dell'arena, indicando un fenotipo ansioso (N = 9-11, *, T ₁₈ = -2.72, p <0,05, media ± SEM)

Figura 5:. La quantità di tempo che il controllo e mouse sperimentale sono Immobile nel FST topi sperimentali non differiscono dai controlli in tempo speso immobile (N = 9-11, T ₁₈ = 1.25, p> 0,05, media SEM)

Discussion

Iniezioni stereotassica di successo si basano su tre fattori: tenere il mouse viva, impostando il corretto punto zero per le coordinate (punta dell'ago sull'intersezione di bregma e la linea interaurale), e impostando la giusta profondità al punto zero (punta dell'ago sfiora l'esterno del tessuto cerebrale). La vitalità dei topi è importante. Sopravvivenza chirurgia può essere aiutata da fare in modo che il mouse sia correttamente anestetizzato e riceve adeguata analgesico. Il dolore è noto per essere una delle principali cause di scarso recupero dopo l'intervento chirurgico. Assicurare che il mouse è completamente anestetizzato durante l'intervento chirurgico (non deve rispondere pizzichi piedi), e dando la giusta dose di analgesico (basato sul peso del mouse), dovrebbe aiutare la sopravvivenza. ¹⁷ Inoltre, il mouse di tenere a una piastra elettrica per tutto il processo di chirurgia fino a quando non si sveglia dall'anestesia. I topi non può regolare la loro temperatura corporea quando sono anestetizzati. Il loro corpo temperamentoature scenderà in modo significativo durante il processo di chirurgia. Anche se la lunghezza della radiochirurgia stereotassica è relativamente breve, l'ipotermia potrebbe compromettere seriamente la sopravvivenza del mouse. La tecnica corretta sutura è anche uno strumento per lo svolgimento di un intervento chirurgico di successo. I topi cercherà di raccogliere i loro punti di sutura, quindi è fondamentale fare in modo che i punti di sutura sono abbastanza stretto per impedire la rimozione, ma non troppo stretto da mettere troppa tensione sulla ferita. Quattro nodi in ogni punto dovrebbero garantire che il mouse è in grado di rimuovere la sutura. Sutura adeguata è importante come una ferita aperta aumenterà la suscettibilità alle infezioni che si ripercuoteranno negativamente eventuali esperimenti comportamentali.

L'OFT è un paradigma comportamentale progettato per valutare la locomozione e il fenotipo ansia nei topi. Durante il test di funzionamento del mouse, è importante essere molto attenti nel maneggiare i topi e la creazione l'arena. Nel OFT, il paradigma è stato progettato per abbinare l'apprensione del topo when collocato in un nuovo ambiente, con la sua naturale curiosità e desiderio di esplorare le novità. Un tipo di mouse selvaggio sarà inizialmente riluttanti a entrare nel centro del campo aperto, dove è più vulnerabile, ma finirà per farlo, a causa della sua innata curiosità. In un mouse ansia, l'apprensione di attraversare uno spazio più vulnerabile (centro del campo) sarà maggiore della loro naturale curiosità e desiderio di esplorare, che si tradurrà in molto meno tempo trascorso in centro. Per assicurarsi che il paradigma funziona correttamente, è importante ridurre al minimo stress associato con fattori diversi dal campo aperto. Lo stress può essere ridotto al minimo, consentendo il mouse si adatti alla camera comportamentale (quindi l'ambiente esterno non è una possibile confusione variabile), e pulire il campo tra i topi, per garantire che tutti gli odori associati con il mouse precedente sono stati rimossi. ¹⁸ Questi passaggi dovrebbero contribuire ad eliminare le differenze che sono causati da impropriamente handlitopi ng. In questo studio, i topi RBM8a knockdown speso molto meno tempo al centro di un campo aperto romanzo, rispetto ai controlli. Questo è indicativo di un fenotipo ansioso, poiché i topi sono più riluttanti a entrare nel centro del campo aperto romanzo, dove sono più vulnerabili, rispetto ai controlli.

La FST si propone di indagare il fenotipo antidepressivo nei topi. Quando posto in un secchio d'acqua, topi che spendono molto meno tempo rispetto a galleggiante nuoto sono considerati avere un fenotipo antidepressivo. L'immobilità nel test di nuoto forzato viene interpretato come disperazione comportamentale (es rinunciare). Questo paradigma è convalidato da un trattamento anti-depressivo. ^7,8,9 topi che ricevono farmaci anti-depressivi spenderà molto meno tempo flottante rispetto ai controlli, che è indicativo di un fenotipo antidepressivo. In questo studio, i topi RBM8a atterramento non differiva significativamente da topi di controllo in tempo speso immobile. This indica che RBM8a atterramento nel giro dentato di topi adulti non suscitare un fenotipo depressivo, o anti-depressivo. Nel nostro studio precedente, RBM8a sovraespressione nel giro dentato di topi adulti diminuisce significativamente il tempo immobile rispetto ai controlli, il che indica un effetto anti-depressivo. ¹⁶

Le iniezioni stereotassica utilizzati per la rappresentazione in questo documento sono stati mirati a giro dentato. Il giro dentato è stata scelta come sito di destinazione, poiché il gene di interesse è altamente espresso lì nel topo adulto. Inoltre, il giro dentato è stato associato con la depressione e ansia. Per esempio, uno studio ha utilizzato topi POMC-ChR2 per attivare selettivamente le cellule dei granuli sia nella dorsale o giro dentato ventrali. Attivazione del sia dorsale e ventrale giro dentato portato a un aumento esplorazione di un ambiente nuovo, indicando un ruolo potenziale del giro dentato in ansia. ¹⁹ Uno studio diversoscoperto che i topi con neurogenesi alterata era aumentata immobilità nel FST, indicando un fenotipo depressivo. ²⁰ Inoltre, l'attivazione di Ap oa ₁ nel proencefalo porta ad un effetto anti-depressivo nel FST, alimentazione novità soppressa, e prova del consumo di saccarosio. Quando VEGF è stato abbattuto nel giro dentato di Ap oa _1, questo fenotipo antidepressivo è stato perso. ²¹ Questi dati suggeriscono che il giro dentato ha un ruolo nella patofisiologia di ansia e depressione, e ha indicato che il giro dentato possono essere una buona zona a bersaglio per la nostra modulazione genetica e esperimenti comportamentali. Un lentivirus stato usato specificamente, in modo che tutte le celle nel giro dentato sarebbero infettate, in contrapposizione alle cellule solo divisori (retrovirus).

Una combinazione di questi tre progetti sperimentali (oltre ad altri compiti comportamentali) è un nuovo modo di valutare fenotipi comportamentali nei topi, dal momento che un virus può essere iniettato in un specifarea del cervello ic in momenti specifici dello sviluppo. Utilizzando iniezioni stereotassica di un lentivirus coppia con compiti comportamentali richiede solo pochi mesi per completare e permette ai ricercatori di raccogliere dati preliminari sugli effetti comportamentali di espressione genica in una zona specifica del cervello. Al contrario, i topi knockout condizionali spesso richiedono anni per generare. Inoltre, tipo di cellula preferenza di virus può essere usato per colpire ulteriormente le cellule. Ad esempio, i retrovirus possono infettare solo le cellule in divisione (come le cellule staminali neurali nel giro dentato), mentre un lentivirus infetta tutti i tipi di cellule. ^22,23 Così, insieme al co-iniezione, questi protocolli sperimentali diffuse e individualmente convalidati forniscono un rapido ma modo completo per testare il ruolo specifico gene in una zona del cervello mirata, sui comportamenti del mouse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder