Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتوليد نوع ثنائي التكافؤ اتش 5 (Ad5) ناقلات إثبات صحة المبدأ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 من خلال الاستفادة من استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس. وقد تجلى هذا متجه لعرض اللياقة البدنية النوعية، والقدرة على الهروب الأمصال Ad5 إيجابية في المختبر، واستضداد وكذلك المناعية لمستضدات يدمج.
Abstract
اتش المصلي 5 (Ad5) تم تعديل نطاق واسع مع أساليب التحوير التقليدية لتطوير لقاح. وكفاءات انخفاض هذه النواقل Ad5 تعديل تقليديا في التجارب السريرية يمكن أن تكون مرتبطة في المقام الأول مع Ad5 الحصانة موجودة من قبل (PEI) بين الغالبية العظمى من السكان. لتعزيز التنمية قاح تنقلها Ad5 من خلال حل قلق Ad5 PEI، واستخدمت استراتيجية مبتكرة مستضد قفيصة التأسيس. من خلال ميزة هذه الاستراتيجية، Ad5-تنقلها نحن بني لأول مكوك hexon البلازميد HVR1-صاحب KWAS-HVR5 6 / pH5S التي كتبها subcloning المنطقة hypervariable (HVR) 1 من hexon إلى البلازميد المكوك شيدت سابقا HVR5-صاحب 6 / pH5S، الذي كان له 6 العلامة دمجها في HVR5. تم توليفها هذه القطعة HVR1 DNA تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية حاتمة ELDKWAS. وكان 6 / pH5S HVR1-KWAS-صاحب HVR5-ثم خطي وتحويلها بالاشتراك مع خطي العمود الفقري البلازميد pAd5 / ΔH5 (GL)،لإعادة التركيب مثلي. هذا البلازميد معاد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 تم transfected في الخلايا لتوليد ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. تم التحقق من صحة هذه متجه لياقة بدنية النوعية المشار إليها الفيروسي عيار البدني (VP / مل)، عيار المعدية (IP / مل)، والمقابلة VP نسبة / IP. كل من حاتمة فيروس نقص المناعة البشرية وصاحب 6 العلامة كانت على قفيصة Ad5 المعرضة للسطح، واحتفظت استضداد حاتمة محددة من تلقاء نفسها. وأشار مقايسة تحييد قدرة هذا ثنائي التكافؤ ناقلات للتحايل على تحييد بواسطة الأمصال Ad5 إيجابية في المختبر. أظهر تحصين الفئران توليد القوي محددة مناعة الخلطية لحاتمة فيروس نقص المناعة البشرية وصاحب 6. وأشارت هذه الدراسة إثبات صحة المبدأ القائل بأن البروتوكول المرتبطة باستراتيجية مستضد قفيصة التأسيس يمكن الاستفادة عمليا للجيل اللقاحات Ad5 تنقلها عن طريق تعديل البروتينات قفيصة مختلفة. بل يمكن و هذا البروتوكولurther تعديل لتوليد اللقاحات تنقلها اتش نادر-المصلي.
Introduction
اتش الإنسان (الإعلان) هو المتوسطة الحجم، غير يلفها الفيروسات مع قفيصة منواة لذوات الوجوه التي تحتوي على ضعف جينوم الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. الإعلان ينتمي إلى عائلة فيروسات غدانية، مع تصنيف إلى سبع مجموعات (A خلال G). تحتوي كل مجموعة الفيروس من الأنماط المصلية مختلفة. لقد منها، اتش المصلي 5 (Ad5) من مجموعة C الأكثر درس على نطاق واسع وتطبيقها على نطاق واسع للنهج تنقلها مثل العلاج الجيني واللقاحات.
وقد وضعت استراتيجية التحوير التقليدية وتطبيقها للتعديلات Ad5، الذي يتميز عن تشريد الفيروس الجينات في وقت مبكر مع الجين في المصالح، والتعبير تركيزا من الجينات من الاهتمام في مضيف. ومن الأمثلة على ذلك بناء pENV9 / Ad5hrΔE3 من خلال استبدال الجينات في وقت مبكر 3 (E3) مع مراجعة الجينات من قردي بفيروس نقص المناعة 1، وبناء AdCMVGag من خلال استبدال الجينات في وقت مبكر 1 (E1) مع الجين هفوة من نقص المناعة البشريفيروس (HIV) 2، وبناء أمريكا اللاتينية والكاريبي الإعلان Z عن طريق استبدال E1 مع أمريكا اللاتينية والكاريبي Z الجينات 3. وتطبيق واسع النطاق للاستراتيجية التحوير التقليدية على Ad5 يعتمد على الأسس الموضوعية التالية: مجموعة واسعة من المضيفين لAd5، والهندسة الوراثية الممكنة على الفيروس وانتشار الفيروس، والإقامة كبيرة من إدراج الجين الغريب وسلامة Ad5 4،5. ومع ذلك، فإن انخفاض كفاءات من العلاجات السريرية Ad5 تنقلها عن طريق استخدام هذه الاستراتيجية كان عقبة رئيسية، والتي تم تعيينها لتكون مرتبطة في المقام الأول مع Ad5 PEI، منذ Ad5 هو السائد حتى بين الغالبية العظمى من الأطفال والبالغين 4،6.
للتغلب على عقبة رئيسية من Ad5، فإن الهدف الأساسي هو وضع استراتيجية بديلة التحايل Ad5 PEI. المناعة الفطرية 7، حصانة التكيفية مثل تحييد الأجسام المضادة (يعتقل) 10/08 وCD8 + T استجابات الخلايا وقد ثبت أن 10 ضد Ad5 للمشاركةntribute إلى Ad5 PEI، مع Ad5 يعتقل الظهور للعب دور مهيمن في المساهمات في Ad5 PEI 10،11. وعلاوة على ذلك، Ad5 يعتقل الحواتم الهدف الموجود في البروتينات قفيصة، بما في ذلك hexon بروتين رئيسي والألياف وقاعدة بينتون. منها، hexon هو الهدف الرئيسي للAd5 يعتقل 8،11-13. وبناء على هذه النتائج، وقد تم عرض استراتيجية مبتكرة مستضد قفيصة التأسيس. هذه الاستراتيجية الجديدة تسلط الضوء على استبدال أو إدراج البروتينات من الفائدة على Ad5 البروتينات قفيصة، الأمر الذي يحول أو أقنعة الحواتم Ad5 تحييد، مما يؤدي إلى الاعتراف ينقص من جانب يعتقل وكفاءة الإدارات ناقلات Ad5. ومن الجدير بالذكر أن هذه الاستراتيجية التنافسية لأنه يمكن أن يساعد أيضا المضيفين يثير مناعة الخلطية قوية والمناعة الخلوية قوية من خلال تقديم مباشرة مستضدات المصالح لجهاز المناعة 4،14،15. وبناء على هذه الاستراتيجية، والاستنساخ الجزيئي والمؤتلف الانقاذ الإعلان ناقلات فيروسية يمكن تقسيم الهيكليةإلى أربع خطوات رئيسية: (أ) إعداد الجينات في المصالح جزء إما عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) أو التوليف؛ (ب) ربط جزء من الجينات في البلازميد المكوك الذي يحتوي على جزء الجينات في المصالح والأسلحة مثلي إلى العمود الفقري اتش. (ج) إعادة التركيب مثلي من قبل البلازميد المكوكية التي تحتوي على جزء الجينات في المصالح مع العمود الفقري البلازميد خطي pAd5 / ΔH5 (GL) 16-تحويل المشترك؛ (د) ترنسفكأيشن من خطي البلازميد الفيروسة الغدانية المؤتلف لانقاذ ناقلات الإعلان المؤتلف تدمج مع مستضدات من الفائدة.
قمنا بمد مجموعتنا والبعض الآخر هذه الاستراتيجية التأسيس الإعلان بديلة عن الإعلان تطوير لقاح ضد مسببات الأمراض المعدية تنقلها مختلفة. أبلغنا توليد متجه الإعلان المؤتلف الإعلان، وHVR1-خطابات الضمان، صاحب 6 -V3 من خلال دمج صاحب الموسومة HIV-1 مستضد V3 في لغة HVR1 من Ad5 hexon (hexon5). وأثار هذا متجه ولدت شارعاونج الاستجابة المناعية الخلطية محددة لحاتمة V3 4. أبلغنا أيضا تطوير Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 من خلال دمج HIV-1 غشاء المنطقة ectodomain الداني (MPER) في لغة HVR2 من hexon5 2. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت مجموعة الدكتور تشو فوائد هذه الاستراتيجية التأسيس الإعلان لتطوير المصلي الإعلان 3 (AD3) اللقاحات تنقلها، أي، توليد الفيروسية ناقلات R1SP70A3 من خلال دمج SP70 تحييد حاتمة من الفيروس المعوي 71 في HVR1 من AD3 hexon (hexon3). R1SP70A3 ولدت يعتقل قوي وإنتاج IFN-γ محددة لSP70 حاتمة، مما يؤدي إلى معدل عال من الحماية ضد الفيروس المعوي 71 تحديا 15.
لغرض مرجعية فنية، اتخذت دراستنا الاستفادة من استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس النوعية التركيز على جيل من ثنائي التكافؤ Ad5 ناقلات Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 من خلال دمج مستضد HIV-1 في HVR1 لدا صاحب العلامة إلى HVR5 من hexon5. كما تم تقييم ناقلات فيروسية ولدت مناعيا. ويمكن استخدام استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس نحو وضع نهج التطعيم Ad5 تنقلها ضد الأمراض المعدية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت جامعة ألاباما في برمنغهام المؤسسي استخدام الحيوان والعناية اللجنة استخدام الفئران كما هو موضح في هذه الوثيقة بموجب البروتوكول رقم افق 101109272.
1. البناء الوراثية لتعديل البلازميد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 مع استراتيجية قفيصة التأسيس مستضد
- بناء البلازميد مكوك 6 / pH5S HVR1-KWAS-صاحب HVR5-
- طلب البلازميد التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي توليفها HVR1-KWAS بين المواقع انزيم التقييد AgeI إلى ACCI من hexon5 الجينات.
- هضم 6 ميكروغرام من جزء توليفها (HVR1-KWAS) مع الانزيمات AgeI (6 وحدات) وACCI (6 وحدات) لمدة 3 ساعات في 37 ° C. حل جزء هضمها في هلام الاغاروز 2٪ بحلول الكهربائي، وتنقية جزء مع مجموعة استخراج الهلام DNA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- على أساس نسبة المولي من إدراج لناقلات بنسبة 3: 1، استخدم يغاز T4 DNA ويغاز بuffer إلى ligate 12 نانوغرام من جزء (HVR1-KWAS) إلى 100 نانوغرام من البلازميد المكوكية التي شيدت سابقا HVR5-صاحب 6 / pH5S 17 في حجم 10 ميكرولتر في RT لمدة 2 ساعة، عن طريق مواقع AgeI وACCI.
- تحويل 1 ميكرولتر من 10 ميكرولتر من المنتج إلى ربط 50 ميكرولتر من الخلايا DH5α electrocompetent في electroporator (في 1800 V). إضافة 950 ميكرولتر من SOC المتوسط إلى الخلايا DH5α تحول واحتضان الخليط لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية، مع 300 دورة في الدقيقة. انتشار 100-200 ميكرولتر من خليط 1 مل على لوريا، Bertani (LB) أجار التي تحتوي على كانامايسين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- لفحص ~ 10 المستعمرات التي PCR استهداف جزء HVR1-KWAS، مزيج من التمهيدي إلى الأمام (TATGTGTGTCATGTATGCGT)، عكس التمهيدي (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) وDH5α مستعمرة واحدة في حل مزيج الرئيسي PCR (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة). تشغيل العينات على thermocycler من خلال الإشارة إلى دليل المقدمة مع الحل PCR مزيج الرئيسي.
- استخدام التمهيدي إلى الأمام (TATGTGTGTCATGTATGCGT) تسلسل جزء HVR1-KWAS في استنساخ عرضه في قسم 1.1.4.1.
- بناء البلازميد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6
- ملخص 6 ميكروغرام من HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 / pH5S مع الانزيمات EcoRI (6 وحدات) وPmeI (6 وحدات) لمدة 3 ساعات في 37 ° C، وتنقية جزء يحتوي على الأسلحة إعادة التركيب مثلي والمزدوجة المعدلة وراثيا hexon5، كما جاء في الخطوة 1.1.2. خطي البلازميد العمود الفقري pAd5 / ΔH5 (GL) 16 مع صوي.
- شارك في تحويل 100 نانوغرام من جزء الهدف من البلازميد مكوك و 100 نانوغرام من خطي pAd5 / ΔH5 (GL) العمود الفقري إلى 50 ميكرولتر من الخلايا BJ5183 electrocompetent لإعادة التركيب مثلي في electroporator (في 1800 V). إضافة 950 ميكرولتر من SOC متوسطة إلى الخلايا تحولت واحتضان الخليط لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية، 300 دورة في الدقيقة. انتشار 100-200 ميكرولتر من خليط 1 ملعلى أجار LB تحتوي على كانامايسين (نهائي 50 ميكروغرام / مل) للO / N الحضانة عند 37 درجة مئوية.
- اختيار ~ 10 المستعمرات الصغيرة إلى 3 مل السائل LB تحتوي على كانامايسين (نهائي 50 ميكروغرام / مل) للO / N الحضانة عند شاكر (250 دورة في الدقيقة، 37 ° C). استخراج البلازميدات من الثقافة. استخدام تحليل PCR لفحص 10 المستعمرات من خلال استهداف جزء HVR1-KWAS، كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.1.
- لفحص نفس المستعمرات من خلال تحليل PCR استهداف جزء بيكسل من الجينوم العمود الفقري، مزيج التمهيدي إلى الأمام (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT)، عكس التمهيدي (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) واحدة BJ5183 مستعمرة في حل مزيج الرئيسي PCR (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة). تشغيل العينات على thermocycler من خلال الإشارة إلى دليل المقدمة مع PCR حل مزيج الرئيسي.
- تعيين PCR المستعمرات انقر نقرا مزدوجا إيجابية pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6.
- تحويل 100 نانوغرام من البلازميد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 فيلDH5α الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.
- استخدام تحليل PCR لفحص ~ 10 المستعمرات من خلال استهداف جزء HVR1-KWAS، كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.1.
- استخدام تحليل PCR لفحص نفس المستعمرات من خلال استهداف جزء بيكسل من الجينوم العمود الفقري، كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.2.
- استخدام التمهيدي إلى الأمام (TATGTGTGTCATGTATGCGT) تسلسل جزء HVR1-KWAS في pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6.
2. إعداد التعديل Ad5 الفيروسية المتجهات Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6
- تشكل المتوسطة كاملة من خلال إضافة FBS (النهائية 10٪) والأحماض الأمينية 100X غير الضرورية (النهائي 0.1 ملم)، و 200 ملي L-الجلوتامين (النهائي 2 مم) والبنسلين / الستربتومايسين الحل (النهائي 1٪) في DMEM مع ارتفاع نسبة الجلوكوز . الحفاظ على الكلى الجنينية (HEK293) الخلايا البشرية في المتوسط كاملة في حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2 تحت 85٪ شروط مرطب).
- إنقاذ الفيروسية هاءالمنشئ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6
- البذور 3.0 × 10 6 الخلايا HEK293 في واحدة T-25 قارورة تحتوي على 5 مل من المتوسط الشامل وثقافة O / N لتحقيق أحادي الطبقة مع 80٪ التقاء.
- خطي 15 ميكروغرام من pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 في حجم 100 ميكرولتر مع انزيم التقييد باشي (15 وحدة) عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- استخراج خطي pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 بواسطة الطرد المركزي رد فعل مرتين (10000 x ج لمدة 1 دقيقة) مع حجم مساو من الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي (النسبة 25: 24: 1) في غطاء الدخان وبواسطة الطرد المركزي متسلسل (10000 x ج لمدة 10 دقيقة) مع الحل المختلط (300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ و 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم) و 700 ميكرولتر من الايثانول 70٪. تجاهل طاف في كل خطوة الطرد المركزي.
- Resuspend والبلازميد المنقى في ~ 40 ميكرولتر من الماء المقطر أو تريس، EDTA (TE) العازلة. Quantitate الحمض النووي البلازميد عن طريق قياس دي البصريnsity (OD) في 260 نانومتر.
- Transfect 3 ميكروغرام من البلازميد خطي مع التجاري كاشف liposomal ترنسفكأيشن في قارورة T-25، وفقا لدليل الشركة المصنعة. تغيير المتوسطة ترنسفكأيشن مع المتوسطة كاملة في 6 ساعات بعد ترنسفكأيشن وحضانة لاحقة في حاضنة الثقافة. الحفاظ على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عن طريق استبدال المتوسطة كاملة كل يومين أو ثلاثة أيام، حتى الفردي شكل لويحات الفيروسية.
- عندما تتطور لويحات لتأثير الاعتلال الخلوي الكامل (CPE)، تتخلص من الخلايا المتبقية من القارورة في غطاء العقيمة، والمحللة خلية الحصاد بواسطة الطرد المركزي المتوسطة في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تعليق بيليه خلية في ~ 1 مل من المتوسط تحتوي على 2٪ FBS، وكسر الخلايا عن طريق تجميد ذوبان أربع مرات. جمع طاف تحتوي على الفيروس إنقاذهم بعد الطرد المركزي المحللة في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نشر على نطاق واسع من ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6
- نشر عشرفيروس البريد في T-75 قارورة تحتوي على خلايا HEK293 في غطاء العقيمة التي تصيب مع 1/3 لالمحللة كامل من القارورة T-25. السماح CPE الكامل لتطوير ضمن 2-3 أيام في حاضنة الثقافة. حصاد طاف المحللة كما جاء في الخطوة 2.2.5.
- نشر الفيروس في 02:59 T-175 قوارير في غطاء العقيمة التي تصيب مع 1/2 لالمحللة كامل من القارورة T-75، اعتمادا على ظروف انتشار الفيروس. السماح CPE الكامل لتطوير ضمن 2-3 أيام في حاضنة الثقافة. حصاد طاف المحللة كما جاء في الخطوة 2.2.5.
- نشر الفيروس في أحد عشر أو أكثر T-175 قوارير في غطاء العقيمة التي تصيب مع 1/2 لالمحللة الكامل من T-175 قارورة السابقة (ق). تحديد مقدار استخدام قارورة استنادا إلى ظروف انتشار الفيروس وكمية الفيروس في أمس الحاجة إليها. حصاد طاف المحللة كما جاء في الخطوة 2.2.5 عندما يحدث CPE كاملا في غضون 2-3 أيام في حاضنة الثقافة.
- Purification من Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 كلوريد السيزيوم
- إعداد اثنين من كثافة حلول CSCL في 5 ملي HEPES: 1.33 جم / مل و 1.45 جم / لتر، في حين تجنب الاتصال مع CSCL.
- تحميل 4 مل من CSCL (1.33 جم / مل) في أنبوب معقم نابذة فائقة السرعة، وتحميل بلطف 4 مل من CSCL (1.45 جم / مل) ضد الجزء السفلي من الأنبوب. تحميل 4 مل من المحللة طاف ببطء على الجزء العلوي من التدرجات في غطاء العقيمة.
- أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 110،000 x ج لمدة 3 ساعات في 4 درجات مئوية لفصل ناضجة / الشريط السفلي الفيروس من معيبة / أعلى الفرقة الفيروس. جمع الشريط السفلي باستخدام حقنة 3 مل المسلحة مع G إبرة 33 وتمييع الفرقة مع 5 ملي HEPES إلى وحدة تخزين 4 مل في غطاء العقيمة.
- تحميل أنبوب آخر مع اثنين من كثافة حلول CSCL والفرقة مخفف من الفيروس كما هو موضح في الخطوة 2.4.2. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 110،000 x ج O / N عند 4 درجات مئوية. جمع الفرقة الفيروسية كما هو موضح في الخطوة 2.4.3.
- حقن محلول الفيروسات التي تم جمعها في dialysغير الكاسيت التي كتبها حقنة 3 مل المسلحة مع G إبرة 33 في غطاء العقيمة.
- وضع الكاسيت في 700 مل من 1X العازلة غسيل الكلى (1 L صفة: 100 مل من 10X PBS، 100 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ و 800 مل من الماء المقطر، تصفية المخزن المؤقت من خلال مرشح 0.22 ميكرون) واستبدال العازلة غسيل الكلى كل 3 ساعة لمدة 4 مرات. نضح من الحل فيروس مدال باستخدام حقنة اذعا.
3. التحقق من ناقلات الفيروسية إنقاذهم
- الفيروسية المتجهات المعايرة
- للفيروس عيار البدني، وتمييع كل من الفيروسات وعازلة لغسيل الكلى (التحكم الخلفية) في 1: 10 و 1: 20 في تحلل العازلة فيروس (10٪ SDS في تريس، EDTA) في أنابيب صغيرة، واحتضان جميع الأنابيب عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- بدوره على مقياس التكيف للظلام وتعيين طريقة الامتصاصية في OD 260 نانومتر. استخدام المخزن المؤقت لغسيل الكلى المخفف (1: 10) لتحقيق التوازن في إشارة الخلفية بالضغط على أسفل "على بياض". اكتب "10 + 90" في قرار مجلس الأمن مقياس التكيف للظلامالتابعين، وقراءة إشارة من الفيروس المخفف (1: 10).
- قراءة إشارة من الفيروس المخفف (1: 20) باتباع الأسلوب في خطوة 3.1.2، ولكن بدلا من كتابة "5 + 95" في شاشة مقياس التكيف للظلام. ضرب رقمين قراءات الفيروس عن طريق 1.1x10 12 وحساب متوسط عيار مع وحدة منصب نائب الرئيس / مل، استنادا الى اثنين من التتر الفردية من التخفيفات اثنين.
- لعيار المعدية فيروس (IP / مل)، استخدم KARBER TCID الإحصائي 50 طريقة 14 لتحديد عمق الإصابة على الخلايا HEK293 في 10 يوما بعد العدوى (نقطة في البوصة)
- تقييم العرض التعرض الأنتيجين على ناقلات فيروسية
- معطف ناقلات فيروسية في لوحة ELISA والمضي قدما مع بقية الخطوات في طريقة ELISA القياسي 14. استخدام البشري مكافحة gp41 (2F5) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) والفأر مكافحة صاحب العلامة ماب للكشف عن مستضدات أدرجت 14 المقابلة.
- حل ناقلات فيروسية في denatuأحمر الكهربائي هلام بروتين (SDS-PAGE) والمضي قدما مع بقية الخطوات في القياسية طريقة الغربية وصمة عار 14. استخدام البشري مكافحة gp41 (2F5) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) والفأر مكافحة صاحب العلامة ماب للكشف عن مستضدات أدرجت 14 المقابلة.
- في تقييم المختبر من ناقلات على القدرة على تجاوز الأمصال Ad5-الفعل positve
- الحفاظ على خلايا هيلا في المتوسط كاملة في حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 تحت 85٪ شروط مرطب). تشكل المتوسطة كاملة من خلال إضافة FBS (النهائية 10٪)، و 200 ملي L-الجلوتامين (النهائي 2 مم) وحل البنسلين / الستربتومايسين (النهائي 1٪) إلى الحد الأدنى الضروري المتوسطة النسر (MEME).
- البذور خلايا هيلا في 6 لوحات جيدا في الخلايا 1x10 6 / جيد، واحتضان لوحات في حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية و 5٪ CO الظروف مرطب 2 تحت 85٪) لمدة 2 ساعة. احتضان الأمصال Ad5 إيجابية (0.1 ميكرولتر أو 0 ميكرولتر) مع 5 IP / خلية من ناقلات فيروسية (Ad5 أو Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6) في حاضنة الثقافة لمدة 1 ساعة قبل إضافة مخاليط على 6 لوحات جيدة تحتوي على خلايا.
- في 24 ساعة إصابة آخر (HPI)، وشطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني والخلايا ليز في 0.5 مل من تحلل العازلة. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 5 دقائق، وجمع طاف. مزيج 20 ميكرولتر من طاف مع 100 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل للقراءة إشارة luciferase المراسل، منذ الفيروسات تحتوي على الجين luciferase المراسل.
4. المناعية تقييم ناقلات الفيروسية إنقاذهم
- إعداد مجموعتين التحصين: Ad5 وAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6.
- حقن الفئران (ن = 8 / مجموعة) العضل مع الفيروسات في 1X10 10 VP / الماوس، في مثلي "رئيس-دفعة" نظام التحصين، مع فاصل من 2 أسابيع.
- في 2 أسابيع آخر كل الحقن، وتنزف الفئران بدون تخدير التي كتبها الخد النزيف مع المشارط الحيوان (5 ملم طول الحافة) لجمع الدم في أنابيب 1.5 مل.
- مزيج من الدم في أنابيب كتبها قلب صعودا وهبوطا، واحتضان الدم في RT لمدة 30 دقيقة. تدور الأنابيب في 10000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية، ونقل الأمصال (الطبقة العليا) إلى 1.5 مل أنابيب جديدة.
- تدور الأنابيب الجديدة في 10000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية، ونقل الأمصال للتميز حديثا 1.5 مل أنابيب لتخزين في -80 ° C.
- تقييم مستضد معين مناعة الخلطية بواسطة ELISA القائم على الأمصال
- تمييع صاحب الببتيد (السهم عند 1 ملم) وHIV-1 الببتيد (السهم عند 1 ملم) بشكل منفصل في 100.
- ملي العازلة كربونات (الرقم الهيدروجيني 9.5) لتحقيق تركيز الببتيد طلاء على 10 ميكرومتر. معطف لوحات ELISA مع الببتيدات المخفف بشكل منفصل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر واحتضان لوحات O / N عند 4 درجات مئوية.
- تغسل الصحون مع PBST لمدة أربعة مرات في 200 ميكرولتر / جيد وكتلة لمدة 1 ساعة في 5٪ BSA في PBST. تطبيق الفئران الأمصال لوحات في التخفيف 1: 100 في عرقلة BUFفر، و 100 ميكرولتر / جيد. احتضان لمدة 2 ساعة حضانة في RT.
- تغسل الصحون مع PBST لأربع مرات. منع الصفائح التي يحتضنها في RT لمدة 30 دقيقة في عازلة تمنع في 100 ميكرولتر / جيد.
- تطبيق الماعز المضادة للماوس مفتش-HRP (1: 5000 في المنطقة العازلة حجب) في 100 ميكرولتر / جيد على حد سواء لوحات المغلفة مع صاحب الببتيد وHIV-1 الببتيد فردي. احتضان لمدة 2 ساعة على RT. تغسل الصحون مع PBST.
- قراءة لوحات في OD450 نانومتر بعد احتضان مع HRP الركيزة لمدة 30 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدمت هذه الاستراتيجية مستضد قفيصة التأسيس (الشكل 1A) لتوليد ثنائي التكافؤ Ad5 ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. أولا، المكوك البلازميد HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 / تم pH5S التي شيدت من قبل subcloning HVR1-KWAS جزء في السابق البلازميد المكوك شيدت HVR5-صاحب 6 / pH5S 17. ثانيا، البلازميد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 14 شيد قبل إعادة التركيب المتماثل بين جزء من "EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-His6-PmeI" وصوي خطي-pAd5 / ΔH5 (GL ) 16 (الشكل 1B). ترنسفكأيشن من باشي هضمها pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 في قارورة الرصاص T-25 لإنقاذ ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 14. ثم نشر ناقلات فيروسية انقاذ في نطاق واسع وتنقيته من قبل دورتين من CSCL التدرج نابذة فائقة السرعة.
لكيإثبات جدوى / اللياقة البدنية للناقلات فيروسية انقاذ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6، تم تحديد عيار البدني عند 1.3 × 10 11 VP / مل عن طريق قياس النسخ المادية من الجينوم الفيروسي، وكان عيار المعدية تحدد عند 1.4 × 10 9 IP / مل من قبل المعايرة الجسيمات الفيروسية المعدية الفعلية. تم احتساب نسبة VP / IP في وقت لاحق في 92 14، وعادة اعلان مع نسبة / IP VP أدناه 1000 يشير إلى وجود اللياقة البدنية النوعية لهذا الفيروس. من أجل إثبات ما إذا كان هذا الفيروس انقاذ يعرض مستضد فيروس نقص المناعة البشرية الأنتيجين وصاحب العلامة على التوالي على سطح قفيصة الفيروسية بروتين رئيسي hexon5، أجري ELISA مع الإنسان 2F5 ماب والفأر مكافحة صاحب العلامة ماب، على التوالي. وأشارت النتائج إلى أن كلا من 2F5 ماب البشري (الشكل 2A) 14 والفأر مكافحة صاحب العلامة ماب (الشكل 2B) 14 أظهرت ملزمة لAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6، في حين لم يكن هناك ملزم للكنترول السلبيةل ناقلات Ad5. تم استخدام تحليل الغربية وصمة عار لتأكيد البيانات في ELISA، على حد سواء 2F5 البشري ماب (الشكل 2C) 14 والفأر مكافحة صاحب العلامة ماب (الشكل 2D) 14 الكشف عن العصابات محددة حول 117 كيلو دالتون فقط في الفيروس Ad5 / H5- HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6، والتي تتطابق مع حجم البروتين hexon5. من أجل تقييم إمكانات Ad5 /-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب H5 6 في التحايل على تحييد بواسطة الأمصال Ad5 إيجابية، وأجري تحليل تحييد فحص خارج كما جاء في القسم بروتوكول 3.3. وأظهرت النتائج أن وحدة الانارة النسبية (RLU) إشارة من ناقلات فيروسية Ad5 تعامل مع 0 ميكرولتر من Ad5-الفعل positve الأمصال هو 12 مرة أعلى من ذلك من نفس ناقلات تعامل مع 0.1 ميكرولتر من Ad5-الفعل positve الأمصال (قيمة p <0.001 ). اقترح هذه تحييد ناقلات Ad5 من الأمصال Ad5-positvive. في المقابل، كان هناك فارق كبير من ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6تعامل مع 0 ميكرولتر و 0.1 ميكرولتر من الأمصال Ad5-الفعل positve (الشكل 3). منذ hexon هو الهدف الرئيسي من الإعلان يعتقل، وhexon محددة الحواتم تحييد تتواجد في جميع HVRs من hexon 12،18، والبيانات المذكورة أعلاه أثبتت أن Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 هرب تحييد بواسطة الأمصال Ad5-الفعل positve في المختبر، واقترح إمكانية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 على التحايل Ad5 PEI في البلد المضيف.
للتحقيق في ما إذا كان ثنائي التكافؤ تعديل Ad5 ناقلات فيروسية مع استراتيجية قفيصة التأسيس مستضد يمكن أن يثير مناعة الخلطية قوية محددة لمستضدات من الفائدة مسجلة، تم تطبيق "رئيس-دفعة" نظام التحصين لتحصين الفئران مع مكافحة ناقلات الأمراض الفيروسية Ad5 و وثنائي التكافؤ ناقلات Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. أظهر ELISA أساس الأمصال المغلفة مع HIV-1 الببتيد أن الأمصال من مجموعة تحصين Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 زيارتها significanر ملزمة لالببتيد HIV-1 في التخفيفات بين 40 و 640، بالمقارنة مع الأمصال من السيطرة على المجموعة (قيمة p <0.001) (الشكل 4A) 14. سيرا على أساس ELISA المغلفة مع الببتيد صاحب أظهرت أن الأمصال من مجموعة تحصين Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 كان كبيرا ملزم لالببتيد صاحب بالمقارنة مع الأمصال من السيطرة على المجموعة، كما إحصائية قيمة p < 0،001 في التخفيفات الأمصال من 40 و 80، قيمة P <0.01 في التخفيف من 160 و ص قيمة <0.05 في 320 التخفيف (الشكل 4B) 14. أشارت النتائج المذكورة أعلاه توليد استجابة مناعية خلطية ضد المستضدات إدراجها على ناقلات فيروسية ثنائي التكافؤ.
الشكل 1. توضيح تخطيطي لبناء الوراثي البلازميد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 مع استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس. وتتميز (A) استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس من قبل عرض مستضد من الفائدة على البروتينات قفيصة (hexon، قاعدة بنتا، بيكس و / أو الألياف) من اتش مباشرة. وقد تم تكييف هذا الرقم من Nemerow وآخرون، 2009. الفيروسات 384 (2009) 380-388، تم تصنيعه حقوق الطبع والنشر إلسفير. (B) جزء جين (HVR1-KWAS) واستنساخ في ناقلات تقوم تقنية من قبل الشركة. وsubcloned هذه القطعة إلى البلازميد المكوك شيدت سابقا HVR5-صاحب 6 / pH5S بسبب القيود المفروضة الانزيمات AgeI وACCI لتوليد 6 / pH5S HVR1-KWAS-صاحب HVR5. تم هضمها مما أدى البلازميد مكوكية مع الانزيمات EcoRI وPmeI، وشارك تحولت مع صوي خطي-البلازميد العمود الفقري pAd5 / ΔH5 (GL) لإعادة التركيب المتماثل، مما أدى إلى جيل معاد pAd5 العمود الفقري البلازميد / H5-HVR1-KWAS -HVR5-صاحب 6. في هذا الشكل، R1 يدل HVR1 وR5 يدل HVR5، وGL يدل على البروتين الأخضر مضان (GFP) وluciferase، بشكل منفصل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تقييم التعرض الأنتيجين من المستضدات إدراجها على سطح قفيصة من ناقلات فيروسية ثنائي التكافؤ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. ناقلات فيروسية كامل أجريت ELISA لتحديد إذا تعرضت المستضدات تأسست في ناقلات السطح مع الحفاظ على الخصائص المستضدات من تلقاء نفسها. وقد تم طلاء لوحات ELISA مع ناقل ثنائي التكافؤ، وحضنت مع الإنسان 2F5 ماب (A) أو الماوس لمكافحة صاحب ماب (B). وأشارت البيانات الربط كبيرة من الأجسام المضادة للناقلات ثنائي التكافؤ، ولكن ليس للسيطرة على ناقلات Ad5. R1-KWAS-R5-صاحب 6 يدل Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. تم إجراء تحليل الغربية وصمة عار لتأكيد مستضدي ملزمة لل2F5 ماب البشري (C) أو الماوس لمكافحة صاحب ماب (D) إلى المستضدات إدراجها على ناقلات ثنائي التكافؤ. في كل من (C) و (D)، حارة 1 يشير Ad5، وحارة 2 تشير Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تنفيذ الشكل 3. تقييم قدرة ناقل فيروسي ثنائي التكافؤ في الهروب من تحييد كتبها Ad5-POSITVE الأمصال في المختبر. مقايسة تحييد لتحديد ما إذا كان ناقل ثنائي التكافؤ يمكن الهروب من التعادل. وأشارت النتائج إلى تحييد الفيروس Ad5 من الأمصال، ولكن وفاقالرأس من تحييد الفيروس ثنائي التكافؤ في المختبر. في هذا الشكل، R1-KWAS-R5-صاحب 6 يدل Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. العلامات النجمية *** يدل على قيمة p <0.001.
وقد استخدم الرقم 4. في الجيل فيفو الحصانة الخلطية من قبل ناقلات فيروسية ثنائي التكافؤ في نموذج الفئران. سيرا على أساس ELISA لتقييم المناعة الخلطية ضد بروتينات أدرجت على ثنائي التكافؤ ناقلات Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 . وقد تم طلاء HIV-1 الببتيد (A) وصاحب الببتيد (B) في لوحات ELISA على حدة، تليها الحضانة مع مصل الفئران من المجموعات التحصين اثنين (Ad5 وAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6) . وأشارت بيانات الجيل كبير من الاستجابات المناعية الخلطية ضد مستضد HIV-1 في HVR1 (A) وعلامة له في HVR5 (B). تمثل كل نقطة بيانات الوسائل وSD من ثمانية مكررات. العلامات النجمية *** يدل على قيمة p <0.001 **، يدل على قيمة ف <0.01، و* يدل على قيمة ف <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قد تقلصت تطبيق استراتيجية التحوير التقليدية على تعديل Ad5 لتطوير لقاحات ويرجع ذلك أساسا إلى عنق الزجاجة المرتبطة Ad5 PEI 4،6. هذا الاختناق يمكن أن تقلص جزئيا من خلال تطبيق البديل مستضد قفيصة التأسيس استراتيجية (الشكل 1A)، لأن هذه الاستراتيجية يمكن التهرب من تحييد كتبها Ad5 يعتقل من خلال استبدال الحواتم تحييد من Ad5 مع مستضدات من الفائدة، وتسهيل توليد مناعة قوية لمستضدات من الفائدة يدمج. في هذه الدراسة، وجيل من ثنائي التكافؤ تعديل ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 تم تقديمه على أنه مثال المفاهيمي (الشكل 1B). المقابلة لقسم بروتوكول 1.1.1، جزء توليفها في البلازميد أمر يحتوي على HIV-1 استبدال الجينات قصيرة gp41 في اللغة HVR1 من hexon5. بترميز الجينات gp41 الجزئي حاتمة ELDKWAS، الذي يستبدلHVR1 جزئي من الأحماض الأمينية 139-144 من hexon5 14. ELDKWAS هو حاتمة تحييد قوية في HIV-1 gp41 19.
خلال الاستنساخ، وكان هناك اثنين من الخطوات الحاسمة. وكانت خطوة واحدة لاختيار اثنين من الانزيمات التقييد عند تجميع مصلحة جزء جين في قسم البروتوكول 1.1.1. اختيار الانزيمات اثنين يعتمد مشروط على موقع قفيصة الإعلان إلى تعديل، أي، في هذه الدراسة، تم تعيين جزء الجينات التي تحتوي على KWAS أن تدرج في HVR1 من البروتين hexon5. تقييد الانزيمات AgeI وACCI موجودة بشكل منفصل في مجالات اللغة HVR1 N-محطة وC-محطة المرافقة، ولم تكن موجودة في جزء HVR1-KWAS، وبالتالي تم اختيار AgeI وACCI إلى وضعها بشكل فردي في N-محطة وC- محطة من جزء توليفها HVR1-KWAS. منذ hexon هو الهدف الرئيسي من الإعلان يعتقل، وhexon محددة الحواتم تحييد تتواجد في جميع HVRs من hexon 12،18، فمن الممكن أن عشرالبريد hexon تعديل ناقلات Ad5 مع استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس يمكن أن يكتسب القدرة على تجاوز تحييد بواسطة الأمصال Ad5 إيجابية في المختبر، وحتى PEI Ad5 في المضيف. في هذه الدراسة، يمكن أن كلا HVR1 وHVR5 على ناقلات فيروسية ثنائي التكافؤ المساهمة في الهروب من تحييد من الأمصال Ad5 إيجابية. كانت خطوة حاسمة أخرى في القسم بروتوكول 1.2.2. بعد O / N حضانة-حولت شارك الخليط على LB أجار، تحتاج نمت BJ5183 المستعمرات أن يكون مثقف مباشرة في السائل LB لO / N، وتحتاج البلازميدات ليكون استخراجه مباشرة من خلايا BJ5183 كذلك. وتأخير إجراءات قد يؤدي إلى إعادة التركيب والطفرات المحتملة، منذ البلازميد معاد في الخلايا BJ5183 غير مستقر. البلازميد الصحيح من إعادة التركيب مثلي يحتاج إلى أن تتحول إلى DH5α من أجل الحفاظ على الأنواع الجينوم مستقرة وصحيحة.
بعد الاستنساخ، وكان هناك اثنين من الخطوات الأكثر أهمية. الالخطوة الأولى في قسم البروتوكول هو حول ترنسفكأيشن. فمن الضروري ل transfect ومعاد الإعلان العمود الفقري البلازميد في الخلايا التي تعبر عن Ad5 E1 (HEK293)، إذا البلازميد هو العمود الفقري E1 الجينات إلى حذفه. الخطوة الأخرى في المقطع بروتوكول 2،3 نحو رفع مستوى الفيروس. الإجراء الأساسي لرفع مستوى الفيروس يتبع مبدأ الارتقاء فيروس القياسية من قارورة T-25 و T-75 قوارير وT-175 قوارير. إلا أن عددا من قوارير (T-75 و / أو T-175) لاستخدامها يعتمد على سرعة نمو الفيروس، وتطوير التعليم المهني المستمر الناجم عن عدوى الفيروس، وكمية الفيروس الحاجة.
يسمح للاستراتيجية مستضد قفيصة-التأسيس لتطبيق واسع النطاق على التعديلات الإعلان. مع هذه الاستراتيجية، فمن الممكن لتعديل أو دمج مستضدات مغاير على مختلف البروتينات الرئيسية قفيصة، مثل hexon 2،4،20، قاعدة بينتون 21 و 22 الألياف. أظهر قفيصة البروتين البسيط بيكس C محطة واعدة لheterolمستضد ogous / الببتيد التأسيس 21،23. بالإضافة إلى تعديل واحد، حقق تعديلات متعددة على الإعلان مع هذه الاستراتيجية أيضا النجاح. ومن الأمثلة على ذلك الجيل من ثنائي التكافؤ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 في هذه الدراسة من خلال المعلومات المدرجة في كل من HVR1 وHVR5 من hexon5، ودمج اثنين الحواتم تحييد من نوع الفيروس المعوي 71 من زمن إما HVR1 وHVR2 أو HVR1 و HVR4، أو HVR1 وHVR5 من hexon3 24. هذه الأمثلة تدل على جدوى التعديلات hexon في الأنماط المصلية الأخرى من الإعلان، لغرض إما العلاج الجيني أو نهج التطعيم. أظهرت البيانات المتوفرة لدينا أيضا المدرجه اثنين من المثقبيات الكروزية الحواتم إلى hexon وبيكس (بيانات غير منشورة). كما تم تمديد هذه الاستراتيجية لجعل ناقلات الإعلان خيالية لأي تطعيم أو طرق العلاج الجيني. ومن الأمثلة على ذلك الجيل من Ad5H3 خيالية عن طريق التحول hexon5 مع hexon3 16، وتوليد Ad3H7 خيالية عن طريق التحول hexon3 وايعشر hexon7 25، وتوليد Ad5F4 خيالية عن طريق استبدال الألياف Ad5 مع Ad4 الألياف 26.
في هذه الدراسة، وثنائي التكافؤ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 أثبت الإنتزاع من الاستجابات المناعية الخلطية محددة لمستضدات من الفائدة يدمج. يوضح مشروعنا الحالي أن استجابة الخلايا ASP2 محددة CD8 T باتت جاهزة بشكل كبير عن طريق التحصين مع ناقل Ad5-بيكسل-ASP2، والتي تم إنشاؤها من خلال دمج ASP2 الببتيد إلى بروتين التاسع (بيكس) من Ad5، مع استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس (لا تظهر البيانات). ASP2، واسمه أيضا بروتين السطح يشمانة 2، هو مستضد سائد مناعيا للمتناوب الأجيال داخل الخلايا وحيدة الخلية الطفيلي المثقبيات الكروزية (T. الكروزية) 27. هذه النتيجة التجريبية جديد يمتد علمنا أن تطبيق استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس على اللقاحات الإعلان تنقلها يمكن أن يثير الاستجابات المناعية الخلطية ليس فقط، ولكن أيضا إمان الخلويردود البريد محددة لمستضدات من الفائدة.
على الرغم من المفيد نسبيا مع الاستراتيجية التحوير التقليدية، لديه استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس أيضا ثلاثة عيوب. أولا، أنه لا يمكن السماح للإدماج الجينات من الفائدة طالما يفعل الاستراتيجية التقليدية. وقد أفيد أن استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس على hexon5 يسمح للالإدراج من أقصى 80 الأحماض الأمينية (أأ) في HVR1، 77 أأ في HVR5 و 57 ألف في HVR2 2. منها، HVR1 هي اللغة الأكثر تساهلا للالتأسيس. ومع ذلك، يمكن للقاصر البروتين قفيصة بيكس استيعاب الإدراج من 1000 الأحماض الأمينية 28. ثانيا، فشلت بعض المستضدات من الاهتمام في الطبيعة في إدراج في البروتينات قفيصة الإعلان، وذلك بسبب عوامل مثل الرسوم وقوات من الأحماض الأمينية، التي يبدو لعرقلة الترتيب الهيكلي للفيروس الإعلان. في هذه الحالة، وإدخال الفواصل المناسبة مرتبطة بالمصلحة المستضدات لقد تساعد عشرالبريد الناجح التأسيس 4. ثالثا، المدرجه في بعض المناطق HVR، أي، HVR6 أو HVR7 يمكن أن يؤدي إلى توليد الفاشلة لناقلات فيروسية قابلة للحياة 12. نظرا للمزايا وعيوب كل من الاستراتيجيات، واختيار الحكيمة من الاستراتيجيتين أو مزيج من الاثنين معا الاستراتيجيات تعتمد على ظروف محددة / الاحتياجات. مثال على تمشيط كل من الاستراتيجيات هو توليد Ad5 / HVR2-MPER-L15 (الكمامة)، حيث المنطقة الخارجية غشاء الداني (MPER) من HIV-1 gp41was دمجها HVR2 من hexon5 مع استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس، وتم إدراج HIV-1 الكمامة الجينات لتحل محل لغة الجينات E1 من Ad5 مع استراتيجية التحوير التقليدية 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح 5T32AI7493-20 و5R01AI089337-03. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
| 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
| glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
| 200 mM L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
| penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
| DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
| Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
| cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
| T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
| T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
| T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
| Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
| Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
| dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
| ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
| human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
| mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
| SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
| PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
| Animal lancet (point length at 5 mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
| Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |
References
- Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
- Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815 (2010).
- DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
- Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112 (2014).
- Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
- Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
- Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571 (2013).
- Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
- Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
- Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
- Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
- Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347 (2013).
- Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381 (2012).
- Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
- Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
- Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
- Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
- Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).
- Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
- Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
- Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
- Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
- Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
- Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533 (2013).
- Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).
- Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).
